Summary
Presentamos un procedimiento de mapeo cerebral basado en matrices de grafeno para reducir la invasividad y mejorar la resolución espacio-temporal. Los electrodos de superficie basados en matrices de grafeno exhiben biocompatibilidad a largo plazo, flexibilidad mecánica e idoneidad para el mapeo cerebral en un cerebro enrevesado. Este protocolo permite construir múltiples formas de mapas sensoriales de forma simultánea y secuencial.
Abstract
Los mapas corticales representan la organización espacial de las respuestas neuronales dependientes de la ubicación a los estímulos sensoriomotores en la corteza cerebral, lo que permite la predicción de comportamientos fisiológicamente relevantes. Para obtener mapas corticales se han utilizado diversos métodos, como electrodos penetrantes, electroencefalografía, tomografía por emisión de positrones, magnetoencefalografía y resonancia magnética funcional. Sin embargo, estos métodos están limitados por una resolución espacio-temporal deficiente, una baja relación señal-ruido (SNR), altos costos y falta de biocompatibilidad o daño físico al cerebro. Este estudio propone un método de mapeo somatosensorial basado en matrices de grafeno como una característica de la electrocorticografía que ofrece una biocompatibilidad superior, alta resolución espacio-temporal, SNR deseable y daño tisular minimizado, superando los inconvenientes de los métodos anteriores. Este estudio demostró la viabilidad de una guía de electrodos de grafeno para el mapeo somatosensorial en ratas. El protocolo presentado se puede aplicar no solo a la corteza somatosensorial sino también a otras cortezas como la corteza auditiva, visual y motora, proporcionando tecnología avanzada para la implementación clínica.
Introduction
Un mapa cortical es un conjunto de parches locales que representan las propiedades de respuesta a los estímulos sensoriomotores en la corteza cerebral. Son una formación espacial de las redes neuronales y permiten la predicción de la percepción y la cognición. Por lo tanto, los mapas corticales son útiles para evaluar las respuestas neuronales a estímulos externos y procesar la información sensoriomotora 1,2,3,4. Existen métodos invasivos y no invasivos para el mapeo cortical. Uno de los métodos invasivos más comunes consiste en el uso de electrodos intracorticales (o penetrantes) para el mapeode 5,6,7,8.
La evaluación de los mapas corticales de alta resolución bajo demanda utilizando electrodos penetrantes se ha enfrentado a varios obstáculos. El método es demasiado laborioso para obtener un mapa decente y demasiado invasivo para implementarlo para uso clínico, lo que impide un mayor desarrollo. Las tecnologías más recientes, como la electroencefalografía (EEG), la tomografía por emisión de positrones (PET), la magnetoencefalografía (MEG) y la resonancia magnética funcional (fMRI) han ganado popularidad porque son menos invasivas y reproducibles. Sin embargo, dados sus costos prohibitivos y su escasa resolución, se utilizan en un número limitado de casos 9,10,11. Recientemente, los electrodos de superficie flexible con una fiabilidad de señal superior han atraído una atención considerable. Los electrodos de superficie basados en grafeno demuestran biocompatibilidad a largo plazo y flexibilidad mecánica, proporcionando registros estables en un cerebro enrevesado 12,13,14,15,16. Nuestro grupo ha desarrollado recientemente una matriz multicanal basada en grafeno para el registro de alta resolución y la neuroestimulación específica del sitio en la superficie cortical. Esta tecnología nos permite realizar un seguimiento de las representaciones corticales de la información sensorial durante un período prolongado.
Este artículo describe los pasos involucrados en la adquisición de un mapa cerebral de la corteza somatosensorial utilizando una matriz de grafeno multielectrodo de 30 canales. Para medir la actividad cerebral, se coloca una matriz de electrodos de grafeno en el área subdural de la corteza, mientras que la pata delantera, la extremidad anterior, la pata trasera, la extremidad posterior, el tronco y los bigotes se estimulan con un palo de madera. Los potenciales evocados somatosensoriales (SEP) se registran para las áreas somatosensoriales. Este protocolo también se puede aplicar a otras áreas del cerebro, como la corteza auditiva, visual y motora.
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Protocol
Todos los procedimientos de manejo de animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Nacional de Incheon (INU-ANIM-2017-08).
1. Preparación de los animales para la cirugía
NOTA: Use Sprague Dawley Rat (8-10 semanas de edad) sin el sesgo sexual para este experimento.
- Anestesiar a la rata con 90 mg/kg de ketamina y 10 mg/kg de cóctel de xilacina por vía intraperitoneal. Para mantener la profundidad deseada de anestesia durante toda la cirugía, proporcione un cóctel suplementario de 45 mg/kg de ketamina y 5 mg/kg de xilacina cuando la rata muestre signos de despertarse.
- Confirme que la rata está bajo anestesia profunda y revise regularmente los reflejos corporales, como el pellizco de los dedos de los pies, el pellizco de la cola y el reflejo corneal.
- Afeita el pelo entre los ojos y la parte posterior de las orejas con una recortadora.
- Aplique un ungüento oftálmico en los ojos para evitar que se sequen.
2. Cirugía para la exposición de la superficie cortical
- Fije la cabeza de rata en el aparato estereotáxico con un adaptador estereotáxico. Para mantener la temperatura corporal de 37 °C durante la cirugía, coloque a la rata sobre una almohadilla térmica con temperatura controlada.
- Esterilice el área afeitada alternando tres veces el alcohol y la povidona yodada.
- Use fórceps para agarrar el cuero cabelludo con firmeza e inyecte 0.1 ml de lidocaína (2%) con una jeringa directamente en el cuero cabelludo para inducir anestesia local en el área de la cirugía.
- Haga una incisión de 2-3 cm de largo en la línea media con un bisturí y separe el cuero cabelludo para exponer el cráneo.
- Pinza el cuero cabelludo con pinzas antimosquitos para exponer el cráneo.
- Rascar la superficie del cráneo con fórceps para extraer el periostio.
- Diseccionar los músculos sobre el cráneo occipital para exponer la cisterna magna por encima del eje en la parte superior de la médula espinal.
- Incidir la cisterna magna con la cuchilla para drenar el líquido cefalorraquídeo y colocar una gasa estéril dentro de la incisión de la cisterna magna para absorber el líquido cefalorraquídeo constantemente para prevenir el edema cerebral y minimizar la inflamación.
- Con un lápiz, marque en el cráneo una ventana rectangular de 3 mm en el eje anteroposterior y 6 mm en la dirección lateral derecha desde el bregma del hemisferio derecho.
NOTA: El marcado debe asegurar una distancia de 1 mm de la línea media para evitar la ruptura del seno sagital superior. - Taladre el área marcada de acuerdo con la coordenada estereotáxica y retire el cráneo con un rongeur óseo.
- Para retirar la duramadre, dobla la punta de la aguja de 26 G a 90°, crea un agujero en la duramadre, levanta la duramadre, inserta unas pinzas en ese agujero y lánzate con unas pinzas.
- Coloque una gasa humedecida con solución salina en la corteza somatosensorial para evitar que se seque.
3. Preparación de la guía de electrodos de grafeno conectada al sistema de registro
- Prepare una guía de electrodos de grafeno con un conector de omnética.
- Separe la matriz de multielectrodos de grafeno sin causar daños aplicando la solución salina.
- Retire la cubierta exterior de los cables de referencia y de tierra del conector.
- Conecte la platina del cabezal con la guía de electrodos de grafeno al conector.
- Conecte el cable de interfaz conectado a la platina principal en el sistema de grabación.
- Fije el complejo de la guía de electrodos de grafeno en el brazo estereotáxico.
- Para capturar las señales neuronales de todos los canales, coloque la matriz en la corteza somatosensorial sin ninguna flexión, siguiendo las coordenadas estereotáxicas predeterminadas.
- Coloque un cable de referencia debajo del tejido detrás del hueso occipital y conecte el cable de tierra a la mesa óptica conectada a tierra.
4. Estimulación física y registro de SEP para mapeo
- Abra el software de grabación de señales neuronales.
- Configure el entorno del software de grabación: (1) configure la frecuencia de muestreo para los SEP y el filtro de muesca (60 o 50 Hz, una frecuencia de la energía eléctrica doméstica) para eliminar el ruido de la línea eléctrica.
- Para mapear bigotes, dóblelos con un palo fino.
- Pinche constantemente la pata delantera, la extremidad delantera, la pata trasera, la extremidad posterior y el tronco con un palo de madera para mapear el cuerpo.
- Registre las señales neuronales en el sistema de adquisición de datos durante el tiempo indicado.
5. Eutanasia animal
- Después de todos los procedimientos de grabación, sacrifique a las ratas con anestesia con isoflurano al >5% y realice una disección cervical.
6. Medición de SEP para mapeo cortical
- Abra MATLAB con el nombre en clave read_Intan_RHS2000_file.m para el análisis de señales.
NOTA: read_Intan_RHS2000_file.m se puede descargar desde "https://intantech.com/downloads.html?tabSelect=Software". - Haga clic en el botón Ejecutar , seleccione el archivo de grabación con la extensión de nombre de archivo ".rhs" y espere a que el archivo se procese y lea.
- Introduzca el comando "plot (t, amplifier_data("channel number",:))" para crear un gráfico lineal 2D de los datos de grabación, encontrar los SEP y calcular la amplitud de los SEP en todos los canales.
NOTA: Ingrese el número de canal en "número de canal". Por ejemplo, "plot(t, amplifier_data(1,:))" crea el gráfico de líneas 2D del canal 1. Además, cuando el experimentador calcule la amplitud de la respuesta, elija la respuesta grabada de cada canal. - Obtenga datos coloreando la cuadrícula con un tono diferente según la amplitud de los SEP.
NOTA: El comando "imagesc" de MATLAB ayuda a obtener un mapa topográfico más rápidamente.
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Representative Results
Este protocolo describe cómo se monta una matriz multicanal de grafeno en la superficie del cerebro. El mapa somatosensorial se construyó adquiriendo respuestas neuronales a estímulos físicos y calculando la amplitud de la respuesta. La figura 1 muestra el esquema de este experimento.
La Figura 2A presenta las características estructurales de una guía de electrodos de grafeno. Hay orificios pasantes del sustrato entre los electrodos. Estos orificios ayudan a que el electrodo entre en contacto con la superficie cortical (Figura 2B). La fuerte adhesión del electrodo a la corteza ayuda a registrar las señales neuronales con menos ruido.
La Figura 2C (izquierda) muestra las respuestas neuronales dependientes de la ubicación adquiridas al estimular los bigotes, el tronco, las patas y las extremidades codificadas en diferentes colores. Un homúnculo de rata, el cuerpo en miniatura de la rata, se dibuja con la proporción real de cada tamaño de color en el mapa de la corteza somatosensorial (Figura 2C, derecha).
La Figura 2D presenta las respuestas específicas de los estímulos con colores asociados a cada parte del cuerpo. Las respuestas se registran a través de una matriz de electrodos de grafeno colocada en la superficie de la corteza. Utilizando los datos registrados de la matriz de grafeno, se calcula la amplitud de los SEP para obtener el mapa somatosensorial dependiente de la amplitud.
Los potenciales de campo local inducidos por estímulos sensoriales permiten la construcción del mapa somatosensorial. El tamaño de la respuesta a cada estímulo corporal plantea el homúnculo roedor. Cada color representa una parte diferente del cuerpo (Figura 3).
El mapa de la corteza adquirida utilizando este protocolo revela las regiones específicas dentro de la corteza somatosensorial que responden a los bigotes, las patas delanteras, las extremidades delanteras, las patas traseras, las extremidades posteriores y los troncos. Proporciona información sobre el grado de participación del área cortical en el procesamiento de la información del estímulo físico para cada parte del cuerpo.
Figura 1: Esquema de la configuración del experimento. La matriz de electrodos basada en grafeno se adhiere a la corteza somatosensorial y los bigotes u otras partes del cuerpo se estimulan con un toque suave. La línea roja gruesa representa el cable, y las líneas rojas y azules delgadas representan los cables de tierra y de referencia. El punto negro indica el bregma. El sistema de adquisición de datos se conecta al ordenador a través de USB. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Matriz de microelectrodos basada en grafeno para el mapeo cerebral en la superficie cortical . (A) Esquema de la guía de electrodos basada en grafeno. (B) Imagen óptica de la matriz de electrodos de grafeno en la superficie cortical. (C) Cortezas auditivas y somatosensoriales de la rata. Dos mapas de áreas auditivas y somatosensoriales que responden a estímulos auditivos con varios tonos de frecuencia y estímulos físicos aplicados a cada parte del cuerpo. (D) El registro de 30 canales (excluyendo los electrodos de referencia y de tierra) de la matriz de electrodos de grafeno en la superficie cortical. Los colores de las cajas se correlacionan con las ubicaciones geográficas de la superficie cortical. Las cifras son adaptadas y modificadas de Lee et al. (2021). 4Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Mapa somatosensorial. (A) Ubicación de los registros neuronales a través de las capas corticales (izquierda). Un mapa de superficie cortical determinado utilizando una guía de electrodos de grafeno. Un mapa somatosensorial codificado por colores construido utilizando las amplitudes de respuesta y superpuesto con el homúnculo (derecha). (B) SEPs corticales registrados y mapas después de la estimulación de cada parte del cuerpo. Esta figura es una adaptación y modificación de Lee et al. (2021). 4Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
El protocolo presentado proporciona un proceso en profundidad, paso a paso, que explica cómo acceder y mapear las respuestas somatosensoriales de las ratas utilizando una matriz de electrodos de grafeno. Los datos adquiridos por el protocolo son SEP que proporcionan información somatosensorial que está vinculada sinápticamente a cada parte del cuerpo.
Deben tenerse en cuenta varios aspectos de este protocolo. Al extraer líquido cefalorraquídeo para prevenir el edema cerebral y mitigar la inflamación, es crucial que el experimentador no dañe el tronco encefálico ubicado frente a la cisterna magna.
Los bigotes faciales proporcionan información sensorial táctil sobre el entorno, como un entorno oscuro y estrecho. En consecuencia, los bigotes de los roedores están lo suficientemente bien desarrollados como para detectar un objeto a través de las direcciones de desviación, la intensidad del estímulo y la ubicación de los bigotes estimulados. La corteza somatosensorial responde de manera diferente a la dirección de flexión, la intensidad y la ubicación de cada bigote18,19. Por lo tanto, todos los bigotes se estimulan con intensidad y dirección constantes en este protocolo.
Este protocolo no puede registrar las señales evocadas en las estructuras cerebrales profundas, ya que nuestra matriz de electrodos de grafeno está montada en la superficie cortical. Por lo tanto, el experimentador no puede identificar cómo la red columnar está organizada jerárquicamente con respecto a las respuestas neuronales.
Este protocolo es superior a los métodos de registro anteriores porque la guía de electrodos de grafeno es menos invasiva, adaptable y biocompatible 12,13,14,15,16. Además, la matriz de electrodos de grafeno tiene >30 canales para registrar señales, lo que permite un mapeo cortical más rápido que un electrodo único o tetrodo. Este protocolo puede aplicarse a otras áreas corticales siempre que sea necesario15,20. El experimentador puede colocar la guía de electrodos en la corteza auditiva o visual para extraer información auditiva y visual como mapas auditivos o visuales. Finalmente, este método se puede implementar para la implantación crónica y el diagnóstico de enfermedades neuronales, como accidentes cerebrovasculares, epilepsia, tinnitus y enfermedad de Parkinson.
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Disclosures
No tenemos nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por la Universidad Nacional de Incheon (Cooperativa Internacional) para Sunggu Yang.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1mL syringe | KOREAVACCINE CORPORATION | injecting the drug for anesthesia | |
| 3mL syringe | KOREAVACCINE CORPORATION | injecting the drug for anesthesia | |
| Bone rongeur | Fine Science Tools | 16220-14 | remove the skull |
| connector | Gbrain | Connect graphene electrode to headstage | |
| drill | FALCON tool | grind the skull | |
| drill bits | Osstem implant | grind the skull | |
| Graefe iris forceps slightly curved serrated | vubu | vudu-02-73010 | remove the tissue from the skull or hold wiper |
| graphene multielectrode array | Gbrain | records signals from neuron | |
| isoflurane | Hana Pharm Corporation | sacrifce the subject | |
| ketamine | yuhan corporation | used for anesthesia | |
| lidocaine(2%) | Daihan pharmaceutical | local anesthetic | |
| Matlab R2021b | Mathworks | Data analysis Software | |
| mosquito hemostats | Fine Science Tools | 91309-12 | fasten the scalp |
| ointment | Alcon | prevent eye from drying out | |
| povidone | Green Pharmaceutical corporation | disinfect the incision area | |
| RHS 32ch Stim/Record headstage | intan technologies | M4032 | connect connector to interface cable and contain intan RHS stim/amplifier chip |
| RHS 6-ft (1.8m) Stim SPI interface cable | intan technologies | M3206 | connect graphene electrode to headstage |
| RHS Stim/Recording controller software | intan technologies | Data Acquisition Software | |
| RHS stimulation/ Recording controller | intan technologies | M4200 | |
| saline | JW Pharmaceutical | ||
| scalpel | Hammacher | HSB 805-03 | |
| stereotaxic instrument | stoelting | fasten the subject | |
| sterile Hypodermic Needle | KOREAVACCINE CORPORATION | remove the dura mater | |
| Steven Iris Tissue Forceps | KASCO | 50-2026 | remove the dura mater |
| surgical blade no.11 | FEATHER | inscise the scalp | |
| surgical sicssors | Fine Science Tools | 14090-09 | inscise the scalp and remove the dura mater |
| wooden stick | whisker stimulation | ||
| xylazine | Bayer Korea | used for anesthesia |
References
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