Summary
Die Machbarkeit und Effektivität von Hochdurchsatz-scRNA-seq-Methoden läutet eine Einzelzell-Ära in der Pflanzenforschung ein. Hier wird ein robustes und vollständiges Verfahren zur Isolierung spezifischer Arabidopsis thaliana-Wurzelzelltypen und zum anschließenden Aufbau und zur Analyse von Transkriptombibliotheken vorgestellt.
Abstract
In mehrzelligen Organismen können die Entwicklungsprogrammierung und die Umweltreaktionen in verschiedenen Zelltypen oder sogar innerhalb von Zellen sehr unterschiedlich sein, was als zelluläre Heterogenität bezeichnet wird. In den letzten Jahren haben sich Einzelzell- und Zelltypisolierungen in Kombination mit Next-Generation-Sequencing-Techniken (NGS) zu wichtigen Werkzeugen entwickelt, um biologische Prozesse mit Einzelzellauflösung zu untersuchen. Die Isolierung von Pflanzenzellen ist jedoch aufgrund des Vorhandenseins von pflanzlichen Zellwänden relativ schwierig, was die Anwendung von Einzelzellansätzen in Pflanzen einschränkt. Dieses Protokoll beschreibt ein robustes Verfahren zur Fluoreszenz-aktivierten Zellsortierung (FACS)-basierten Einzelzell- und Zelltypisolierung mit Pflanzenzellen, das sich für nachgelagerte Multi-Omics-Analysen und andere Studien eignet. Anhand von Arabidopsis-Wurzel-Fluoreszenzmarkerlinien zeigen wir, wie bestimmte Zelltypen, wie z.B. Xylempol-Pericyclenzellen, laterale Wurzelinitialzellen, laterale Wurzelkappenzellen, Kortexzellen und endodermale Zellen, isoliert werden. Darüber hinaus wird eine effektive Downstream-Transkriptom-Analysemethode unter Verwendung von Smart-seq2 bereitgestellt. Die Zellisolationsmethode und die Transkriptomanalysetechniken können auf andere Zelltypen und Pflanzenarten übertragen werden und haben ein breites Anwendungspotenzial in den Pflanzenwissenschaften.
Introduction
Zellen sind die Grundeinheit aller Lebewesen und erfüllen strukturelle und physiologische Funktionen. Obwohl die Zellen in mehrzelligen Organismen eine scheinbare Synchronizität aufweisen, weisen Zellen verschiedener Typen und einzelne Zellen Unterschiede in ihren Transkriptomen während der Entwicklung und der Umweltreaktionen auf. Die Hochdurchsatz-Einzelzell-RNA-Sequenzierung (scRNA-seq) bietet eine noch nie dagewesene Leistung für das Verständnis der zellulären Heterogenität. Die Anwendung von scRNA-seq in den Pflanzenwissenschaften hat zur erfolgreichen Erstellung eines Pflanzenzellatlas1 beigetragen, wurde zur Identifizierung seltener zellulärer Taxa in Pflanzengeweben2 verwendet, hat Einblicke in die Zusammensetzung von Zelltypen in Pflanzengeweben geliefert und wurde verwendet, um die zelluläre Identität und wichtige Funktionen zu identifizieren, die bei der Entwicklung und Differenzierung von Pflanzen eine Rolle spielen. Darüber hinaus ist es möglich, räumlich-zeitliche Entwicklungsverläufe in Pflanzengeweben 1,2,3 abzuleiten, um neue Markergene4 zu entdecken und die Funktionen wichtiger Transkriptionsfaktoren5 mit Hilfe von scRNA-seq zu untersuchen, um die evolutionäre Konservierung desselben Zelltyps in verschiedenen Pflanzen aufzudecken 3. Abiotische Belastungen gehören zu den wichtigsten Umwelteinflüssen auf das Wachstum und die Entwicklung von Pflanzen. Indem man die Veränderungen in der Zusammensetzung von Zelltypen in Pflanzengeweben unter verschiedenen Behandlungsbedingungen durch Einzelzell-Transkriptom-Sequenzierung untersucht, kann man auch den abiotischen Stressreaktionsmechanismus aufklären6.
Das Potenzial für die Auflösung der transkriptionellen Heterogenität zwischen Zelltypen durch scRNA-Sequenzierung hängt von der Zellisolationsmethode und der Sequenzierungsplattform ab. Die fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS) ist eine weit verbreitete Technik zur Isolierung einer Subpopulation von Zellen für scRNA-seq basierend auf Lichtstreuung und den Fluoreszenzeigenschaften der Zellen. Die Entwicklung von fluoreszierenden Markerlinien mittels transgener Technologie hat die Effizienz der Zellisolierung durch FACS7 erheblich verbessert. Die Durchführung von scRNA-seq mit Smart-seq28 verbessert die Fähigkeit, die zelluläre Heterogenität zu analysieren. Die Smart-seq2-Methode hat eine gute Sensitivität für den Gennachweis und kann Gene auch mit einem geringen Transkripteintrag nachweisen9. Zusätzlich zur Massenerfassung von Zelltypen bieten moderne Zellsortierer ein Einzelzell-Index-Sortierformat, das eine Transkriptomanalyse mit Einzelzellauflösung unter Verwendung von Smart-seq210 oder anderen gemultiplexten RNA-seq-Methoden, wie z. B. CEL-seq211, ermöglicht. Die Einzelzell- oder Zellsortierung kann potenziell für viele andere nachgelagerte Anwendungen verwendet werden, z. B. für parallele Multi-Omics-Studien12,13. Hier wird ein robustes und vielseitiges Protokoll zur Isolierung von Pflanzenzelltypen, wie z.B. Xylempol-Pericyclenzellen, lateralen Wurzelkappenzellen, lateralen Wurzelinitialzellen, Kortexzellen und endodermalen Zellen aus den Wurzeln von Arabidopsis thaliana-Markerzelllinien mittels FACS vorgestellt. Das Protokoll beinhaltet außerdem den Aufbau der Smart-seq2-Bibliothek für die nachgelagerte Transkriptomanalyse.
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Protocol
Das folgende Protokoll wurde für A. thaliana-Wildtyp-Samen (WT) ohne Fluoreszenz- und Fluoreszenzmarkerlinien für die folgenden Wurzelzelltypen optimiert: Xylempol-Pericycluszellen (J0121), laterale Wurzelinitialzellen, laterale Wurzelkappenzellen (J3411), Endodermis- und Cortexzellen (J0571) (Abbildung 1A). Alle Markierungslinien wurden aus einer kommerziellen Quelle gewonnen (siehe Materialtabelle), mit Ausnahme der Lateralwurzel-Initiationszell-Markerlinie, die durch die Einführung eines GATA23-Promotor-getriebenen GFP-Konstrukts in eine Wildtyp-Arabidopsis-Pflanze im Anschluss an einen zuvor veröffentlichten Berichterzeugt wurde 14.
1. Aufbereitung des Pflanzenmaterials
- Sterilisieren Sie die A. thaliana WT-Samen und die fluoreszierenden Markerliniensamen, indem Sie die Samen in 20%igem Bleichmittel in einem rotierenden Inkubator bei Raumtemperatur für 15 Minuten inkubieren.
- Spülen Sie die Samen drei- bis fünfmal in doppelt destilliertem Wasser (ddH2O) ab. Führen Sie diesen Schritt auf einer sterilen, sauberen Bank durch.
- Die Samen der WT- und Reporterlinie auf halbstarkem Murashige und Skoog (MS) Medium mit 0,8 % Agar (w/v)15 ablegen. Wachsen Sie die Pflanzen 5 Tage lang senkrecht (16 h Licht bei 23 °C), nachdem Sie sie 2 Tage lang bei 4 °C stratifiziert haben.
2. Protoplasting
- Bereiten Sie die protoplasting Lösungen2,5 vor, die als Lösung A und Lösung B bezeichnet werden (siehe Materialtabelle).
- Bereiten Sie Lösung A vor, die 400 mM Mannitol, 0,05 % BSA, 20 mM MES (pH 5,7), 10 mM CaCl2 und 20 mM KCl enthält (siehe Materialtabelle). Lagern Sie Lösung A bis zu 1 Monat bei −20 °C.
- Bereiten Sie Lösung B zu, indem Sie 1 % (w/v) Cellulase R10, 1 % (w/v) Cellulase RS, 1 % (w/v) Hemicellulase, 0,5 % (w/v) Pektoligase und 1 % (w/v) Macerozym R10 in einem frischen Aliquot von Lösung A hinzufügen. Lagern Sie Lösung B bei −20 °C für bis zu 1 Monat.
- Tauen Sie Lösung A und Lösung B vorsichtig auf Eis auf, bevor Sie mit dem Experiment beginnen.
- Schneiden Sie die Wurzeln mit einer sauberen Klinge oder Schere ab und hacken Sie die Wurzeln in ~0,5 cm große Stücke. Tauchen Sie die Wurzeln in 1,5 ml Lösung B, gefolgt von einer sanften Rotation (bei ca. 18 U/min) bei Raumtemperatur für 1,5-2 Stunden.
- Filtern Sie die Wurzelprotoplasten durch das 40 μm Siebgewebe (siehe Materialtabelle).
- Spülen Sie das Siebgewebe mit 1-2 ml Lösung A aus.
- Die Flüssigkeiten aus Schritt 2.4 und Schritt 2.5 vermischen und bei 300 x g 5 min bei 4 °C zentrifugieren. Entsorgen Sie den Überstand mit einer Pipette, resuspendieren Sie das Zellpellet in 500-600 μl Lösung A und legen Sie es dann sofort auf Eis.
- Die resuspendierte Zelllösung wird zur Zellsortierung in ein neues 5-ml-Reagenzglas überführt.
3. Fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS)
- Schalten Sie das Gerät ein und beenden Sie die Schritte zum Einrichten des Geräts am Sortierer (siehe Materialtabelle). Wählen Sie die Fluoreszenzkanäle aus, verwenden Sie eine WEA-Anlage (keine Fluoreszenz) als Kontrolle, um die Basislinie für die Autofluoreszenz zu bestimmen, und passen Sie den Sortierschieber basierend auf der Fluoreszenzintensität und den FSC/SSC-Vereinzelungen an (Abbildung 2).
- Geben Sie 500 μl Lösung A (Schritt 2.1.1) in ein 1,5-ml-Sammelröhrchen, um eine Beschädigung der Zellen zu verhindern. Sammle 2.000-3.000 Zellen pro Röhrchen.
- Nach dem Sortieren werden die Proben sofort auf Eis gelegt, das Sammelröhrchen mit den Zellen bei 300 x g für 5 min bei 4 °C zentrifugiert und der Überstand mit einer Pipette entfernt.
- Nehmen Sie 2 μl sortierte Zellen und überprüfen Sie sie mit einem Fluoreszenzmikroskop auf Fluoreszenz (siehe Materialtabelle).
- Lagern Sie die sortierten Zellen bei −80 °C oder verwenden Sie sie sofort für den Bibliotheksaufbau (Schritt 4).
- Setzen Sie für die Sortierung des Einzelzellenindex die 96-Well-Platte in den Adapter ein. Kalibrieren Sie die Position der Platte so, dass der Tropfen in das mittlere Loch der Platte fällt. Wählen Sie beim Sortieren den Einzelzellen-Sortiermodus, geben Sie die Zielanzahl der sortierten Zellen als 1 ein und starten Sie die Sortierung.
4. Vorbereitung der Smart-seq2-Bibliothek
- Aufgrund der extrem geringen Menge an Input können Einzelzell-RNA-seq-Bibliotheken in einer kontaminationsfreien Umgebung erstellt werden. Bevor Sie mit dem Experiment beginnen, reinigen Sie den Prüfstand mit einem Oberflächendekontaminationsmittel8 (siehe Materialtabelle) und 75%igem Ethanol.
- Herstellung von Lysepuffer (Gemisch A) (Tabelle 1) durch Kombination von 0,33 μl 10 % Triton X-100, 0,55 μl RNase-Inhibitor und 0,22 μl 0,1 M DTT (siehe Materialtabelle).
- Geben Sie 1 μl der Mischung A in die sortierte Probe und mahlen Sie sie mit einem sterilen Stößel. Das bevorzugte Probenvolumen beträgt ≤0,5 μl; Verwenden Sie RNase-freies Wasser, um das Volumen auf 14 μl zu erhöhen. Übertragen Sie jede einzelne Zellprobe in ein dünnwandiges 0,2-ml-PCR-Röhrchen.
- Bereiten Sie Gemisch B vor, das 0,44 μl Oligo-dT30VN reverse Transkription (RT)-Reaktionsprimer (100 μM) und 4,4 μl dNTPs (10 mM) enthält (Tabelle 2) (siehe Materialtabelle).
- Fügen Sie 4,4 μl Mischung B zu den 14 μl Probe in jedem Röhrchen hinzu, pipettieren Sie vorsichtig, um die Probe zu mischen, und inkubieren Sie die Probe 3 Minuten lang bei 72 °C. Nach der Inkubation werden die Proben sofort auf Eis gelegt, um das Oligo-dT mit dem Poly-A-Schwanz zu hybridisieren.
- Bereiten Sie das Reverse-Transkriptions-Reaktionsgemisch (Gemisch C) (Tabelle 3) vor (siehe Materialtabelle). Geben Sie 21,6 μl der Mischung C in jedes Röhrchen mit den Proben. Schalten Sie das RT-Programm auf einem gängigen PCR-Gerät ein (Tabelle 4).
- Führen Sie die Vorverstärkungsreaktion auf Eis durch. Bereiten Sie Gemisch D vor, indem Sie 44 μl 2x PCR-Polymerase-Mix und 0,88 μl IS-PCR-Primer (10 μM) kombinieren (Tabelle 5) (siehe Materialtabelle). Fügen Sie 40,8 μl Gemisch D zu den 40 μl RT-Reaktionsprodukt hinzu und führen Sie das Voramplifikationsprogramm aus (Tabelle 6).
- Reinigen Sie die Produkte der Voramplifikationsreaktion mit Ampure XP-Kügelchen (siehe Materialtabelle). Geben Sie 48 μl Beads (Verhältnis 0,6:1) in jede Probe aus Schritt 4.7 und mischen Sie die Proben vorsichtig durch Pipettieren.
- Inkubieren Sie die Proben 10 Minuten lang bei Raumtemperatur. Legen Sie die 1,5-ml-Röhrchen mit den Proben für 5 Minuten auf einen magnetischen Trennständer. Entsorgen Sie den Überstand vorsichtig aus den Proben, ohne die Kügelchen zu stören.
- Waschen Sie die Kügelchen, indem Sie sie in 200 μl 80%igem Ethanol resuspendieren, und legen Sie die Proben für weitere 3 Minuten auf den Magnetseparationsständer (siehe Materialtabelle), bevor Sie den ethanolhaltigen Überstand entsorgen.
- Lassen Sie die Proben 10 Minuten lang an der Luft trocknen und decken Sie das Röhrchen ab, um eine Kontamination und Kreuzkontamination während der Lufttrocknung zu vermeiden.
- Resuspendieren Sie die Beads in 20 μLddH2O, inkubieren Sie die Proben bei Raumtemperatur für 5 min und legen Sie sie dann für 5 min auf den magnetischen Trennständer.
- Pipettieren Sie 18 μl des Überstands aus jedem Röhrchen und übertragen Sie die Proben in neue 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen. Verwenden Sie 1 μl der Probe, um die Qualität der cDNA mit einem DNA-Quantifizierungskit zu beurteilen, bestimmen Sie die Größenverteilung jeder Vorbibliothek mit einem Fragmentanalysator (siehe Materialtabelle) und lagern Sie die verbleibende Probe bei −20 °C.
- Konstruieren Sie eine cDNA-Bibliothek8 für die Illumina-Sequenzierung 16 aus dem Vorbibliotheksprodukt aus Schritt4.13 unter Verwendung eines Sequenzierungsbibliotheks-Vorbereitungskits (siehe Materialtabelle).
- Bereinigen Sie die Bibliotheken (ab Schritt 4.14) mit den Ampure XP-Beads, quantifizieren Sie die bereinigten Bibliotheken und bestimmen Sie die Größenverteilung der einzelnen Bibliotheken gemäß Schritt 4.13.
HINWEIS: Fassen Sie gleiche Nanomol jeder Bibliothek zusammen, um sicherzustellen, dass keiner von ihnen die gleiche Kombination des Illumina-Index hat. Andernfalls können die Libraries in einem Verhältnis basierend auf dem gewünschten Sequencing-Output gepoolt und auf derselben Lane des Illumina-Sequenzers sequenziert werden. Im Allgemeinen bietet die Sequenzierung jeder Bibliothek bis zu einer Tiefe von 4-6 GB, was >10 Millionen kartierte Lesevorgänge ergibt, eine 20-30-fache Abdeckung des Arabidopsis-Genoms . Geringere Sequenziertiefen sind ebenfalls akzeptabel, können aber die Aussagekraft der differentiellen Expressionsanalyse beeinträchtigen.
5. RNA-seq-Datenanalyse
- Trimmen Sie die rohen Reads mit Trim-Galore17, gefolgt von der Zuordnung zum Referenzgenom mit hisat2 18 (daehwankimlab.github.io/hisat2), und entfernen Sie die PCR-duplizierten Fragmente mit Picard19 (broadinstitute.github.io/picard).
- Führen Sie die Rohzählung und die anschließende Analyse der differentiell exprimierten Gene (DEG) mit DESeq220 unter Verwendung von mindestens drei biologischen Replikaten für jede Probe durch. Führen Sie ein Clustering der Genexpression mit dem Pheatmap-Paket durch und visualisieren Sie es in einer Expressions-Heatmap.
HINWEIS: Die RPKM-Werte (Reads per Kilobase per Million Mapped Reads) der Gene und der TEs (Transposable Elements) wurden mit Stringtie18 (github.com/gpertea/stringtie) berechnet und in einem Genombrowser visualisiert.
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Representative Results
Isolierung von Protoplasten
Dieses Protokoll ist effektiv für die Protoplastensortierung von fluoreszierenden A. thaliana-Wurzelmarkerlinien . Diese Markerlinien wurden durch die Fusion von fluoreszierenden Proteinen mit Genen, die spezifisch in Zielzelltypen exprimiert werden, oder durch die Verwendung von Enhancer-Fallenlinien entwickelt (Abbildung 1). Zahlreiche Gewebe und Organe wurden in Zelltypen zerlegt, die spezifische Fluoreszenzmarker in Modellpflanzen und Nutzpflanzen exprimieren.
FACS-Population, sortierte Zellen und Bibliotheks-QC
Durch die Verwendung einer Wildtyp-Pflanze als Kontrolle und das Setzen von Toren wie Vorwärtsstreuung (FSC) und Seitenstreuung (SSC) bestimmten wir eine Hauptpopulation von interessierenden Zellen und eine Basislinie für die Autofluoreszenz und sortierten erfolgreich die fluoreszenzspezifisch markierten Zellen (Abbildung 2). Die Qualität der finalen Sequenzierungsbibliotheken (aus Schritt 4.15) wurde durch die Fragmentgrößenverteilungsanalyse bestimmt. Die repräsentativen Ergebnisse der RNA-seq-Bibliothek von etwa 2.000 Xylempol-Perizykluszellen, lateralen Wurzelprimordienzellen, Endodermis/Cortex-Zellen und lateralen Wurzelkappenzellen sind in Abbildung 3A-D dargestellt.
Analyse von Expressionsmustern
Die Qualität der Sequenzierungsdaten kann anhand mehrerer Analyseverfahren bewertet werden, z. B. anhand von Sequenzierungstiefe, Kartierungsrate und FastQC-Berichten. Die Genauigkeit und Sensitivität der Sequenzierungsdaten kann durch das Vorhandensein einer Reihe von zelltypangereicherten Genen nachgewiesen werden, die aus der DEG-Analyse zwischen isolierten Zelltypen und dem gesamten Gewebe identifiziert werden können. Gene mit signifikant höheren Expressionsniveaus in bestimmten Zelltypen können als zelltypangereicherte Gene identifiziert werden. Währenddessen können die Genom-Browser-Ansichten der einzelnen Zelltypen nebeneinander verglichen werden, um die Expressionsniveaus bekannter Markergene zu zeigen und zu testen, ob das Expressionsmuster der Markergene in den Expressionsdaten des Zelltyps rekonstruiert werden kann. Beispielsweise wurden die Gene, die in einem der vier Wurzelzelltypen angereichert sind, geclustert und in einer Heatmap dargestellt, die die Spezifität der Genexpression zwischen verschiedenen Zelltypen zeigte (Abbildung 4). YUCCA3, MYB36, WOX5 und PFA1 wurden untersucht, und die Expressionsmuster entsprachen den Erwartungen nach früheren Berichten21,22,23,24. Datenanalyse-Pipelines und repräsentative Rohsequenzierungsdaten sind in einem öffentlichen Repository (github.com/gaolabsjtu/root_cell_types_RNAseq) verfügbar.
Abbildung 1: Die spezifische Zelltyp-Markerlinie der Wurzel- und Protoplastenpräparation (A, links) Einführung in die Enhancer-Fallenlinie und Bilder. (A, rechts) Die spezifische Zellentyp-Markierungslinie der Wurzel. (B) Ein Bild der Protoplastenpräparation vor dem Sortieren. Die Skalenbalken für die Gründerzelle, den Pericyclus, die Endodermis/Cortex, die laterale Wurzelkappe und die Protoplasten repräsentieren 25 μm, 100 μm, 100 μm, 75 μm bzw. 20 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Etablierung von FACS für bestimmte Wurzelzelltypen. Beispiel für ein FACS-Experiment: (A) die Hauptbevölkerung mit SSC und FSC; (B) die GFP-positiven (+) und GFP-negativen (−) Gatter; (C) die Hellfeld- und (D) Fluoreszenzbilder der sortierten Zellen. Der Maßstabsbalken stellt 50 μm dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Größenverteilung der Smart-seq2-Sequenzierungsbibliotheken. Repräsentative Fragmentgrößenverteilungen der Sequenzierungsbibliotheken (aus Schritt 4.15), die aus Xylempol-Pericycluszellen (A), lateralen Wurzelprimordienzellen (B), Endodermis/Cortex-Zellen (C) und lateralen Wurzelkappenzellen (D) generiert wurden. (E) Eine kleine Bibliothek mit Primer-/Adapter-Dimer-Peaks, die nach der Größenauswahl noch sequenziert werden können. (F) Eine Bibliothek mit einer abnormalen Größenverteilung, die auf eine erfolglose Bibliotheksvorbereitung hinweist. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4: Genanalyse mit Zelltyp angereichert. Es wurde eine DEG-Analyse zwischen jedem Zelltyp und der gesamten Wurzel durchgeführt; Gene mit mehr als vierfacher Hochregulation in jedem Zelltyp wurden als zelltypangereicherte Gene identifiziert. Diese Gene wurden kombiniert, geclustert und im Heatmap-Diagramm (oberes Bild) visualisiert. Zu den mit dem Zelltyp angereicherten Genen gehörten viele bekannte Markergene; Typische Markergene wie YUCCA3, MYB36, WOX5 und PFA1 wurden ausgewählt, um im Genombrowser (unteres Bild) angezeigt zu werden. Abkürzungen: LRP = laterale Wurzelprimordia; Endo/Cor = Endodermis/Kortex; LRC = seitliche Wurzelkappe. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
| Komponenten | Volumen (μL) |
| 10% Triton X-100 | 0.33 |
| RNase-Hemmer | 0.55 |
| DVB-T (0,1 M) | 0.22 |
Tabelle 1: Reaktionskomponenten zur Herstellung des Zelllysepuffers (Gemisch A).
| Komponenten | Volumen (μL) |
| Oligo-dT30VN (100 μM) | 0.44 |
| dNTPs (10 mM) | 4.4 |
Tabelle 2: Reaktionskomponenten zur Herstellung von Gemisch B.
| Komponenten | Volumen (μL) |
| SuperScript IV Puffer (5x) | 8.8 |
| Betain (5 M) | 8.8 |
| DVB-T (0,1 M) | 2.2 |
| MgCl2 (1 M) | 0.264 |
| TSO (100 μM) | 0.44 |
| Reverse Transkriptase SuperScript IV (200 U/μl) | 2.2 |
| RNase-Hemmer | 1.1 |
Tabelle 3: Reaktionskomponenten zur Herstellung des Reverse-Transkriptions-PCR-Gemisches (Gemisch C).
| Zyklus | Temperatur (°C) | Zeit |
| 1 | 50 | 90 Minuten |
| 2-11 | 55 | 2 Minuten |
| 50 | 2 Minuten | |
| 12 | 70 | 15 Minuten |
| 13 | 4 | ∞ |
Tabelle 4: PCR-Einstellungen für die reverse Transkription (RT) zur Synthese von cDNA aus mRNA.
| Komponenten | Volumen (μL) |
| KAPA HiFi HotStart ReadyMix (2x) | 44 |
| IS-PCR-Primer (10 μM) | 0.88 |
Tabelle 5: Reaktionskomponenten zur Herstellung des Voramplifikations-Reaktionsgemisches (Gemisch D).
| Zyklus | Temperatur (°C) | Zeit |
| 1 | 98 | 5 Minuten |
| 2-13 | 98 | 20 s |
| 67 | 30 s | |
| 72 | 3 Minuten | |
| 14 | 72 | 5 Minuten |
| 15 | 4 | ∞ |
Tabelle 6: PCR-Programmeinstellungen für die Voramplifikationsreaktion.
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Discussion
Das Smart-seq2-basierte Protokoll kann zuverlässige Sequenzierungsbibliotheken aus mehreren hundert Zellenerzeugen 8. Die Qualität des Ausgangsmaterials ist entscheidend für die Genauigkeit der Transkriptomanalyse. FACS ist ein leistungsfähiges Werkzeug für die Präparation von Zellen von Interesse, aber dieses Verfahren, insbesondere der Protoplasting-Schritt, muss für pflanzliche Anwendungen optimiert werden. Laser-Capture-Mikrodissektion (LCM) oder manuell präparierte Zellen können auch als Eingabe25,26 verwendet werden, so dass das hier bereitgestellte Protokoll potenziell in einer Vielzahl von Pflanzenarten und Zelltypen mit oder ohne bekannte Markergene verwendet werden kann.
Aufbereitung des Pflanzenmaterials
In der pflanzlichen Entwicklungsbiologie wird FACS in der Regel verwendet, um angereicherte Zellpopulationen zu isolieren, die einen Fluoreszenzmarker exprimieren. Die Pflanzen, die einen solchen Marker exprimieren, werden protoplastiert, und die Protoplasten werden schließlich basierend auf der Expression des zelltypspezifischen Markers in reine Subpopulationen einsortiert. Daher muss das Signal des Fluoreszenzmarkers stark und spezifisch sein. Außerdem sollte der Forscher im Vorfeld prüfen, welche Marker sortiert werden können. Die Anzahl der benötigten Seeds hängt von der Expressionsebene ab, wo der Marker exprimiert wird, wie viele Zellen für nachgelagerte Anwendungen benötigt werden und wie viele Replikate sortiert werden. Wenn die Expression in einem einzelnen Zelltyp mit sehr wenigen Zellen pro Pflanze erfolgt, wird im Allgemeinen eine größere Anzahl von Pflanzen benötigt, als wenn der Marker in einer höheren Anzahl von Zellen exprimiert wird. Am besten ist es, die Anzahl der Samen, die für einzelne Markierungslinien benötigt werden, empirisch zu bestimmen. Besonders sinnvoll ist es, mit jeder Markierungslinie Vorversuche durchzuführen, um das Fenster für die Sortierung zu optimieren und zu wissen, wie viele Zellen sich aus einer festen Anzahl von Pflanzen ergeben. Handelt es sich bei dem Versuchsmaterial um Wurzeln, kann vor der Besamung ein entsprechend großes und autoklaviertes Netz auf den mediumhaltigen Agar gelegt werden, um ein Einsinken der Wurzeln in den Agar zu verhindern und das Schneiden sauberer Wurzeln zu erleichtern. Die Schichtung bei niedriger Temperatur fördert die Keimung und Entwicklung der Samen, daher empfehlen wir, die Samen nach dem Sterilisieren oder Ausplattieren 2 Tage lang bei 4 °C zu stratifizieren und die Pflanzen dann vertikal wachsen zu lassen.
Protoplasting und FACS
Protoplasting und Sortierung 5-6 Tage nach der Schichtung funktionieren gut. Lösung A und Lösung B müssen mit einem 0,22-μm-Sieb filtriert werden. Darüber hinaus verringert die Lagerung von Lösung B bei −20 °C über längere Zeiträume die Effizienz der Enzyme. Vor Beginn sollten Lösung A und Lösung B vorsichtig auf Eis aufgetaut werden, was etwa 20 Minuten dauert. Lösung B darf nicht geschüttelt werden, da das Schütteln von Lösung B die Enzyme stören und zu einer übermäßigen Blasenbildung führen kann. Durch mehrmaliges Waschen des Siebgewebes mit Lösung A kann die Anzahl der in Schritt 2.5 erhaltenen Zellen erhöht werden. Wie in Schritt 2.6 beschrieben, sollte nicht der gesamte Überstand abgesaugt werden, da sich die Protoplasten unten in der Nähe des Pellets befinden und nicht zu sehen sind. Vor der Sortierung ist es am besten, sicherzustellen, dass die Konzentration der Protoplasten etwa 105-10 6 Zellen/ml beträgt, um eine bessere Sortiereffizienz zu erreichen. Beim Aufbau eines neuen Versuchs wird das gleiche Gewebe aus der WEA-Anlage als Kontrolle für den Aufbau der Sortierschleuse benötigt. In Schritt 3.1 wird empfohlen, zunächst die Fluoreszenzkanäle (z. B. PE und FITC) auszuwählen und eine Kontrollprobe zu verwenden, um die Hauptpopulation nach SSC und FSC zu bestimmen. Zusätzlich wird empfohlen, die Position des Gates durch Ändern der Spannung des Fluoreszenzkanals anzupassen, um sicherzustellen, dass sich das Steuersignal links vom Gate befindet (d. h. die negative Gruppe befindet sich unterhalb von 103). Die Sortierzeit muss auf 30 min oder weniger als 60 min begrenzt werden, um Veränderungen in der Genexpression zu vermeiden, die durch Protoplasting oder Sortierung auftreten können. Nach der Sortierung sollte eine kleine Anzahl sortierter Zellen gesammelt und auf Fluoreszenz überprüft werden (Schritt 3.4). Es sollte so viel Puffer wie möglich aus dem Überstand entfernt werden, um Auswirkungen auf die nachgelagerte Bibliothekskonstruktion zu vermeiden (Schritt 3.3).
Aufbau der RNA-seq-Bibliothek
Für den Aufbau der RNA-seq-Bibliothek empfehlen wir, Zellen unmittelbar nach der Sortierung zu verwenden, um den Abbau der RNA zu reduzieren. Es ist nicht ratsam, mit zu vielen Zellen zu beginnen, da dies aufgrund unzureichender Reaktionen zu einer schlechten Qualität der Bibliothek führen kann. Die Anzahl der PCR-Zyklen in Schritt 4.7 und Schritt 4.14 hängt von der Eingangsmenge an RNA/cDNA ab. Die Anzahl der Zyklen kann erhöht werden, wenn weniger Input vorhanden ist, oder verringert werden, wenn mehr Input vorhanden ist. Daher wird empfohlen, einige der gemischten Proben aus Schritt 4.7 und Schritt 4.14 zu entnehmen, um die real-time PCR mit dem gleichen Amplifikationsverfahren durchzuführen und dann die endgültige Anzahl der Zyklen auf der Grundlage der Ergebnisse der qPCR vor der formalen Amplifikation der Vorbibliothek/Bibliothek zu bestimmen. Darüber hinaus müssen die Ampure XP-Kügelchen vor dem Reinigungsschritt 4.8 mindestens 10 min bei Raumtemperatur äquilibriert und dann gut vortexed werden. Das Volumen der Kügelchen im Reinigungsschritt sollte nicht über das Verhältnis von 0,8:1 hinaus erhöht werden. Andernfalls erhöht sich dadurch die Verschleppung von Primer-Dimeren. Außerdem sollte man ein Übertrocknen der Perlen in Schritt 4.11 vermeiden, um eine schwierige Resuspension zu vermeiden. Eine qualifizierte Vorbibliothek sollte eine durchschnittliche Größe von etwa 1,5-2 kb und eine kleine Menge an kurzen (<500 bp) Fragmenten haben. Abnorme Größenverteilungen oder kleine Primer-/Adapter-Dimer-Peaks in Bibliotheken sind Indikatoren für schlechte Qualität, und diese Proben sollten verworfen oder weiteren Runden der Beads-Reinigung unterzogen werden (Schritt 4.15) (Abbildung 3E-F).
Begrenzungen
Dieses Protokoll kann angewendet werden, um Zellen aus anderen Pflanzengeweben und anderen Pflanzenarten zu isolieren. Der Prozess der Zellisolierung hängt jedoch stark von der Präparation der Protoplasten ab. Einige Zelltypen sind schwer zu isolieren, wie z. B. Gefäßzellen und weibliche Geschlechtszellen, die sich im Inneren des Gewebes befinden und/oder nur wenige sind. Für Zellen, für die es schwierig ist, Protoplasten zu präparieren, ist die fluoreszenzaktivierte Kernsortierung (FANS)27 eine optionale Methode, die verwendet werden kann. Die Verwendung dieses Protokolls zur Gewinnung bestimmter Zelltypen durch FACS hängt von der Verfügbarkeit fluoreszierender Markierungslinien ab. Das Fehlen solcher Markierungslinien schränkt den Einsatz dieser Methoden in Nutz- und Gartenbaupflanzen ein. Die Anwendung der Hochdurchsatz-Einzelzell-RNA-seq-Technologie in Nutzpflanzen wird neue zelltypspezifische Markergene aufdecken, die zur Entwicklung von Zelltyp-Markerlinien und zur Erweiterung der Anwendungsmöglichkeiten von FACS-basierten Zelltyp-RNA-seq- und Multi-Omics-Studien verwendet werden können.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Wir haben dieses Protokoll in der Einzelzell-Multi-Omics-Einrichtung der School of Agriculture and Biology der Shanghai Jiao Tong University eingerichtet und wurden von der National Natural Science Foundation of China (Grant No. 32070608), dem Shanghai Pujiang Program (Grant No. 20PJ1405800) und der Shanghai Jiao Tong University (Grant Nos. Agri-X20200202, 2019TPB05) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 µm strainer | Sorfa | 622110 | |
| Agar | Yeasen | 70101ES76 | |
| Agilent fragment analyzer | Aglient | Aglient 5200 | |
| Agilent high-sensitivity DNA kit | Aglient | DNF-474-0500 | |
| Ampure XP beads | BECKMAN | A63881 | |
| Betaine | yuanye | S18046-100g | |
| Bleach | Mr Muscle | FnBn83BK | 20% (v/v) bleach |
| BSA | sigma | 9048-46-8 | |
| CaCl2 | yuanye | S24109-500g | |
| Cellulase R10 | Yakult (Japan) | 9012-54-8 | |
| Cellulase RS | Yakult (Japan) | 9012-54-8 | |
| Centrifuge tube (1.5 mL) | Eppendolf | 30121589 | |
| DNase, RNase, DNA and RNA Away Surface Decontaminants | Beyotime | R0127 | |
| dNTPs (10 mM) | NEB | N0447S | |
| DTT (0.1 M) | invitrogen |
18090050 | |
| Ethanol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 100092680 | |
| FACS | BD FACS Melody | BD-65745 | |
| FACS | Sony | SH800S | |
| Filter tip (1000 µL) | Thermo Scientific | TF112-1000-Q | |
| Filter tip (200 µL) | Thermo Scientific | TF140-200-Q | |
| Filter tip (10 µL) | Thermo Scientific | TF104-10-Q | |
| Filter tip (100 µL) | Thermo Scientific | TF113-100-Q | |
| Fluorescent microscope | Nikon | Eclipse Ni-E | |
| Four-Dimensional Rotating Mixer | Kylin -Bell | BE-1100 | |
| Hemicellulase | sigma | 9025-56-3 | |
| IS PCR primer | 5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG T-3' |
||
| KAPA HiFi HotStart ReadyMix(2X) | Roche | 7958935001 | |
| KCl | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 7447-40-7 | |
| Macerozyme R10 | Yakult (Japan) | 9032-75-1 | |
| Magnetic separation stand | invitrogen | 12321D | |
| Mannitol | aladdin | 69-65-8 | |
| MES | aladdin | 145224948 | |
| MgCl2 | yuanye | R21455-500ml | |
| Microcentrifuges | Eppendorf | Centrifuge 5425 | |
| Micro-mini-centrifuge | Titan | Timi-10k | |
| MS | Phytotech | M519 | |
| Nextera XT DNA Library Preparation Kit | illumina | FC-131-1024 | |
| oligo-dT30VN primer | 5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG TACTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT TTTTTTTTTTVN-3' |
||
| PCR instrument | Thermal cycler | A24811 | |
| Pectolyase | Yakult (Japan) | 9033-35-6 | |
| Plant marker lines | Nottingham Arabidopsis Stock Centre (NASC) | ||
| Qubit 1x dsDNA HS Assay Kit | invitrogen | Q33231 | |
| Qubit 2.0 fluorometer | invitrogen | Q32866 | |
| RNase inhibitor | Thermo Scientific | EO0382 | |
| RNase-free water | invitrogen | 10977023 | |
| Solution A | 400 mM mannitol, 0.05 % BSA , 20 mM MES (pH5.7), 10 mM CaCl2, 20 mM KCl | ||
| Solution B | 1 % (w/v)cellulase R10, 1 % (w/v) cellulase RS, 1 % (w/v)hemicellulase, 0.5 % (w/v)pectolyase and 1 % (w/v) Macerozyme R10 in a fresh aliquot of solution A | ||
| Sterile pestle | BIOTREAT | 453463 | |
| Strainer (40 µm ) | Sorfa | 251100 | |
| SuperScript IV reverse transcriptase (200 U/µL) | invitrogen | 18090050 | |
| SuperScript IV buffer (5x) | invitrogen | 18090050 | |
| Test tube (5 mL) | BD Falcon | 352052 | |
| Thin-walled PCR tubes with caps (0.5 mL) | AXYGEN | PCR-05-C | |
| Triton X-100 | Sangon Biotech | A600198-0500 | |
| TSO primer | 5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG TACATrGrG+G-3' |
||
| Vortex | Titan | VM-T2 |
References
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