Summary
La fattibilità e l'efficacia dei metodi scRNA-seq ad alto rendimento annunciano un'era a singola cellula nella ricerca sulle piante. Presentata qui è una procedura robusta e completa per isolare specifici tipi di cellule radice di Arabidopsis thaliana e la successiva costruzione e analisi della libreria di trascrittomi.
Abstract
Negli organismi multicellulari, la programmazione dello sviluppo e le risposte ambientali possono essere altamente divergenti in diversi tipi di cellule o anche all'interno delle cellule, che è noto come eterogeneità cellulare. Negli ultimi anni, l'isolamento di singole cellule e di tipo cellulare combinato con tecniche di sequenziamento di nuova generazione (NGS) sono diventati strumenti importanti per studiare i processi biologici a risoluzione singola cellulare. Tuttavia, isolare le cellule vegetali è relativamente più difficile a causa della presenza di pareti cellulari vegetali, che limita l'applicazione di approcci unicellulari nelle piante. Questo protocollo descrive una solida procedura per l'isolamento basato su cellule singole e cellulari attivate da fluorescenza (FACS) con cellule vegetali, adatta per l'analisi multi-omica a valle e altri studi. Utilizzando le linee marcatrici fluorescenti della radice di Arabidopsis , dimostriamo come particolari tipi di cellule, come le cellule del periciclo xilematico-polo, le cellule iniziali della radice laterale, le cellule del cappuccio radicale laterale, le cellule della corteccia e le cellule endodermiche, sono isolate. Inoltre, viene fornito anche un efficace metodo di analisi del trascrittoma a valle utilizzando Smart-seq2. Il metodo di isolamento cellulare e le tecniche di analisi del trascrittoma possono essere adattati ad altri tipi di cellule e specie vegetali e hanno un ampio potenziale applicativo nella scienza delle piante.
Introduction
Le cellule sono l'unità fondamentale di tutti gli organismi viventi e svolgono funzioni strutturali e fisiologiche. Sebbene le cellule negli organismi multicellulari mostrino un'apparente sincronicità, cellule di diversi tipi e singole cellule presentano differenze nei loro trascrittomi durante lo sviluppo e le risposte ambientali. Il sequenziamento dell'RNA a singola cellula ad alto rendimento (scRNA-seq) fornisce una potenza senza precedenti per comprendere l'eterogeneità cellulare. L'applicazione di scRNA-seq nelle scienze vegetali ha contribuito a costruire con successo un atlante cellularevegetale 1, è stato utilizzato per identificare taxa cellulari rari nei tessuti vegetali2, ha fornito informazioni sulla composizione dei tipi di cellule nei tessuti vegetali ed è stato utilizzato per identificare l'identità cellulare e importanti funzioni impiegate durante lo sviluppo e la differenziazione delle piante. Inoltre, è possibile dedurre traiettorie di sviluppo spazio-temporali nei tessuti vegetali 1,2,3 per scoprire nuovi geni marcatori4 e studiare le funzioni di importanti fattori di trascrizione 5 utilizzando scRNA-seq al fine di rivelare la conservazione evolutiva dello stesso tipo cellulare in piante diverse 3. Gli stress abiotici sono tra le più importanti influenze ambientali sulla crescita e lo sviluppo delle piante. Esplorando i cambiamenti nella composizione dei tipi di cellule nei tessuti vegetali in diverse condizioni di trattamento attraverso il sequenziamento del trascrittoma a singola cellula, si può anche risolvere il meccanismo di risposta allo stress abiotico6.
Il potenziale per risolvere l'eterogeneità trascrizionale tra i tipi di cellule utilizzando il sequenziamento scRNA dipende dal metodo di isolamento cellulare e dalla piattaforma di sequenziamento. La selezione cellulare attivata dalla fluorescenza (FACS) è una tecnica ampiamente utilizzata per isolare una sottopopolazione di cellule per scRNA-seq basata sulla diffusione della luce e sulle proprietà di fluorescenza delle cellule. Lo sviluppo di linee di marcatori fluorescenti mediante tecnologia transgenica ha notevolmente migliorato l'efficienza dell'isolamento cellulare mediante FACS7. Condurre scRNA-seq usando Smart-seq28 migliora ulteriormente la capacità di sezionare l'eterogeneità cellulare. Il metodo Smart-seq2 ha una buona sensibilità per il rilevamento genico e può rilevare geni anche con un basso input di trascrizione9. Oltre alla raccolta di tipi di cellule di massa, i moderni selezionatori di cellule forniscono un formato di ordinamento dell'indice a singola cellula, consentendo l'analisi del trascrittoma a risoluzione di singola cellula utilizzando Smart-seq210 o altri metodi multiplexed RNA-seq, come CEL-seq211. La selezione a cella singola o a cella può essere potenzialmente utilizzata per molte altre applicazioni a valle, come gli studi multiomici paralleli12,13. Presentato qui è un protocollo robusto e versatile per isolare i tipi di cellule vegetali, come le cellule del periciclo xilematico-polo, le cellule del cappuccio della radice laterale, le cellule iniziali della radice laterale, le cellule della corteccia e le cellule endodermiche dalle radici delle linee cellulari marcatrici di Arabidopsis thaliana mediante FACS. Il protocollo prevede inoltre la costruzione della libreria Smart-seq2 per l'analisi del trascrittoma a valle.
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Protocol
Il seguente protocollo è stato ottimizzato per i semi wild-type ( WT) di A. thaliana senza fluorescenza e linee marcatrici fluorescenti per i seguenti tipi di cellule radicali: cellule del periciclo xilematico-polo (J0121), cellule iniziali della radice laterale, cellule del cappuccio radicale laterale (J3411), cellule dell'endoderma e della corteccia (J0571) (Figura 1A). Tutte le linee marcatrici sono state ottenute da una fonte commerciale (vedi Tabella dei materiali), ad eccezione della linea marcatrice della cella di iniziazione della radice laterale, che è stata generata introducendo un costrutto GFP guidato dal promotore GATA23 in un impianto di Arabidopsis wild-type a seguito di un rapporto precedentemente pubblicato14.
1. Preparazione del materiale vegetale
- Sterilizzare i semi di A. thaliana WT e i semi della linea marcatrice fluorescente incubando i semi in candeggina al 20% in un'incubatrice rotante a temperatura ambiente per 15 minuti.
- Risciacquare i semi in acqua bidistillata (ddH2O) da tre a cinque volte. Eseguire questo passaggio su una panca pulita sterile.
- Placcare i semi WT e reporter line su mezzi Murashige e Skoog (MS) a mezza forza con agar (w/v)15 allo 0,8%. Coltivare le piante verticalmente per 5 giorni (16 h luce a 23 °C) dopo stratificare per 2 giorni a 4 °C.
2. Protoplasting
- Preparare le soluzioni di protopertura2,5, denominate Soluzione A e Soluzione B (vedere Tabella dei materiali).
- Preparare la soluzione A contenente 400 mM di mannitolo, 0,05% BSA, 20 mM MES (pH 5,7), 10 mM CaCl2 e 20 mM KCl (vedere Tabella dei materiali). Conservare la soluzione A a -20 °C per un massimo di 1 mese.
- Preparare la soluzione B aggiungendo l'1% (p/v) di cellulasi R10, l'1% (p/v) di cellulasi RS, l'1% (p/v) di emicellulasi, lo 0,5% (p/v) di pectoliasi e l'1% (p/v) di macerozima R10 in una nuova aliquota della soluzione A. Conservare la soluzione B a -20 °C per un massimo di 1 mese.
- Scongelare delicatamente la soluzione A e la soluzione B sul ghiaccio prima di iniziare l'esperimento.
- Tagliare le radici usando una lama pulita o delle forbici e tagliare le radici in pezzi di ~ 0,5 cm. Immergere le radici in 1,5 ml di soluzione B seguita da una leggera rotazione (a circa 18 giri/min) a temperatura ambiente per 1,5-2 ore.
- Filtrare i protoplasti radicali attraverso la maglia del filtro da 40 μm (vedere la tabella dei materiali).
- Risciacquare la rete del colino con 1-2 mL di soluzione A.
- Unire i liquidi del punto 2.4 e del punto 2.5 e centrifugare a 300 x g per 5 minuti a 4 °C. Scartare il surnatante con una pipetta, risospendere il pellet cellulare in 500-600 μL di soluzione A, quindi metterlo immediatamente sul ghiaccio.
- Trasferire la soluzione cellulare risospesa in una nuova provetta da 5 ml per la selezione delle cellule.
3. Selezione cellulare attivata dalla fluorescenza (FACS)
- Accendere e completare le fasi di configurazione dello strumento sullo smistatore (vedere Tabella dei materiali). Selezionare i canali di fluorescenza, utilizzare un impianto WT (senza fluorescenza) come controllo per determinare la linea di base per l'autofluorescenza e regolare il gate di selezione in base all'intensità di fluorescenza e ai singoletti FSC/SSC (Figura 2).
- Aggiungere 500 μL di soluzione A (fase 2.1.1) in una provetta di raccolta da 1,5 mL per evitare che le cellule vengano danneggiate. Raccogliere 2.000-3.000 cellule per provetta.
- Dopo la cernita, porre immediatamente i campioni su ghiaccio, centrifugare la provetta di raccolta contenente le cellule a 300 x g per 5 minuti a 4 °C e rimuovere il surnatante con una pipetta.
- Prendere 2 μL di cellule selezionate e verificare la fluorescenza utilizzando un microscopio a fluorescenza (vedere Tabella dei materiali).
- Conservare le celle ordinate a -80 °C o utilizzarle immediatamente per la costruzione della libreria (fase 4).
- Per l'ordinamento degli indici a cella singola, inserire la piastra a 96 pozzetti nell'adattatore. Calibrare la posizione della piastra in modo che la goccia cada nel foro centrale della piastra. Selezionare la modalità di ordinamento a cella singola durante l'ordinamento, immettere il numero di celle di destinazione come 1 e avviare l'ordinamento.
4. Preparazione della libreria Smart-seq2
- Come risultato della quantità ultra-bassa di input, eseguire la costruzione di librerie di RNA-seq di tipo a singola cellula in un ambiente privo di contaminazione. Prima di iniziare l'esperimento, pulire il banco con un decontaminante superficiale8 (vedi Tabella dei materiali) e etanolo al 75%.
- Preparare il tampone di lisi (miscela A) (Tabella 1) combinando 0,33 μL di Triton X-100 al 10%, 0,55 μL di inibitore della RNasi e 0,22 μL di 0,1 M DTT (vedere Tabella dei materiali).
- Aggiungere 1 μL di miscela A nel campione selezionato e macinare con un pestello sterile. Il volume del campione preferibile è ≤0,5 μL; utilizzare acqua priva di RNasi per portare il volume a 14 μL. Trasferire ogni singolo campione di cellula in una provetta PCR a parete sottile da 0,2 ml.
- Preparare la miscela B contenente 0,44 μL di oligo-dT 30 VN di primer di reazione a trascrizione inversa (RT) (100 μM) e 4,4 μL di dNTP (10mM) (Tabella 2) (vedere Tabella dei materiali).
- Aggiungere 4,4 μL di miscela B ai 14 μL di campione in ciascuna provetta, pipettare delicatamente per miscelare il campione e incubare il campione a 72 °C per 3 minuti. Dopo l'incubazione, mettere immediatamente i campioni sul ghiaccio per ibridare l'oligo-dT alla coda poli A.
- Preparare la miscela di reazione di trascrizione inversa (miscela C) (Tabella 3) (vedi Tabella dei materiali). Aggiungere 21,6 μL di miscela C a ciascuna provetta contenente i campioni. Accendere il programma RT su uno strumento PCR comune (Tabella 4).
- Eseguire la reazione di preamplificazione su ghiaccio. Preparare la miscela D combinando 44 μL di miscela 2x PCR polimerasi e 0,88 μL di primer IS PCR (10 μM) (Tabella 5) (vedere Tabella dei materiali). Aggiungere 40,8 μL di miscela D ai 40 μL del prodotto di reazione RT ed eseguire il programma di preamplificazione (Tabella 6).
- Purificare i prodotti della reazione di preamplificazione utilizzando le sfere Ampure XP (vedere Tabella dei materiali). Aggiungere 48 μL di perline (rapporto 0,6:1) in ciascun campione del punto 4.7 e mescolare delicatamente i campioni mediante pipettaggio.
- Incubare i campioni a temperatura ambiente per 10 minuti. Posizionare le provette da 1,5 mL contenenti i campioni su un supporto di separazione magnetica per 5 minuti. Scartare con attenzione il surnatante dai campioni senza disturbare le perline.
- Lavare le perle risospendendole in 200 μL di etanolo all'80% e posizionare i campioni sul supporto di separazione magnetica (vedere Tabella dei materiali) per altri 3 minuti prima di scartare il surnatante contenente etanolo.
- Asciugare all'aria i campioni per 10 minuti e coprire il tubo per evitare contaminazioni e contaminazioni incrociate durante l'essiccazione all'aria.
- Risospendere le sfere in 20 μL di ddH2O, incubare i campioni a temperatura ambiente per 5 minuti, quindi posizionarli sul supporto di separazione magnetica per 5 minuti.
- Pipettare 18 μL di surnatante da ciascuna provetta e trasferire i campioni in nuove provette da centrifuga da 1,5 ml. Utilizzare 1 μL del campione per valutare la qualità del cDNA utilizzando un kit di quantificazione del DNA, determinare la distribuzione dimensionale di ciascuna prelibreria utilizzando un analizzatore di frammenti (vedi Tabella dei materiali) e conservare il campione rimanente a -20 °C.
- Costruire una libreria di cDNA8 per il sequenziamento Illumina 16 dal prodotto prelibrary del passo4.13 usando un kit di preparazione della libreria di sequenziamento (vedere Tabella dei materiali).
- Purificare le librerie (dal punto 4.14) usando le perline Ampure XP, quantificare le librerie purificate e determinare la distribuzione delle dimensioni di ciascuna libreria seguendo il passaggio 4.13.
NOTA: Pool uguale nanomoli di ogni libreria, assicurando che nessuno di essi abbia la stessa combinazione di indice Illumina. In caso contrario, le librerie possono essere raggruppate in un rapporto basato sull'output di sequenziamento desiderato e sequenziate insieme sulla stessa corsia del sequencer Illumina. Generalmente, il sequenziamento di ogni libreria a una profondità di 4-6 GB, che produce >10 milioni di letture mappate, fornisce una copertura 20x-30x del genoma di Arabidopsis . Anche profondità di sequenziamento inferiori sono accettabili, ma potrebbero influenzare il significato dell'analisi di espressione differenziale.
5. Analisi dei dati RNA-seq
- Tagliare le letture grezze usando Trim-Galore17 seguito dalla mappatura al genoma di riferimento usando hisat2 18 (daehwankimlab.github.io/hisat2) e rimuovere i frammenti duplicati PCR usando Picard19 (broadinstitute.github.io/picard).
- Eseguire l'elaborazione del conteggio grezzo e la successiva analisi dei geni differenzialmente espressi (DEG) con DESeq220 utilizzando almeno tre repliche biologiche per ciascun campione. Eseguire il clustering dell'espressione genica con il pacchetto Pheatmap e visualizzarlo in una mappa termica di espressione.
NOTA: I valori RPKM (letture per kilobase per milione di letture mappate) dei geni e dei TE (elementi trasponibili) sono stati calcolati con Stringtie18 (github.com/gpertea/stringtie) e visualizzati in un browser del genoma.
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Representative Results
Isolamento del protoplasto
Questo protocollo è efficace per la selezione dei protoplasti delle linee marcatrici fluorescenti delle radici di A. thaliana. Queste linee di marcatori sono state sviluppate dalla fusione di proteine fluorescenti con geni espressi specificamente in tipi di cellule bersaglio, o utilizzando linee trappola enhancer (Figura 1). Numerosi tessuti e organi sono stati sezionati in tipi cellulari che esprimono specifici marcatori fluorescenti in piante e colture modello.
Popolazione FACS, celle ordinate e QC della libreria
Utilizzando una pianta wild-type come porte di controllo e impostazione come forward scatter (FSC) e side scatter (SSC), abbiamo determinato una popolazione importante di cellule di interesse e una linea di base per l'autofluorescenza e ordinato con successo le cellule marcate specifiche per la fluorescenza (Figura 2). La qualità delle librerie di sequenziamento finale (dal punto 4.15) è stata determinata dall'analisi della distribuzione delle dimensioni dei frammenti. I risultati rappresentativi della libreria RNA-seq di circa 2.000 cellule del periciclo xilematico-polo, cellule primordiali della radice laterale, cellule endoderma / corteccia e cellule del cappuccio radicale laterale sono mostrati in Figura 3A-D.
Analisi dei modelli di espressione
La qualità dei dati di sequenziamento può essere valutata da più procedure di analisi, come la profondità di sequenziamento, la velocità di mappatura e i report fastQC. L'accuratezza e la sensibilità dei dati di sequenziamento possono essere dimostrate dalla presenza di una serie di geni arricchiti di tipo cellulare, che possono essere identificati dall'analisi DEG tra tipi cellulari isolati e l'intero tessuto. I geni con livelli di espressione significativamente più elevati in alcuni tipi di cellule possono essere identificati come geni arricchiti di tipo cellulare. Nel frattempo, le viste genoma-browser di ciascun tipo di cellula possono essere confrontate fianco a fianco per mostrare i livelli di espressione dei geni marcatori noti e verificare se il modello di espressione dei geni marcatori può essere ricostruito nei dati di espressione del tipo di cellula. Ad esempio, i geni arricchiti in uno qualsiasi dei quattro tipi di cellule radice sono stati raggruppati e mostrati in heatmap, che ha mostrato la specificità dell'espressione genica tra diversi tipi di cellule (Figura 4). Sono stati esaminati YUCCA3, MYB36, WOX5 e PFA1 e i modelli di espressione erano come previsto secondo i rapporti precedenti21,22,23,24. Le pipeline di analisi dei dati e i dati di sequenziamento grezzi rappresentativi sono disponibili in un repository pubblico (github.com/gaolabsjtu/root_cell_types_RNAseq).
Figura 1: La linea marcatrice specifica del tipo di cellula della preparazione della radice e del protoplasto . (A, sinistra) Introduzione alla linea di trappola del potenziatore e immagini. (A, a destra) Linea dell'indicatore del tipo di cella specifica della radice. b) un'immagine della preparazione del protoplasto prima della cernita. Le barre della scala per la cellula fondatrice della radice laterale, il periciclo, l'endoderma / corteccia, il cappuccio della radice laterale e i protoplasti rappresentano rispettivamente 25 μm, 100 μm, 75 μm e 20 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Istituzione di FACS per specifici tipi di cellule radicali. Esempio di esperimento FACS: (A) la popolazione principale che utilizza SSC e FSC; (B) i gate GFP-positivi (+) e GFP-negativi (−); (C) le immagini in campo chiaro e (D) di fluorescenza delle celle selezionate. La barra della scala rappresenta 50 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Distribuzione dimensionale delle librerie di sequenziamento Smart-seq2. Distribuzioni rappresentative delle dimensioni dei frammenti delle librerie di sequenziamento (dal passo 4.15) generate da cellule del periciclo xilematico-polo (A), cellule primordiali della radice laterale (B), cellule endoderma / corteccia (C) e cellule del cappuccio radicale laterale (D). (E) Una libreria di piccole dimensioni con picchi dimeri primer/adattatori, che possono ancora essere sequenziati dopo la selezione delle dimensioni. (F) Una biblioteca con una distribuzione di dimensioni anomala, che indicava una preparazione della biblioteca non riuscita. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 4: Analisi genica arricchita di tipo cellulare. È stata effettuata un'analisi DEG tra ciascun tipo di cellula e l'intera radice; I geni con una sovraregolazione più di quattro volte in ciascun tipo di cellula sono stati identificati come geni arricchiti di tipo cellulare. Questi geni sono stati combinati, raggruppati e visualizzati nel grafico della mappa di calore (pannello superiore). I geni arricchiti di tipo cellulare includevano molti geni marcatori noti; geni marcatori tipici come YUCCA3, MYB36, WOX5 e PFA1 sono stati scelti per essere mostrati nel browser del genoma (pannello inferiore). Abbreviazioni: LRP = radice laterale primordia; Endo/Cor = endoderma/corteccia; LRC = tappo radicale laterale. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
| Componenti | Volume (μL) |
| 10% Triton X-100 | 0.33 |
| Inibitore della RNasi | 0.55 |
| DTT (0,1 M) | 0.22 |
Tabella 1: Componenti di reazione per la preparazione del tampone di lisi cellulare (miscela A).
| Componenti | Volume (μL) |
| Oligo-dT30VN (100 μM) | 0.44 |
| dNTP (10 mM) | 4.4 |
Tabella 2: Componenti di reazione per la preparazione della miscela B.
| Componenti | Volume (μL) |
| Buffer SuperScript IV (5x) | 8.8 |
| Betaina (5 M) | 8.8 |
| DTT (0,1 M) | 2.2 |
| MgCl2 (1 M) | 0.264 |
| TSO (100 μM) | 0.44 |
| Trascrittasi inversa SuperScript IV (200 U/μL) | 2.2 |
| Inibitore della RNasi | 1.1 |
Tabella 3: Componenti di reazione per la preparazione della miscela PCR a trascrizione inversa (miscela C).
| Ciclo | Temperatura (°C) | Ore |
| 1 | 50 | 90 minuti |
| 2-11 | 55 | 2 minuti |
| 50 | 2 minuti | |
| 12 | 70 | 15 minuti |
| 13 | 4 | ∞ |
Tabella 4: Impostazioni della PCR a trascrizione inversa (RT) per sintetizzare cDNA da mRNA.
| Componenti | Volume (μL) |
| KAPA HiFi HotStart ReadyMix (2x) | 44 |
| Primer IS PCR (10 μM) | 0.88 |
Tabella 5: Componenti di reazione per la preparazione della miscela di reazione di preamplificazione (miscela D).
| Ciclo | Temperatura (°C) | Ore |
| 1 | 98 | 5 minuti |
| 2-13 | 98 | 20 secondi |
| 67 | 30 secondi | |
| 72 | 3 minuti | |
| 14 | 72 | 5 minuti |
| 15 | 4 | ∞ |
Tabella 6: Impostazioni del programma PCR per la reazione di pre-amplificazione.
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Discussion
Il protocollo basato su Smart-seq2 può generare librerie di sequenziamento affidabili da diverse centinaia di celle8. La qualità del materiale di partenza è essenziale per l'accuratezza dell'analisi del trascrittoma. FACS è un potente strumento per la preparazione delle celle di interesse, ma questa procedura, in particolare la fase di protopertura, deve essere ottimizzata per le applicazioni dell'impianto. La microdissezione a cattura laser (LCM) o le cellule sezionate manualmente possono anche essere utilizzate come input25,26, quindi il protocollo fornito qui può potenzialmente essere utilizzato in una varietà di specie vegetali e tipi di cellule con o senza geni marcatori noti.
Preparazione del materiale vegetale
Nella biologia dello sviluppo vegetale, FACS viene solitamente utilizzato per isolare popolazioni cellulari arricchite che esprimono un marcatore fluorescente. Le piante che esprimono un tale marcatore sono protoplasizzate e i protoplasti vengono infine ordinati in sottopopolazioni pure basate sull'espressione del marcatore specifico del tipo cellulare. Pertanto, il segnale del marcatore fluorescente deve essere forte e specifico. Inoltre, il ricercatore dovrebbe verificare quali marcatori possono essere ordinati in anticipo. Il numero di semi necessari dipende dal livello di espressione, da dove viene espresso il marcatore, da quante cellule sono necessarie per le applicazioni a valle e da quante repliche sono ordinate. Se l'espressione è in un singolo tipo di cellula con pochissime cellule per pianta, generalmente è necessario un numero maggiore di piante rispetto a quando il marcatore è espresso in un numero maggiore di cellule. È meglio determinare empiricamente il numero di semi richiesti per le singole linee di marcatori. È particolarmente significativo eseguire esperimenti preliminari con ogni linea marcatrice per ottimizzare la finestra per l'ordinamento e sapere quante celle risulteranno da un numero fisso di piante. Se il materiale sperimentale è costituito da radici, per evitare che le radici affondino nell'agar e per facilitare il taglio delle radici pulite, è possibile posare una maglia opportunamente dimensionata e autoclavata sull'agar contenente terreno prima della placcatura del seme. La stratificazione a bassa temperatura aiuta la germinazione e lo sviluppo dei semi, quindi suggeriamo di stratificare i semi a 4 °C per 2 giorni dopo la sterilizzazione o la placcatura e quindi far crescere le piante verticalmente.
Protoplasting e FACS
La protodurata e lo smistamento 5-6 giorni dopo la stratificazione funzionano bene. La soluzione A e la soluzione B devono essere filtrate utilizzando un filtro da 0,22 μm. Inoltre, la conservazione della soluzione B a -20 °C per periodi di tempo più lunghi riduce l'efficienza degli enzimi. Prima di iniziare, la soluzione A e la soluzione B devono essere delicatamente scongelate sul ghiaccio, che richiede circa 20 minuti. La soluzione B non deve essere agitata, poiché agitare la soluzione B può disturbare gli enzimi e può causare un'eccessiva formazione di bolle. Il lavaggio della rete del filtro con la soluzione A più volte può aumentare il numero di celle ottenute nel passaggio 2.5. Come descritto al punto 2.6, l'intero surnatante non deve essere aspirato, poiché i protoplasti si trovano nella parte inferiore vicino al pellet e non possono essere visti. Prima di selezionare, è meglio assicurarsi che la concentrazione di protoplasti sia di circa 105-10 6 cellule / ml per ottenere una migliore efficienza di selezione. Quando si imposta un nuovo esperimento, lo stesso tessuto dell'impianto WT è richiesto come controllo per l'impostazione del cancello di selezione. Nella fase 3.1, si raccomanda di selezionare prima i canali di fluorescenza (ad esempio, PE e FITC) e utilizzare un campione di controllo per determinare la popolazione principale in base a SSC e FSC. Inoltre, si consiglia di regolare la posizione del gate modificando la tensione del canale di fluorescenza per garantire che il segnale di controllo si trovi a sinistra del gate (cioè, il gruppo negativo si trova al di sotto di 103). Il tempo di selezione deve essere limitato a 30 minuti o meno di 60 minuti per evitare alterazioni nell'espressione genica, che possono verificarsi a causa della protoduratura o della selezione. Dopo la selezione, un piccolo numero di cellule selezionate deve essere raccolto e controllato per la fluorescenza (fase 3.4). Il maggior numero possibile di buffer deve essere rimosso dal surnatante per evitare qualsiasi impatto sulla costruzione della libreria a valle (passaggio 3.3).
Costruzione della libreria RNA-seq
Per la costruzione della libreria RNA-seq, si consiglia di utilizzare le cellule immediatamente dopo l'ordinamento per ridurre la degradazione dell'RNA. Non è consigliabile iniziare con troppe celle, in quanto ciò potrebbe comportare una libreria di scarsa qualità a causa di reazioni inadeguate. Il numero di cicli di PCR nella fase 4.7 e nella fase 4.14 dipende dalla quantità di input di RNA / cDNA. Il numero di cicli può essere aumentato quando c'è meno input o abbassato quando c'è più input. Pertanto, si consiglia di prelevare alcuni dei campioni misti dal passo 4.7 e dal passo 4.14 per eseguire la PCR in tempo reale con la stessa procedura di amplificazione e quindi determinare il numero finale di cicli in base ai risultati della qPCR prima dell'amplificazione formale della prelibreria/libreria. Inoltre, prima della fase di purificazione 4.8, le perle Ampure XP devono essere equilibrate a temperatura ambiente per almeno 10 minuti e poi vorticate bene. Il volume delle perle nella fase di purificazione non deve essere aumentato al di sopra del rapporto 0,8: 1. Altrimenti, ciò aumenterà il riporto dei dimeri di primer. Inoltre, si dovrebbe evitare di asciugare eccessivamente le perline nel passaggio 4.11 per evitare una difficile risospensione. Una pre-biblioteca qualificata dovrebbe avere una dimensione media di circa 1,5-2 kb e una piccola quantità di frammenti brevi (<500 bp). Distribuzioni dimensionali anomale o picchi di dimero di piccole dimensioni nelle librerie sono indicatori di scarsa qualità e questi campioni dovrebbero essere scartati o sottoposti a ulteriori cicli di purificazione delle perle (fase 4.15) (Figura 3E-F).
Limitazioni
Questo protocollo può essere applicato per isolare le cellule da altri tessuti vegetali e altre specie vegetali. Tuttavia, il processo di isolamento cellulare dipende fortemente dalla preparazione dei protoplasti. Alcuni tipi di cellule sono difficili da isolare, come le cellule vascolari e le cellule sessuali femminili, che si trovano all'interno del tessuto e / o sono poche in numero. Per le cellule per le quali è difficile preparare protoplasti, la selezione dei nuclei attivati dalla fluorescenza (FANS)27 è un metodo opzionale che può essere utilizzato. Nel frattempo, l'utilizzo di questo protocollo per ottenere specifici tipi di cellule da FACS dipende dalla disponibilità di linee di marcatori fluorescenti. La mancanza di tali linee marcatrici limita l'uso di questi metodi nelle colture e nelle piante orticole. L'applicazione della tecnologia RNA-seq a singola cellula ad alto rendimento nelle colture rivelerà nuovi geni marcatori specifici del tipo di cellula, che possono essere ulteriormente utilizzati per sviluppare linee di marcatori di tipo cellulare e ampliare la capacità applicativa degli studi RNA-seq e multi-omici di tipo cellulare basati su FACS.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Abbiamo istituito questo protocollo nella struttura multi-omica a cellula singola della School of Agriculture and Biology, Shanghai Jiao Tong University, e siamo stati supportati dalla National Natural Science Foundation of China (Grant No. 32070608), Shanghai Pujiang Program (Grant No. 20PJ1405800) e Shanghai Jiao Tong University (Grant Nos. Agri-X20200202, 2019TPB05).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 µm strainer | Sorfa | 622110 | |
| Agar | Yeasen | 70101ES76 | |
| Agilent fragment analyzer | Aglient | Aglient 5200 | |
| Agilent high-sensitivity DNA kit | Aglient | DNF-474-0500 | |
| Ampure XP beads | BECKMAN | A63881 | |
| Betaine | yuanye | S18046-100g | |
| Bleach | Mr Muscle | FnBn83BK | 20% (v/v) bleach |
| BSA | sigma | 9048-46-8 | |
| CaCl2 | yuanye | S24109-500g | |
| Cellulase R10 | Yakult (Japan) | 9012-54-8 | |
| Cellulase RS | Yakult (Japan) | 9012-54-8 | |
| Centrifuge tube (1.5 mL) | Eppendolf | 30121589 | |
| DNase, RNase, DNA and RNA Away Surface Decontaminants | Beyotime | R0127 | |
| dNTPs (10 mM) | NEB | N0447S | |
| DTT (0.1 M) | invitrogen |
18090050 | |
| Ethanol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 100092680 | |
| FACS | BD FACS Melody | BD-65745 | |
| FACS | Sony | SH800S | |
| Filter tip (1000 µL) | Thermo Scientific | TF112-1000-Q | |
| Filter tip (200 µL) | Thermo Scientific | TF140-200-Q | |
| Filter tip (10 µL) | Thermo Scientific | TF104-10-Q | |
| Filter tip (100 µL) | Thermo Scientific | TF113-100-Q | |
| Fluorescent microscope | Nikon | Eclipse Ni-E | |
| Four-Dimensional Rotating Mixer | Kylin -Bell | BE-1100 | |
| Hemicellulase | sigma | 9025-56-3 | |
| IS PCR primer | 5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG T-3' |
||
| KAPA HiFi HotStart ReadyMix(2X) | Roche | 7958935001 | |
| KCl | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 7447-40-7 | |
| Macerozyme R10 | Yakult (Japan) | 9032-75-1 | |
| Magnetic separation stand | invitrogen | 12321D | |
| Mannitol | aladdin | 69-65-8 | |
| MES | aladdin | 145224948 | |
| MgCl2 | yuanye | R21455-500ml | |
| Microcentrifuges | Eppendorf | Centrifuge 5425 | |
| Micro-mini-centrifuge | Titan | Timi-10k | |
| MS | Phytotech | M519 | |
| Nextera XT DNA Library Preparation Kit | illumina | FC-131-1024 | |
| oligo-dT30VN primer | 5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG TACTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT TTTTTTTTTTVN-3' |
||
| PCR instrument | Thermal cycler | A24811 | |
| Pectolyase | Yakult (Japan) | 9033-35-6 | |
| Plant marker lines | Nottingham Arabidopsis Stock Centre (NASC) | ||
| Qubit 1x dsDNA HS Assay Kit | invitrogen | Q33231 | |
| Qubit 2.0 fluorometer | invitrogen | Q32866 | |
| RNase inhibitor | Thermo Scientific | EO0382 | |
| RNase-free water | invitrogen | 10977023 | |
| Solution A | 400 mM mannitol, 0.05 % BSA , 20 mM MES (pH5.7), 10 mM CaCl2, 20 mM KCl | ||
| Solution B | 1 % (w/v)cellulase R10, 1 % (w/v) cellulase RS, 1 % (w/v)hemicellulase, 0.5 % (w/v)pectolyase and 1 % (w/v) Macerozyme R10 in a fresh aliquot of solution A | ||
| Sterile pestle | BIOTREAT | 453463 | |
| Strainer (40 µm ) | Sorfa | 251100 | |
| SuperScript IV reverse transcriptase (200 U/µL) | invitrogen | 18090050 | |
| SuperScript IV buffer (5x) | invitrogen | 18090050 | |
| Test tube (5 mL) | BD Falcon | 352052 | |
| Thin-walled PCR tubes with caps (0.5 mL) | AXYGEN | PCR-05-C | |
| Triton X-100 | Sangon Biotech | A600198-0500 | |
| TSO primer | 5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG TACATrGrG+G-3' |
||
| Vortex | Titan | VM-T2 |
References
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