La fattibilità e l'efficacia dei metodi scRNA-seq ad alto rendimento annunciano un'era a singola cellula nella ricerca sulle piante. Presentata qui è una procedura robusta e completa per isolare specifici tipi di cellule radice di Arabidopsis thaliana e la successiva costruzione e analisi della libreria di trascrittomi.
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Articolo metodologico
Analisi dell'isolamento e del trascrittoma di tipi di cellule vegetali
In questo articolo
Sommario
Abstract
Negli organismi multicellulari, la programmazione dello sviluppo e le risposte ambientali possono essere altamente divergenti in diversi tipi di cellule o anche all'interno delle cellule, che è noto come eterogeneità cellulare. Negli ultimi anni, l'isolamento di singole cellule e di tipo cellulare combinato con tecniche di sequenziamento di nuova generazione (NGS) sono diventati strumenti importanti per studiare i processi biologici a risoluzione singola cellulare. Tuttavia, isolare le cellule vegetali è relativamente più difficile a causa della presenza di pareti cellulari vegetali, che limita l'applicazione di approcci unicellulari nelle piante. Questo protocollo descrive una solida procedura per l'isolamento basato su cellule singole e cellulari attivate da fluorescenza (FACS) con cellule vegetali, adatta per l'analisi multi-omica a valle e altri studi. Utilizzando le linee marcatrici fluorescenti della radice di Arabidopsis , dimostriamo come particolari tipi di cellule, come le cellule del periciclo xilematico-polo, le cellule iniziali della radice laterale, le cellule del cappuccio radicale laterale, le cellule della corteccia e le cellule endodermiche, sono isolate. Inoltre, viene fornito anche un efficace metodo di analisi del trascrittoma a valle utilizzando Smart-seq2. Il metodo di isolamento cellulare e le tecniche di analisi del trascrittoma possono essere adattati ad altri tipi di cellule e specie vegetali e hanno un ampio potenziale applicativo nella scienza delle piante.
Introduzione
Le cellule sono l'unità fondamentale di tutti gli organismi viventi e svolgono funzioni strutturali e fisiologiche. Sebbene le cellule negli organismi multicellulari mostrino un'apparente sincronicità, cellule di diversi tipi e singole cellule presentano differenze nei loro trascrittomi durante lo sviluppo e le risposte ambientali. Il sequenziamento dell'RNA a singola cellula ad alto rendimento (scRNA-seq) fornisce una potenza senza precedenti per comprendere l'eterogeneità cellulare. L'applicazione di scRNA-seq nelle scienze vegetali ha contribuito a costruire con successo un atlante cellularevegetale 1, è stato utilizzato per identificare tax....
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Protocollo
Il seguente protocollo è stato ottimizzato per i semi wild-type ( WT) di A. thaliana senza fluorescenza e linee marcatrici fluorescenti per i seguenti tipi di cellule radicali: cellule del periciclo xilematico-polo (J0121), cellule iniziali della radice laterale, cellule del cappuccio radicale laterale (J3411), cellule dell'endoderma e della corteccia (J0571) (Figura 1A). Tutte le linee marcatrici sono state ottenute da una fonte commerciale (vedi Tabella dei materiali), ad eccezione della linea marcatrice della cella di iniziazione della radice laterale, che è stata generata introducendo un costrutto GFP guidato....
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Risultati
Isolamento del protoplasto
Questo protocollo è efficace per la selezione dei protoplasti delle linee marcatrici fluorescenti delle radici di A. thaliana. Queste linee di marcatori sono state sviluppate dalla fusione di proteine fluorescenti con geni espressi specificamente in tipi di cellule bersaglio, o utilizzando linee trappola enhancer (Figura 1). Numerosi tessuti e organi sono stati sezionati in tipi cellulari che esprimono specifici marcatori fluorescenti i.......
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Discussione
Il protocollo basato su Smart-seq2 può generare librerie di sequenziamento affidabili da diverse centinaia di celle8. La qualità del materiale di partenza è essenziale per l'accuratezza dell'analisi del trascrittoma. FACS è un potente strumento per la preparazione delle celle di interesse, ma questa procedura, in particolare la fase di protopertura, deve essere ottimizzata per le applicazioni dell'impianto. La microdissezione a cattura laser (LCM) o le cellule sezionate manualmente possono anche e.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Abbiamo istituito questo protocollo nella struttura multi-omica a cellula singola della School of Agriculture and Biology, Shanghai Jiao Tong University, e siamo stati supportati dalla National Natural Science Foundation of China (Grant No. 32070608), Shanghai Pujiang Program (Grant No. 20PJ1405800) e Shanghai Jiao Tong University (Grant Nos. Agri-X20200202, 2019TPB05).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 0,22 µ m filtro | Sorfa | 622110 | |
| Agar | Yeasen | 70101ES76 | |
| Analizzatore di frammenti Agilent | Aglient Aglient 5200 | ||
| Kit DNA ad alta sensibilità Agilent | DNF-474-0500 | ||
| Perline Ampure XP | BECKMAN | A63881 | |
| Betaina | yuanye | S18046-100g | |
| Candeggina | Mr Muscle | FnBn83BK | 20% (v/v) candeggina |
| BSA | sigma | 9048-46-8 | |
| CaCl2 | yuanye | S24109-500g | |
| Cellulase R10 | Yakult (Giappone) | 9012-54-8 | |
| Cellulase RS | Yakult (Giappone) | 9012-54-8 | |
| Provetta da centrifuga (1,5 mL) | Eppendolf | 30121589 | |
| Decontaminanti per superfici lontane da DNasi, RNasi, DNA e RNA | Beyotime | R0127 | |
| dNTP (10 mM) | NEB | N0447S | |
| DTT (0,1 m) | invitrogen | 18090050 | |
| Ethanol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 100092680 | |
| FACS | BD FACS Melody | BD-65745 | |
| FACS | Sony | SH800S | |
| Punta del filtro (1000 µ L) | Thermo Scientific | TF112-1000-Q | |
| Punta filtrante (200 µ L) | Thermo Scientific | TF140-200-Q | |
| Puntale filtrante (10 & micro; L) | Thermo Scientific | TF104-10-Q | |
| Puntale filtrante (100 & micro; L) | Thermo Scientific | TF113-100-Q | |
| Microscopio fluorescente | Nikon | Eclipse Ni-E | |
| Miscelatore rotante quadridimensionale | Kylin -Bell | BE-1100 | |
| Emicellulasi | sigma | 9025-56-3 | |
| IS PCR primer | 5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG T-3'KAPA | ||
| HiFi HotStart ReadyMix( 2X) | Roche | ||
| KCl | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 7447-40-7 | |
| Macerozyme R10 | Yakult (Giappone) | 9032-75-1 | |
| Supporto di separazione magnetica | invitrogen | 12321D | |
| Mannitolo | aladdina | 69-65-8 | |
| MES | aladdin | 145224948 | |
| MgCl2 | yuanye | R21455-500ml | |
| Microcentrifughe | Eppendorf | Centrifuge 5425 | |
| Micro-mini-centrifuga | Titan | Timi-10k | |
| MS | Phytotech | M519 | |
| Nextera XT Kit di preparazione della libreria del DNA | illumina | FC-131-1024 | |
| oligo-dT30VN primer | 5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG TACTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT TTTTTTTTTTVN-3'PCR | ||
| Termociclatore | A24811 | ||
| Pectolyase | Yakult (Giappone) | 9033-35-6 | |
| Linee di marcatura delle piante | Nottingham Arabidopsis Stock Centre (NASC) | ||
| Qubit 1x dsDNA HS Assay Kit | invitrogen | Q33231 | |
| Qubit 2.0 fluorimetro | invitrogen | Q32866 | |
| Inibitore della RNasi | Thermo Scientific | EO0382 | |
| di 10977023 | invertitore | d'acqua senza RNasi | |
| A | 400 mM di mannitolo, 0,05 % BSA, 20 mM di MES (pH5,7), 10 mM di CaCl2, 20 mM di KCl | ||
| Soluzione B | 1 % (p/v)cellulasi R10, 1 % (p/v) cellulasi RS, 1 % (p/v)emicellulasi, 0,5 % (p/v)pectoliasi e 1 % (w/v) Macerozyme R10 in un'aliquota fresca di soluzione A | ||
| Pestello sterile | BIOTREAT | 453463 | |
| Colino (40 &5; m ) | Sorfa | 251100 | |
| Trascrittasi inversa SuperScript IV (200 U/µ L) | invitrogen | 18090050 | |
| tampone SuperScript IV (5x) | invitrogen | 18090050 | |
| Provetta (5 mL) | BD Falcon | 352052 | |
| Provette per PCR a parete sottile con tappi (0,5 mL) | AXYGEN | PCR-05-C | |
| Triton X-100 | Sangon Biotech | A600198-0500 | |
| TSO primer | 5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG TACATrGrG+G-3'Vortex | ||
| Titan | VM-T2 |
Riferimenti
- Zhang, T. -Q., Chen, Y., Liu, Y., Lin, W. -H., Wang, J. -W. Single-cell transcriptome atlas and chromatin accessibility landscape reveal differentiation trajectories in the rice root. Nature Communications. 12 (1), 2053(2021).
- Denyer, T., et al.
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Ristampe e permessi
