Summary
A viabilidade e a eficácia de métodos scRNA-seq de alto rendimento anunciam uma era de célula única na pesquisa de plantas. Apresentamos aqui um procedimento robusto e completo para o isolamento de tipos específicos de células de raízes de Arabidopsis thaliana e posterior construção e análise da biblioteca de transcriptomas.
Abstract
Em organismos multicelulares, a programação do desenvolvimento e as respostas ambientais podem ser altamente divergentes em diferentes tipos celulares ou mesmo dentro das células, o que é conhecido como heterogeneidade celular. Nos últimos anos, o isolamento de célula única e do tipo celular combinado com técnicas de sequenciamento de próxima geração (NGS) tornaram-se ferramentas importantes para o estudo de processos biológicos em resolução de célula única. No entanto, o isolamento de células vegetais é relativamente mais difícil devido à presença de paredes celulares vegetais, o que limita a aplicação de abordagens unicelulares em plantas. Este protocolo descreve um procedimento robusto para o isolamento de células únicas e do tipo celular com células vegetais baseado em classificação celular ativada por fluorescência (FACS), que é adequado para análise multi-ômica a jusante e outros estudos. Usando linhas de marcadores fluorescentes de raízes de Arabidopsis , demonstramos como tipos celulares particulares, tais como células do periciclo xilema-pólo, células iniciais da raiz lateral, células da calota lateral da raiz, células do córtex e células endodérmicas, são isolados. Além disso, um método eficaz de análise do transcriptoma a jusante usando Smart-seq2 também é fornecido. O método de isolamento celular e as técnicas de análise do transcriptoma podem ser adaptados a outros tipos celulares e espécies vegetais e têm amplo potencial de aplicação na ciência vegetal.
Introduction
As células são a unidade fundamental de todos os organismos vivos e desempenham funções estruturais e fisiológicas. Embora as células em organismos multicelulares mostrem aparente sincronicidade, células de diferentes tipos e células individuais apresentam diferenças em seus transcriptomas durante o desenvolvimento e respostas ambientais. O sequenciamento de RNA de célula única de alto rendimento (scRNA-seq) fornece um poder sem precedentes para a compreensão da heterogeneidade celular. A aplicação de scRNA-seq em ciências vegetais tem contribuído para o sucesso na construção de um atlas celular vegetal1, tem sido usado para identificar táxons celulares raros em tecidos vegetais2, tem fornecido informações sobre a composição de tipos celulares em tecidos vegetais, e tem sido usado para identificar a identidade celular e funções importantes empregadas durante o desenvolvimento e diferenciação vegetal. Além disso, é possível inferir trajetórias espaço-temporais de desenvolvimento em tecidosvegetais1,2,3 para descobrir novos genesmarcadores4 e estudar as funções de importantes fatores detranscrição5 usando scRNA-seq, a fim de revelar a conservação evolutiva de um mesmo tipo celular em diferentesplantas3. Os estresses abióticos estão entre as influências ambientais mais importantes sobre o crescimento e desenvolvimento das plantas. Ao explorar as mudanças na composição dos tipos celulares em tecidos vegetais sob diferentes condições de tratamento por meio do sequenciamento do transcriptoma de célula única, pode-se também resolver o mecanismo de resposta abiótica ao estresse6.
O potencial para resolver a heterogeneidade transcricional entre tipos celulares usando o sequenciamento de scRNA depende do método de isolamento celular e da plataforma de sequenciamento. A classificação celular ativada por fluorescência (FACS) é uma técnica amplamente utilizada para isolar uma subpopulação de células para scRNA-seq com base no espalhamento de luz e nas propriedades de fluorescência das células. O desenvolvimento de linhagens de marcadores fluorescentes por tecnologia transgênica melhorou muito a eficiência do isolamento celular pelo FACS7. A realização de scRNA-seq usando Smart-seq28 aumenta ainda mais a capacidade de dissecar a heterogeneidade celular. O método Smart-seq2 tem boa sensibilidade para detecção de genes e pode detectar genes mesmo com uma baixa entrada de transcrito9. Além da coleta de tipos de células em massa, os classificadores de células modernos fornecem um formato de classificação de índice de célula única, permitindo a análise do transcriptoma em resolução de célula única usando Smart-seq210 ou outros métodos de RNA-seq multiplexados como o CEL-seq211. A classificação de célula única ou do tipo célula pode ser potencialmente usada para muitas outras aplicações a jusante, como estudos multi-ômicos paralelos12,13. Apresenta-se aqui um protocolo robusto e versátil para o isolamento de tipos celulares vegetais, tais como células periciclo xilema-pólo, células da calota lateral radicular, células iniciais da raiz lateral, células do córtex e células endodérmicas das raízes de linhagens celulares marcadoras de Arabidopsis thaliana por FACS. O protocolo envolve ainda a construção da biblioteca Smart-seq2 para análise do transcriptoma a jusante.
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Protocol
O seguinte protocolo foi otimizado para sementes de A. thaliana wild-type (WT) sem fluorescência e linhagens fluorescentes para os seguintes tipos de células radiculares: células do periciclo xilema-pólo (J0121), células iniciais da raiz lateral, células da calota lateral (J3411), células da endoderme e do córtex (J0571) (Figura 1A). Todas as linhagens de marcadores foram obtidas de uma fonte comercial (ver Tabela de Materiais), exceto a linha de marcador de célula de iniciação de raiz lateral, que foi gerada pela introdução de uma construção GFP orientada por promotor GATA23 em uma planta de Arabidopsis selvagem após um relatório publicado anteriormente14.
1. Preparação do material vegetal
- Esterilizar as sementes de A. thaliana WT e as sementes da linha de marcadores fluorescentes, incubando-as em água sanitária a 20% em estufa rotativa à temperatura ambiente por 15 min.
- Enxaguar as sementes em água bidestilada (ddH2O) de três a cinco vezes. Execute esta etapa em uma bancada limpa e estéril.
- Plaquear as sementes WT e linhagem repórter em meio Murashige e Skoog (MS) de meia resistência com 0,8% de ágar (p/v)15. Cultivar as plantas verticalmente por 5 dias (16 h de luz a 23 °C) após estratificação por 2 dias a 4 °C.
2. Protoplastificação
- Preparar as soluções de protoplastagem2,5, referidas como Solução A e Solução B (ver Tabela de Materiais).
- Preparar a solução A contendo 400 mM de manitol, 0,05% de BSA, 20 mM de MES (pH 5,7), 10 mM de CaCl2 e 20 mM de KCl (ver Tabela de Materiais). Loja Solução A a -20 °C por até 1 mês.
- Preparar a Solução B adicionando 1% (p/v) celulase R10, 1% (p/v) celulase RS, 1% (p/v) hemicelulase, 0,5% (p/v) pectolyase e 1% (p/v) macerozyme R10 em uma alíquota fresca da Solução A. Armazene a Solução B a -20 °C por até 1 mês.
- Descongelar suavemente a Solução A e a Solução B no gelo antes de iniciar o experimento.
- Corte as raízes usando uma lâmina ou tesoura limpa e pique as raízes em pedaços de ~0,5 cm. Submergir as raízes em 1,5 mL de Solução B, seguido de rotação suave (aproximadamente 18 rpm) à temperatura ambiente por 1,5-2 h.
- Filtrar os protoplastos radiculares através da malha de filtro de 40 μm (ver Tabela de Materiais).
- Enxaguar a malha do filtro com 1-2 mL de solução A.
- Combinar os líquidos dos passos 2.4 e 2.5 e centrifugar a 300 x g durante 5 minutos a 4 °C. Descarte o sobrenadante com uma pipeta, ressuspenda o pellet de célula em 500-600 μL de Solução A e, em seguida, coloque-o no gelo imediatamente.
- Transfira a solução celular ressuspensa para um novo tubo de ensaio de 5 mL para triagem celular.
3. Classificação de células ativadas por fluorescência (FACS)
- Ligue e conclua as etapas de configuração do instrumento no classificador (consulte Tabela de materiais). Selecione os canais de fluorescência, use uma planta WT (sem fluorescência) como controle para determinar a linha de base para autofluorescência e ajuste a porta de classificação com base na intensidade da fluorescência e nos singlets FSC/SSC (Figura 2).
- Adicionar 500 μL da solução A (passo 2.1.1) num tubo de recolha de 1,5 ml para evitar que as células sejam danificadas. Coletar 2.000-3.000 células por tubo.
- Após a triagem, colocar imediatamente as amostras no gelo, centrifugar o tubo de recolha contendo as células a 300 x g durante 5 min a 4 °C e retirar o sobrenadante com uma pipeta.
- Pegue 2 μL de células classificadas e verifique se há fluorescência usando um microscópio de fluorescência (ver Tabela de Materiais).
- Armazene as células classificadas a -80 °C ou use-as imediatamente para a construção da biblioteca (etapa 4).
- Para classificação de índice de célula única, coloque a placa de 96 poços no adaptador. Calibre a posição da placa de modo que a gotícula caia no orifício central da placa. Selecione o modo de classificação de célula única ao classificar, insira o número de destino de células classificadas como 1 e inicie a classificação.
4. Preparação da biblioteca Smart-seq2
- Como resultado da quantidade ultrabaixa de entrada, execute a construção de biblioteca RNA-seq do tipo célula única em um ambiente livre de contaminação. Antes de iniciar o experimento, limpe a bancada com um descontaminante de superfície8 (ver Tabela de Materiais) e etanol 75%.
- Preparar tampão de lise (mistura A) (Tabela 1) combinando 0,33 μL de Triton X-100 a 10%, 0,55 μL de inibidor de RNase e 0,22 μL de TDT 0,1 M (ver Tabela de Materiais).
- Adicionar 1 μL da mistura A à amostra separada e triturar com um pilão estéril. O volume de amostra preferencial é de ≤0,5 μL; usar água livre de RNase para completar o volume para 14 μL. Transfira cada amostra de célula única para um tubo de PCR de paredes finas de 0,2 mL.
- Preparar a mistura B contendo 0,44 μL de oligo-dT30VN de primer de reação de transcrição reversa (RT) (100 μM) e 4,4 μL de dNTPs (10 mM) (Tabela 2) (ver Tabela de Materiais).
- Adicionar 4,4 μL da mistura B aos 14 μL de amostra em cada tubo, pipetar suavemente para misturar a amostra e incubar a amostra a 72 °C durante 3 min. Após a incubação, colocar imediatamente as amostras em gelo para hibridizar o oligo-dT à cauda poli A.
- Preparar a mistura de reação de transcrição reversa (mistura C) (Tabela 3) (ver Tabela de Materiais). Adicionar 21,6 μL de mistura C a cada tubo contendo as amostras. Ligue o programa de TR em um instrumento comum de PCR (Tabela 4).
- Realizar a reação de pré-amplificação no gelo. Preparar a mistura D combinando 44 μL de 2x mistura de polimerase por PCR e 0,88 μL de primer IS PCR (10 μM) (Tabela 5) (ver Tabela de Materiais). Adicionar 40,8 μL da mistura D aos 40 μL do produto da reação de RT e executar o programa de pré-amplificação (Tabela 6).
- Purificar os produtos da reação de pré-amplificação usando contas Ampure XP (ver Tabela de Materiais). Adicionar 48 μL de contas (proporção 0,6:1) em cada amostra do passo 4.7 e misturar suavemente as amostras por pipetagem.
- Incubar as amostras à temperatura ambiente durante 10 min. Colocar os tubos de 1,5 ml que contêm as amostras num suporte de separação magnética durante 5 minutos. Descarte cuidadosamente o sobrenadante das amostras sem perturbar as contas.
- Lave as esferas ressuspendendo-as em 200 μL de etanol 80% e coloque as amostras no suporte de separação magnética (ver Tabela de Materiais) por mais 3 minutos antes de descartar o sobrenadante contendo etanol.
- Seque as amostras ao ar por 10 min e cubra o tubo para evitar contaminação e contaminação cruzada durante a secagem ao ar.
- Ressuspender as esferas em 20 μL de ddH2O, incubar as amostras à temperatura ambiente por 5 min e, em seguida, colocá-las no suporte de separação magnética por 5 min.
- Pipetar 18 μL do sobrenadante de cada tubo e transferir as amostras para novos tubos centrífugos de 1,5 mL. Use 1 μL da amostra para avaliar a qualidade do cDNA usando um kit de quantificação de DNA, determine a distribuição de tamanho de cada pré-biblioteca usando um analisador de fragmentos (ver Tabela de Materiais) e armazene a amostra restante a -20 °C.
- Construa uma biblioteca de cDNA8 para o sequenciamento Illumina 16 a partir do produto da pré-biblioteca da etapa4.13 usando um kit de preparação de biblioteca de sequenciamento (consulte Tabela de Materiais).
- Purifice as bibliotecas (a partir da etapa 4.14) usando as contas Ampure XP, quantifique as bibliotecas purificadas e determine a distribuição de tamanho de cada biblioteca seguindo a etapa 4.13.
NOTA: Agrupe nanomoles iguais de cada biblioteca, garantindo que nenhum deles tenha a mesma combinação de índice Illumina. Caso contrário, as bibliotecas podem ser agrupadas em uma proporção com base na saída de sequenciamento desejada e sequenciadas juntas na mesma faixa do sequenciador Illumina. Geralmente, o sequenciamento de cada biblioteca a uma profundidade de 4-6 GB, o que produz > 10 milhões de leituras mapeadas, fornece cobertura de 20x-30x do genoma de Arabidopsis . Profundidades de sequenciamento mais baixas também são aceitáveis, mas podem afetar a importância da análise de expressão diferencial.
5. Análise dos dados de RNA-seq
- Corte as leituras brutas usando Trim-Galore17 seguido de mapeamento para o genoma de referência usando hisat2 18 (daehwankimlab.github.io/hisat2), e remova os fragmentos duplicados de PCR usando Picard19 (broadinstitute.github.io/picard).
- Realizar o processamento da contagem bruta e posterior análise dos genes diferencialmente expressos (DEG) com DESeq220 utilizando pelo menos três réplicas biológicas para cada amostra. Realizar agrupamento da expressão gênica com o pacote Pheatmap, e visualizar em um heatmap de expressão.
NOTA: Os valores de RPKM (leituras por quilobase por milhão de leituras mapeadas) dos genes e dos TEs (elementos transponíveis) foram calculados com Stringtie18 (github.com/gpertea/stringtie) e visualizados em um navegador de genoma.
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Representative Results
Isolamento de protoplastos
Este protocolo é eficaz para a classificação de protoplastos de linhagens fluorescentes de marcadores radiculares de A. thaliana. Essas linhagens de marcadores foram desenvolvidas pela fusão de proteínas fluorescentes com genes expressos especificamente em tipos celulares alvo, ou usando linhagens de armadilhas intensificadoras (Figura 1). Numerosos tecidos e órgãos foram dissecados em tipos celulares expressando marcadores fluorescentes específicos em plantas-modelo e culturas.
População FACS, células classificadas e QC da biblioteca
Usando uma planta selvagem como controle e estabelecendo comportas como espalhamento frontal (FSC) e dispersão lateral (SSC), determinamos uma grande população de células de interesse e uma linha de base para autofluorescência e classificamos com sucesso as células marcadas específicas por fluorescência (Figura 2). A qualidade das bibliotecas de sequenciamento final (a partir da etapa 4.15) foi determinada pela análise da distribuição de tamanho dos fragmentos. Os resultados representativos da biblioteca RNA-seq de cerca de 2.000 células do periciclo do xilema-pólo, células do primórdio da raiz lateral, células da endoderme/córtex e células da calota lateral da raiz são mostrados na Figura 3A-D.
Análise de padrões de expressão
A qualidade dos dados de sequenciamento pode ser avaliada a partir de vários procedimentos de análise, como profundidade de sequenciamento, taxa de mapeamento e relatórios de fastQC. A acurácia e a sensibilidade dos dados de sequenciamento podem ser demonstradas pela presença de uma série de genes enriquecidos com tipos celulares, que podem ser identificados a partir da análise de DEG entre os tipos celulares isolados e todo o tecido. Genes com níveis de expressão significativamente mais altos em certos tipos celulares podem ser identificados como genes enriquecidos com tipos celulares. Enquanto isso, as visões do genoma de cada tipo de célula podem ser comparadas lado a lado para mostrar os níveis de expressão de genes marcadores conhecidos e testar se o padrão de expressão dos genes marcadores pode ser reconstruído nos dados de expressão do tipo celular. Como exemplo, os genes que são enriquecidos em qualquer um dos quatro tipos celulares radiculares foram agrupados e mostrados no mapa de calor, que mostrou a especificidade da expressão gênica entre os diferentes tipos celulares (Figura 4). YUCCA3, MYB36, WOX5 e PFA1 foram examinados, e os padrões de expressão foram os esperados de acordo com relatos anteriores21,22,23,24. Pipelines de análise de dados e dados brutos representativos de sequenciamento estão disponíveis em um repositório público (github.com/gaolabsjtu/root_cell_types_RNAseq).
Figura 1: Linha de marcadores específicos do tipo celular da preparação da raiz e do protoplasto . (A, esquerda) Introdução e imagens da linha de armadilha Enhancer. (A, à direita) A linha de marcador de tipo de célula específica da raiz. (B) Uma imagem da preparação do protoplasto antes da triagem. As barras de escala para a célula fundadora da raiz lateral, periciclo, endoderme/córtex, calota radicular lateral e protoplastos representam 25 μm, 100 μm, 100 μm, 75 μm e 20 μm, respectivamente. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Estabelecimento do FACS para tipos específicos de células radiculares. Exemplo de um experimento FACS: (A) a população maior usando CSC e FSC; (B) as comportas GFP-positivas (+) e GFP-negativas (−); (C) as imagens de campo claro e (D) imagens de fluorescência das células classificadas. A barra de escala representa 50 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Distribuição de tamanho das bibliotecas de sequenciamento Smart-seq2. Distribuições representativas do tamanho dos fragmentos das bibliotecas de sequenciamento (a partir do passo 4.15) geradas a partir de células do periciclo xilema-pólo (A), células do primórdio da raiz lateral (B), células da endoderme/córtex (C) e células da calota lateral da raiz (D). (E) Uma biblioteca de tamanho pequeno com picos de dímeros de primer/adaptador, que ainda pode ser sequenciada após a seleção de tamanho. (F) Uma biblioteca com uma distribuição de tamanho anormal, o que indicou uma preparação malsucedida da biblioteca. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Análise gênica enriquecida com tipo celular. Uma análise de DEG foi realizada entre cada tipo celular e toda a raiz; Genes com mais de quatro vezes de upregulation em cada tipo celular foram identificados como genes enriquecidos com tipo celular. Esses genes foram combinados, agrupados e visualizados no gráfico do mapa de calor (painel superior). Os genes enriquecidos com tipo celular incluíram muitos genes marcadores conhecidos; genes marcadores típicos como YUCCA3, MYB36, WOX5 e PFA1 foram escolhidos para mostrar no navegador do genoma (painel inferior). Abreviações: LRP = primórdios da raiz lateral; Endo/Cor = endoderme/córtex; LRC = calota radicular lateral. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Componentes | Volume (μL) |
| 10% Tritão X-100 | 0.33 |
| Inibidor de RNase | 0.55 |
| TDT (0,1 M) | 0.22 |
Tabela 1: Componentes da reação para a preparação do tampão de lise celular (mistura A).
| Componentes | Volume (μL) |
| Oligo-dT30VN (100 μM) | 0.44 |
| dNTPs (10 mM) | 4.4 |
Quadro 2: Componentes de reacção para a preparação da mistura B.
| Componentes | Volume (μL) |
| Buffer SuperScript IV (5x) | 8.8 |
| Betaína (5 M) | 8.8 |
| TDT (0,1 M) | 2.2 |
| MgCl2 (1 M) | 0.264 |
| TSO (100 μM) | 0.44 |
| SuperScript IV transcriptase reversa (200 U/μL) | 2.2 |
| Inibidor de RNase | 1.1 |
Tabela 3: Componentes de reação para a preparação da mistura de PCR de transcrição reversa (mistura C).
| Ciclo | Temperatura (°C) | Hora |
| 1 | 50 | 90 minutos |
| 2-11 | 55 | 2 minutos |
| 50 | 2 minutos | |
| 12 | 70 | 15 minutos |
| 13 | 4 | ∞ |
Tabela 4: Configurações de PCR de transcrição reversa (RT) para sintetizar cDNA a partir de mRNA.
| Componentes | Volume (μL) |
| KAPA HiFi HotStart ReadyMix (2x) | 44 |
| Primer IS PCR (10 μM) | 0.88 |
Tabela 5: Componentes de reação para a preparação da mistura de reação pré-amplificação (mistura D).
| Ciclo | Temperatura (°C) | Hora |
| 1 | 98 | 5 minutos |
| 2-13 | 98 | Anos 20 |
| 67 | Anos 30 | |
| 72 | 3 minutos | |
| 14 | 72 | 5 minutos |
| 15 | 4 | ∞ |
Tabela 6: Configurações do programa de PCR para a reação pré-amplificação.
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Discussion
O protocolo baseado em Smart-seq2 pode gerar bibliotecas de sequenciamento confiáveis a partir de várias centenas de células8. A qualidade do material de partida é essencial para a precisão da análise do transcriptoma. O FACS é uma ferramenta poderosa para o preparo de células de interesse, mas este procedimento, especialmente a etapa de protoplast, deve ser otimizado para aplicações em plantas. Microdissecção por captura a laser (LCM) ou células dissecadas manualmente também podem ser usadas comoentrada25,26, de modo que o protocolo aqui fornecido pode potencialmente ser usado em uma variedade de espécies de plantas e tipos celulares com ou sem genes marcadores conhecidos.
Preparo do material vegetal
Em biologia do desenvolvimento vegetal, a FACS é geralmente usada para isolar populações de células enriquecidas expressando um marcador fluorescente. As plantas que expressam tal marcador são protoplastadas, e os protoplastos são eventualmente classificados em subpopulações puras com base na expressão do marcador específico do tipo celular. Portanto, o sinal do marcador fluorescente deve ser forte e específico. Além disso, o pesquisador deve verificar quais marcadores podem ser classificados com antecedência. O número de sementes necessárias depende do nível de expressão, onde o marcador é expresso, quantas células são necessárias para aplicações downstream e quantas réplicas são classificadas. Se a expressão é em um único tipo celular com muito poucas células por planta, geralmente é necessário um número maior de plantas do que se o marcador for expresso em um número maior de células. É melhor determinar empiricamente o número de sementes necessárias para linhas de marcadores individuais. É especialmente significativo realizar experimentos preliminares com cada linha de marcador para otimizar a janela de classificação e saber quantas células resultarão de um número fixo de plantas. Se o material experimental for raízes, para evitar que as raízes afundem no ágar e para facilitar o corte de raízes limpas, uma malha autoclavada e de tamanho adequado pode ser colocada no ágar contendo meio antes do revestimento da semente. A estratificação a baixas temperaturas auxilia na germinação e no desenvolvimento das sementes, por isso sugerimos estratificar as sementes a 4 °C por 2 dias após a esterilização ou plaqueamento e, em seguida, cultivar as plantas verticalmente.
Protoplasting e FACS
Protoplasting e classificação 5-6 dias após a estratificação funcionam bem. A solução A e a solução B devem ser filtradas com filtro de 0,22 μm. Além disso, armazenar a solução B a -20 °C por períodos de tempo mais longos diminui a eficiência das enzimas. Antes de começar, a Solução A e a Solução B devem ser suavemente descongeladas no gelo, o que leva cerca de 20 min. A solução B não deve ser agitada, pois agitar a solução B pode interromper as enzimas e causar formação excessiva de bolhas. A lavagem múltipla da malha do filtro com a Solução A pode aumentar o número de células obtidas na etapa 2.5. Conforme descrito no passo 2.6, todo o sobrenadante não deve ser aspirado, pois os protoplastos estão na parte inferior, perto do pellet, e não podem ser vistos. Antes de classificar, é melhor garantir que a concentração de protoplastos seja de cerca de 105-10 6 células/mL para alcançar uma melhor eficiência de classificação. Ao montar um novo experimento, o mesmo tecido da planta WT é necessário como controle para a configuração da comporta de triagem. Na etapa 3.1, recomenda-se selecionar primeiro os canais de fluorescência (por exemplo, PE e FITC) e usar uma amostra controle para determinar a população principal de acordo com SSC e FSC. Além disso, sugere-se ajustar a posição da porta alterando a tensão do canal de fluorescência para garantir que o sinal de controle esteja localizado à esquerda da porta (ou seja, o grupo negativo está localizado abaixo de 103). O tempo de triagem deve ser limitado a 30 min ou menos de 60 min para evitar alterações na expressão gênica, que podem ocorrer devido à protoplastagem ou triagem. Após a triagem, um pequeno número de células classificadas deve ser coletado e verificado quanto à fluorescência (passo 3.4). Deve ser removido o máximo possível de tampão do sobrenadante para evitar qualquer impacto na construção da biblioteca a jusante (passo 3.3).
Construção da biblioteca RNA-seq
Para a construção da biblioteca RNA-seq, recomendamos o uso de células imediatamente após a triagem para reduzir a degradação do RNA. Não é aconselhável começar com muitas células, pois isso pode resultar em uma biblioteca de baixa qualidade devido a reações inadequadas. O número de ciclos de PCR nas etapas 4.7 e 4.14 depende da quantidade de entrada de RNA/cDNA. O número de ciclos pode ser aumentado quando há menos entrada ou reduzido quando há mais entrada. Portanto, recomenda-se pegar algumas das amostras mistas das etapas 4.7 e 4.14 para executar a PCR em tempo real com o mesmo procedimento de amplificação e, em seguida, determinar o número final de ciclos com base nos resultados da qPCR antes da amplificação formal da pré-biblioteca/biblioteca. Além disso, antes da etapa de purificação 4.8, as contas de Ampure XP devem ser equilibradas à temperatura ambiente por pelo menos 10 min e, em seguida, bem vórtices. O volume de contas na etapa de purificação não deve ser aumentado acima da proporção de 0,8:1. Caso contrário, isso aumentará o transporte de dímeros de primer. Além disso, deve-se evitar o ressecamento excessivo das contas no passo 4.11 para evitar a reuspensão difícil. Uma pré-biblioteca qualificada deve ter um tamanho médio de cerca de 1,5-2 kb e uma pequena quantidade de fragmentos curtos (<500 pb). Distribuições de tamanho anormais ou picos de dímeros de primer/adaptador de tamanho pequeno em bibliotecas são indicadores de baixa qualidade, e essas amostras devem ser descartadas ou submetidas a novas rodadas de purificação de contas (passo 4.15) (Figura 3E-F).
Limitações
Este protocolo pode ser aplicado para isolar células de outros tecidos vegetais e outras espécies vegetais. No entanto, o processo de isolamento celular é altamente dependente da preparação dos protoplastos. Alguns tipos celulares são difíceis de isolar, como as células vasculares e as células sexuais femininas, que estão localizadas no interior do tecido e/ou são em número reduzido. Para células para as quais é difícil preparar protoplastos, a classificação de núcleos ativados por fluorescência (FANS)27 é um método opcional que pode ser usado. Enquanto isso, o uso desse protocolo para obtenção de tipos celulares específicos por FACS depende da disponibilidade de linhagens de marcadores fluorescentes. A falta dessas linhas limita o uso desses métodos em culturas e plantas hortícolas. A aplicação da tecnologia de RNA-seq de célula única de alto rendimento em culturas revelará novos genes marcadores específicos do tipo celular, que podem ser usados para desenvolver linhas de marcadores de tipo celular e ampliar a capacidade de aplicação de estudos de RNA-seq e multi-ômicos baseados em FACS.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Estabelecemos este protocolo na instalação multi-ômica de célula única da Escola de Agricultura e Biologia, Shanghai Jiao Tong University, e fomos apoiados pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (Grant No. 32070608), pelo Shanghai Pujiang Program (Grant No. 20PJ1405800) e pela Shanghai Jiao Tong University (Grant Nos. Agri-X20200202, 2019TPB05).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 µm strainer | Sorfa | 622110 | |
| Agar | Yeasen | 70101ES76 | |
| Agilent fragment analyzer | Aglient | Aglient 5200 | |
| Agilent high-sensitivity DNA kit | Aglient | DNF-474-0500 | |
| Ampure XP beads | BECKMAN | A63881 | |
| Betaine | yuanye | S18046-100g | |
| Bleach | Mr Muscle | FnBn83BK | 20% (v/v) bleach |
| BSA | sigma | 9048-46-8 | |
| CaCl2 | yuanye | S24109-500g | |
| Cellulase R10 | Yakult (Japan) | 9012-54-8 | |
| Cellulase RS | Yakult (Japan) | 9012-54-8 | |
| Centrifuge tube (1.5 mL) | Eppendolf | 30121589 | |
| DNase, RNase, DNA and RNA Away Surface Decontaminants | Beyotime | R0127 | |
| dNTPs (10 mM) | NEB | N0447S | |
| DTT (0.1 M) | invitrogen |
18090050 | |
| Ethanol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 100092680 | |
| FACS | BD FACS Melody | BD-65745 | |
| FACS | Sony | SH800S | |
| Filter tip (1000 µL) | Thermo Scientific | TF112-1000-Q | |
| Filter tip (200 µL) | Thermo Scientific | TF140-200-Q | |
| Filter tip (10 µL) | Thermo Scientific | TF104-10-Q | |
| Filter tip (100 µL) | Thermo Scientific | TF113-100-Q | |
| Fluorescent microscope | Nikon | Eclipse Ni-E | |
| Four-Dimensional Rotating Mixer | Kylin -Bell | BE-1100 | |
| Hemicellulase | sigma | 9025-56-3 | |
| IS PCR primer | 5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG T-3' |
||
| KAPA HiFi HotStart ReadyMix(2X) | Roche | 7958935001 | |
| KCl | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 7447-40-7 | |
| Macerozyme R10 | Yakult (Japan) | 9032-75-1 | |
| Magnetic separation stand | invitrogen | 12321D | |
| Mannitol | aladdin | 69-65-8 | |
| MES | aladdin | 145224948 | |
| MgCl2 | yuanye | R21455-500ml | |
| Microcentrifuges | Eppendorf | Centrifuge 5425 | |
| Micro-mini-centrifuge | Titan | Timi-10k | |
| MS | Phytotech | M519 | |
| Nextera XT DNA Library Preparation Kit | illumina | FC-131-1024 | |
| oligo-dT30VN primer | 5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG TACTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT TTTTTTTTTTVN-3' |
||
| PCR instrument | Thermal cycler | A24811 | |
| Pectolyase | Yakult (Japan) | 9033-35-6 | |
| Plant marker lines | Nottingham Arabidopsis Stock Centre (NASC) | ||
| Qubit 1x dsDNA HS Assay Kit | invitrogen | Q33231 | |
| Qubit 2.0 fluorometer | invitrogen | Q32866 | |
| RNase inhibitor | Thermo Scientific | EO0382 | |
| RNase-free water | invitrogen | 10977023 | |
| Solution A | 400 mM mannitol, 0.05 % BSA , 20 mM MES (pH5.7), 10 mM CaCl2, 20 mM KCl | ||
| Solution B | 1 % (w/v)cellulase R10, 1 % (w/v) cellulase RS, 1 % (w/v)hemicellulase, 0.5 % (w/v)pectolyase and 1 % (w/v) Macerozyme R10 in a fresh aliquot of solution A | ||
| Sterile pestle | BIOTREAT | 453463 | |
| Strainer (40 µm ) | Sorfa | 251100 | |
| SuperScript IV reverse transcriptase (200 U/µL) | invitrogen | 18090050 | |
| SuperScript IV buffer (5x) | invitrogen | 18090050 | |
| Test tube (5 mL) | BD Falcon | 352052 | |
| Thin-walled PCR tubes with caps (0.5 mL) | AXYGEN | PCR-05-C | |
| Triton X-100 | Sangon Biotech | A600198-0500 | |
| TSO primer | 5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG TACATrGrG+G-3' |
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| Vortex | Titan | VM-T2 |
References
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