Summary
La viabilidad y efectividad de los métodos scRNA-seq de alto rendimiento anuncian una era unicelular en la investigación de plantas. Aquí se presenta un procedimiento robusto y completo para aislar tipos específicos de células de raíz de Arabidopsis thaliana y la posterior construcción y análisis de la biblioteca del transcriptoma.
Abstract
En los organismos multicelulares, la programación del desarrollo y las respuestas ambientales pueden ser altamente divergentes en diferentes tipos de células o incluso dentro de las células, lo que se conoce como heterogeneidad celular. En los últimos años, el aislamiento de células individuales y de tipo celular combinado con técnicas de secuenciación de próxima generación (NGS) se han convertido en herramientas importantes para estudiar procesos biológicos a resolución de una sola célula. Sin embargo, aislar las células vegetales es relativamente más difícil debido a la presencia de paredes celulares vegetales, lo que limita la aplicación de enfoques unicelulares en las plantas. Este protocolo describe un procedimiento robusto para el aislamiento de células individuales y de tipo celular activado por fluorescencia (FACS) con células vegetales, que es adecuado para el análisis multiómico posterior y otros estudios. Usando líneas marcadoras fluorescentes de la raíz de Arabidopsis , demostramos cómo se aíslan tipos particulares de células, como las células periciclo del xilema-polo, las células iniciales de la raíz lateral, las células de la tapa de la raíz lateral, las células de la corteza y las células endodérmicas. Además, también se proporciona un método efectivo de análisis de transcriptoma aguas abajo utilizando Smart-seq2. El método de aislamiento celular y las técnicas de análisis del transcriptoma se pueden adaptar a otros tipos de células y especies de plantas y tienen un amplio potencial de aplicación en la ciencia de las plantas.
Introduction
Las células son la unidad fundamental de todos los organismos vivos y realizan funciones estructurales y fisiológicas. Aunque las células en organismos multicelulares muestran una aparente sincronicidad, las células de diferentes tipos y células individuales presentan diferencias en sus transcriptomas durante el desarrollo y las respuestas ambientales. La secuenciación de ARN unicelular de alto rendimiento (scRNA-seq) proporciona una potencia sin precedentes para comprender la heterogeneidad celular. La aplicación de scRNA-seq en ciencias de las plantas ha contribuido a construir con éxito un atlas celularvegetal 1, se ha utilizado para identificar taxones celulares raros en tejidos vegetales2, ha proporcionado información sobre la composición de los tipos de células en los tejidos vegetales y se ha utilizado para identificar la identidad celular y las funciones importantes empleadas durante el desarrollo y la diferenciación de las plantas. Además, es posible inferir trayectorias de desarrollo espaciotemporal en tejidos vegetales 1,2,3 para descubrir nuevos genes marcadores4 y estudiar las funciones de importantes factores de transcripción5 utilizando scRNA-seq con el fin de revelar la conservación evolutiva del mismo tipo celular en diferentes plantas3. El estrés abiótico se encuentra entre las influencias ambientales más importantes en el crecimiento y desarrollo de las plantas. Al explorar los cambios en la composición de los tipos de células en los tejidos vegetales bajo diferentes condiciones de tratamiento a través de la secuenciación del transcriptoma unicelular, también se puede resolver el mecanismo de respuesta al estrés abiótico6.
El potencial para resolver la heterogeneidad transcripcional entre los tipos de células mediante la secuenciación de scRNA depende del método de aislamiento celular y la plataforma de secuenciación. La clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) es una técnica ampliamente utilizada para aislar una subpoblación de células para scRNA-seq basada en la dispersión de la luz y las propiedades de fluorescencia de las células. El desarrollo de líneas marcadoras fluorescentes mediante tecnología transgénica ha mejorado considerablemente la eficiencia del aislamiento celular mediante el sistema de control de los datos sobre el terreno7. La realización de scRNA-seq utilizando Smart-seq28 mejora aún más la capacidad de diseccionar la heterogeneidad celular. El método Smart-seq2 tiene buena sensibilidad para la detección de genes y puede detectar genes incluso con una entrada de transcripción baja9. Además de la recolección masiva de tipos de células, los clasificadores de células modernos proporcionan un formato de clasificación de índice de una sola célula, lo que permite el análisis del transcriptoma a una resolución de una sola célula utilizando Smart-seq210 u otros métodos multiplexados de RNA-seq, como CEL-seq211. La clasificación de una sola célula o de tipo celular puede utilizarse potencialmente para muchas otras aplicaciones posteriores, como los estudios multiómicos paralelos12,13. Aquí se presenta un protocolo robusto y versátil para aislar tipos de células vegetales, como células periciclo xilema-polo, células de la tapa lateral de la raíz, células iniciales de la raíz lateral, células de la corteza y células endodérmicas de las raíces de las líneas celulares marcadoras de Arabidopsis thaliana por FACS. El protocolo implica además la construcción de la biblioteca Smart-seq2 para el análisis del transcriptoma aguas abajo.
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Protocol
El siguiente protocolo se ha optimizado para semillas de tipo salvaje (WT) de A. thaliana sin fluorescencia y líneas marcadoras fluorescentes para los siguientes tipos de células radiculares: células periciclo xilema-polo (J0121), células iniciales de raíz lateral, células de la tapa lateral de la raíz (J3411), endodermis y células de la corteza (J0571) (Figura 1A). Todas las líneas marcadoras se obtuvieron de una fuente comercial (ver Tabla de materiales), excepto la línea de marcador celular de iniciación de la raíz lateral, que se generó mediante la introducción de una construcción GFP impulsada por el promotor GATA23 en una planta de Arabidopsis de tipo silvestre siguiendo un informe previamente publicado14.
1. Preparación del material vegetal
- Esterilice las semillas WT de A. thaliana y las semillas de línea marcador fluorescente incubando las semillas en lejía al 20% en una incubadora giratoria a temperatura ambiente durante 15 min.
- Enjuague las semillas en agua de doble destilación (ddH2O) de tres a cinco veces. Realice este paso en un banco limpio estéril.
- Platea las semillas de la línea WT y reporter en medio Murashige y Skoog (MS) de media fuerza con 0.8% de agar (w / v) 15. Cultivar las plantas verticalmente durante 5 días (16 h de luz a 23 °C) después de estratificar durante 2 días a 4 °C.
2. Protoplasting
- Preparar las soluciones de protoplasting2,5, denominadas Solución A y Solución B (ver Tabla de materiales).
- Prepare la solución A que contenga 400 mM de manitol, 0,05% de BSA, 20 mM de MES (pH 5,7), 10 mM de CaCl2 y 20 mM de KCl (consulte la Tabla de materiales). Guarde la solución A a -20 °C durante un máximo de 1 mes.
- Prepare la solución B añadiendo 1% (p/v) de celulasa R10, 1% (p/v) de celulasa RS, 1% (p/v) de hemicelulasa, 0,5% (p/v) de pectolyasa y 1% (p/v) de macerozima R10 en una nueva alícuota de la solución A. Conservar la solución B a -20 °C durante un máximo de 1 mes.
- Descongele suavemente la solución A y la solución B en hielo antes de comenzar el experimento.
- Corte las raíces con una cuchilla limpia o tijeras, y corte las raíces en trozos de ~0.5 cm. Sumergir las raíces en 1,5 ml de solución B seguido de una rotación suave (a aproximadamente 18 rpm) a temperatura ambiente durante 1,5-2 h.
- Filtre los protoplastos de la raíz a través de la malla del filtro de 40 μm (consulte la Tabla de materiales).
- Enjuague la malla del colador con 1-2 ml de solución A.
- Combinar los líquidos de los pasos 2.4 y 2.5, y centrifugar a 300 x g durante 5 min a 4 °C. Deseche el sobrenadante con una pipeta, resuspenda el pellet celular en 500-600 μL de solución A y luego colóquelo en hielo inmediatamente.
- Transfiera la solución celular resuspendida a un nuevo tubo de ensayo de 5 ml para la clasificación celular.
3. Clasificación celular activada por fluorescencia (FACS)
- Encienda y finalice los pasos de configuración del instrumento en el clasificador (consulte Tabla de materiales). Seleccione los canales de fluorescencia, use una planta WT (sin fluorescencia) como control para determinar la línea de base para la autofluorescencia y ajuste la puerta de clasificación en función de la intensidad de fluorescencia y los singletes FSC / SSC (Figura 2).
- Añadir 500 μL de solución A (paso 2.1.1) en un tubo colector de 1,5 ml para evitar que las células se dañen. Recolectar 2,000-3,000 células por tubo.
- Después de la clasificación, colocar inmediatamente las muestras en hielo, centrifugar el tubo de recolección que contiene las células a 300 x g durante 5 min a 4 °C y retirar el sobrenadante con una pipeta.
- Tome 2 μL de células clasificadas y verifique la fluorescencia con un microscopio de fluorescencia (consulte la Tabla de materiales).
- Almacene las celdas ordenadas a -80 °C o utilícelas inmediatamente para la construcción de bibliotecas (paso 4).
- Para la clasificación de índices de una sola celda, coloque la placa de 96 pocillos en el adaptador. Calibre la posición de la placa para que la gota caiga en el orificio central de la placa. Seleccione el modo de ordenación de una sola celda al ordenar, introduzca el número objetivo de celdas ordenadas como 1 y comience a ordenar.
4. Preparación de la biblioteca Smart-seq2
- Como resultado de la cantidad ultra baja de entrada, realice la construcción de una biblioteca RNA-seq de tipo unicelular en un ambiente libre de contaminación. Antes de comenzar el experimento, limpie el banco con un descontaminante superficial8 (consulte la Tabla de materiales) y etanol al 75%.
- Preparar tampón de lisis (mezcla A) (Tabla 1) combinando 0,33 μL de Tritón X-100 al 10%, 0,55 μL de inhibidor de la RNasa y 0,22 μL de DTT 0,1 M (ver Tabla de materiales).
- Añadir 1 μL de mezcla A en la muestra clasificada y moler con un mortero estéril. El volumen de muestra preferible es ≤0,5 μL; use agua libre de RNasa para completar el volumen a 14 μL. Transfiera cada muestra de una sola célula a un tubo de PCR de pared delgada de 0,2 ml.
- Preparar la mezcla B que contenga 0,44 μL de cebador de reacción de transcripción inversa (RT) oligo-dT30VN (100 μM) y 4,4 μL de dNTPs (10 mM) (Tabla 2) (ver Tabla de materiales).
- Añadir 4,4 μL de mezcla B a los 14 μL de muestra en cada tubo, pipetear suavemente para mezclar la muestra e incubar la muestra a 72 °C durante 3 min. Después de la incubación, ponga inmediatamente las muestras en hielo para hibridar el oligo-dT a la cola poli A.
- Prepare la mezcla de reacción de transcripción inversa (mezcla C) (Tabla 3) (ver Tabla de materiales). Añadir 21,6 μL de mezcla C a cada tubo que contenga las muestras. Activar el programa RT en un instrumento de PCR común (Tabla 4).
- Realizar la reacción de preamplificación sobre hielo. Preparar la mezcla D combinando 44 μL de 2x mezcla de PCR polimerasa y 0,88 μL de cebador IS PCR (10 μM) (Tabla 5) (ver Tabla de materiales). Agregue 40.8 μL de mezcla D a los 40 μL de producto de reacción RT y ejecute el programa de preamplificación (Tabla 6).
- Purificar los productos de reacción de preamplificación utilizando perlas Ampure XP (ver Tabla de materiales). Añadir 48 μL de perlas (proporción 0,6:1) en cada muestra del paso 4.7 y mezclar suavemente las muestras mediante pipeteo.
- Incubar las muestras a temperatura ambiente durante 10 min. Coloque los tubos de 1,5 ml que contienen las muestras en un soporte de separación magnética durante 5 minutos. Deseche cuidadosamente el sobrenadante de las muestras sin alterar las cuentas.
- Lave las perlas resuspendiéndolas en 200 μL de etanol al 80% y coloque las muestras en el soporte de separación magnética (consulte la Tabla de materiales) durante otros 3 minutos antes de desechar el sobrenadante que contiene etanol.
- Seque al aire las muestras durante 10 minutos y cubra el tubo para evitar la contaminación y la contaminación cruzada durante el secado al aire.
- Vuelva a suspender las perlas en 20 μL deddH2O, incubar las muestras a temperatura ambiente durante 5 min y, a continuación, colóquelas en el soporte de separación magnética durante 5 min.
- Pipetear 18 μL del sobrenadante de cada tubo y transferir las muestras a nuevos tubos centrífugos de 1,5 ml. Utilice 1 μL de la muestra para evaluar la calidad del ADNc utilizando un kit de cuantificación de ADN, determine la distribución de tamaño de cada prebiblioteca utilizando un analizador de fragmentos (consulte la Tabla de materiales) y almacene la muestra restante a -20 °C.
- Construya una biblioteca de ADNc8 para la secuenciación 16 de Illumina a partir del producto de prebiblioteca del paso4.13 utilizando un kit de preparación de biblioteca de secuenciación (consulte Tabla de materiales).
- Purificar las bibliotecas (del paso 4.14) utilizando las cuentas de Ampure XP, cuantificar las bibliotecas purificadas y determinar la distribución de tamaño de cada biblioteca siguiendo el paso 4.13.
NOTA: Agrupe nanomoles iguales de cada biblioteca, asegurándose de que ninguno de ellos tenga la misma combinación del índice Illumina. De lo contrario, las bibliotecas se pueden agrupar en una proporción basada en la salida de secuenciación deseada y secuenciar juntas en el mismo carril del secuenciador Illumina. En general, la secuenciación de cada biblioteca a una profundidad de 4-6 GB, lo que produce >10 millones de lecturas mapeadas, proporciona una cobertura de 20x-30x del genoma de Arabidopsis . Las profundidades de secuenciación más bajas también son aceptables, pero podrían afectar la importancia del análisis de expresión diferencial.
5. Análisis de datos RNA-seq
- Recorte las lecturas sin procesar usando Trim-Galore17 seguido de mapeo al genoma de referencia usando hisat2 18 (daehwankimlab.github.io/hisat2), y elimine los fragmentos duplicados de PCR usando Picard19 (broadinstitute.github.io/picard).
- Realizar el procesamiento del recuento bruto y posterior análisis de los genes expresados diferencialmente (DEG) con DESeq220 utilizando al menos tres réplicas biológicas para cada muestra. Realice la agrupación de la expresión génica con el paquete Pheatmap y visualice en un mapa de calor de expresión.
NOTA: Los valores RPKM (lecturas por kilobase por millón de lecturas mapeadas) de los genes y los TEs (elementos transponibles) se calcularon con Stringtie18 (github.com/gpertea/stringtie) y se visualizaron en un navegador de genoma.
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Representative Results
Aislamiento de protoplastos
Este protocolo es efectivo para la clasificación de protoplastos de líneas marcadoras de raíces fluorescentes de A. thaliana. Estas líneas marcadoras se han desarrollado mediante la fusión de proteínas fluorescentes con genes expresados específicamente en tipos de células diana, o mediante el uso de líneas de trampa potenciadoras (Figura 1). Numerosos tejidos y órganos se han diseccionado en tipos de células que expresan marcadores fluorescentes específicos en plantas y cultivos modelo.
Población FACS, células ordenadas y control de calidad de biblioteca
Mediante el uso de una planta de tipo silvestre como control y puertas de ajuste como la dispersión directa (FSC) y la dispersión lateral (SSC), determinamos una población importante de células de interés y una línea de base para la autofluorescencia y clasificamos con éxito las células marcadas específicas de fluorescencia (Figura 2). La calidad de las bibliotecas de secuenciación final (del paso 4.15) se determinó mediante el análisis de distribución de tamaño de fragmento. Los resultados representativos de la biblioteca RNA-seq de aproximadamente 2.000 células periciclo de xilema-polo, células primordia de raíz lateral, células de endodermis / corteza y células de la tapa de la raíz lateral se muestran en la Figura 3A-D.
Análisis de patrones de expresión
La calidad de los datos de secuenciación se puede evaluar a partir de múltiples procedimientos de análisis, como la profundidad de secuenciación, la tasa de mapeo y los informes fastQC. La precisión y sensibilidad de los datos de secuenciación se puede demostrar por la presencia de una serie de genes enriquecidos con tipo celular, que se pueden identificar a partir del análisis DEG entre tipos de células aisladas y todo el tejido. Los genes con niveles de expresión significativamente más altos en ciertos tipos de células pueden identificarse como genes enriquecidos con tipo celular. Mientras tanto, las vistas del navegador del genoma de cada tipo de célula se pueden comparar una al lado de la otra para mostrar los niveles de expresión de los genes marcadores conocidos y probar si el patrón de expresión de los genes marcadores se puede reconstruir en los datos de expresión del tipo celular. Como ejemplo, los genes que están enriquecidos en cualquiera de los cuatro tipos de células raíz se agruparon y se mostraron en el mapa de calor, que mostró la especificidad de la expresión génica entre diferentes tipos de células (Figura 4). Se examinaron YUCCA3, MYB36, WOX5 y PFA1, y los patrones de expresión fueron los esperados según informes anteriores21,22,23,24. Las canalizaciones de análisis de datos y los datos representativos de secuenciación sin procesar están disponibles en un repositorio público (github.com/gaolabsjtu/root_cell_types_RNAseq).
Figura 1: La línea de marcador de tipo celular específico de la preparación de la raíz y el protoplasto . (A, izquierda) Introducción e imágenes de la línea de trampa del potenciador. (A, derecha) La línea de marcador de tipo de celda específica de la raíz. (B) Una imagen de la preparación del protoplasto antes de la clasificación. Las barras de escala para la célula fundadora de la raíz lateral, el periciclo, la endodermis / corteza, la tapa lateral de la raíz y los protoplastos representan 25 μm, 100 μm, 100 μm, 75 μm y 20 μm, respectivamente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Establecimiento de FACS para tipos específicos de células radiculares. Ejemplo de un experimento del sistema de control de los bienes sobre el terreno: A) la población principal que utiliza la CSS y la FSC; (B) las puertas GFP-positivo (+) y GFP-negativo (-); (C) las imágenes de campo claro y (D) fluorescencia de las células clasificadas. La barra de escala representa 50 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Distribución del tamaño de las bibliotecas de secuenciación Smart-seq2. Distribuciones representativas del tamaño de los fragmentos de las bibliotecas de secuenciación (del paso 4.15) generadas a partir de células periciclo xilema-polo (A), células primordios de raíz lateral (B), células endodermis/corteza (C) y células de la tapa radicular lateral (D). (E) Una biblioteca de tamaño pequeño con picos de dímero de cebador/adaptador, que aún se pueden secuenciar después de la selección de tamaño. (F) Una biblioteca con una distribución de tamaño anormal, que indicó una preparación infructuosa de la biblioteca. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Análisis de genes enriquecidos con tipo celular. Se realizó un análisis DEG entre cada tipo de célula y toda la raíz; Los genes con una regulación positiva de más de cuatro veces en cada tipo de célula se identificaron como genes enriquecidos con el tipo de célula. Estos genes se combinaron, agruparon y visualizaron en el gráfico del mapa de calor (panel superior). Los genes enriquecidos con el tipo de célula incluían muchos genes marcadores conocidos; se eligieron genes marcadores típicos como YUCCA3, MYB36, WOX5 y PFA1 para mostrarlos en el navegador del genoma (panel inferior). Abreviaturas: LRP = primordios de raíz lateral; Endo/Cor = endodermis/corteza; LRC = tapa lateral de la raíz. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Componentes | Volumen (μL) |
| 10% Triton X-100 | 0.33 |
| Inhibidor de la RNasa | 0.55 |
| TDT (0,1 m) | 0.22 |
Tabla 1: Componentes de reacción para la preparación del tampón de lisis celular (mezcla A).
| Componentes | Volumen (μL) |
| Oligo-dT30VN (100 μM) | 0.44 |
| dNTPs (10 mM) | 4.4 |
Tabla 2: Componentes de reacción para la preparación de la mezcla B.
| Componentes | Volumen (μL) |
| Búfer SuperScript IV (5x) | 8.8 |
| Betaína (5 m) | 8.8 |
| TDT (0,1 m) | 2.2 |
| MgCl2 (1 m) | 0.264 |
| TSO (100 μM) | 0.44 |
| Transcriptasa inversa SuperScript IV (200 U/μL) | 2.2 |
| Inhibidor de la RNasa | 1.1 |
Tabla 3: Componentes de reacción para la preparación de la mezcla de PCR con transcripción inversa (mezcla C).
| Ciclo | Temperatura (°C) | Hora |
| 1 | 50 | 90 minutos |
| 2-11 | 55 | 2 minutos |
| 50 | 2 minutos | |
| 12 | 70 | 15 minutos |
| 13 | 4 | ∞ |
Tabla 4: Configuración de PCR con transcripción inversa (RT) para sintetizar ADNc a partir de ARNm.
| Componentes | Volumen (μL) |
| KAPA HiFi HotStart ReadyMix (2x) | 44 |
| Imprimación IS PCR (10 μM) | 0.88 |
Tabla 5: Componentes de reacción para la preparación de la mezcla de reacción de preamplificación (mezcla D).
| Ciclo | Temperatura (°C) | Hora |
| 1 | 98 | 5 minutos |
| 2-13 | 98 | 20 s |
| 67 | 30 s | |
| 72 | 3 minutos | |
| 14 | 72 | 5 minutos |
| 15 | 4 | ∞ |
Tabla 6: Configuración del programa de PCR para la reacción de preamplificación.
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Discussion
El protocolo basado en Smart-seq2 puede generar bibliotecas de secuenciación fiables a partir de varios cientos de celdas8. La calidad del material de partida es esencial para la precisión del análisis del transcriptoma. FACS es una herramienta poderosa para preparar células de interés, pero este procedimiento, especialmente el paso de protoplasting , debe optimizarse para aplicaciones de plantas. La microdisección de captura láser (LCM) o las células diseccionadas manualmente también se pueden usar como entrada25,26, por lo que el protocolo proporcionado aquí puede usarse potencialmente en una variedad de especies de plantas y tipos de células con o sin genes marcadores conocidos.
Preparación del material vegetal
En biología del desarrollo vegetal, el FACS se utiliza generalmente para aislar poblaciones de células enriquecidas que expresan un marcador fluorescente. Las plantas que expresan tal marcador son protoplastadas, y los protoplastos finalmente se clasifican en subpoblaciones puras basadas en la expresión del marcador específico del tipo de célula. Por lo tanto, la señal del marcador fluorescente debe ser fuerte y específica. Además, el investigador debe verificar qué marcadores se pueden clasificar de antemano. El número de semillas necesarias depende del nivel de expresión, dónde se expresa el marcador, cuántas células se necesitan para aplicaciones posteriores y cuántas réplicas se clasifican. Si la expresión es en un solo tipo de célula con muy pocas células por planta, generalmente se necesita un mayor número de plantas que si el marcador se expresa en un mayor número de células. Es mejor determinar empíricamente el número de semillas requeridas para las líneas marcadoras individuales. Es especialmente significativo realizar experimentos preliminares con cada línea de marcador para optimizar la ventana para la clasificación y saber cuántas células resultarán de un número fijo de plantas. Si el material experimental son raíces, para evitar que las raíces se hundan en el agar y para facilitar el corte de raíces limpias, se puede colocar una malla de tamaño adecuado y esterilizada en autoclave sobre el agar que contiene el medio antes del recubrimiento de semillas. La estratificación a baja temperatura ayuda a la germinación y el desarrollo de las semillas, por lo que sugerimos estratificar las semillas a 4 ° C durante 2 días después de esterilizar o emplatar y luego cultivar las plantas verticalmente.
Protoplasting y FACS
El protoplasting y la clasificación 5-6 días después de la estratificación funcionan bien. La solución A y la solución B deben filtrarse con un filtro de 0,22 μm. Además, el almacenamiento de la solución B a -20 °C durante períodos de tiempo más largos disminuye la eficiencia de las enzimas. Antes de comenzar, la solución A y la solución B deben descongelarse suavemente en hielo, lo que tarda unos 20 minutos. La solución B no debe agitarse, ya que agitar la solución B puede alterar las enzimas y puede causar una formación excesiva de burbujas. Lavar la malla del filtro con la solución A varias veces puede aumentar el número de células obtenidas en el paso 2.5. Como se describe en el paso 2.6, no se debe aspirar todo el sobrenadante, ya que los protoplastos están en la parte inferior cerca del pellet y no se pueden ver. Antes de clasificar, es mejor asegurarse de que la concentración de protoplastos sea de aproximadamente 105-10 6 células/ml para lograr una mejor eficiencia de clasificación. Al configurar un nuevo experimento, se requiere el mismo tejido de la planta WT como control para configurar la compuerta de clasificación. En el paso 3.1, se recomienda seleccionar primero los canales de fluorescencia (por ejemplo, PE y FITC) y usar una muestra de control para determinar la población principal de acuerdo con SSC y FSC. Además, se sugiere ajustar la posición de la puerta cambiando el voltaje del canal de fluorescencia para garantizar que la señal de control se encuentre a la izquierda de la puerta (es decir, el grupo negativo se encuentra por debajo de 103). El tiempo de clasificación debe limitarse a 30 min o menos de 60 min para evitar alteraciones en la expresión génica, que pueden ocurrir debido a la protoplasting o la clasificación. Después de la clasificación, se debe recolectar un pequeño número de células clasificadas y verificar la fluorescencia (paso 3.4). Se debe eliminar la mayor cantidad posible de búfer del sobrenadante para evitar cualquier impacto en la construcción de la biblioteca aguas abajo (paso 3.3).
Construcción de la biblioteca RNA-seq
Para la construcción de la biblioteca RNA-seq, recomendamos usar células inmediatamente después de la clasificación para reducir la degradación del ARN. No es aconsejable comenzar con demasiadas células, ya que esto puede resultar en una biblioteca de mala calidad debido a reacciones inadecuadas. El número de ciclos de PCR en los pasos 4.7 y 4.14 depende de la cantidad de entrada de ARN/ADNc. El número de ciclos se puede aumentar cuando hay menos entrada o disminuir cuando hay más entrada. Por lo tanto, se recomienda tomar algunas de las muestras mixtas del paso 4.7 y el paso 4.14 para ejecutar la PCR en tiempo real con el mismo procedimiento de amplificación y luego determinar el número final de ciclos en función de los resultados de la qPCR antes de la amplificación formal de la prebiblioteca/biblioteca. Además, antes del paso de purificación 4.8, las perlas Ampure XP deben equilibrarse a temperatura ambiente durante al menos 10 minutos y luego enrojecerse bien. El volumen de perlas en el paso de purificación no debe aumentarse por encima de la proporción de 0.8: 1. De lo contrario, esto aumentará el arrastre de dímeros de imprimación. Además, se debe evitar el secado excesivo de las perlas en el paso 4.11 para evitar una resuspensión difícil. Una prebiblioteca calificada debe tener un tamaño promedio de aproximadamente 1.5-2 kb y una pequeña cantidad de fragmentos cortos (<500 pb). Las distribuciones de tamaño anormales o los picos de dímero de imprimación/adaptador de tamaño pequeño en las bibliotecas son indicadores de mala calidad, y estas muestras deben descartarse o someterse a rondas adicionales de purificación de perlas (paso 4.15) (Figura 3E-F).
Limitaciones
Este protocolo se puede aplicar para aislar células de otros tejidos vegetales y otras especies de plantas. Sin embargo, el proceso de aislamiento celular depende en gran medida de la preparación de los protoplastos. Algunos tipos de células son difíciles de aislar, como las células vasculares y las células sexuales femeninas, que se encuentran en el interior del tejido y / o son pocas en número. Para las células para las que es difícil preparar protoplastos, la clasificación de núcleos activados por fluorescencia (FANS)27 es un método opcional que se puede utilizar. Mientras tanto, el uso de este protocolo para obtener tipos celulares específicos por FACS depende de la disponibilidad de líneas marcadoras fluorescentes. La falta de tales líneas de marcador limita el uso de estos métodos en cultivos y plantas hortícolas. La aplicación de la tecnología RNA-seq unicelular de alto rendimiento en cultivos revelará nuevos genes marcadores específicos de tipo celular, que pueden utilizarse aún más para desarrollar líneas marcadoras de tipo celular y ampliar la capacidad de aplicación de los estudios multiómicos y de ARN-seq de tipo celular basados en FACS.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Establecimos este protocolo en la instalación multiómica unicelular de la Escuela de Agricultura y Biología de la Universidad Jiao Tong de Shanghai, y contamos con el apoyo de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Subvención No. 32070608), el Programa Pujiang de Shanghai (Subvención No. 20PJ1405800) y la Universidad Jiao Tong de Shanghai (Subvención No. Agri-X20200202, 2019TPB05).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 µm strainer | Sorfa | 622110 | |
| Agar | Yeasen | 70101ES76 | |
| Agilent fragment analyzer | Aglient | Aglient 5200 | |
| Agilent high-sensitivity DNA kit | Aglient | DNF-474-0500 | |
| Ampure XP beads | BECKMAN | A63881 | |
| Betaine | yuanye | S18046-100g | |
| Bleach | Mr Muscle | FnBn83BK | 20% (v/v) bleach |
| BSA | sigma | 9048-46-8 | |
| CaCl2 | yuanye | S24109-500g | |
| Cellulase R10 | Yakult (Japan) | 9012-54-8 | |
| Cellulase RS | Yakult (Japan) | 9012-54-8 | |
| Centrifuge tube (1.5 mL) | Eppendolf | 30121589 | |
| DNase, RNase, DNA and RNA Away Surface Decontaminants | Beyotime | R0127 | |
| dNTPs (10 mM) | NEB | N0447S | |
| DTT (0.1 M) | invitrogen |
18090050 | |
| Ethanol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 100092680 | |
| FACS | BD FACS Melody | BD-65745 | |
| FACS | Sony | SH800S | |
| Filter tip (1000 µL) | Thermo Scientific | TF112-1000-Q | |
| Filter tip (200 µL) | Thermo Scientific | TF140-200-Q | |
| Filter tip (10 µL) | Thermo Scientific | TF104-10-Q | |
| Filter tip (100 µL) | Thermo Scientific | TF113-100-Q | |
| Fluorescent microscope | Nikon | Eclipse Ni-E | |
| Four-Dimensional Rotating Mixer | Kylin -Bell | BE-1100 | |
| Hemicellulase | sigma | 9025-56-3 | |
| IS PCR primer | 5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG T-3' |
||
| KAPA HiFi HotStart ReadyMix(2X) | Roche | 7958935001 | |
| KCl | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 7447-40-7 | |
| Macerozyme R10 | Yakult (Japan) | 9032-75-1 | |
| Magnetic separation stand | invitrogen | 12321D | |
| Mannitol | aladdin | 69-65-8 | |
| MES | aladdin | 145224948 | |
| MgCl2 | yuanye | R21455-500ml | |
| Microcentrifuges | Eppendorf | Centrifuge 5425 | |
| Micro-mini-centrifuge | Titan | Timi-10k | |
| MS | Phytotech | M519 | |
| Nextera XT DNA Library Preparation Kit | illumina | FC-131-1024 | |
| oligo-dT30VN primer | 5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG TACTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT TTTTTTTTTTVN-3' |
||
| PCR instrument | Thermal cycler | A24811 | |
| Pectolyase | Yakult (Japan) | 9033-35-6 | |
| Plant marker lines | Nottingham Arabidopsis Stock Centre (NASC) | ||
| Qubit 1x dsDNA HS Assay Kit | invitrogen | Q33231 | |
| Qubit 2.0 fluorometer | invitrogen | Q32866 | |
| RNase inhibitor | Thermo Scientific | EO0382 | |
| RNase-free water | invitrogen | 10977023 | |
| Solution A | 400 mM mannitol, 0.05 % BSA , 20 mM MES (pH5.7), 10 mM CaCl2, 20 mM KCl | ||
| Solution B | 1 % (w/v)cellulase R10, 1 % (w/v) cellulase RS, 1 % (w/v)hemicellulase, 0.5 % (w/v)pectolyase and 1 % (w/v) Macerozyme R10 in a fresh aliquot of solution A | ||
| Sterile pestle | BIOTREAT | 453463 | |
| Strainer (40 µm ) | Sorfa | 251100 | |
| SuperScript IV reverse transcriptase (200 U/µL) | invitrogen | 18090050 | |
| SuperScript IV buffer (5x) | invitrogen | 18090050 | |
| Test tube (5 mL) | BD Falcon | 352052 | |
| Thin-walled PCR tubes with caps (0.5 mL) | AXYGEN | PCR-05-C | |
| Triton X-100 | Sangon Biotech | A600198-0500 | |
| TSO primer | 5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG TACATrGrG+G-3' |
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| Vortex | Titan | VM-T2 |
References
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