Summary
Genomförbarheten och effektiviteten av scRNA-seq-metoder med hög genomströmning förebådar en encellsera i växtforskning. Här presenteras en robust och komplett procedur för att isolera specifika Arabidopsis thaliana rotcellstyper och efterföljande transkriptombibliotekskonstruktion och analys.
Abstract
I flercelliga organismer kan utvecklingsprogrammering och miljösvar vara mycket divergerande i olika celltyper eller till och med inom celler, vilket är känt som cellulär heterogenitet. Under de senaste åren har isolering av encells- och celltyp i kombination med nästa generations sekvenseringstekniker (NGS) blivit viktiga verktyg för att studera biologiska processer med encellsupplösning. Att isolera växtceller är emellertid relativt svårare på grund av närvaron av växtcellväggar, vilket begränsar tillämpningen av encelliga metoder i växter. Detta protokoll beskriver en robust procedur för fluorescensaktiverad cellsortering (FACS)-baserad encells- och celltypisolering med växtceller, vilket är lämpligt för nedströms multi-omics-analys och andra studier. Med hjälp av Arabidopsis rotfluorescerande markörlinjer demonstrerar vi hur specifika celltyper, såsom xylem-pole pericycle-celler, laterala rotinitialceller, laterala rotlockceller, cortexceller och endodermala celler, isoleras. Dessutom tillhandahålls en effektiv nedströms transkriptomanalysmetod med Smart-seq2. Cellisoleringsmetoden och transkriptomanalysteknikerna kan anpassas till andra celltyper och växtarter och har bred tillämpningspotential inom växtvetenskap.
Introduction
Celler är den grundläggande enheten för alla levande organismer och utför strukturella och fysiologiska funktioner. Även om cellerna i flercelliga organismer visar uppenbar synkronicitet, uppvisar celler av olika typer och enskilda celler skillnader i deras transkriptom under utveckling och miljösvar. High-throughput single-cell RNA-sekvensering (scRNA-seq) ger oöverträffad kraft för att förstå cellulär heterogenitet. Tillämpning av scRNA-seq inom växtvetenskap har bidragit till att framgångsrikt konstruera en växtcellatlas1, har använts för att identifiera sällsynta cellulära taxa i växtvävnader2, har gett insikt i sammansättningen av celltyper i växtvävnader och har använts för att identifiera cellulär identitet och viktiga funktioner som används under växtutveckling och differentiering. Dessutom är det möjligt att härleda spatiotemporala utvecklingsbanor i växtvävnader 1,2,3 för att upptäcka nya markörgener4 och studera funktionerna hos viktiga transkriptionsfaktorer 5 med hjälp av scRNA-seq för att avslöja det evolutionära bevarandet av samma celltyp i olika växter 3. Abiotiska påfrestningar är bland de viktigaste miljöpåverkan på växttillväxt och utveckling. Genom att utforska förändringarna i sammansättningen av celltyper i växtvävnader under olika behandlingsförhållanden genom encellstranskriptomsekvensering kan man också lösa den abiotiska stressresponsmekanismen6.
Potentialen för att lösa transkriptionell heterogenitet mellan celltyper med scRNA-sekvensering beror på cellisoleringsmetoden och sekvenseringsplattformen. Fluorescensaktiverad cellsortering (FACS) är en allmänt använd teknik för att isolera en subpopulation av celler för scRNA-seq baserat på ljusspridning och cellernas fluorescensegenskaper. Utvecklingen av fluorescerande markörlinjer med transgen teknik har avsevärt förbättrat effektiviteten av cellisolering med FACS7. Att genomföra scRNA-seq med Smart-seq28 förbättrar ytterligare förmågan att dissekera den cellulära heterogeniteten. Smart-seq2-metoden har god känslighet för gendetektion och kan detektera gener även med låg transkriptingång9. Förutom insamling av bulkcelltyp tillhandahåller moderna cellsorterare ett sorteringsformat för encellsindex, vilket möjliggör transkriptomanalys vid encellsupplösning med Smart-seq210 eller andra multiplexerade RNA-seq-metoder, såsom CEL-seq211. Sortering av encells- eller celltyp kan potentiellt användas för många andra nedströmsapplikationer, såsom parallella multi-omics-studier12,13. Här presenteras ett robust och mångsidigt protokoll för att isolera växtcelltyper, såsom xylem-pole pericykelceller, laterala rotlockceller, laterala rotinitialceller, cortexceller och endodermala celler från rötterna till Arabidopsis thaliana markörcellinjer av FACS. Protokollet innefattar vidare att konstruera Smart-seq2-biblioteket för transkriptomanalys nedströms.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Följande protokoll har optimerats för A. thaliana vildtypsfrön (WT) utan fluorescens och fluorescerande markörlinjer för följande rotcellstyper: xylempoliska pericykelceller (J0121), laterala rotinitialceller, laterala rotlockceller (J3411), endodermis och cortexceller (J0571) (figur 1A). Alla markörlinjer erhölls från en kommersiell källa (se materialförteckning), förutom den laterala rotinitieringscellmarkörlinjen, som genererades genom att införa en GATA23-promotordriven GFP-konstruktion i en Arabidopsis-växt av vildtyp efter en tidigare publicerad rapport14.
1. Beredning av växtmaterialet
- Sterilisera A. thaliana WT-frön och fluorescerande markörlinjefrön genom att inkubera fröna i 20% blekmedel i en roterande inkubator vid rumstemperatur i 15 minuter.
- Skölj fröna i dubbeldestillerat vatten (ddH2O) tre till fem gånger. Utför detta steg på en steril ren bänk.
- Platta WT- och reporterlinjefrön på halvstyrka Murashige och Skoog (MS) medium med 0,8% agar (w / v) 15. Odla plantorna vertikalt i 5 dagar (16 timmar ljus vid 23 °C) efter skiktning i 2 dagar vid 4 °C.
2. Protoplastning
- Bered protoblastlösningarna2,5, benämnda lösning A och lösning B (se materialtabell).
- Bered lösning A innehållande 400 mM mannitol, 0,05 % BSA, 20 mM MES (pH 5,7), 10 mMCaCl2 och 20 mM KCl (se materialtabell). Förvara lösning A vid -20 °C i upp till 1 månad.
- Bered lösning B genom att tillsätta 1 % (vikt/volym) cellulas R10, 1 % (vikt/volym) cellulas RS, 1 % (vikt/volym) hemicellulas, 0,5 % (vikt/volym) pektolyas och 1 % (vikt/volym) makroenzym R10 i en ny alikvot av lösning A. Förvara lösning B vid −20 °C i upp till 1 månad.
- Tina försiktigt lösning A och lösning B på is innan experimentet påbörjas.
- Skär av rötterna med ett rent blad eller sax och hacka rötterna i ~ 0,5 cm bitar. Sänk ner rötterna i 1,5 ml lösning B följt av mild rotation (vid cirka 18 rpm) vid rumstemperatur i 1,5-2 timmar.
- Filtrera rotprotoplasterna genom 40 μm silnätet (se Materialförteckning).
- Skölj silnätet med 1-2 ml lösning A.
- Kombinera vätskorna i steg 2.4 och steg 2.5 och centrifugera vid 300 x g i 5 minuter vid 4 °C. Kassera supernatanten med en pipett, suspendera cellpelleten igen i 500-600 μL lösning A och lägg den sedan omedelbart på is.
- Överför den återsuspenderade celllösningen till ett nytt 5 ml provrör för cellsortering.
3. Fluorescensaktiverad cellsortering (FACS)
- Slå på och slutför instrumentinställningsstegen på sorteraren (se Materialförteckning). Välj fluorescenskanaler, använd en WT-anläggning (ingen fluorescens) som kontroll för att bestämma baslinjen för autofluorescens och justera sorteringsgrinden baserat på fluorescensintensiteten och FSC/SSC-singletter (figur 2).
- Tillsätt 500 μl lösning A (steg 2.1.1) i ett 1,5 ml uppsamlingsrör för att förhindra att cellerna skadas. Samla 2 000-3 000 celler per rör.
- Efter sortering läggs proverna omedelbart på is, centrifugerar uppsamlingsröret med cellerna vid 300 x g i 5 minuter vid 4 °C och avlägsnar supernatanten med en pipett.
- Ta 2 μL sorterade celler och kontrollera fluorescens med hjälp av ett fluorescensmikroskop (se materialförteckning).
- Förvara de sorterade cellerna vid −80 °C eller använd dem omedelbart för biblioteksbygge (steg 4).
- För encellsindexsortering placerar du 96-brunnsplattan i adaptern. Kalibrera plattans position så att droppen faller i plattans mitthål. Välj sorteringsläge för en cell vid sortering, ange målantalet sorterade celler som 1 och börja sortera.
4. Smart-seq2 biblioteksförberedelse
- Som ett resultat av den extremt låga mängden ingång, utför encellstyp RNA-seq-bibliotekskonstruktion i en kontamineringsfri miljö. Innan du börjar experimentet, rengör bänken med en ytdekontaminant8 (se materialförteckning) och 75% etanol.
- Bered lysbuffert (blandning A) (tabell 1) genom att kombinera 0,33 μl 10% Triton X-100, 0,55 μL RNas-hämmare och 0,22 μL 0,1 M DTT (se materialtabell).
- Tillsätt 1 μl blandning A i det sorterade provet och mal med en steril mortelstöt. Den föredragna provvolymen är ≤0,5 μl; använd RNasfritt vatten för att fylla volymen till 14 μl. Överför varje enskilt cellprov till ett 0,2 ml tunnväggigt PCR-rör.
- Bered blandning B innehållande 0,44 μl oligo-dT30 VN reaktionsprimer (RT) reaktionsprimer (100 μM) och 4,4 μl dNTP (10mM) (tabell 2) (se materialtabell).
- Tillsätt 4,4 μl blandning B till 14 μl prov i varje rör, pipettera försiktigt för att blanda provet och inkubera provet vid 72 °C i 3 minuter. Efter inkubation, lägg omedelbart proverna på is för att hybridisera oligo-dT till poly A-svansen.
- Bered reaktionsblandningen med omvänd transkription (blandning C) (tabell 3) (se materialtabell). Tillsätt 21,6 μl blandning C till varje rör som innehåller proverna. Slå på RT-programmet på ett vanligt PCR-instrument (tabell 4).
- Utför förförstärkningsreaktionen på is. Bered blandning D genom att kombinera 44 μL 2x PCR-polymerasblandning och 0,88 μL IS PCR-primer (10 μM) (tabell 5) (se materialtabell). Tillsätt 40,8 μl blandning D till 40 μL RT-reaktionsprodukt och kör förförstärkningsprogrammet (tabell 6).
- Rena föramplifieringsreaktionsprodukterna med Ampure XP-pärlor (se materialförteckning). Tillsätt 48 μL pärlor (förhållandet 0,6:1) i varje prov från steg 4.7 och blanda proverna försiktigt genom pipettering.
- Inkubera proverna vid rumstemperatur i 10 minuter. Placera 1,5 ml rören som innehåller proverna på ett magnetiskt separationsstativ i 5 minuter. Kassera försiktigt supernatanten från proverna utan att störa pärlorna.
- Tvätta pärlorna genom att återsuspendera dem i 200 μl 80 % etanol och placera proverna på det magnetiska separationsstället (se materialtabell) i ytterligare 3 minuter innan du kasserar den etanolinnehållande supernatanten.
- Lufttorka proverna i 10 minuter och täck över röret för att förhindra kontaminering och korskontaminering under lufttorkningen.
- Suspendera pärlorna på nytt i 20 μlddH2O, inkubera proverna vid rumstemperatur i 5 minuter och placera dem sedan på magnetseparationsstället i 5 minuter.
- Pipettera ut 18 μl av supernatanten från varje rör och överför proverna till nya 1,5 ml centrifugrör. Använd 1 μL av provet för att bedöma kvaliteten på cDNA med hjälp av ett DNA-kvantifieringskit, bestäm storleksfördelningen för varje förbibliotek med hjälp av en fragmentanalysator (se materialtabell) och lagra det återstående provet vid −20 °C.
- Konstruera ett cDNA-bibliotek8 för Illumina-sekvensering 16 från förbiblioteksprodukten i steg4.13 med hjälp av ett sekvenseringsbiblioteksberedningssats (se materialförteckning).
- Rena biblioteken (från steg 4.14) med hjälp av Ampure XP-pärlorna, kvantifiera de renade biblioteken och bestäm storleksfördelningen för varje bibliotek enligt steg 4.13.
OBS: Samla lika nanomol i varje bibliotek, vilket säkerställer att ingen av dem har samma kombination av Illumina-index. Annars kan biblioteken samlas i ett förhållande baserat på önskad sekvenseringsutgång och sekvenseras tillsammans på samma körfält som Illumina-sekvenseraren. I allmänhet ger sekvensering av varje bibliotek till ett djup på 4-6 GB, vilket ger >10 miljoner mappade läsningar, 20x-30x täckning av Arabidopsis-genomet . Lägre sekvenseringsdjup är också acceptabla men kan påverka betydelsen av differentialuttrycksanalysen.
5. RNA-seq dataanalys
- Trimma de råa läsningarna med Trim-Galore17 följt av mappning till referensgenomet med hisat2 18 (daehwankimlab.github.io/hisat2) och ta bort PCR-duplicerade fragment med Picard19 (broadinstitute.github.io/picard).
- Utför råräkningsbearbetning och efterföljande analys av de differentiellt uttryckta generna (DEG) med DESeq220 med användning av minst tre biologiska replikat för varje prov. Utför klustring av genuttrycket med Pheatmap-paketet och visualisera i en uttrycksvärmekarta.
RPKM-värdena (reads per kilobase per million mapped reads) för generna och TEs (transposable elements) beräknades med Stringtie18 (github.com/gpertea/stringtie) och visualiserades i en genombläddrare.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Protoplast isolering
Detta protokoll är effektivt för protoplastsortering av fluorescerande A. thaliana rotmarkörlinjer. Dessa markörlinjer har utvecklats genom fusion av fluorescerande proteiner med gener som uttrycks specifikt i målcelltyper, eller med hjälp av förstärkare fälllinjer (figur 1). Många vävnader och organ har dissekerats i celltyper som uttrycker specifika fluorescerande markörer i modellväxter och grödor.
FACS-population, sorterade celler och bibliotek QC
Genom att använda en vildtypsväxt som kontroll- och inställningsgrindar som framåtspridning (FSC) och sidospridning (SSC) bestämde vi en stor population av celler av intresse och en baslinje för autofluorescens och sorterade framgångsrikt de fluorescensspecifika markerade cellerna (figur 2). Kvaliteten på de slutliga sekvenseringsbiblioteken (från steg 4.15) bestämdes av fragmentstorleksfördelningsanalysen. De representativa resultaten av RNA-seq-biblioteket med cirka 2 000 xylempolska pericykelceller, laterala rotprimordiaceller, endodermis/cortexceller och laterala rotlockceller visas i figur 3A-D.
Analys av uttrycksmönster
Kvaliteten på sekvenseringsdata kan utvärderas från flera analysprocedurer, till exempel sekvenseringsdjup, kartläggningshastighet och fastQC-rapporter. Noggrannheten och känsligheten hos sekvenseringsdata kan demonstreras genom närvaron av en serie anrikade gener av celltyp, som kan identifieras från DEG-analysen mellan isolerade celltyper och hela vävnaden. Gener med signifikant högre uttrycksnivåer i vissa celltyper kan identifieras som cellberikade gener. Under tiden kan genomwebbläsarvyerna för varje celltyp jämföras sida vid sida för att visa uttrycksnivåerna för kända markörgener och testa om markörgenernas uttrycksmönster kan rekonstrueras i celltypsuttrycksdata. Som ett exempel grupperades generna som är anrikade i någon av de fyra rotcellstyperna och visades i värmekarta, vilket visade specificiteten av genuttryck bland olika celltyper (figur 4). YUCCA3, MYB36, WOX5 och PFA1 undersöktes, och uttrycksmönstren var som förväntat enligt tidigare rapporter21,22,23,24. Dataanalyspipelines och representativa råsekvenseringsdata är tillgängliga i en offentlig lagringsplats (github.com/gaolabsjtu/root_cell_types_RNAseq).
Figur 1: Den specifika celltypsmarkörlinjen för rot- och protoplastberedning . (A, vänster) Introduktion och bilder för Enhancer-traplinjen. (A, höger) Rotens specifika markörlinje för celltyp. (B) En bild av protoplastberedningen före sortering. Skalstängerna för den laterala rotgrundarcellen, pericykeln, endodermis/cortex, laterala rotkapslar och protoplaster representerar 25 μm, 100 μm, 100 μm, 75 μm respektive 20 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Upprättande av FACS för specifika rotcellstyper. Exempel på ett FACS-experiment: (A) den större populationen som använder SSC och FSC; b) GFP-positiva (+) och GFP-negativa (−) grindar. (C) ljusfältet och (D) fluorescensbilder av de sorterade cellerna. Skalstapeln representerar 50 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Storleksfördelning för Smart-seq2-sekvenseringsbibliotek. Representativa fragmentstorleksfördelningar för sekvenseringsbiblioteken (från steg 4.15) genererade från xylempoliga pericykelceller (A), laterala rotprimordiaceller (B), endodermis/cortexceller (C) och laterala rotlockceller (D). (E) Ett litet bibliotek med primer-/adapterdimertoppar, som fortfarande kan sekvenseras efter storleksval. (F) Ett bibliotek med en onormal storleksfördelning, vilket indikerade misslyckad biblioteksförberedelse. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Celltypberikad genanalys. En DEG-analys utfördes mellan varje celltyp och hela roten; Gener med mer än fyrfaldig uppreglering i varje celltyp identifierades som celltypberikade gener. Dessa gener kombinerades, grupperades och visualiserades i värmekartan (övre panelen). De celltypberikade generna inkluderade många kända markörgener; typiska markörgener som YUCCA3, MYB36, WOX5 och PFA1 valdes för att visas i genombläddraren (nedre panelen). Förkortningar: LRP = lateral root primordia; Endo/Cor = endodermis/cortex; LRC = lateral rotlock. Klicka här för att se en större version av denna figur.
| Komponenter | Volym (μL) |
| 10% Triton X-100 | 0.33 |
| RNashämmare | 0.55 |
| DTT (0,1 M) | 0.22 |
Tabell 1: Reaktionskomponenter för beredning av celllysbufferten (blandning A).
| Komponenter | Volym (μL) |
| Oligo-dT30VN (100 μM) | 0.44 |
| dNTP (10 mM) | 4.4 |
Tabell 2: Reaktionskomponenter för beredning av blandning B.
| Komponenter | Volym (μL) |
| SuperScript IV-buffert (5x) | 8.8 |
| Betain (5 m) | 8.8 |
| DTT (0,1 M) | 2.2 |
| MgCl2 (1 M) | 0.264 |
| TSO (100 μM) | 0.44 |
| SuperScript IV omvänt transkriptas (200 E/μL) | 2.2 |
| RNashämmare | 1.1 |
Tabell 3: Reaktionskomponenter för beredning av PCR-blandningen med omvänd transkription (blandning C).
| Cykel | Temperatur (°C) | Tid |
| 1 | 50 | 90 minuter |
| 2-11 | 55 | 2 minuter |
| 50 | 2 minuter | |
| 12 | 70 | 15 minuter |
| 13 | 4 | ∞ |
Tabell 4: PCR-inställningar för omvänd transkription (RT) för syntetisering av cDNA från mRNA.
| Komponenter | Volym (μL) |
| KAPA HiFi HotStart ReadyMix (2x) | 44 |
| IS PCR-primer (10 μM) | 0.88 |
Tabell 5: Reaktionskomponenter för beredning av reaktionsblandningen före amplifiering (blandning D).
| Cykel | Temperatur (°C) | Tid |
| 1 | 98 | 5 minuter |
| 2-13 | 98 | 20 sekunder |
| 67 | 30 sekunder | |
| 72 | 3 minuter | |
| 14 | 72 | 5 minuter |
| 15 | 4 | ∞ |
Tabell 6: PCR-programinställningar för förförstärkningsreaktionen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det Smart-seq2-baserade protokollet kan generera tillförlitliga sekvenseringsbibliotek från flera hundra celler8. Utgångsmaterialets kvalitet är avgörande för transkriptomanalysens noggrannhet. FACS är ett kraftfullt verktyg för att förbereda celler av intresse, men denna procedur, särskilt protoplastionssteget, måste optimeras för växtapplikationer. Laserinfångningsmikrodissektion (LCM) eller manuella dissekerade celler kan också användas som ingång25,26, så protokollet som tillhandahålls här kan potentiellt användas i en mängd olika växtarter och celltyper med eller utan kända markörgener.
Framställning av växtmaterialet
I växtutvecklingsbiologi används FACS vanligtvis för att isolera anrikade cellpopulationer som uttrycker en fluorescerande markör. Växterna som uttrycker en sådan markör protoplasteras, och protoplasterna sorteras så småningom i rena delpopulationer baserat på uttrycket av den celltypspecifika markören. Därför måste signalen från den fluorescerande markören vara stark och specifik. Dessutom bör forskaren kontrollera vilka markörer som kan sorteras i förväg. Antalet frön som behövs beror på uttrycksnivån, var markören uttrycks, hur många celler som behövs för nedströmsapplikationer och hur många replikat som sorteras. Om uttrycket är i en enda celltyp med mycket få celler per planta, behövs i allmänhet ett större antal växter än om markören uttrycks i ett högre antal celler. Det är bäst att empiriskt bestämma antalet frön som krävs för enskilda markörlinjer. Det är särskilt meningsfullt att utföra preliminära experiment med varje markörlinje för att optimera fönstret för sortering och veta hur många celler som kommer att bli resultatet av ett fast antal växter. Om försöksmaterialet är rötter, för att förhindra att rötterna sjunker ner i agarn och för att underlätta skärningen av rena rötter, kan ett lämpligt stort och autoklaverat nät läggas på den mediuminnehållande agaren före fröpläteringen. Lågtemperaturstratifiering hjälper frögroning och utveckling, så vi föreslår att fröna stratifieras vid 4 ° C i 2 dagar efter sterilisering eller plätering och sedan växer växterna vertikalt.
Protoplasting och FACS
Protoplasting och sortering 5-6 dagar efter stratifiering fungerar bra. Lösning A och lösning B måste filtreras med en sil på 0,22 μm. Dessutom minskar lagring av lösning B vid −20 °C under längre tidsperioder enzymernas effektivitet. Innan du börjar ska lösning A och lösning B tinas försiktigt på is, vilket tar cirka 20 minuter. Lösning B får inte skakas, eftersom skakning av lösning B kan störa enzymerna och orsaka överdriven bubbelbildning. Att tvätta silnätet med lösning A flera gånger kan öka antalet celler som erhållits i steg 2.5. Som beskrivs i steg 2.6 bör hela supernatanten inte aspireras, eftersom protoplasterna är längst ner nära pelleten och inte kan ses. Före sortering är det bäst att säkerställa att koncentrationen av protoplaster är ca 10 5-10 6 celler/ml för att uppnå bättre sorteringseffektivitet. När du sätter upp ett nytt experiment krävs samma vävnad från WT-anläggningen som en kontroll för att ställa in sorteringsporten. I steg 3.1 rekommenderas att först välja fluorescenskanaler (t.ex. PE och FITC) och använda ett kontrollprov för att bestämma huvudpopulationen enligt SSC och FSC. Dessutom föreslås att man justerar grindens position genom att ändra spänningen på fluorescenskanalen för att säkerställa att styrsignalen är placerad till vänster om grinden (dvs den negativa gruppen ligger under 103). Sorteringstiden måste begränsas till 30 min eller mindre än 60 min för att förhindra förändringar i genuttryck, som kan uppstå på grund av protoblastering eller sortering. Efter sortering ska ett litet antal sorterade celler samlas in och kontrolleras för fluorescens (steg 3.4). Så mycket buffert som möjligt bör tas bort från supernatanten för att undvika påverkan på bibliotekskonstruktionen nedströms (steg 3.3).
Konstruktion av RNA-seq-biblioteket
För konstruktion av RNA-seq-biblioteket rekommenderar vi att man använder celler omedelbart efter sortering för att minska nedbrytningen av RNA. Det är inte tillrådligt att börja med för många celler, eftersom det kan leda till ett bibliotek av dålig kvalitet på grund av otillräckliga reaktioner. Antalet PCR-cykler i steg 4.7 och steg 4.14 beror på den ingående mängden RNA/cDNA. Antalet cykler kan ökas när det finns mindre inmatning eller sänkas när det finns mer inmatning. Därför rekommenderas att ta några av de blandade proverna från steg 4.7 och steg 4.14 för att köra realtids-PCR med samma amplifieringsprocedur och sedan bestämma det slutliga antalet cykler baserat på resultaten från qPCR före den formella förstärkningen av förbiblioteket/biblioteket. Dessutom, före reningssteg 4.8, måste Ampure XP-pärlorna balanseras vid rumstemperatur i minst 10 minuter och sedan virvlas väl. Volymen av pärlor i reningssteget bör inte ökas över förhållandet 0,8: 1. Annars kommer detta att öka överföringen av primerdimerer. Dessutom bör man undvika att övertorka pärlorna i steg 4.11 för att förhindra svår resuspension. Ett kvalificerat förbibliotek bör ha en genomsnittlig storlek på cirka 1,5-2 kb och en liten mängd korta (<500 bp) fragment. Onormala storleksfördelningar eller små primer/adapterdimertoppar i bibliotek är indikatorer på dålig kvalitet, och dessa prover bör kasseras eller genomgå ytterligare omgångar av pärlrening (steg 4.15) (figur 3E-F).
Begränsningar
Detta protokoll kan tillämpas för att isolera celler från andra växtvävnader och andra växtarter. Cellisoleringsprocessen är emellertid starkt beroende av beredningen av protoplasterna. Vissa celltyper är svåra att isolera, såsom vaskulära celler och kvinnliga könsceller, som finns i vävnadens inre och/eller är få till antalet. För celler för vilka det är svårt att framställa protoplaster är fluorescensaktiverad kärnsortering (FANS)27 en valfri metod som kan användas. Under tiden beror användningen av detta protokoll för att erhålla specifika celltyper av FACS på tillgängligheten av fluorescerande markörlinjer. Bristen på sådana markörlinjer begränsar användningen av dessa metoder i grödor och trädgårdsväxter. Tillämpningen av single-cell RNA-seq-teknik med hög kapacitet i grödor kommer att avslöja nya celltypspecifika markörgener, som kan användas vidare för att utveckla markörlinjer av celltyp och bredda applikationsförmågan för FACS-baserade RNA-seq- och multi-omics-studier av celltyp.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Vi satte upp detta protokoll i encellsanläggningen för multi-omics vid School of Agriculture and Biology, Shanghai Jiao Tong University, och stöddes av National Natural Science Foundation of China (Grant No. 32070608), Shanghai Pujiang Program (Grant No. 20PJ1405800) och Shanghai Jiao Tong University (Grant Nos. Agri-X20200202, 2019TPB05).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 µm strainer | Sorfa | 622110 | |
| Agar | Yeasen | 70101ES76 | |
| Agilent fragment analyzer | Aglient | Aglient 5200 | |
| Agilent high-sensitivity DNA kit | Aglient | DNF-474-0500 | |
| Ampure XP beads | BECKMAN | A63881 | |
| Betaine | yuanye | S18046-100g | |
| Bleach | Mr Muscle | FnBn83BK | 20% (v/v) bleach |
| BSA | sigma | 9048-46-8 | |
| CaCl2 | yuanye | S24109-500g | |
| Cellulase R10 | Yakult (Japan) | 9012-54-8 | |
| Cellulase RS | Yakult (Japan) | 9012-54-8 | |
| Centrifuge tube (1.5 mL) | Eppendolf | 30121589 | |
| DNase, RNase, DNA and RNA Away Surface Decontaminants | Beyotime | R0127 | |
| dNTPs (10 mM) | NEB | N0447S | |
| DTT (0.1 M) | invitrogen |
18090050 | |
| Ethanol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 100092680 | |
| FACS | BD FACS Melody | BD-65745 | |
| FACS | Sony | SH800S | |
| Filter tip (1000 µL) | Thermo Scientific | TF112-1000-Q | |
| Filter tip (200 µL) | Thermo Scientific | TF140-200-Q | |
| Filter tip (10 µL) | Thermo Scientific | TF104-10-Q | |
| Filter tip (100 µL) | Thermo Scientific | TF113-100-Q | |
| Fluorescent microscope | Nikon | Eclipse Ni-E | |
| Four-Dimensional Rotating Mixer | Kylin -Bell | BE-1100 | |
| Hemicellulase | sigma | 9025-56-3 | |
| IS PCR primer | 5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG T-3' |
||
| KAPA HiFi HotStart ReadyMix(2X) | Roche | 7958935001 | |
| KCl | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 7447-40-7 | |
| Macerozyme R10 | Yakult (Japan) | 9032-75-1 | |
| Magnetic separation stand | invitrogen | 12321D | |
| Mannitol | aladdin | 69-65-8 | |
| MES | aladdin | 145224948 | |
| MgCl2 | yuanye | R21455-500ml | |
| Microcentrifuges | Eppendorf | Centrifuge 5425 | |
| Micro-mini-centrifuge | Titan | Timi-10k | |
| MS | Phytotech | M519 | |
| Nextera XT DNA Library Preparation Kit | illumina | FC-131-1024 | |
| oligo-dT30VN primer | 5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG TACTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT TTTTTTTTTTVN-3' |
||
| PCR instrument | Thermal cycler | A24811 | |
| Pectolyase | Yakult (Japan) | 9033-35-6 | |
| Plant marker lines | Nottingham Arabidopsis Stock Centre (NASC) | ||
| Qubit 1x dsDNA HS Assay Kit | invitrogen | Q33231 | |
| Qubit 2.0 fluorometer | invitrogen | Q32866 | |
| RNase inhibitor | Thermo Scientific | EO0382 | |
| RNase-free water | invitrogen | 10977023 | |
| Solution A | 400 mM mannitol, 0.05 % BSA , 20 mM MES (pH5.7), 10 mM CaCl2, 20 mM KCl | ||
| Solution B | 1 % (w/v)cellulase R10, 1 % (w/v) cellulase RS, 1 % (w/v)hemicellulase, 0.5 % (w/v)pectolyase and 1 % (w/v) Macerozyme R10 in a fresh aliquot of solution A | ||
| Sterile pestle | BIOTREAT | 453463 | |
| Strainer (40 µm ) | Sorfa | 251100 | |
| SuperScript IV reverse transcriptase (200 U/µL) | invitrogen | 18090050 | |
| SuperScript IV buffer (5x) | invitrogen | 18090050 | |
| Test tube (5 mL) | BD Falcon | 352052 | |
| Thin-walled PCR tubes with caps (0.5 mL) | AXYGEN | PCR-05-C | |
| Triton X-100 | Sangon Biotech | A600198-0500 | |
| TSO primer | 5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG TACATrGrG+G-3' |
||
| Vortex | Titan | VM-T2 |
References
- Zhang, T. -Q., Chen, Y., Liu, Y., Lin, W. -H., Wang, J. -W. Single-cell transcriptome atlas and chromatin accessibility landscape reveal differentiation trajectories in the rice root. Nature Communications. 12 (1), 2053 (2021).
- Denyer, T., et al. Spatiotemporal developmental trajectories in the Arabidopsis root revealed using high-throughput single-cell RNA sequencing. Developmental Cell. 48 (6), 840-852 (2019).
- Liu, Q., et al. Transcriptional landscape of rice roots at the single-cell resolution. Molecular Plant. 14 (3), 384-394 (2021).
- Liu, Z., et al. Global dynamic molecular profiling of stomatal lineage cell development by single-cell RNA sequencing. Molecular Plant. 13 (8), 1178-1193 (2020).
- Shahan, R., et al. A single-cell Arabidopsis root atlas reveals developmental trajectories in wild-type and cell identity mutants. Developmental Cell. 57 (4), 543-560 (2022).
- Wendrich, J. R., et al. Vascular transcription factors guide plant epidermal responses to limiting phosphate conditions. Science. 370 (6518), (2020).
- Carter, A. D., Bonyadi, R., Gifford, M. L. The use of fluorescence-activated cell sorting in studying plant development and environmental responses. The International Journal of Developmental Biology. 57 (6-8), 545-552 (2013).
- Picelli, S., et al. Full-length RNA-seq from single cells using Smart-seq2. Nature Protocols. 9 (1), 171-181 (2014).
- Wang, X., He, Y., Zhang, Q., Ren, X., Zhang, Z. Direct comparative analyses of 10X genomics chromium and Smart-seq2. Genomics Proteomics Bioinformatics. 19 (2), 253-266 (2021).
- Serrano-Ron, L., et al. Reconstruction of lateral root formation through single-cell RNAsequencing reveals order of tissue initiation. Molecular Plant. 14 (8), 1362-1378 (2021).
- Hashimshony, T., et al. CEL-Seq2: Sensitive highly-multiplexed single-cell RNA-Seq. Genome Biology. 17, 77 (2016).
- Macaulay, I. C., et al. G&T-seq: Parallel sequencing of single-cell genomes and transcriptomes. Nature Methods. 12 (6), 519-522 (2015).
- Angermueller, C., et al. Parallel single-cell sequencing links transcriptional and epigenetic heterogeneity. Nature Methods. 13 (3), 229-232 (2016).
- De Rybel, B., et al. A novel aux/IAA28 signaling cascade activates GATA23-dependent specification of lateral root founder cell identity. Current Biology. 20 (19), 1697-1706 (2010).
- Duncombe, S. G., Barnes, W. J., Anderson, C. T. Imaging the delivery and behavior of cellulose synthases in Arabidopsis thaliana using confocal microscopy. Methods in Cell Biology. 160, 201-213 (2020).
- Levy, S. E., Myers, R. M.
- Ooi, C. C., et al. High-throughput full-length single-cell mRNA-seq of rare cells. PLoS One. 12 (11), e0188510 (2017).
- Pertea, M., Kim, D., Pertea, G. M., Leek, J. T., Salzberg, S. L. Transcript-level expression analysis of RNA-seq experiments with HISAT, StringTie and Ballgown. Nature Protocols. 11 (9), 1650-1667 (2016).
- Tsyganov, K., Perry, A., Archer, S., Powell, D. RNAsik: A Pipeline for complete and reproducible RNA-seq analysis that runs anywhere with speed and ease. Journal of Open Source Software. 3, 583 (2018).
- Love, M. I., Huber, W., Anders, S. Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2. Genome Biology. 15 (12), 550 (2014).
- Kamiya, T., et al. The MYB36 transcription factor orchestrates Casparian strip formation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (33), 10533-10538 (2015).
- Zhang, Y., et al. Two types of bHLH transcription factor determine the competence of the pericycle for lateral root initiation. Nature Plants. 7 (5), 633-643 (2021).
- Haecker, A., et al. Expression dynamics of WOX genes mark cell fate decisions during early embryonic patterning in Arabidopsis thaliana. Development. 131 (3), 657-668 (2004).
- Chen, Q., et al. Auxin overproduction in shoots cannot rescue auxin deficiencies in Arabidopsis roots. Plant Cell Physiol. 55 (6), 1072-1079 (2014).
- Nichterwitz, S., et al. Laser capture microscopy coupled with Smart-seq2 for precise spatial transcriptomic profiling. Nature Communications. 7, 12139 (2016).
- Long, J., et al. Nurse cell--derived small RNAs define paternal epigenetic inheritance in Arabidopsis. Science. 373 (6550), (2021).
- Gutzat, R., et al. Arabidopsis shoot stem cells display dynamic transcription and DNA methylation patterns. EMBO Journal. 39 (20), e103667 (2020).
