Summary
현재 방법은 쉽게 사용할 수 있는 유전적으로 암호화된 칼슘 지표를 사용하여 예쁜꼬마선충에서 생체 내 고해상도 하위 구획 칼슘 이미징을 위한 비비율계량 접근 방식을 설명합니다.
Abstract
칼슘(Ca2+) 이미징은 뉴런 활동을 조사하는 데 주로 사용되어 왔지만, 세포내Ca2+ 처리가 세포내 신호전달의 중요한 구성 요소라는 것이 점점 더 분명해지고 있습니다. 생체 내에서 세포 내 Ca2+ 역학의 시각화는 뉴런이 원래의 온전한 회로에서 연구될 수 있으며, 복잡한 신경계에서 기술적으로 어려운 것으로 입증되었습니다. 선충 Caenorhabditis elegans의 투명성과 비교적 단순한 신경계는 형광 태그 및 지표의 세포 특이적 발현 및 생체 내 시각화를 가능하게 합니다. 이들 중에는 세포질뿐만 아니라 미토콘드리아와 같은 다양한 세포 내 구획에서 사용하도록 변형 된 형광 지표가 있습니다. 이 프로토콜은 개별 수지상 가시 및 미토콘드리아 수준까지 Ca 2+ 역학을 분석할 수 있는 세포 내 분해능으로 생체 내에서 비비율계량 Ca2+ 이미징을 가능하게 합니다. 여기서, 상이한 Ca2+ 친화도를 갖는 2개의 이용가능한 유전적으로 암호화된 지표가 단일 쌍의 흥분성 중간 뉴런 (AVA)에서 세포질 또는 미토콘드리아 매트릭스 내의 상대적Ca2+ 수준을 측정하기 위한 이 프로토콜의 사용을 입증하기 위해 사용된다. 예쁜꼬마선충에서 가능한 유전자 조작 및 종단 관찰과 함께 이 이미징 프로토콜은 Ca2+ 처리가 신경 기능과 가소성을 조절하는 방법에 관한 질문에 답하는 데 유용할 수 있습니다.
Introduction
칼슘 이온(Ca2+)은 많은 세포 유형에서 매우 다재다능한 정보 전달체입니다. 뉴런에서,Ca2+는 신경전달물질의 활성-의존적 방출, 세포골격 운동성의 조절, 대사 과정의 미세 조정, 그리고 적절한 뉴런 유지와 기능에 필요한 다른 많은 기전을 담당한다 1,2. 효과적인 세포내 신호전달을 보장하기 위해, 뉴런은 세포질에서 낮은 기저 Ca2+ 수준을 유지해야 한다3. 이것은 소포체(ER) 및 미토콘드리아와 같은 세포 기관으로의 Ca2+ 흡수를 포함하는 협력적 Ca2+ 처리 메커니즘에 의해 달성됩니다. 이러한 과정은, 원형질막에서 Ca2+-투과성 이온 채널의 배열에 더하여, 뉴런 전체에 걸쳐 이질적인 수준의 세포질Ca2+를 초래한다.
휴지기 및 뉴런 활성화 동안 Ca2+ 이질성은Ca2+-의존적 메카니즘의 다양한, 위치-특이적조절을 허용한다1. Ca2+의 농도-특이적 효과의 한 예는 이노시톨 1,4,5-삼인산(InsP3) 수용체를 통해 ER로부터Ca2+의 방출이다. InsP3와 조합된 낮은 Ca2+ 수준은 수용체의 칼슘 투과성 기공을 여는 데 필요합니다. 대안적으로, 높은Ca2+ 수준은 수용체4를 직접 및 간접적으로 억제한다. 적절한 뉴런 기능을 위한 Ca2+ 항상성의 중요성은 세포내Ca2+ 처리 및 신호전달의 중단이 신경퇴행성 장애 및 자연노화의 발병기전의 초기 단계임을 시사하는 증거에 의해 뒷받침된다 5,6. 특히, ER 및 미토콘드리아에 의한 비정상적인 Ca2+ 흡수 및 방출은 알츠하이머병, 파킨슨병 및 헌팅턴병에서 뉴런 기능 장애의 발병과 관련이 있다 6,7.
자연 노화 또는 신경변성 동안 Ca2+ 항상성 이상에 대한 연구는 천연 세포 구조(즉, 시냅스의 배열 및 이온 채널의 분포)가 유지되는 살아 있는 온전한 유기체에서 세포하 분해능을 갖는Ca2+ 수준의 종단적 관찰을 필요로 한다. 이를 위해, 이 프로토콜은 높은 공간 및 시간 분해능으로 생체 내에서 Ca2+ 역학을 기록하기 위해 쉽게 이용가능한, 유전적으로 인코딩된 2개의 Ca2+ 센서의 사용에 대한 지침을 제공한다. 예쁜꼬마선충(C. elegans)에 기술된 방법을 사용하여 얻은 대표적인 결과는 단일 뉴런의 세포질 또는 미토콘드리아 기질에서Ca2+ 지표의 발현이 단일 척추 유사 구조 및 개별 미토콘드리아 내에서 Ca2+ 수준을 식별하는 추가 능력과 함께 Ca2+ 역학을 설명하는 형광 이미지(최대 50Hz)의 신속한 획득을 허용할 수 있는 방법을 보여줍니다.
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Protocol
1. 형질전환 균주 생성
- 선택8,9의 클로닝 방법을 사용하여, 발현 벡터를 복제하여 Pflp-18 또는 Prig-3 프로모터(복부 신경줄의 AVA 특이적 신호에 대해), 선택의Ca2+ 지표, 그 다음 3' UTR(자세한 내용은 논의 참조)10. 플라스미드 및 그 공급원의 목록은 보충 표 1에서 찾을 수 있습니다.
- Ca 2+ 지표 이식유전자(~20ng/μL) 및 구조 DNA lin-15+(선택 마커)를 포함하는 DNA 믹스(<100ng/μL, 각 플라스미드의 농도는 보충 표 1 참조)를 통해 형질전환 균주를 생성하기 위해 확립된 프로토콜을 따르십시오. 린-15(N765TS); 표현형: 다중 외음부)10,11.
메모. lin-15(n765ts) 부모를 15°C로 유지하여 온도에 민감한 돌연변이를 억제합니다. - F1 자손이 성체가 될 때까지 주입된 부모를 20°C로 유지하여 다중 외음부 표현형의 부재를 사용하여 형질전환 선택을 허용합니다.
- 클론 계대(13 )와 같은 다외음부 표현형을 갖지 않는 성인 F1 자손은Ca2+ 지시인자를 포함하는 염색체외 배열의 발현을 나타낸다(11).
- 섹션 3의 뒷부분에 설명된 대로 생후 1일 된 성인을 장착하고 이미징하여 다중 외음부 표현형을 갖지 않는 F2 또는 F3 자손에서 Ca2+ 지표의 발현을 평가합니다.
메모. 여기에 설명된 대로 이미지의 빠른 획득을 위해서는 상대적으로 높은 인디케이터 표현이 필요합니다(자세한 내용은 논의 참조). - Ca 2+ 지표의 최적 발현으로 형질전환 균주의 후속 세대에 대한 실험을 수행하고(자세한 내용은 논의 참조), 균주를 표준 조건(NGM 플레이트에서20 °C)12 하에서 유지합니다.
2. 광학 설정
- 장기간 타임랩스 이미징이 가능한 현미경을 사용하십시오.
메모. 대표적인 데이터는 488nm 및 561nm 여기 레이저가 장착된 도립 스피닝 디스크 컨포칼 현미경을 사용하여 획득되었습니다. - 웜의 조잡한 위치를 파악하기 위해 저배율 대물렌즈(예: 10x/0.40)를 사용합니다.
- 세포 내 분해능을 달성하려면 고배율 대물렌즈를 사용하여 뉴런으로 전환하고 위치를 파악합니다.
메모. 이 연구에서 대표 데이터를 얻기 위해 100x/1.40 NA 오일 대물렌즈가 사용되었습니다. - 빠른 이미지 획득(>50fps)이 가능한 초고감도 카메라를 사용하여 이미지를 획득합니다.
- 선택한 Ca2+ 표시기에 대해 표준 방출 필터를 사용하십시오(즉, GCaMP6f 및 mitoGCaMP에 대해 525nm ± 50nm 방출 필터).
- 이미징 세션 동안 한천 패드가 건조되면 신경돌기가 몇 초 이내에 초점에서 벗어날 수 있으므로 10초보다 긴 이미지 스트림을 획득하기 위해 Z-드리프트 교정기(ZDC)를 추가합니다.
메모. 현미경 설정에서 ZDC를 허용하지 않거나 긴(>20분) 이미징 기간이 필요한 경우 한천 패드 주위에 실리콘 그리스 또는 녹은 바셀린의 테두리를 적용하여 건조 속도를 늦춥니다.
3. 이미징 용 웜 준비
- 한천 패드 준비
- 13mm x 100mm 유리 배양 튜브에 M912 에 분자 등급 한천을 용해하고 몇 초 동안 전자레인지에 돌려 10% 한천 3mL를 만듭니다( 재료 표 참조).
메모. 용융된 한천은 최대 1시간 동안 열 블록에 보관하거나 한천 패드가 필요할 때마다 신선하게 만들 수 있습니다. - 각각 두 겹의 실험실 테이프가 있는 두 개의 추가 슬라이드 사이에 현미경 슬라이드를 놓습니다(그림 1A-i 참조).
- 1,000 μL 피펫 팁의 끝 부분(필터 없음)을 잘라서 중앙 커버슬립에 작은 한천 방울을 피펫팅하는 데 사용합니다(그림 1A-i).
- 한천 상단의 다른 슬라이드를 아래로 눌러 한천을 평평하게 합니다(그림 1A-ii).
- 식힌 후 13mm x 100mm 유리 배양 튜브(그림 1A-iii)의 개구부를 사용하여 한천을 작은 디스크로 자른 다음 주변 한천을 제거합니다.
- 13mm x 100mm 유리 배양 튜브에 M912 에 분자 등급 한천을 용해하고 몇 초 동안 전자레인지에 돌려 10% 한천 3mL를 만듭니다( 재료 표 참조).
- 웜롤링 솔루션 준비
- Muscimol 분말을 M9에 용해시켜 30mM 스톡을 만듭니다. 분취량 50 μL로 분리하고, 4°C에서 보관한다.
- 3-5일마다 30mM muscimol의 새 분취량을 해동합니다(사용 중 20°C에서 보관).
- 30mM muscimol 스톡을 폴리스티렌 비드로 1:1 비율로 희석하여 롤링 용액을 만듭니다.
- 이미징을 위한 웜 위치 지정
- 롤링 용액 1.6μL를 한천 패드 중앙에 놓습니다.
알림: 액체의 양은 더 어린(적은) 또는 나이든 동물(더 많이)을 이미징하기 위해 조정되어야 합니다. - 바람직한 웜 픽(즉, 유리 또는 백금 와이어 픽)13을 사용하여, 다외음부 표현형(11)이 없는 원하는 나이의 웜을 한천 패드의 롤링 용액으로 옮깁니다(그림 1A-iv).
메모. 대표적인 데이터는 1일 된 자웅동체(GCaMP6f 균주 = FJH185; mitoGCaMP 균주; FJH597; 보충 표 1 참조), 이는 단 한 줄의 알의 존재로 식별 할 수 있습니다. 다양한 연령대의 웜 작업에 대한 자세한 내용은 토론을 참조하십시오. - muscimol이 웜 움직임을 줄일 때까지 ~5분 동안 기다린 다음 한천 패드 위에 22mm x 22mm 커버슬립을 떨어뜨려 웜 움직임을 물리적으로 제한합니다.
- 복부 신경줄의 신경돌기를 영상화하려면 커버슬립을 가볍게 밀어 그림 1B,C에 표시된 방향으로 벌레를 굴립니다.
메모. 복부 신경줄을 시각화하려면 머리가 위로 향하도록 웜을 배치하고 장이 근위 부분의 오른쪽에, 웜의 원위 부분에 왼쪽이 될 때까지 웜을 굴립니다 (시청자의 관점에서). 이 방향을 반전시킵니다(그림 1C) 등쪽 신경줄의 신경돌기를 이미징합니다.
- 롤링 용액 1.6μL를 한천 패드 중앙에 놓습니다.
- 현미경에 웜 장착
- 현미경에 장착하기 전에 커버슬립에 침지 오일 한 방울을 떨어뜨립니다.tage.
- 명시야에서 저배율 대물렌즈(10x) 대물렌즈를 사용하여 웜을 찾습니다.
- 100x 대물렌즈로 전환하고 초점을 조정합니다.
- 488nm 이미징 레이저와 함께 GCaMP 또는 mitoGCaMP의 조명을 사용하여 AVA 신경돌기를 찾습니다.
알림: 웜이 찌그러지거나 커버슬립이 당겨지지 않도록 약간의 조정을 사용하십시오.
4. 고해상도 이미지 스트림 획득
- 생체 내 GCaMP 이미징
- 노출 시간을 20ms로 설정합니다.
- 기본 GCaMP 형광이 카메라 다이내믹 레인지14의 중간 범위에 있을 때까지 이미징 레이저 및 획득 설정을 조정합니다. 다른 현미경 설정을 사용하여 이미징 매개변수를 최적화하는 방법에 대한 제안은 토론을 참조하십시오.
메모. 이 연구에 사용된 광학 설정의 경우 488nm 이미징 레이저를 레이저 출력 = 50% 및 감쇠 = 1 출력 설정으로 설정합니다. 추가 획득 설정을 EM 게인 = 200 및 프리앰프 게인 = 1로 수정합니다. - 100x 배율에서 GCaMP 형광을 사용하여 AVA 신경돌기를 찾은 후 ZDC( 재료 표 참조)를 ±30μm 범위로 설정하고 연속 자동 초점을 시작합니다. 이미징하기 전에 필요에 따라 초점면을 수동으로 수정하십시오.
- 100x 배율로 이미지 스트림을 획득합니다. 이 연구에 사용된 설정으로 최대 10분의 지속 시간을 달성할 수 있습니다.
- 생체 내 mitoGCaMP 이미징
- 필요에 따라 4.1.1-4.1.2 단계에 따라 카메라의 다이내믹 레인지14에 대한 중간 범위에서 기본 mitoGCaMP 형광을 획득합니다.
메모. 이 연구에 사용된 광학 설정의 경우 488nm 이미징 레이저를 레이저 출력 = 20% 및 감쇠 = 10 출력 설정으로 설정합니다. 획득 설정을 EM 게인 = 100 및 프리앰프 게인 = 2로 수정합니다. - AVA 신경돌기 내의 미토콘드리아가 mitoGCaMP 형광을 이용하여 위치하게 한 후, 단계 3.3에서 상술한 바와 같이 ZDC를 설정한다.
- 100x 배율로 이미지 스트림을 획득합니다.
- 필요에 따라 4.1.1-4.1.2 단계에 따라 카메라의 다이내믹 레인지14에 대한 중간 범위에서 기본 mitoGCaMP 형광을 획득합니다.
5. 이미지 스트림 분석
- 이미지 계열의 픽셀 값을 분석하기 위해 적절한 이미지 소프트웨어에서 이미지 스트림을 엽니다( 재료 표 참조).
- 다각형 선택 도구를 사용하여 GCaMP 또는 mitoGCaMP를 포함하는 관심 영역(ROI)을 정의합니다.
- > 도구 분석 > ROI 관리자를 클릭합니다. ROI 관리자에서 Add(추가)를 클릭한 다음 More(추가)> Multi Measure(다중 측정)를 클릭합니다. 다중 측정 창에서 확인을 클릭하여 추가 분석을 위해 이미지 스트림의 각 프레임에 대해 위에서 정의한 ROI의 평균, 최소 및 최대 픽셀 강도를 자동으로 수집합니다.
메모. 평균 픽셀 강도(Favg)는 z-평면에서의 포지셔닝으로 인한 형광 차이를 설명하기 위해 비율Favg/Fmin을 사용하여 각 ROI에 대한 최소 강도(Fmin)로 정규화하는 것이 좋습니다. 이미징 중에 웜 움직임이 있는 이미지 스트림은 형광 측정에도 영향을 미치므로 폐기하십시오.
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Representative Results
이 두 가지 프로토콜은 높은 공간 분해능으로 생체 내 개별 신경돌기의 세포 내 영역 및 세포 기관 내에서 차등 Ca2+ 수준을 빠르게 획득할 수 있도록 합니다. 첫 번째 프로토콜은 높은 시간적 및 공간적 분해능으로 세포질Ca2+의 측정을 허용합니다. 이것은 신경돌기가 복부 신경줄의 전체 길이를 달리는 글루타메이트성 AVA 명령 중간 뉴런15에서 GCaMP6f의 세포 특이적 발현을 사용하여 여기에서 입증됩니다. GCaMP6f 형광(50Hz)의 신속한 획득을 통해 Ca 2+ 유입의 방향 전파를 검출할 수 있었습니다(그림 2A 및 보충 비디오 1). GCaMP6f 형광의 세포내 정량화는Ca2+ 유입의 시작이 단지 10μm 떨어진 신경돌기의 일부에서 지연된다는 것을 밝혀냈습니다(그림 2B). 부가적으로, 이 프로토콜은 구획화된 Ca2+ 및 역치 이하Ca2+ 이벤트의 여러 관찰을 허용하였다. 예를 들어, AVA 신경돌기를 따라 발견된 수지상 척추 유사 구조는 신경돌기 활성화와 독립적으로 발생하고 Ca 2+ 유입의 전파로 이어지지 않는 GCaMP6f 형광에서 섬광을 갖는 것으로 나타났습니다(그림 2C, D 및 보충 비디오 2).
두 번째 프로토콜은 단일 신경돌기에서 개별 미토콘드리아의 상대적인 Ca2+ 수준을 신속하게 측정하는 것을 목표로 했습니다. 미토콘드리아 매트릭스의 AVA 특이적 발현을 갖는 웜 균주-국소화된Ca2+ 지표 mitoGCaMP를 사용하여 AVA 중성석 내의 개별 미토콘드리아 수준에서 mitoGCaMP 형광의 변화를 신속하게 검출할 수 있었습니다. 이 이미징 프로토콜은 적어도 이 뉴런에서 미토콘드리아로의 Ca2+ 흡수의 다양한 모드를 밝혀냈습니다. 먼저, 도 3A에 나타낸 결과는 미토콘드리아의 하위집합 내로 비교적 많은 양의Ca2+의 동기 흡수의 예를 제공한다. 보다 구체적으로, 이들 데이터는 일부 미토콘드리아로의 Ca2+ 흡수가 동기화되었음을 보여주었습니다 (Mito1 및 Mito2; 그림 3A, B 및 보충 비디오 3), 이웃 미토콘드리아는 Ca2+(Mito3; 그림 3A, B). 유사하게, 미토콘드리아의 하위집합은 소량의Ca2+를 빠르게 흡수하고 방출하는 것으로 나타났다. 이것은 또한 동기식으로 나타났지만(Mito1 및 Mito3, 그림 3C, D 및 보충 비디오 4), 다시 미토콘드리아의 하위 집합(Mito 2, 그림 3C, D)에 대해서만 나타났습니다.
그림 1: 복부 신경줄을 이미징하기 위한 예쁜꼬마선충 장착 및 롤링. (A) 한천 패드를 준비하고 단일 웜을 롤링 용액으로 선택하는 단계에 대한 그림. (B) 이미징을 위해 재배치되기 전의 웜 위치의 예. 빨간색 화살표는 웜을 오른쪽으로 굴려야 함을 나타내며, 이는 커버슬립을 오른쪽(파란색 화살표)으로 밀어서 얻을 수 있습니다. 스케일 바 = 50 μm. (C) 복부 신경줄을 시각화하는 데 필요한 올바른 방향. 참고: 장은 근위 절반에서 관찰자의 오른쪽(정립 현미경 사용)에 있고 원위 절반의 왼쪽에 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: AVA 신경돌기 및 척추 유사 구조에서 세포내 분해능을 이용한 GCaMP6f 형광의 신속한 획득. (A) AVAL 및 AVAR 신경돌기 분기점에서 GCaMP6f 형광의 대표 이미지. 스케일 바 = 5 μm. (B) 패널 A의 하단 이미지에 정의된 근위(주황색) 및 원위(파란색) 영역에 대한 해당 영역(Fmin)에 대한 최소 형광(F)으로 정규화된 GCaMP6f 형광의 정량화. (C) AVA 중성석의 척추 유사 돌기에서 GCaMP6f 형광의 대표 이미지. (D) 패널 C의 하단 이미지에서 해당 영역의 신경돌기(주황색) 및 척추 유사 돌기(파란색)의 정규화된 GCaMP6f 형광. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3. AVA 중성석 내의 개별 미토콘드리아로의 칼슘 흡수의 신속한 이미징. (ᄀ,ᄃ) 시간 경과에 따른 mitoGCaMP 형광의 대표 이미지. 스케일 바 = 50 μm. (B) 패널 A의 하단 이미지에 표시된 해당 미토콘드리아에 대한 정규화된 GCaMP 형광(F/F min)의 흔적. (D) 패널 C의 하단 이미지에서 강조 표시된 영역에서 40초 이상의 이미징 F/Fmin. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
보충 비디오 1: AVA 중성석의 GCaMP6f 형광. 비디오는 2배속으로 렌더링되었습니다. 스케일 바 = 5 μm. 이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 비디오 2: AVA 중성석의 척추 유사 투영에서 GCaMP6f 형광. 비디오는 2배속으로 렌더링되었습니다. 스케일 바 = 5 μm. 이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 비디오 3: AVA 중성석 동기화 미토콘드리아 칼슘 흡수의 MitoGCaMP 형광. 비디오는 4배속으로 렌더링되었습니다. 스케일 바 = 5 μm. 이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 비디오 4: AVA 중성석의 MitoGCaMP 형광 - 미토콘드리아에 의한 칼슘의 빠른 흡수 및 방출. 비디오는 4배속으로 렌더링되었습니다. 스케일 바 = 5 μm. 이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 표 1: 본 연구에 사용된 유전 시약 및 균주. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
설명된 방법을 구현할 때 첫 번째 고려 사항은 주어진 연구 질문에 대해 이상적인 특성을 가진Ca2+ 지표를 선택하는 것입니다. 세포질 Ca2+ 지표는 전형적으로 Ca2+에 대해 높은 친화도를 가지며,Ca2+에 대한 이들 지표의 민감도는 동역학(on/off rate)16,17과 반비례한다. 이는 Ca2+ 감도 또는 동역학이 관심 현상에 따라 우선 순위를 지정해야 함을 의미합니다. ER과 같이 상대적으로 높은 기저 Ca2+ 수준을 갖는 세포하 구획의 경우, 낮은Ca2+ 친화도를 갖는Ca2+ 지표가 고려되어야 한다18. Ca2+ 지표의 세포-특이적 발현을 위한 재조합 DNA를 생성하기 위해, 바람직한 클로닝 기술은 선택된Ca2+ 지표 및 3' UTR에 이어 세포-특이적 프로모터19,20을 삽입하기 위해 사용되어야 한다. 프로모터 Pflp-18 또는 Prig-3, let-858 또는 unc-54 3' UTR을 사용하여 플라스미드를 구성하고 이 플라스미드를 15-25ng/μL로 미세주입함으로써 AVA 뉴런에서 상대적으로 높은 발현 수준을 달성할 수 있습니다(보충 표 1 참조).
Ca 2+ 지표 및 lin-15+를 포함하는 플라스미드를 lin-15(n765ts) 돌연변이 벌레의 생식선에 성공적으로 미세주입하면 Ca2+ 지표를 발현하고 다중 외음부 표현형에 대해 구출되는 F1 자손이 생성됩니다. F1 세대의 하위 집합(30%-80%)만이 합성 DNA를 F2 세대로 전달합니다. Ca2+ 지표의 발현은 다중 외음부 표현형에 대해 구조된 1일 된 성인의 형광을 장착 및 이미징하여 합성 DNA의 <60% 투과율을 갖는 플레이트에서 구조된 F2 또는 F3 자손에서 평가되어야 합니다. 이상적인 발현 수준은 Ca2+ 지표의 특성 및 위치뿐만 아니라 생물학적 질문에 기초하여 결정된다. 빠른 이미지 획득이 필요한 경우 상대적으로 높은 표현이 이상적입니다. 그러나,Ca2+ 지표의 극히 높은 발현은 다른 세포 또는 조직에서의 비특이적 발현 뿐만 아니라 세포내 미편재화를 유발하는 것으로 밝혀졌다.
유전적으로 암호화된 Ca 2+ 지표는 예쁜꼬마선충 및 다른 모델 유기체에서 Ca2+의 생체 내 분석에 널리 사용되었습니다. 이들 연구들 중 일부는 뉴런 세포체21,22,23,24에서Ca2+ 수준의 단세포 분해능 모니터링을 달성하였다. 뉴런 하위 구획에서의 Ca 2+ 유입의 측정은 척추동물 시스템뿐만 아니라 예쁜꼬마선충(C. elegans)에서 생체 내에서 이루어졌지만, 전체 신경돌기(neurolite)25,26 또는 수상돌기(dendrites)의 개체군(population)에서Ca2+ 지표 활성을 기록함으로써만 이루어졌다27. 뉴런 세포체 및 수상돌기에서 Ca2+ 활성을 전체적으로 측정하는 것은 세포의 스파이크 활성을 반영하지만, Ca2+ 유입(즉, 전파 방향 또는 속도) 또는 임계 미만Ca2+ 과도현상의 역학의 관찰을 허용하지 않는다. 여기에서 입증된 공간적 및 시간적 분해능에 대한 뉴런의Ca2+ 처리를 식별할 수 있는 생체내 연구는 거의 없습니다. 대부분의 예쁜꼬마선충 뉴런(28)에서Ca2+ 유입의 시간적 동역학은 척추동물 뉴런(29)에서보다 느린 것으로 보이므로, 이러한 빠른 이미징 프로토콜은 척추동물 시스템에서 유사한 시간적 동역학을 포착하기에 불충분할 가능성이 높다는 점에 유의해야 한다. 그러나, 이광자 현미경의 최근의 발전은 자유롭게 행동하는 마우스(30)에서 개별 해마 수상돌기에서 칼슘의 초고속(120Hz) 세포내 이미징을 허용하며, 이는 척추동물에서 유사한 고해상도Ca2+ 이미징을 달성할 수 있는 가능성을 제공한다.
생체내 Ca2+ 영상화에 대한 이러한 비비율계량적 접근법은 체벽 근육의 수축을 억제하고, 따라서 영상화 동안 웜 이동을 제한하는 무시몰의 사용을 필요로 한다는 점에 유의하는 것이 중요하다(31). 이미징 중 과도한 움직임이 있는 경우(웜의 ~20% 이상에서 일관된 움직임) 새로 해동된 muscimol 분취량으로 새로운 롤링 용액을 만들어야 하며, 롤링 전에 롤링 용액에서 웜이 목욕하는 시간을 연장해야 합니다. Muscimol은 GABA 수용체 작용제로, AVA 뉴런에 입력을 제공하는 뉴런을 포함하여 GABA 성 뉴런을 억제합니다. 또한 AVA를 포함한 많은 흥분성 뉴런은 낮은 수준의 GABA 수용체를 발현하므로 이 프로토콜에서 muscimol을 사용하면 신경 활동이 감소할 수 있습니다. 그러나 이 프로토콜을 사용하면 AVA의 전반적인 자발적 활성화는 muscimol(미공개 데이터)이 있는 경우 ~29%만 감소합니다. 다른 뉴런의 활성화는 muscimol에 의해 더 급격하게 감소 될 수 있으며, 이는 롤링 용액에서 M9를 muscimol로 대체하고 저배율32에서 뉴런 세포체에서 이미징을 수행함으로써 테스트 할 수 있습니다. muscimol을 사용하는 대안은 비율 계량 Ca2+ 지표33,34를 사용하는 것인데, 이는 웜 이동으로 인한 형광 보정을 허용합니다. 이 접근법의 단점은 이중 파장 이미징이 가능한 광학 설정이 필요하고 다른 많은 형광 도구와 함께 Ca2+ 표시기를 사용하는 기능을 제한한다는 것입니다.
설명된 현미경 시스템의 한 가지 주요 한계는 회전하는 디스크에 의해 방출되는 빛의 감소로 인해 정보가 손실된다는 것입니다. 이 시스템은 더 큰 직경의 핀 구멍이 있는 디스크를 구현하여 방출된 빛의 캡처를 증가시키도록 수정할 수 있습니다. 그러나 이러한 변경은 축(z면) 분해능을 감소시키고 배경 형광을 증가시킵니다. 이 목적을 위한 또 다른 가능한 현미경 설정은 고속 스캐닝 광시트 현미경으로, 최근 몇 년 동안 현장 및 생체 내35에서 신속한(최대 50Hz) 이미징을 허용하도록 개선되었습니다.
세포질 및 미토콘드리아 Ca 2+의 시공간 역학을 평가하면 국소 Ca2+ 과도 현상 및 역치 이하 사건이 어떻게 칼슘 의존성 신호 전달을 유발하거나 미토콘드리아 생물학을 조절할 수 있는지 더 잘 이해할 수 있습니다. 이러한 세포하, 생체내 Ca2+ 이미징은 시냅스 가소성, 뉴런 대사의 활성-의존적 변화, 및 뉴런 흥분성의 항상성 조절의 연구에 특히 유용할 수 있다. 국소적, 아세포 환경이 정의된 뉴런 활동 상태(즉, 공간적으로 특정한 농도 및 Ca 2+의 수명)를 중심으로 어떻게 적응하는지에 대한 추가 조사는 Ca2+ 항상성 장애가 어떻게 뉴런 기능의 병원성 변화로 이어지는지에 대한 통찰력을 제공할 것입니다. 살아 있는 온전한 유기체에서 이것을 연구할 수 있는 능력은 자연 노화 및 질병 관련 신경퇴행에 따라Ca2+ 항상성이 어떻게 그리고 왜 변하는지에 대한 종단 연구를 가능하게 하기 때문에 특히 유용합니다. 노화와 신경 퇴행을 연구하기 위해이 방법을 적용하는 것은 C. elegans의 초기 생물학적 연령 (성인기 <4 일)으로 다소 제한됩니다. 실제로, 이미징을 위해 벌레를 장착하고 배치하는 동안 물리적 조작은 성인기 약 5일 후에 근육의 긴장도와 큐티클 무결성 감소로 인해 벌레가 이완되는 경우 어렵습니다.
Ca2+의 역학 및 세포 내 처리에 대한 신속한 생체 내 이미징은 신경 흥분성과 세포 내 신호 전달이 공간적 및 시간적으로 미세하게 조절되는 방법을 이해하는 데 도움이 될 것입니다. 이 프로토콜은 Ca2+ 의존 과정의 다양성과 신경 기능에서의 중심 역할로 인해 많은 분야의 광범위한 연구와 연구자에게 도움이 될 수 있습니다. 예를 들어, 건강한 뉴런에 이 방법을 적용하면 노화 동안 세포질 Ca2+ 상승이 시냅스 가소성 손상, 비효율적인 미토콘드리아 호흡 및 기타 기능 장애와 함께 발생하는 이유에 대한 통찰력을 얻을 수 있습니다36,37. 또한, 이 방법은 연령 관련Ca2+ 항상장애의 원인을 조사하는 데 사용될 수 있다38. 그러나 노화 및 신경 퇴행과 관련된 질문에 대한 이 방법의 적용은 노화의 초기 단계(<성기의 5일)로 다소 제한됩니다38. 위에서 언급했듯이 롤링 방법을 사용하여 노인 벌레(성체 >5일)의 이미징은 어렵지만 C. elegans 미세 유체 공학의 발전은 성인기의 최대 12일 동안 유사한 공간 해상도로 이미징에 대한 가능성을 보여줍니다39,40.
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Disclosures
저자는 경쟁 이익을 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
이 작업은 국립 보건원 (NIH) (R01-NS115947이 F. Hoerndli에게 수여됨)의 지원을 받았습니다. 또한 pAS1 플라스미드에 대해 Attila Stetak 박사에게도 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100x/1.40 Oil objective | Olympus | UPlanSApo | |
| 10x/0.40 Objective | Olympus | UPlanSApo | |
| 22 mm x 22 mm Cover glass | VWR | 48366-227 | |
| Agarose SFR | VWR | J234-100G | |
| Beam homogenizer | Andor Technologies | Borealis upgrade to CSU-X1 | |
| CleanBench laboratory table | TMC | With vibration control | |
| Disposable culture tubes | VWR | 47729-572 | 13 mm x 100 mm |
| Environmental chamber | Thermo Scientific | 3940 | Set to 20 °C |
| Filter wheel or slider | ASI | For 25 mm diameter filters | |
| FJH 185 | Caenorhabditis Genetics Center | FJH 185 | Worm strain |
| FJH 597 | Caenorhabditis Genetics Center | FJH 597 | Worm strain |
| GFP bandpass emission filter | Chroma | 525 ± 50 nm (25 mm diameter) | |
| ILE laser combiner | Andor Technologies | 4 laser lines | |
| ILE solid state 488 nm laser | Andor Technologies | 50 mW | |
| ImageJ | National Institutes of Health | Version 1.52a | |
| IX83 Spinning disk confocal microscope | Olympus | With Yokogawa CSU-X1 spinning disc | |
| iXon Ultra EMCCD camera | Andor Technologies | ||
| Low auto-fluorescence immersion oil | Olympus | Z-81226 | |
| MetaMorph | Molecular Devices | Version 7.10.1 | |
| Microscope control box | Olympus | IX3-CBH | |
| Muscimol | MP Biomedical / Sigma | 02195336-CF | |
| pAS1 | AddGene | 194970 | Plasmid |
| pBSKS | Stratagene | ||
| pCT61 | Plasmid available from Hoerndli/Maricq lab upon request | ||
| pJM23 | Plasmid available from Hoerndli/Maricq lab upon request | ||
| pKK1 | AddGene | 194969 | Plasmid |
| Polybead microspheres | Polysciences Inc. | 00876-15 | 0.094 µm |
| Stability chamber | Norlake Scientific | NSRI241WSW/8H | Set to 15 °C |
| Stage controller | ASI | With filter wheel control | |
| Standard microscope slide | Premiere | 9108W-E | 75 mm x 25 mm x 1 mm |
| Touch panel controller | Olympus | I3-TPC | |
| Z-drift corrector | Olympus | IX3-ZDC2 |
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