Summary
Die aktuellen Methoden beschreiben einen nicht-ratiometrischen Ansatz für die hochauflösende, subkompartimentelle Kalziumbildgebung in vivo in Caenorhabditis elegans unter Verwendung leicht verfügbarer genetisch kodierter Kalziumindikatoren.
Abstract
Die Bildgebung von Kalzium (Ca 2+) wurde bisher weitgehend zur Untersuchung der neuronalen Aktivität eingesetzt, aber es wird immer deutlicher, dass die subzelluläre Ca2+-Handhabung eine entscheidende Komponente der intrazellulären Signalübertragung ist. Die Visualisierung der subzellulären Ca2+-Dynamik in vivo, bei der Neuronen in ihren nativen, intakten Schaltkreisen untersucht werden können, hat sich in komplexen Nervensystemen als technisch anspruchsvoll erwiesen. Die Transparenz und das relativ einfache Nervensystem des Fadenwurms Caenorhabditis elegans ermöglichen die zellspezifische Expression und in vivo Visualisierung von fluoreszierenden Tags und Indikatoren. Darunter befinden sich Fluoreszenzindikatoren, die für den Einsatz im Zytoplasma modifiziert wurden, sowie verschiedene subzelluläre Kompartimente, wie z.B. die Mitochondrien. Dieses Protokoll ermöglicht eine nicht-ratiometrische Ca 2+ Bildgebung in vivo mit einer subzellulären Auflösung, die die Analyse der Ca2+ Dynamik bis auf die Ebene einzelner dendritischer Dornen und Mitochondrien ermöglicht. In dieser Arbeit werden zwei genetisch kodierte Indikatoren mit unterschiedlichen Ca 2+-Affinitäten verwendet, um die Verwendung dieses Protokolls zur Messung relativer Ca2+-Spiegel innerhalb des Zytoplasmas oder der mitochondrialen Matrix in einem einzigen Paar exzitatorischer Interneuronen (AVA) zu demonstrieren. Zusammen mit den genetischen Manipulationen und Längsschnittbeobachtungen, die in C. elegans möglich sind, könnte dieses Bildgebungsprotokoll nützlich sein, um Fragen zu beantworten, wie der Umgang mit Ca2+ die neuronale Funktion und Plastizität reguliert.
Introduction
Calcium-Ionen (Ca2+) sind in vielen Zelltypen sehr vielseitige Informationsträger. In Neuronen ist Ca2+ für die aktivitätsabhängige Freisetzung von Neurotransmittern, die Regulierung der Zytoskelettmotilität, die Feinabstimmung von Stoffwechselprozessen sowie viele andere Mechanismen verantwortlich, die für eine ordnungsgemäße Aufrechterhaltung und Funktion der Nervenzellen erforderlich sind 1,2. Um eine effektive intrazelluläre Signalübertragung zu gewährleisten, müssen Neuronen einen niedrigen basalen Ca2+-Spiegel in ihrem Zytoplasmaaufrechterhalten 3. Dies wird durch kooperative Ca 2+-Handhabungsmechanismen erreicht, einschließlich der Aufnahme von Ca2+ in Organellen wie das Endoplasmatische Retikulum (ER) und Mitochondrien. Diese Prozesse, zusätzlich zur Anordnung von Ca 2+-permeablen Ionenkanälen in der Plasmamembran, führen zu heterogenen Konzentrationen von zytoplasmatischem Ca2+ im gesamten Neuron.
Die Ca 2+-Heterogenität während der Ruhephase und der neuronalen Aktivierung ermöglicht die vielfältige, ortsspezifische Regulation von Ca2+-abhängigen Mechanismen1. Ein Beispiel für die konzentrationsspezifischen Effekte von Ca 2+ ist die Freisetzung von Ca2+ aus dem ER durch Inositol-1,4,5-trisphosphat (InsP3)-Rezeptoren. NiedrigeCa2+-Spiegel in Kombination mit InsP3 sind für die Öffnung der kalziumdurchlässigen Pore des Rezeptors erforderlich. Alternativ hemmen hoheCa2+-Spiegel sowohl direkt als auch indirekt den Rezeptor4. Die Bedeutung der Ca 2+-Homöostase für die ordnungsgemäße neuronale Funktion wird durch Hinweise gestützt, die darauf hindeuten, dass eine gestörte intrazelluläre Ca2+-Handhabung und -Signalübertragung ein früher Schritt in der Pathogenese neurodegenerativer Erkrankungen und des natürlichen Alterns ist 5,6. Insbesondere die abnorme Aufnahme und Freisetzung von Ca2+ durch das ER und die Mitochondrien wird mit dem Auftreten neuronaler Dysfunktion bei der Alzheimer-Krankheit, der Parkinson-Krankheit und der Huntington-Krankheit in Verbindung gebracht 6,7.
Die Untersuchung der Ca 2+ Dyshomöostase während des natürlichen Alterns oder der Neurodegeneration erfordert die longitudinale Beobachtung der Ca2+ Spiegel mit subzellulärer Auflösung in einem lebenden, intakten Organismus, in dem die native zelluläre Architektur (d.h. die Anordnung der Synapsen und die Verteilung der Ionenkanäle) erhalten bleibt. Zu diesem Zweck bietet dieses Protokoll eine Anleitung für den Einsatz von zwei leicht verfügbaren, genetisch kodierten Ca 2+ Sensoren zur Erfassung der Ca2+ Dynamik in vivo mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung. Die repräsentativen Ergebnisse, die mit der beschriebenen Methode in C. elegans gewonnen wurden, zeigen, wie die Expression von Ca 2+-Indikatoren im Zytoplasma oder in der mitochondrialen Matrix einzelner Neuronen die schnelle Aufnahme von Fluoreszenzbildern (bis zu 50 Hz) ermöglichen kann, die die Ca 2+-Dynamik veranschaulichen, mit der zusätzlichen Fähigkeit, die Ca 2+-Spiegel innerhalb einzelner stachelähnlicher Strukturen und einzelner Mitochondrien zu erkennen.
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Protocol
1. Erzeugung transgener Stämme
- Klonieren Sie Expressionsvektoren unter Verwendung einer Klonierungsmethode Ihrer Wahl8,9 so, dass sie den Pflp-18- oder Prig-3-Promotor (für AVA-spezifisches Signal im ventralen Nervenstrang) enthalten, gefolgt vom Ca2+-Indikator der Wahl und dann einer 3'-UTR (siehe Diskussion für weitere Informationen)10. Eine Liste der Plasmide und ihrer Quellen finden Sie in der ergänzenden Tabelle 1.
- Befolgen Sie das etablierte Protokoll für die Erzeugung transgener Stämme durch Mikroinjektion einer DNA-Mischung (<100 ng/μl; siehe ergänzende Tabelle 1 für die Konzentrationen der einzelnen Plasmide), die das Ca2+-Indikatortransgen (~20 ng/μl) und die Rettungs-DNA lin-15+ (Selektionsmarker) enthält, in die Keimdrüse eines 1 Tag alten erwachsenen C. elegans10 (Genotyp: LIN-15(N765TS); Phänotyp: Multi-Vulva)10,11.
ANMERKUNG. Die lin-15(n765ts)- Eltern sollten bei 15 °C gehalten werden, um die temperaturempfindliche Mutation zu unterdrücken. - Halten Sie die injizierten Eltern bei 20 °C, bis die F1-Nachkommen das Erwachsenenalter erreichen, um eine transgene Selektion unter Ausnutzung des Fehlens des Multivulva-Phänotyps zu ermöglichen.
- Klonale Passage13 adulter F1-Nachkommen, die nicht den Multivulva-Phänotyp aufweisen, da dies auf die Expression des extrachromosomalen Arrays hinweist, das den Ca2+ -Indikator11 enthält.
- Beurteilen Sie die Expression des Ca2+ -Indikators bei den F2- oder F3-Nachkommen, die nicht den Multivulva-Phänotyp aufweisen, indem Sie 1 Tag alte erwachsene Tiere wie weiter unten in Abschnitt 3 beschrieben montieren und bildgeben.
ANMERKUNG. Eine relativ hohe Ausprägung des Indikators ist für die schnelle Aufnahme von Bildern erforderlich, wie hier beschrieben (siehe die Diskussion für weitere Details). - Durchführung von Experimenten an nachfolgenden Generationen der transgenen Stämme mit einer optimalen Expression des Ca 2+-Indikators (siehe Diskussion für weitere Details) und Beibehaltung der Stämme unter Standardbedingungen (20 °C auf NGM-Platten)12.
2. Optischer Aufbau
- Verwenden Sie ein Mikroskop, das Langzeitaufnahmen im Zeitraffer ermöglicht.
ANMERKUNG. Die repräsentativen Daten wurden mit einem konfokalen inversen Spinning-Disk-Mikroskop aufgenommen, das mit 488 nm und 561 nm Anregungslasern ausgestattet ist. - Verwenden Sie ein Objektiv mit geringer Vergrößerung (z. B. 10x/0,40) für die grobe Lokalisierung des Wurms.
- Um eine subzelluläre Auflösung zu erreichen, schalten Sie auf die Neuronen um und lokalisieren Sie sie mit einem Objektiv mit hoher Vergrößerung.
ANMERKUNG. Ein 100x/1,40 NA Ölobjektiv wurde verwendet, um die repräsentativen Daten in dieser Studie zu erfassen. - Nehmen Sie die Bilder mit einer hochempfindlichen Kamera auf, die eine schnelle Bildaufnahme (>50 fps) ermöglicht.
- Verwenden Sie einen Standard-Emissionsfilter für den Ca2+ -Indikator Ihrer Wahl (d. h. einen 525-nm- ± 50-nm-Emissionsfilter für GCaMP6f und mitoGCaMP).
- Fügen Sie einen Z-Drift-Korrektor (ZDC) für die Aufnahme von Bildströmen hinzu, die länger als 10 s sind, da die Austrocknung des Agar-Pads während der Bildgebungssitzung dazu führt, dass der Neurit innerhalb weniger Sekunden unscharf driftet.
ANMERKUNG. Wenn ein Mikroskopie-Setup keine ZDC zulässt oder wenn lange Bildgebungszeiten (>20 Minuten) gewünscht werden, tragen Sie einen Rand aus Silikonfett oder geschmolzener Vaseline um das Agar-Pad auf, um die Austrocknung zu verlangsamen.
3. Vorbereitung der Würmer für die Bildgebung
- Vorbereiten der Agar-Pads
- Stellen Sie 3 ml 10%iges Agar her, indem Sie molekularen Agar in M912 in einem 13 mm x 100 mm großen Glaskulturröhrchen auflösen und einige Sekunden lang in der Mikrowelle erhitzen (siehe Materialtabelle).
ANMERKUNG. Geschmolzener Agar kann bis zu 1 Stunde auf einem Heizblock aufbewahrt oder jedes Mal frisch zubereitet werden, wenn Agarpads benötigt werden. - Legen Sie einen Objektträger zwischen zwei zusätzliche Objektträger, die jeweils zwei Lagen Laborklebeband aufweisen (siehe Abbildung 1A-i).
- Schneiden Sie die Spitze einer 1.000-μl-Pipettenspitze (ohne Filter) ab und pipettieren Sie damit einen kleinen Tropfen Agar auf das mittlere Deckglas (Abbildung 1A-i).
- Glätten Sie den Agar, indem Sie einen weiteren Schieber auf den Agar drücken (Abbildung 1A-ii).
- Schneiden Sie den Agar nach dem Abkühlen mit der Öffnung eines 13 mm x 100 mm großen Glaskulturröhrchens in eine kleine Scheibe (Abbildung 1A-iii) und entfernen Sie dann den umgebenden Agar.
- Stellen Sie 3 ml 10%iges Agar her, indem Sie molekularen Agar in M912 in einem 13 mm x 100 mm großen Glaskulturröhrchen auflösen und einige Sekunden lang in der Mikrowelle erhitzen (siehe Materialtabelle).
- Aufbereitung der Schneckenwalzlösung
- Lösen Sie Muscimol-Pulver in M9 auf, um eine 30-mM-Brühe zu erhalten. In 50-μl-Aliquots trennen und bei 4 °C lagern.
- Alle 3-5 Tage ein neues Aliquot von 30 mM Muscimol auftauen (und während der Anwendung bei 20 °C lagern).
- Verdünnen Sie eine 30 mM Muscimol-Brühe im Verhältnis 1:1 mit Styroporperlen, um die Walzlösung herzustellen.
- Positionieren eines Wurms für die Bildgebung
- Geben Sie 1,6 μl der Rollenlösung auf die Mitte des Agarpads.
Anmerkungen: Die Flüssigkeitsmenge sollte für die Aufnahme jüngerer (weniger) oder älterer Tiere (mehr) angepasst werden. - Übertragen Sie mit dem bevorzugten Wurmstich (d. h. einem Glas- oder Platindrahtpickel)13 einen Wurm des gewünschten Alters ohne den Multivulva-Phänotyp11 in die rollende Lösung auf dem Agarkissen (Abbildung 1A-iv).
ANMERKUNG. Die repräsentativen Daten stammen von 1 Tag alten Hermaphroditen (GCaMP6f-Stamm = FJH185; mitoGCaMP-Stamm; FJH597; siehe Ergänzende Tabelle 1), die durch das Vorhandensein von nur einer Reihe von Eiern identifiziert werden kann. Weitere Informationen zur Arbeit mit Würmern unterschiedlichen Alters finden Sie in der Diskussion. - Warten Sie ~5 Minuten, bis das Muscimol die Wurmbewegung reduziert hat, und lassen Sie dann ein 22 mm x 22 mm großes Deckglas auf das Agar-Pad fallen, wodurch die Bewegung des Wurms physisch eingeschränkt wird.
- Um Neuriten im ventralen Nervenstrang abzubilden, rollen Sie den Wurm durch leichtes Schieben des Deckglases in die in Abbildung 1B,C gezeigte Ausrichtung.
ANMERKUNG. Um den ventralen Nervenstrang zu visualisieren, positionieren Sie den Wurm mit dem Kopf nach oben und rollen Sie den Wurm, bis sich der Darm auf der rechten Seite des proximalen Abschnitts und auf der linken Seite des distalen Teils des Wurms befindet (aus der Perspektive des Betrachters). Kehren Sie diese Orientierung um (Abbildung 1C), um Neuriten im dorsalen Nervenstrang abzubilden.
- Geben Sie 1,6 μl der Rollenlösung auf die Mitte des Agarpads.
- Den Wurm auf ein Mikroskop montieren
- Geben Sie einen Tropfen Immersionsöl auf das Deckglas, bevor Sie es auf den Mikroskoptisch montieren.
- Finden Sie den Wurm mit einem Objektiv mit geringer Vergrößerung (10x) im Hellfeld.
- Wechseln Sie zum 100x-Objektiv und passen Sie den Fokus an.
- Lokalisieren Sie den AVA-Neuriten mit der Beleuchtung des GCaMP oder mitoGCaMP mit dem 488-nm-Bildgebungslaser.
Anmerkungen: Verwenden Sie kleine Anpassungen, um zu verhindern, dass der Wurm gequetscht oder das Deckglas abgezogen wird.
4. Aufnahme von hochauflösenden Bildströmen
- Im lebenden Organismus GCaMP-Bildgebung
- Stellen Sie die Belichtungszeit auf 20 ms ein.
- Passen Sie den Bildgebungslaser und die Aufnahmeeinstellungen an, bis die basale GCaMP-Fluoreszenz im mittleren Bereich des Dynamikbereichs der Kameraliegt 14. In der Diskussion finden Sie Vorschläge zur Optimierung der Bildgebungsparameter mit anderen Mikroskopie-Setups.
ANMERKUNG. Stellen Sie für den in dieser Studie verwendeten optischen Aufbau den 488-nm-Bildgebungslaser auf die folgenden Ausgangseinstellungen ein: Laserleistung = 50 % und Dämpfung = 1. Ändern Sie die zusätzlichen Erfassungseinstellungen wie folgt: EM-Verstärkung = 200 und Vorverstärkerverstärkung = 1. - Nachdem der AVA-Neurit mit der GCaMP-Fluoreszenz bei 100-facher Vergrößerung lokalisiert wurde, stellen Sie den ZDC (siehe Materialtabelle) auf einen Bereich von ±30 μm ein und starten Sie den kontinuierlichen Autofokus. Korrigieren Sie die Fokusebene vor der Bildgebung nach Bedarf manuell.
- Erfassen Sie einen Strom von Bildern mit 100-facher Vergrößerung. Mit dem in dieser Studie verwendeten Aufbau können Dauern von bis zu 10 Minuten erreicht werden.
- In-vivo-mitoGCaMP-Bildgebung
- Befolgen Sie die Schritte 4.1.1-4.1.2 nach Bedarf, um die basale mitoGCaMP-Fluoreszenz im mittleren Bereich für den Dynamikbereichder Kamera zu erfassen 14.
ANMERKUNG. Stellen Sie für den in dieser Studie verwendeten optischen Aufbau den 488-nm-Bildgebungslaser auf die folgenden Ausgangseinstellungen ein: Laserleistung = 20 % und Dämpfung = 10. Ändern Sie die Erfassungseinstellungen wie folgt: EM-Verstärkung = 100 und Vorverstärkerverstärkung = 2. - Nachdem die Mitochondrien im AVA-Neuriten mit Hilfe der mitoGCaMP-Fluoreszenz lokalisiert wurden, stellen Sie den ZDC wie oben in Schritt 3.3 beschrieben ein.
- Erfassen Sie einen Strom von Bildern mit 100-facher Vergrößerung.
- Befolgen Sie die Schritte 4.1.1-4.1.2 nach Bedarf, um die basale mitoGCaMP-Fluoreszenz im mittleren Bereich für den Dynamikbereichder Kamera zu erfassen 14.
5. Analyse des Bildstroms
- Öffnen Sie den Bildstrom in einer geeigneten Bildsoftware, um die Pixelwerte in einer Bildserie zu analysieren (siehe Materialtabelle).
- Definieren Sie mit dem Werkzeug Polygonauswahl die subzelluläre Region of Interest (ROI), die GCaMP oder mitoGCaMP enthält.
- Klicken Sie auf Analyze > Tools > ROI Manager. Klicken Sie im ROI-Manager auf Hinzufügen und dann auf Mehr > Multi-Kennzahl. Klicken Sie im Fenster "Multi Measure" auf "OK ", um automatisch die durchschnittliche, minimale und maximale Pixelintensität des oben definierten ROI für jedes Bild des Bildstreams zur weiteren Analyse zu erfassen.
ANMERKUNG. Es wird empfohlen, die durchschnittliche Pixelintensität (Favg) für jede ROI auf die minimale Intensität (F min) zu normalisieren, wobei das Verhältnis Favg/Fmin verwendet wird, um Fluoreszenzunterschiede aufgrund der Positionierung in der z-Ebene zu berücksichtigen. Verwerfen Sie die Bildströme mit Wurmbewegung während der Bildgebung, da dies auch die Fluoreszenzmessungen beeinflussen würde.
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Representative Results
Diese beiden Protokolle ermöglichen die schnelle Erfassung von differentiellen Ca2+-Spiegeln innerhalb der subzellulären Regionen und Organellen einzelner Neuriten in vivo mit hoher räumlicher Auflösung. Das erste Protokoll ermöglicht die Messung von zytoplasmatischem Ca2+ mit hoher zeitlicher und räumlicher Auflösung. Dies wird hier anhand der zellspezifischen Expression von GCaMP6f in den glutamatergen AVA-Befehlsinterneuronen15 demonstriert, deren Neuriten sich über die gesamte Länge des ventralen Nervenstrangs erstrecken. Die schnelle Erfassung der GCaMP6f-Fluoreszenz (50 Hz) ermöglichte die Detektion der gerichteten Ausbreitung des Ca 2+-Einstroms (Abbildung 2A und ergänzendes Video 1). Die subzelluläre Quantifizierung der GCaMP6f-Fluoreszenz zeigte, dass der Beginn des Ca 2+-Einstroms in einem nur 10 μm entfernten Teil des Neuriten verzögert war (Abbildung 2B). Darüber hinaus ermöglichte dieses Protokoll mehrere Beobachtungen von kompartimentierten Ca 2+ und unterschwelligen Ca2+ Ereignissen. Zum Beispiel wurde beobachtet, dass dendritische wirbelsäulenartige Strukturen, die entlang des AVA-Neuriten gefunden wurden, Blitze in der GCaMP6f-Fluoreszenz aufwiesen, die unabhängig von der Neuritenaktivierung auftraten und nicht zu einer Ausbreitung des Ca 2+-Einstroms führten (Abbildung 2C, D und ergänzendes Video 2).
Das zweite Protokoll zielte darauf ab, die relativenCa2+-Spiegel in den einzelnen Mitochondrien in einzelnen Neuriten schnell zu messen. Die Verwendung eines Wurmstammes mit AVA-spezifischer Expression des mitochondrialen Matrix-lokalisierten Ca2+ Indikators mitoGCaMP ermöglichte die schnelle Detektion von Veränderungen der mitoGCaMP-Fluoreszenz auf der Ebene einzelner Mitochondrien innerhalb des AVA-Neuriten. Dieses Bildgebungsprotokoll zeigte verschiedene Modi der Aufnahme von Ca2+ in die Mitochondrien, zumindest in diesem Neuron. Erstens zeigen die in Abbildung 3A gezeigten Ergebnisse ein Beispiel für die synchrone Aufnahme einer relativ großen Menge Ca2+ in eine Untergruppe von Mitochondrien. Genauer gesagt zeigten diese Daten, dass die Aufnahme von Ca2+ in einige Mitochondrien synchronisiert war (Mito1 und Mito2; Abbildung 3A,B und ergänzendes Video 3), während benachbarte Mitochondrien Ca2+ (Mito3; Abbildung 3A,B). In ähnlicher Weise wurde beobachtet, dass Untergruppen von Mitochondrien schnell kleine Mengen von Ca2+ aufnehmen und freisetzen. Dies schien ebenfalls synchron zu sein (Mito1 und Mito3, Abbildung 3C,D und Supplemental Video 4), aber wiederum nur für eine Teilmenge der Mitochondrien (Mito 2, Abbildung 3C,D).
Abbildung 1: Montieren und Rollen von C. elegans zur Darstellung des ventralen Nervenstrangs. (A) Eine Illustration der Schritte zur Vorbereitung der Agarpads und zum Aufnehmen eines einzelnen Wurms in eine rollende Lösung. (B) Ein Beispiel für eine Wurmposition, bevor sie für die Bildgebung neu positioniert wird. Der rote Pfeil zeigt an, dass die Schnecke nach rechts rollen muss, was durch Verschieben des Deckglases nach rechts erreicht werden kann (blauer Pfeil). Maßstabsbalken = 50 μm. (C) Die richtige Ausrichtung, die für die Visualisierung des ventralen Nervenstrangs erforderlich ist. Hinweis: Der Darm befindet sich auf der rechten Seite des Betrachters (mit einem aufrechten Mikroskop) in der proximalen Hälfte und dann auf der linken Seite in der distalen Hälfte. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Schnelle Erfassung von GCaMP6f-Fluoreszenz mit subzellulärer Auflösung in AVA-Neuriten und wirbelsäulenartigen Strukturen. (A) Repräsentative Bilder der GCaMP6f-Fluoreszenz an der AVAL- und AVAR-Neuritenbifurkation. Maßstabsbalken = 5 μm. (B) Quantifizierung der GCaMP6f-Fluoreszenz, normiert auf die minimale Fluoreszenz (F) für diese Region (Fmin) für die proximalen (orange) und distalen (blau) Regionen, die im unteren Bild in Tafel A definiert sind. (C) Repräsentative Bilder der GCaMP6f-Fluoreszenz bei einer spinnartigen Projektion im AVA-Neuriten. (D) Normalisierte GCaMP6f-Fluoreszenz im Neuriten (orange) und die wirbelsäulenartige Projektion (blau) aus den entsprechenden Regionen im unteren Bild von Panel C. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3. Schnelle Bildgebung der Kalziumaufnahme in einzelne Mitochondrien innerhalb des AVA-Neuriten. (A,C) Repräsentative Bilder der mitoGCaMP-Fluoreszenz über die Zeit. Maßstabsbalken = 50 μm. (B) Spuren normalisierter GCaMP-Fluoreszenz (F/F min) für die entsprechenden Mitochondrien im unteren Bild von Tafel A. (D) F/Fmin über 40 s Bildgebung in den im unteren Bild in Tafel C hervorgehobenen Regionen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Ergänzendes Video 1: GCaMP6f-Fluoreszenz im AVA-Neuriten. Das Video wurde mit 2-facher Geschwindigkeit gerendert. Maßstabsbalken = 5 μm. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.
Ergänzendes Video 2: GCaMP6f-Fluoreszenz in einer wirbelsäulenartigen Projektion auf den AVA-Neuriten. Das Video wurde mit 2-facher Geschwindigkeit gerendert. Maßstabsbalken = 5 μm. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.
Ergänzendes Video 3: MitoGCaMP-Fluoreszenz in der AVA-Neuriten-synchronisierten mitochondrialen Kalziumaufnahme. Das Video wurde mit 4-facher Geschwindigkeit gerendert. Maßstabsbalken = 5 μm. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.
Ergänzendes Video 4: MitoGCaMP-Fluoreszenz in den AVA-Neuriten - schnelle Aufnahme und Freisetzung von Kalzium durch die Mitochondrien. Das Video wurde mit 4-facher Geschwindigkeit gerendert. Maßstabsbalken = 5 μm. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.
Ergänzende Tabelle 1: Genetische Reagenzien und Stämme, die in dieser Studie verwendet wurden. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
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Discussion
Die erste Überlegung bei der Implementierung der beschriebenen Methode betrifft die Auswahl eines Ca2+ Indikators mit idealen Eigenschaften für die gegebene Forschungsfrage. Zytoplasmatische Ca 2+-Indikatoren haben typischerweise eine hohe Affinität zu Ca 2+, und die Sensitivität dieser Indikatoren gegenüber Ca 2+ steht in umgekehrtem Verhältnis zur Kinetik (Ein-/Ausschaltrate)16,17. Dies bedeutet, dass entweder die Empfindlichkeit oder die Kinetik von Ca2+ basierend auf dem interessierenden Phänomen priorisiert werden muss. Für subzelluläre Kompartimente mit relativ hohen basalen Ca 2+-Spiegeln, wie z. B. dem ER, sollten Ca 2+-Indikatoren mit niedriger Ca 2+-Affinität in Betracht gezogen werden18. Um rekombinante DNA für die zellspezifische Expression eines Ca2+-Indikators zu erzeugen, sollte die bevorzugte Klonierungstechnik verwendet werden, um einen zellspezifischen Promotor19,20 gefolgt von demCa2+-Indikator der Wahl und einer 3'-UTR einzufügen. Relativ hohe Expressionsniveaus in den AVA-Neuronen können erreicht werden, indem ein Plasmid mit den Promotoren Pflp-18 oder Prig-3, einem let-858 oder unc-54 3' UTR konstruiert und dieses Plasmid mit 15-25 ng/μL mikroinjiziert wird (siehe ergänzende Tabelle 1).
Die erfolgreiche Mikroinjektion der Plasmide, die den Ca 2+ Indikator und lin-15+ enthalten, in die Keimdrüse von lin-15(n765ts) mutierten Würmern wird einen F1-Nachkommen hervorbringen, der den Ca2+ Indikator exprimiert und für den Multivulva-Phänotyp gerettet wird. Nur eine Untergruppe (30%-80%) der F1-Generation wird die synthetische DNA an die F2-Generation übertragen. Die Expression des Ca2+-Indikators sollte bei den geretteten F2- oder F3-Nachkommen auf Platten mit <60%iger Transmission der synthetischen DNA durch Einbettung und Bildgebung der Fluoreszenz bei 1 Tag alten Erwachsenen beurteilt werden, die für den Multivulva-Phänotyp gerettet wurden. Das ideale Expressionsniveau wird auf der Grundlage der Eigenschaften und der Lage des Ca2+-Indikators sowie der biologischen Fragestellung bestimmt. Wenn eine schnelle Bildaufnahme gewünscht wird, ist eine relativ hohe Expression ideal. Es wurde jedoch festgestellt, dass eine extrem hohe Expression von Ca2+-Indikatoren eine subzelluläre Fehllokalisation sowie eine unspezifische Expression in anderen Zellen oder Geweben verursacht.
Genetisch kodierte Ca 2+ Indikatoren werden häufig für In-vivo-Analysen von Ca2+ in C. elegans sowie in anderen Modellorganismen eingesetzt. Einige dieser Studien haben eine einzelzellige Überwachung des Ca 2+-Spiegels im neuronalen Zellkörpererreicht 21,22,23,24. Messungen des Ca 2+ Einstroms in neuronalen Subkompartimenten wurden in vivo sowohl in C. elegans als auch in Wirbeltiersystemen durchgeführt, jedoch nur durch die Aufzeichnung der Ca 2+ Indikatoraktivität in einem ganzen Neuriten25,26 oder Populationen von Dendriten 27. Obwohl die Messung der Ca 2+-Aktivität in neuronalen Zellkörpern und Dendriten als Ganzes die Spiking-Aktivität der Zelle widerspiegelt, erlaubt sie nicht die Beobachtung der Dynamik des Ca 2+-Einstroms (d. h. der Richtung oder Geschwindigkeit der Ausbreitung) oder von Ca 2+-Transienten unter dem Schwellenwert. Nur wenige In-vivo-Studien waren in der Lage, die Handhabung von Ca2+ in Neuronen in der hier gezeigten räumlichen und zeitlichen Auflösung zu erkennen. Es sollte beachtet werden, dass die zeitliche Dynamik des Ca 2+-Einstroms in den meisten C. elegans-Neuronen 28 langsamer zu sein scheint als in Wirbeltierneuronen29, so dass es wahrscheinlich ist, dass dieses schnelle Bildgebungsprotokoll nicht ausreicht, um ähnliche zeitliche Dynamiken in Wirbeltiersystemen zu erfassen. Jüngste Fortschritte in der Zwei-Photonen-Mikroskopie ermöglichen jedoch die ultraschnelle (120 Hz), subzelluläre Bildgebung von Kalzium in einzelnen Hippocampus-Dendriten in sich frei verhaltenden Mäusen30, was vielversprechend ist, um eine ähnliche hochauflösende Ca2+-Bildgebung bei Wirbeltieren zu erreichen.
Es ist wichtig zu beachten, dass dieser nicht-ratiometrische Ansatz für die In-vivo-Ca2+-Bildgebung die Verwendung von Muscimol erfordert, das die Kontraktion der Körperwandmuskulatur hemmt und so die Wurmbewegung während der Bildgebung einschränkt31. Wenn es während der Bildgebung zu einer übermäßigen Bewegung kommt (konsistente Bewegung bei mehr als ~20% der Würmer), sollte eine neue Walzlösung mit einem frisch aufgetauten Aliquot von Muscimol hergestellt werden, und die Zeit, für die ein Wurm vor dem Walzen in der Rollenlösung badet, sollte verlängert werden. Muscimol ist ein GABA-Rezeptor-Agonist, was bedeutet, dass es GABAerge Neuronen hemmt, einschließlich derjenigen, die den AVA-Neuronen Input liefern. Darüber hinaus exprimieren viele exzitatorische Neuronen, einschließlich AVA, niedrige Spiegel von GABA-Rezeptoren, so dass es wahrscheinlich ist, dass die Verwendung von Muscimol in diesem Protokoll die neuronale Aktivität verringert. Mit diesem Protokoll wird die spontane Aktivierung von AVA in Gegenwart von Muscimol jedoch nur um ~29% reduziert (unveröffentlichte Daten). Die Aktivierung anderer Neuronen kann durch Muscimol drastischer verringert werden, und dies kann getestet werden, indem Muscimol durch Muscimol in der Rolllösung ersetzt wird und eine Bildgebung im neuronalen Zellkörper bei geringer Vergrößerung durchgeführt wird32. Eine Alternative zur Verwendung von Muscimol wäre die Verwendung eines ratiometrischenCa2+-Indikators33,34, der eine Fluoreszenzkorrektur aufgrund von Wurmbewegungen ermöglichen würde. Der Nachteil dieses Ansatzes besteht darin, dass er einen optischen Aufbau erfordert, der eine Bildgebung mit zwei Wellenlängen ermöglicht, und die Möglichkeit einschränkt, einen Ca2+-Indikator in Kombination mit vielen anderen Fluoreszenzwerkzeugen zu verwenden.
Eine wesentliche Einschränkung des beschriebenen Mikroskopiesystems ist die Reduzierung des emittierten Lichts durch die rotierende Scheibe, was zu einem Informationsverlust führt. Dieses System könnte modifiziert werden, um eine bessere Erfassung des emittierten Lichts zu ermöglichen, indem eine Scheibe mit Stiftlöchern mit größerem Durchmesser implementiert wird. Diese Änderung würde jedoch die axiale Auflösung (z-Ebene) verringern und die Hintergrundfluoreszenz erhöhen. Ein weiterer möglicher Mikroskopieaufbau für diesen Zweck wäre das Fast-Scanning-Light-Sheet-Mikroskop, das in den letzten Jahren verbessert wurde, um eine schnelle (bis zu 50 Hz) Bildgebung in situ und in vivo zu ermöglichen 35.
Die Untersuchung der raumzeitlichen Dynamik von zytoplasmatischem und mitochondrialem Ca 2+ wird ein besseres Verständnis dafür ermöglichen, wie lokale Ca2+-Transienten und sogar unterschwellige Ereignisse kalziumabhängige Signalübertragung auslösen oder die mitochondriale Biologie modulieren können. Diese subzelluläre in vivo Ca2+ Bildgebung könnte besonders nützlich sein für die Untersuchung der synaptischen Plastizität, aktivitätsabhängiger Veränderungen im neuronalen Stoffwechsel und der homöostatischen Modulation der neuronalen Erregbarkeit. Weitere Untersuchungen, wie sich lokale, subzelluläre Umgebungen an definierte Zustände neuronaler Aktivität anpassen (d.h. räumlich spezifische Konzentrationen und Lebensdauer von Ca 2+), würden Aufschluss darüber geben, wie Ca2+-Dyshomöostase zu pathogenen Veränderungen der neuronalen Funktion führt. Die Möglichkeit, dies in einem lebenden, intakten Organismus zu untersuchen, ist besonders nützlich, da sie Längsschnittstudien ermöglicht, die Aufschluss darüber geben würden, wie und warum sich die Ca2+-Homöostase mit natürlichem Altern und krankheitsbedingter Neurodegeneration verändert. Die Anwendung dieser Methode zur Untersuchung des Alterns und der Neurodegeneration ist etwas auf das frühe biologische Alter von C. elegans (<4 Tage im Erwachsenenalter) beschränkt. In der Tat ist die physische Manipulation während des Montierens und Positionierens der Würmer für die Bildgebung nach etwa 5 Tagen im Erwachsenenalter schwierig, wenn die Würmer aufgrund des verminderten Muskeltonus und der Integrität der Kutikula schlaff werden.
Die schnelle In-vivo-Bildgebung der Dynamik und des subzellulären Umgangs mit Ca2+ wird entscheidend dazu beitragen, zu verstehen, wie neuronale Erregbarkeit und intrazelluläre Signalübertragung räumlich und zeitlich fein reguliert werden. Dieses Protokoll könnte aufgrund der Vielfalt der Ca2+-abhängigen Prozesse und ihrer zentralen Rolle in der neuronalen Funktion einem breiten Spektrum von Forschung und Forschern in vielen Bereichen zugute kommen. Zum Beispiel würde die Anwendung dieser Methode in gesunden Neuronen Aufschluss darüber geben, warum ein erhöhter zytoplasmatischerCa2+-Wert während des Alterns in Verbindung mit Beeinträchtigungen der synaptischen Plastizität, ineffizienter mitochondrialer Atmung sowie anderen Funktionsstörungen auftritt36,37. Darüber hinaus könnte diese Methode verwendet werden, um die Ursachen der altersassoziierten Ca2+-Dyshomöostasezu untersuchen 38. Die Anwendung dieser Methode auf Fragen des Alterns und der Neurodegeneration ist jedoch etwas auf die frühen Stadien des Alterns (<5 Tage im Erwachsenenalter) beschränkt38. Wie bereits erwähnt, ist die Bildgebung älterer adulter Würmer (>5 Tage im Erwachsenenalter) mit unserer Rolling-Methode schwierig, aber Fortschritte in der Mikrofluidik von C. elegans sind vielversprechend für die Bildgebung mit einer ähnlichen räumlichen Auflösung für bis zu 12 Tage im Erwachsenenalter39,40.
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Disclosures
Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von den National Institutes of Health (NIH) unterstützt (R01- NS115947 verliehen an F. Hoerndli). Wir bedanken uns auch bei Dr. Attila Stetak für das pAS1-Plasmid.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100x/1.40 Oil objective | Olympus | UPlanSApo | |
| 10x/0.40 Objective | Olympus | UPlanSApo | |
| 22 mm x 22 mm Cover glass | VWR | 48366-227 | |
| Agarose SFR | VWR | J234-100G | |
| Beam homogenizer | Andor Technologies | Borealis upgrade to CSU-X1 | |
| CleanBench laboratory table | TMC | With vibration control | |
| Disposable culture tubes | VWR | 47729-572 | 13 mm x 100 mm |
| Environmental chamber | Thermo Scientific | 3940 | Set to 20 °C |
| Filter wheel or slider | ASI | For 25 mm diameter filters | |
| FJH 185 | Caenorhabditis Genetics Center | FJH 185 | Worm strain |
| FJH 597 | Caenorhabditis Genetics Center | FJH 597 | Worm strain |
| GFP bandpass emission filter | Chroma | 525 ± 50 nm (25 mm diameter) | |
| ILE laser combiner | Andor Technologies | 4 laser lines | |
| ILE solid state 488 nm laser | Andor Technologies | 50 mW | |
| ImageJ | National Institutes of Health | Version 1.52a | |
| IX83 Spinning disk confocal microscope | Olympus | With Yokogawa CSU-X1 spinning disc | |
| iXon Ultra EMCCD camera | Andor Technologies | ||
| Low auto-fluorescence immersion oil | Olympus | Z-81226 | |
| MetaMorph | Molecular Devices | Version 7.10.1 | |
| Microscope control box | Olympus | IX3-CBH | |
| Muscimol | MP Biomedical / Sigma | 02195336-CF | |
| pAS1 | AddGene | 194970 | Plasmid |
| pBSKS | Stratagene | ||
| pCT61 | Plasmid available from Hoerndli/Maricq lab upon request | ||
| pJM23 | Plasmid available from Hoerndli/Maricq lab upon request | ||
| pKK1 | AddGene | 194969 | Plasmid |
| Polybead microspheres | Polysciences Inc. | 00876-15 | 0.094 µm |
| Stability chamber | Norlake Scientific | NSRI241WSW/8H | Set to 15 °C |
| Stage controller | ASI | With filter wheel control | |
| Standard microscope slide | Premiere | 9108W-E | 75 mm x 25 mm x 1 mm |
| Touch panel controller | Olympus | I3-TPC | |
| Z-drift corrector | Olympus | IX3-ZDC2 |
References
- Berridge, M. J.
- Brini, M., Calì, T., Ottolini, D., Carafoli, E. Neuronal calcium signaling: Function and dysfunction. Cellular and Molecular Life Sciences. 71 (15), 2787-2814 (2014).
- Brini, M., Calì, T., Ottolini, D., Carafoli, E. Intracellular calcium homeostasis and signaling. Metal Ions in Life Sciences. 12, 119-168 (2013).
- Berridge, M. J. The inositol trisphosphate/calcium signaling pathway in health and disease. Physiological Reviews. 96 (4), 1261-1296 (2016).
- Schrank, S., Barrington, N., Stutzmann, G. E. Calcium-handling defects and neurodegenerative disease. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 12 (7), 035212 (2020).
- Pchitskaya, E., Popugaeva, E., Bezprozvanny, I. Calcium signaling and molecular mechanisms underlying neurodegenerative diseases. Cell Calcium. 70, 87-94 (2018).
- Jadiya, P., et al. Impaired mitochondrial calcium efflux contributes to disease progression in models of Alzheimer's disease. Nature Communications. 10 (1), 3885 (2019).
- Zeiser, E., Frøkjær-Jensen, C., Jorgensen, E., Ahringer, J. MosSCI and gateway compatible plasmid toolkit for constitutive and inducible expression of transgenes in the C. elegans germline. PLoS One. 6 (5), 20082 (2011).
- Zhu, B., Cai, G., Hall, E. O., Freeman, G. J. In-FusionTM assembly: Seamless engineering of multidomain fusion proteins, modular vectors, and mutations. Biotechniques. 43 (3), 354-359 (2007).
- Evans, T. C.
- Giordano-Santini, R., Dupuy, D. Selectable genetic markers for nematode transgenesis. Cellular and Molecular Life Sciences. 68 (11), 1917-1927 (2011).
- Stiernagle, T.
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans: Transferring worms grown on NGM plates. WormBook. , (2006).
- Ogama, T. A beginner's guide to improving image acquisition in fluorescence microscopy. The Biochemist. 42 (6), 22-27 (2020).
- Mellem, J. E., Brockie, P. J., Madsen, D. M., Maricq, A. v Action potentials contribute to neuronal signaling in C. elegans. Nature Neuroscience. 11 (8), 865-867 (2009).
- Zhang, Y., et al. Fast and sensitive GCaMP calcium indicators for imaging neural populations. bioRxiv. , (2021).
- Kerruth, S., Coates, C., Dürst, C. D., Oertner, T. G., Török, K. The kinetic mechanisms of fast-decay red-fluorescent genetically encoded calcium indicators. Journal of Biological Chemistry. 294 (11), 3934-3946 (2019).
- de Juan-Sanz, J., et al. Axonal endoplasmic reticulum Ca2+ content controls release probability in CNS nerve terminals. Neuron. 93 (4), 867-881 (2017).
- Bhatla, N. C. elegans neural network. , Available from: http://wormweb.org/neurainet#c=BAG&m=1 (2014).
- Fung, W., Wexler, L., Heiman, M. G. Cell-type-specific promoters for C. elegans glia. Journal of Neurogenetics. 34 (3-4), 335-346 (2020).
- Ali, F., Kwan, A. C. Interpreting in vivo calcium signals from neuronal cell bodies, axons, and dendrites: a review. Neurophotonics. 7 (1), 011402 (2019).
- Tian, L., et al. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nature Methods. 6 (12), 875-881 (2009).
- Mank, M., et al. A genetically encoded calcium indicator for chronic in vivo two-photon imaging. Nature Methods. 5 (9), 805-811 (2008).
- Birkner, A., Tischbirek, C. H., Konnerth, A. Improved deep two-photon calcium imaging in vivo. Cell Calcium. 64, 29-35 (2017).
- Ryan, K. C., Laboy, J. T., Norman, K. R. Deregulation of mitochondrial calcium handling due to presenilin loss disrupts redox homeostasis and promotes neuronal dysfunction. Antioxidants. 11 (9), 1642 (2022).
- Yang, H. H., et al. Subcellular imaging of voltage and calcium signals reveals neural processing in vivo. Cell. 166 (1), 245-257 (2016).
- Takahashi, N., Oertner, T. G., Hegemann, P., Larkum, M. E. Active cortical dendrites modulate perception. Science. 354 (6319), 1587-1590 (2016).
- Nicoletti, M., et al. Biophysical modeling of C. elegans neurons: Single ion currents and whole-cell dynamics of AWCon and RMD. PLoS One. 14 (7), 0218738 (2019).
- Church, P. J., Stanley, E. F. Single L-type calcium channel conductance with physiological levels of calcium in chick ciliary ganglion neurons. The Journal of Physiology. 496, 59-68 (1996).
- O'Hare, J. K., et al. Compartment-specific tuning of dendritic feature selectivity by intracellular Ca 2+ release. Science. 375 (6586), (2022).
- Mclntire, S. L., Jorgensen, E., Horvitz, H. R. Genes required for GABA function in Caenorhabditis elegans. Nature. 364 (6435), 334-337 (1993).
- Doser, R. L., Amberg, G. C., Hoerndli, F. J. Reactive oxygen species modulate activity-dependent AMPA receptor transport in C. elegans. The Journal of Neuroscience. 40 (39), 7405-7420 (2020).
- Wu, J., et al. A long Stokes shift red fluorescent Ca2+ indicator protein for two-photon and ratiometric imaging. Nature Communications. 5, 5262 (2014).
- Cho, J. -H., et al. The GCaMP-R family of genetically encoded ratiometric calcium indicators. ACS Chemical Biology. 12 (4), 1066-1074 (2017).
- Smith, J. J., et al. A light sheet fluorescence microscopy protocol for Caenorhabditis elegans larvae and adults. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 1012820 (2022).
- Müller, M., et al. Mitochondria and calcium regulation as basis of neurodegeneration associated with aging. Frontiers in Neuroscience. 12, 470 (2018).
- Nikoletopoulou, V., Tavernarakis, N.
- Chen, C. -H., Chen, Y. -C., Jiang, H. -C., Chen, C. -K., Pan, C. -L. Neuronal aging: Learning from C. elegans. Journal of Molecular Signaling. 8 (1), 14 (2013).
- Saberi-Bosari, S., Huayta, J., San-Miguel, A. A microfluidic platform for lifelong high-resolution and high throughput imaging of subtle aging phenotypes in C. elegans. Lab on a Chip. 18 (20), 3090-3100 (2018).
- Sridhar, N., Fajrial, A. K., Doser, R. L., Hoerndli, F. J., Ding, X. Surface acoustic wave microfluidics for repetitive and reversible temporary immobilization of C. elegans. Lab on a Chip. 22 (24), 4882-4893 (2022).
