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Neuroscience

विवो में न्यूरोनल कैल्शियम हैंडलिंग की उपकोशिकीय इमेजिंग

Published: March 17, 2023 doi: 10.3791/64928
Automatic Translation
*1, *1,2, 1, 1
1Department of Biomedical Sciences, Colorado State University College of Veterinary Medicine and Biomedical Sciences, 2Cellular and Molecular Biology Graduate Program, Colorado State University College of Veterinary Medicine and Biomedical Sciences
* These authors contributed equally

Summary

वर्तमान तरीकों में आसानी से उपलब्ध आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड कैल्शियम संकेतकों का उपयोग करके केनोरहाब्डिस एलिगेंस में विवो में उच्च-रिज़ॉल्यूशन, उप-कंपार्टमेंटल कैल्शियम इमेजिंग के लिए एक गैर-अनुपातमीट्रिक दृष्टिकोण का वर्णन किया गया है।

Abstract

कैल्शियम (सीए 2 +) इमेजिंग का उपयोग बड़े पैमाने पर न्यूरोनल गतिविधि की जांच करने के लिए किया गया है, लेकिन यह तेजी से स्पष्ट हो रहा है कि उपकोशिकीय सीए2 + हैंडलिंग इंट्रासेल्युलर सिग्नलिंग का एक महत्वपूर्ण घटक है। विवो में उपकोशिकीय सीए2 + गतिशीलता का विज़ुअलाइज़ेशन, जहां न्यूरॉन्स को उनके मूल, बरकरार सर्किटरी में अध्ययन किया जा सकता है, जटिल तंत्रिका तंत्र में तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण साबित हुआ है। नेमाटोड केनोरहाब्डिस एलिगेंस की पारदर्शिता और अपेक्षाकृत सरल तंत्रिका तंत्र सेल-विशिष्ट अभिव्यक्ति और फ्लोरोसेंट टैग और संकेतकों के विवो विज़ुअलाइज़ेशन में सक्षम करता है। इनमें फ्लोरोसेंट संकेतक हैं जिन्हें साइटोप्लाज्म के साथ-साथ माइटोकॉन्ड्रिया जैसे विभिन्न उपकोशिकीय डिब्बों में उपयोग के लिए संशोधित किया गया है। यह प्रोटोकॉल एक उपकोशिकीय संकल्प के साथ विवो में गैर-अनुपातमीट्रिक सीए 2 + इमेजिंग को सक्षम करता है जो व्यक्तिगत डेंड्राइटिक स्पाइन और माइटोकॉन्ड्रिया के स्तर तक सीए2 + गतिशीलता के विश्लेषण की अनुमति देता है। यहां, विभिन्न सीए 2 + समानताओं के साथ दो उपलब्ध आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड संकेतकों का उपयोग उत्तेजक इंटरन्यूरॉन (एवीए) की एक जोड़ी में साइटोप्लाज्म या माइटोकॉन्ड्रियल मैट्रिक्स के भीतर सापेक्ष सीए2 + स्तरों को मापने के लिए इस प्रोटोकॉल के उपयोग को प्रदर्शित करने के लिए किया जाता है। एलिगेंस में संभव आनुवंशिक जोड़तोड़ और अनुदैर्ध्य टिप्पणियों के साथ, यह इमेजिंग प्रोटोकॉल इस बारे में सवालों के जवाब देने के लिए उपयोगी हो सकता है कि सीए2 + हैंडलिंग न्यूरोनल फ़ंक्शन और प्लास्टिसिटी को कैसे नियंत्रित करता है।

Introduction

कैल्शियम आयन (सीए2 +) कई सेल प्रकारों में जानकारी के अत्यधिक बहुमुखी वाहक हैं। न्यूरॉन्स में, सीए 2 + न्यूरोट्रांसमीटर की गतिविधि-निर्भर रिहाई, साइटोस्केलेटल गतिशीलता के विनियमन, चयापचय प्रक्रियाओं की बारीक-ट्यूनिंग, साथ ही उचित न्यूरोनल रखरखाव और कार्य 1,2 के लिए आवश्यक कई अन्य तंत्रों के लिए जिम्मेदार है। प्रभावी इंट्रासेल्युलर सिग्नलिंग सुनिश्चित करने के लिए, न्यूरॉन्स को अपने साइटोप्लाज्म3 में कम बेसल सीए2 + स्तर बनाए रखना चाहिए। यह सहकारी सीए 2 + हैंडलिंग तंत्र द्वारा पूरा किया जाता है, जिसमें एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम (ईआर) और माइटोकॉन्ड्रिया जैसे ऑर्गेनेल में सीए2 + का उत्थान शामिल है। ये प्रक्रियाएं, प्लाज्मा झिल्ली में सीए 2 + -पारगम्य आयन चैनलों की व्यवस्था के अलावा, पूरे न्यूरॉन में साइटोप्लाज्मिक सीए2 + के विषम स्तर के परिणामस्वरूप होती हैं।

आराम और न्यूरोनल सक्रियण के दौरान सीए 2 + विषमता सीए2 + -निर्भर तंत्र1 के विविध, स्थान-विशिष्ट विनियमन की अनुमति देती है। सीए 2 + के एकाग्रता-विशिष्ट प्रभावों का एक उदाहरण इनोसिटोल 1,4,5-ट्राइस्फॉस्फेट (आईएनएसपी3) रिसेप्टर्स के माध्यम से ईआर से सीए2 + की रिहाई है। रिसेप्टर के कैल्शियम-पारगम्य छिद्र के उद्घाटन के लिए आईएनएसपी3 के साथ संयोजन में कम सीए2 + स्तर की आवश्यकता होती है। वैकल्पिक रूप से, उच्च सीए2 + स्तर प्रत्यक्ष और अप्रत्यक्ष रूप से रिसेप्टर4 को रोकते हैं। उचित न्यूरोनल फ़ंक्शन के लिए सीए 2 + होमियोस्टैसिस का महत्व सबूतों से समर्थित है जो बताते हैं कि बाधित इंट्रासेल्युलर सीए2 + हैंडलिंग और सिग्नलिंग न्यूरोडीजेनेरेटिव विकारों औरप्राकृतिक उम्र बढ़ने 5,6 के रोगजनन में एक प्रारंभिक कदम है। विशेष रूप से, ईआर और माइटोकॉन्ड्रिया द्वारा असामान्य सीए2 + अपटेक और रिलीज अल्जाइमर रोग, पार्किंसंस रोग और हंटिंगटन रोग 6,7 में न्यूरोनल डिसफंक्शन की शुरुआत से जुड़ा हुआ है।

प्राकृतिक उम्र बढ़ने या न्यूरोडीजेनेरेशन के दौरान सीए 2 + डिस्होमोस्टेसिस के अध्ययन के लिए एक जीवित, बरकरार जीव में उपकोशिकीय संकल्प के साथ सीए2 + स्तरों के अनुदैर्ध्य अवलोकन की आवश्यकता होती है जिसमें देशी सेलुलर वास्तुकला (यानी, सिनैप्स की व्यवस्था और आयन चैनलों का वितरण) बनाए रखा जाता है। इसके लिए, यह प्रोटोकॉल उच्च स्थानिक और लौकिक रिज़ॉल्यूशन के साथ विवो में सीए 2 + गतिशीलता को रिकॉर्ड करने के लिए दो आसानी से उपलब्ध, आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड सीए2 + सेंसर के उपयोग पर मार्गदर्शन प्रदान करता है। एलिगेंस में वर्णित विधि का उपयोग करके प्राप्त प्रतिनिधि परिणाम दर्शाते हैं कि एकल न्यूरॉन्स के साइटोप्लाज्म या माइटोकॉन्ड्रियल मैट्रिक्स में सीए 2 + संकेतकों की अभिव्यक्ति फ्लोरोसेंट छवियों (50 हर्ट्ज तक) के तेजी से अधिग्रहण की अनुमति दे सकती है जो एकल रीढ़ जैसी संरचनाओं और व्यक्तिगत माइटोकॉन्ड्रिया के भीतर सीए 2 + स्तरों को समझने की अतिरिक्त क्षमता के साथ सीए 2 + गतिशीलता को चित्रित करती है।

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Protocol

1. ट्रांसजेनिक उपभेदों का निर्माण

  1. विकल्प 8,9 की क्लोनिंग विधि का उपयोग करते हुए, क्लोन अभिव्यक्ति वैक्टर में पीएफएलपी -18 या प्रिग -3 प्रमोटर (वेंट्रल तंत्रिका कॉर्ड में एवीए-विशिष्ट संकेत के लिए) शामिल हैं, इसके बाद सीए2 + पसंद का संकेतक है, और फिर 3 ' यूटीआर (अधिक जानकारी के लिए चर्चा देखें) 10। प्लास्मिड और उनके स्रोतों की एक सूची पूरक तालिका 1 में पाई जा सकती है।
  2. डीएनए मिश्रण के माइक्रोइंजेक्शन के माध्यम से ट्रांसजेनिक उपभेदों के निर्माण के लिए स्थापित प्रोटोकॉल का पालन करें (<100 एनजी / μL; प्रत्येक प्लास्मिड की सांद्रता के लिए पूरक तालिका 1 देखें) जिसमें सीए 2 + संकेतक ट्रांसजीन (~ 20 एनजी / μL) और बचाव डीएनए लिन -15 + (चयन मार्कर) शामिल हैं। लिन -15 (एन 765 टी); फेनोटाइप: मल्टी-वल्वा)10,11।
    नोट। तापमान-संवेदनशील उत्परिवर्तन को दबाने के लिए लिन -15 (एन 765 टी) माता-पिता को 15 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखें।
  3. इंजेक्शन वाले माता-पिता को 20 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखें जब तक कि एफ 1 संतान वयस्कता तक नहीं पहुंच जाती है ताकि मल्टी-वल्वा फेनोटाइप की अनुपस्थिति का उपयोग करके ट्रांसजेनिक चयन की अनुमति मिल सके।
  4. क्लोनल मार्ग13 वयस्क एफ 1 संतान जिसमें मल्टी-वल्वा फेनोटाइप नहीं होता है क्योंकि यह सीए2 + संकेतक11 युक्त एक्स्ट्राक्रोमोसोमल सरणी की अभिव्यक्ति को इंगित करता है।
  5. एफ 2 या एफ 3 संतान ों में सीए2 + संकेतक की अभिव्यक्ति का आकलन करें जिसमें 1 दिन के वयस्कों को माउंट और इमेजिंग करके बहु-वल्वा फेनोटाइप नहीं है जैसा कि बाद में खंड 3 में वर्णित है।
    नोट। यहां वर्णित छवियों के तेजी से अधिग्रहण के लिए संकेतक की अपेक्षाकृत उच्च अभिव्यक्ति की आवश्यकता होती है (अधिक विस्तार के लिए चर्चा देखें)।
  6. सीए2 + संकेतक की इष्टतम अभिव्यक्ति के साथ ट्रांसजेनिक उपभेदों की अगली पीढ़ियों पर प्रयोग करें (अधिक विस्तार के लिए चर्चा देखें), मानक परिस्थितियों में उपभेदों को बनाए रखना (एनजीएम प्लेटों पर 20 डिग्री सेल्सियस)12।

2. ऑप्टिकल सेटअप

  1. दीर्घकालिक समय-चूक इमेजिंग में सक्षम माइक्रोस्कोप का उपयोग करें।
    नोट। प्रतिनिधि डेटा 488 एनएम और 561 एनएम उत्तेजना लेजर से लैस एक उल्टे स्पिनिंग डिस्क कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करके प्राप्त किया गया था।
  2. कीड़े के कच्चे स्थानीयकरण के लिए कम-आवर्धन उद्देश्य (यानी, 10x / 0.40) का उपयोग करें।
  3. उपकोशिकीय संकल्प प्राप्त करने के लिए, उच्च-आवर्धन उद्देश्य का उपयोग करके न्यूरॉन्स पर स्विच करें और स्थानीयकृत करें।
    नोट। इस अध्ययन में प्रतिनिधि डेटा प्राप्त करने के लिए 100x/ 1.40 NA तेल उद्देश्य का उपयोग किया गया था।
  4. तेजी से छवि अधिग्रहण (>50 एफपीएस) में सक्षम एक अल्ट्रा-संवेदनशील कैमरे का उपयोग करके छवियों को प्राप्त करें।
  5. पसंद के सीए2 + संकेतक के लिए एक मानक उत्सर्जन फ़िल्टर का उपयोग करें (यानी, GCaMP6f और mitoGCaMP के लिए 525 nm ± 50 nm उत्सर्जन फ़िल्टर)।
  6. 10 सेकंड से अधिक समय तक छवि धाराओं के अधिग्रहण के लिए जेड-ड्रिफ्ट सुधारक (जेडडीसी) जोड़ें, क्योंकि इमेजिंग सत्र के दौरान अगर पैड के निर्जलीकरण के कारण न्यूराइट कई सेकंड के भीतर फोकस से बाहर हो जाता है।
    नोट। यदि एक माइक्रोस्कोपी सेट-अप जेडडीसी के लिए अनुमति नहीं देता है, या यदि लंबी (>20 मिनट) इमेजिंग अवधि वांछित है, तो निर्जलीकरण को धीमा करने के लिए आगर पैड के चारों ओर सिलिकॉन ग्रीस या पिघला हुआ पेट्रोलियम जेली की सीमा लागू करें।

3. इमेजिंग के लिए कीड़े की तैयारी

  1. अगर पैड तैयार करना
    1. एम 9 12 में आणविक ग्रेड एगर को 13 मिमी x 100 मिमी ग्लास कल्चर ट्यूब में घोलकर और कई सेकंड के लिए माइक्रोवेविंग करके10 % एगर का 3 एमएल बनाएं ( सामग्री की तालिका देखें)।
      नोट। पिघले हुए आगर को 1 घंटे तक गर्मी ब्लॉक पर रखा जा सकता है या हर बार जब आगर पैड की आवश्यकता होती है तो ताजा बनाया जा सकता है।
    2. दो अतिरिक्त स्लाइडों के बीच एक माइक्रोस्कोप स्लाइड रखें जिनमें से प्रत्येक में प्रयोगशाला टेप की दो परतें हों (चित्रा 1 ए-आई देखें)।
    3. 1,000 μL पिपेट टिप (फ़िल्टर के बिना) की नोक को काटें, और इसका उपयोग केंद्र कवरस्लिप (चित्रा 1 ए-आई) पर आगर की एक छोटी बूंद को पिपेट करने के लिए करें।
    4. आगर के शीर्ष पर एक और स्लाइड दबाकर आगर को समतल करें (चित्र 1 ए-ii)।
    5. ठंडा होने के बाद, 13 मिमी x 100 मिमी ग्लास कल्चर ट्यूब (चित्रा 1 ए-iii) के उद्घाटन का उपयोग करके आगर को एक छोटी डिस्क में काट लें, और फिर आसपास के आगर को हटा दें।
  2. कीड़ा-रोलिंग समाधान तैयार करना
    1. 30 एमएम स्टॉक बनाने के लिए एम 9 में म्यूसिमोल पाउडर घोलें। 50 μL एलिकोट में अलग करें, और 4 °C पर स्टोर करें।
    2. हर 3-5 दिनों में 30 mM muscimol का एक नया एलिकोट पिघलाएं (और उपयोग में रहते हुए 20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें)।
    3. रोलिंग समाधान बनाने के लिए पॉलीस्टाइनिन मोतियों के साथ 1: 1 अनुपात में 30 एमएम म्यूसिमोल स्टॉक को पतला करें।
  3. इमेजिंग के लिए एक कीड़े की स्थिति
    1. आगर पैड के केंद्र पर रोलिंग समाधान के 1.6 μL रखें।
      नोट: तरल की मात्रा को छोटे (कम) या पुराने जानवरों (अधिक) की इमेजिंग के लिए समायोजित किया जाना चाहिए।
    2. पसंदीदा वर्म पिक (यानी, एक ग्लास या प्लैटिनम वायर पिक) 13 का उपयोग करके, मल्टी-वल्वा फेनोटाइप11 के बिना वांछित आयु के एक कीड़े को आगर पैड पर रोलिंग समाधान में स्थानांतरित करें (चित्रा 1 ए-iv)।
      नोट। प्रतिनिधि डेटा 1 दिन पुराने हेर्मैफ्रोडाइट्स (जीसीएएमपी 6 एफ स्ट्रेन = एफजेएच 185; माइटोजीसीएएमपी स्ट्रेन; एफजेएच 597; पूरक तालिका 1 देखें, जिसे अंडे की केवल एक पंक्ति की उपस्थिति से पहचाना जा सकता है। विभिन्न उम्र के कीड़े के साथ काम करने पर अधिक जानकारी के लिए चर्चा देखें।
    3. कीड़े की गति को कम करने के लिए म्यूसिमोल के लिए ~ 5 मिनट तक प्रतीक्षा करें, और फिर आगर पैड के शीर्ष पर 22 मिमी x 22 मिमी कवरस्लिप गिराएं, शारीरिक रूप से कीड़े की गति को प्रतिबंधित करें।
    4. वेंट्रल तंत्रिका कॉर्ड में इमेजिंग न्यूरॉइट्स के लिए, कवरस्लिप को हल्के से स्लाइड करके चित्रा 1 बी, सी में दिखाए गए अभिविन्यास में कीड़े को रोल करें।
      नोट। उदर तंत्रिका कॉर्ड की कल्पना करने के लिए, कीड़े को सिर के साथ ऊपर की ओर रखें, और कीड़े को तब तक रोल करें जब तक कि आंत समीपस्थ भाग के दाईं ओर न हो और बाईं ओर कीड़े के बाहर के हिस्से के लिए (दर्शक के दृष्टिकोण से)। पृष्ठीय तंत्रिका कॉर्ड में इमेजिंग न्यूरॉइट्स के लिए इस अभिविन्यास (चित्रा 1 सी) को उलटा करें।
  4. माइक्रोस्कोप पर कीड़े को माउंट करना
    1. माइक्रोस्कोप स्टेज पर चढ़ाने से पहले कवरस्लिप पर विसर्जन तेल की एक बूंद रखें।
    2. ब्राइटफील्ड में कम-आवर्धन उद्देश्य (10x) उद्देश्य का उपयोग करके कीड़ा ढूंढें।
    3. 100x उद्देश्य पर स्विच करें, और फ़ोकस समायोजित करें।
    4. 488 एनएम इमेजिंग लेजर के साथ जीसीएएमपी या माइटोजीसीएएमपी की रोशनी का उपयोग करके एवीए न्यूराइट का पता लगाएं।
      नोट: कीड़े को दबाने या कवरस्लिप को खींचने से रोकने के लिए छोटे समायोजन का उपयोग करें।

4. उच्च-रिज़ॉल्यूशन छवि धाराओं का अधिग्रहण

  1. विवो में । जीसीएएमपी इमेजिंग
    1. एक्सपोजर समय 20 एमएस पर सेट करें।
    2. इमेजिंग लेजर और अधिग्रहण सेटिंग्स को समायोजित करें जब तक कि बेसल जीसीएएमपी फ्लोरेसेंस कैमरे की गतिशील सीमा14 की मध्य-श्रेणी में न हो। अन्य माइक्रोस्कोपी सेटअप का उपयोग करके इमेजिंग मापदंडों को अनुकूलित करने पर सुझावों के लिए चर्चा देखें।
      नोट। इस अध्ययन में उपयोग किए गए ऑप्टिकल सेटअप के लिए, 488 एनएम इमेजिंग लेजर को निम्नलिखित आउटपुट सेटिंग्स पर सेट करें: लेजर पावर = 50% और क्षीणन = 1। अतिरिक्त अधिग्रहण सेटिंग्स को निम्नानुसार संशोधित करें: ईएम लाभ = 200 और पूर्व-एम्पलीफायर लाभ = 1।
    3. 100x आवर्धन पर GCaMP प्रतिदीप्ति का उपयोग करके AVA न्यूराइट स्थित होने के बाद, ZDC ( सामग्री की तालिका देखें) को ±30 μm की सीमा पर सेट करें, और निरंतर ऑटोफोकसिंग शुरू करें। इमेजिंग से पहले आवश्यकतानुसार फोकल प्लेन को मैन्युअल रूप से सही करें।
    4. 100x आवर्धन पर छवियों की एक धारा प्राप्त करें। इस अध्ययन में उपयोग किए गए सेटअप के साथ 10 मिनट तक की अवधि प्राप्त की जा सकती है।
  2. विवो माइटोजीसीएएमपी इमेजिंग में।
    1. कैमरे की गतिशील रेंज14 के लिए मिड-रेंज में बेसल माइटोजीसीएएमपी फ्लोरेसेंस प्राप्त करने के लिए आवश्यक चरण 4.1.1-4.1.2 का पालन करें।
      नोट। इस अध्ययन में उपयोग किए जाने वाले ऑप्टिकल सेट-अप के लिए, 488 एनएम इमेजिंग लेजर को निम्नलिखित आउटपुट सेटिंग्स पर सेट करें: लेजर पावर = 20% और क्षीणन = 10। अधिग्रहण सेटिंग्स को निम्न में संशोधित करें: ईएम लाभ = 100 और पूर्व-एम्पलीफायर लाभ = 2।
    2. एवीए न्यूराइट में माइटोकॉन्ड्रिया माइटोजीसीएएमपी प्रतिदीप्ति का उपयोग करके स्थित होने के बाद, जेडडीसी को चरण 3.3 में ऊपर वर्णित के रूप में सेट करें।
    3. 100x आवर्धन पर छवियों की एक धारा प्राप्त करें।

5. छवि स्ट्रीम विश्लेषण

  1. छवि श्रृंखला में पिक्सेल मानों का विश्लेषण करने के लिए एक उपयुक्त छवि सॉफ़्टवेयर में छवि स्ट्रीम खोलें ( सामग्री की तालिका देखें)।
  2. बहुभुज चयन उपकरण का उपयोग करके, GCaMP या mitoGCaMP युक्त रुचि के उपकोशिकीय क्षेत्र (ROI) को परिभाषित करें।
  3. ROI प्रबंधक > > उपकरण का विश्लेषण करें पर क्लिक करें। ROI प्रबंधक में, जोड़ें और फिर अधिक > मल्टी माप क्लिक करें. मल्टी माप विंडो में, आगे के विश्लेषण के लिए छवि स्ट्रीम के प्रत्येक फ्रेम के लिए ऊपर परिभाषित ROI की औसत, न्यूनतम और अधिकतम पिक्सेल तीव्रता को स्वचालित रूप से एकत्र करने के लिए ठीक क्लिक करें।
    नोट। यह अनुशंसा की जाती है कि जेड-प्लेन में स्थिति के कारण प्रतिदीप्ति अंतर के लिए अनुपात एफ औसत / एफमिन का उपयोग करके प्रत्येक आरओआई के लिएऔसत पिक्सेल तीव्रता (एफएवमेंट) को न्यूनतम तीव्रता (एफमिनट) तक सामान्यीकृत किया जाए। इमेजिंग के दौरान कृमि आंदोलन के साथ छवि धाराओं को छोड़ दें क्योंकि यह प्रतिदीप्ति माप को भी प्रभावित करेगा।

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Representative Results

ये दो प्रोटोकॉल उच्च स्थानिक रिज़ॉल्यूशन के साथ विवो में व्यक्तिगत न्यूरॉइट्स के उप-कोशिकीय क्षेत्रों और ऑर्गेनेल के भीतर अंतर सीए2 + स्तरों के तेजी से अधिग्रहण को सक्षम करते हैं। पहला प्रोटोकॉल उच्च अस्थायी और स्थानिक संकल्प के साथ साइटोप्लाज्मिक सीए2 + के माप के लिए अनुमति देता है। यह ग्लूटामेटर्जिक एवीए कमांड इंटरन्यूरॉन15 में जीसीएएमपी 6 एफ की सेल-विशिष्ट अभिव्यक्ति का उपयोग करके यहां प्रदर्शित किया गया है, जिसके न्यूरॉइट्स वेंट्रल तंत्रिका कॉर्ड की पूरी लंबाई चलाते हैं। GCaMP6f प्रतिदीप्ति (50 हर्ट्ज) के तेजी से अधिग्रहण ने सीए 2+ प्रवाह (चित्रा 2 ए और पूरक वीडियो 1) के दिशात्मक प्रसार का पता लगाने में सक्षम बनाया। GCaMP6f प्रतिदीप्ति के उपकोशिकीय परिमाणीकरण से पता चला किCa2+ प्रवाह की शुरुआत न्यूराइट के एक हिस्से में सिर्फ 10 μm दूर थी (चित्रा 2B)। इसके अतिरिक्त, इस प्रोटोकॉल ने कंपार्टमेंटल सीए 2 + और सबथ्रेशोल्ड सीए2 + घटनाओं के कई अवलोकनों के लिए अनुमति दी। उदाहरण के लिए, एवीए न्यूराइट के साथ पाए जाने वाले डेंड्राइटिक स्पाइन जैसी संरचनाओं को जीसीएएमपी 6 एफ फ्लोरेसेंस में चमक देखी गई थी जो न्यूराइट सक्रियण से स्वतंत्र रूप से हुई थी और सीए 2 + प्रवाह (चित्रा 2 सी, डी और पूरक वीडियो 2) के प्रसार का कारण नहीं बनी थी।

दूसरे प्रोटोकॉल का उद्देश्य एकल न्यूरॉइट्स में व्यक्तिगत माइटोकॉन्ड्रिया में सापेक्ष सीए2 + स्तरों को तेजी से मापना था। माइटोकॉन्ड्रियल मैट्रिक्स-स्थानीयकृत सीए2 + संकेतक माइटोजीसीएएमपी की एवीए-विशिष्ट अभिव्यक्ति के साथ एक कृमि तनाव का उपयोग करने से एवीए न्यूराइट के भीतर व्यक्तिगत माइटोकॉन्ड्रिया के स्तर पर माइटोजीसीएएमपी प्रतिदीप्ति में परिवर्तन का तेजी से पता लगाने में सक्षम बनाया गया। इस इमेजिंग प्रोटोकॉल ने माइटोकॉन्ड्रिया में सीए2 + अपटेक के विभिन्न तरीकों का खुलासा किया, कम से कम इस न्यूरॉन में। सबसे पहले, चित्रा 3 ए में दिखाए गए परिणाम माइटोकॉन्ड्रिया के उप-समूह में सीए2 + की अपेक्षाकृत बड़ी मात्रा के तुल्यकालिक उत्थान का एक उदाहरण प्रदान करते हैं। अधिक विशेष रूप से, इन आंकड़ों से पता चला कि कुछ माइटोकॉन्ड्रिया में सीए 2 + अपटेक सिंक्रनाइज़ किया गया था (मिटो 1 और मिटो2; चित्रा 3 ए, बी और पूरक वीडियो 3), जबकि पड़ोसी माइटोकॉन्ड्रिया सीए2 + (मिटो 3) लेने के लिए प्रकट नहीं हुए। चित्रा 3 ए, बी)। इसी तरह, माइटोकॉन्ड्रिया के उपसमुच्चय को सीए2 + की छोटी मात्रा में तेजी से ऊपर उठाने और जारी करने के लिए देखा गया था। यह तुल्यकालिक (मिटो 1 और मिटो 3, चित्रा 3 सी, डी और पूरक वीडियो 4) भी प्रतीत होता है, लेकिन फिर से केवल माइटोकॉन्ड्रिया के उप-समूह (मिटो 2, चित्रा 3 सी, डी) के लिए।

Figure 1
चित्रा 1: वेंट्रल तंत्रिका कॉर्ड की इमेजिंग के लिए माउंटिंग और रोलिंग सी एलिगेंस । (ए) अगर पैड तैयार करने और एक कीड़े को रोलिंग समाधान में चुनने के चरणों का एक चित्रण। (बी) इमेजिंग के लिए पुनर्स्थापित किए जाने से पहले एक कीड़े की स्थिति का एक उदाहरण। लाल तीर कीड़े के दाएं रोल की आवश्यकता को इंगित करता है, जिसे कवरस्लिप को दाईं ओर स्लाइड करके प्राप्त किया जा सकता है (नीला तीर)। स्केल बार = 50 μm। (सी) उदर तंत्रिका कॉर्ड की कल्पना करने के लिए आवश्यक सही अभिविन्यास। नोट: आंत समीपस्थ आधे हिस्से में दर्शक के दाईं ओर (एक ईमानदार माइक्रोस्कोप का उपयोग करके) है और फिर डिस्टल आधे हिस्से में बाईं ओर है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: एवीए न्यूराइट और रीढ़ जैसी संरचनाओं में उपकोशिकीय संकल्प के साथ जीसीएएमपी 6 एफ फ्लोरेसेंस का तेजी से अधिग्रहण। (ए) एवीएएल और एवीएआर न्यूराइट विभाजन में जीसीएएमपी 6 एफ फ्लोरेसेंस की प्रतिनिधि छवियां। स्केल बार = 5 μm। (बी) पैनल ए में नीचे की छवि में परिभाषित समीपस्थ (नारंगी) और डिस्टल (नीले) क्षेत्रों के लिए उस क्षेत्र (एफमिन) के लिए न्यूनतम प्रतिदीप्ति (एफ) के लिए जीसीएएमपी 6 एफ प्रतिदीप्ति का परिमाणीकरण सामान्यीकृत है। (डी) पैनल सी की निचली छवि में संबंधित क्षेत्रों से न्यूराइट (नारंगी) और रीढ़ की तरह प्रक्षेपण (नीला) में सामान्यीकृत जीसीएएमपी 6 एफ प्रतिदीप्ति। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्र 3. एवीए न्यूराइट के भीतर व्यक्तिगत माइटोकॉन्ड्रिया में कैल्शियम अपटेक की तेजी से इमेजिंग। (ए, सी) समय के साथ माइटोजीसीएएमपी प्रतिदीप्ति की प्रतिनिधि छवियां। स्केल बार = 50 μm। (बी) पैनल ए की निचली छवि में दिखाए गए संबंधित माइटोकॉन्ड्रिया के लिए सामान्यीकृत जीसीएएमपी फ्लोरेसेंस (एफ / एफ मिन) के निशान। (डी) पैनल सी में नीचे की छवि में हाइलाइट किए गए क्षेत्रों में 40 सेकंड से अधिक इमेजिंग के लिए एफ / एफमिन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

पूरक वीडियो 1: एवीए न्यूराइट में जीसीएएमपी 6 एफ प्रतिदीप्ति। वीडियो 2 गुना गति से प्रस्तुत किया गया था। स्केल बार = 5 μm। कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

पूरक वीडियो 2: एवीए न्यूराइट पर रीढ़ की तरह प्रक्षेपण में जीसीएएमपी 6 एफ प्रतिदीप्ति। वीडियो 2 गुना गति से प्रस्तुत किया गया था। स्केल बार = 5 μm। कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

पूरक वीडियो 3: एवीए न्यूराइट-सिंक्रनाइज़ माइटोकॉन्ड्रियल कैल्शियम अपटेक में मिटोजीसीएएमपी प्रतिदीप्ति। वीडियो को 4 गुना गति से प्रस्तुत किया गया था। स्केल बार = 5 μm। कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

पूरक वीडियो 4: एवीए न्यूराइट में माइटोजीसीएएमपी प्रतिदीप्ति- माइटोकॉन्ड्रिया द्वारा कैल्शियम का तेजी से उत्थान और रिहाई। वीडियो को 4 गुना गति से प्रस्तुत किया गया था। स्केल बार = 5 μm। कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

पूरक तालिका 1: इस अध्ययन में उपयोग किए जाने वाले आनुवंशिक अभिकर्मक और उपभेद। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

वर्णित विधि को लागू करते समय पहले विचार में दिए गए शोध प्रश्न के लिए आदर्श विशेषताओं के साथ सीए2 + संकेतक का चयन शामिल है। साइटोप्लाज्मिक सीए 2 + संकेतकों में आमतौर पर सीए 2 + के लिए एक उच्च संबंध होता है, और सीए 2 + के लिए इन संकेतकों की संवेदनशीलता कैनेटीक्स (ऑन / ऑफ रेट) 16,17 से विपरीत रूप से संबंधित होती है। इसका मतलब यह है कि या तो सीए2 + संवेदनशीलता या कैनेटीक्स को रुचि की घटना के आधार पर प्राथमिकता देने की आवश्यकता होगी। अपेक्षाकृत उच्च बेसल सीए 2+ स्तरों वाले उपकोशिकीय डिब्बों के लिए, जैसे ईआर, कम सीए2 + आत्मीयता वाले सीए2 + संकेतक ों को18 माना जाना चाहिए। सीए 2 + संकेतक की सेल-विशिष्ट अभिव्यक्ति के लिए पुनः संयोजक डीएनए उत्पन्न करने के लिए, पसंदीदा क्लोनिंग तकनीक का उपयोग सेल-विशिष्ट प्रमोटर19,20 को सम्मिलित करने के लिए किया जाना चाहिए, इसके बाद सीए2 + पसंद का संकेतक और 3 ' यूटीआर शामिल किया जाना चाहिए। एवीए न्यूरॉन्स में अपेक्षाकृत उच्च अभिव्यक्ति स्तर प्रमोटरों पीएफएलपी -18 या प्रिग -3, एक लेट -858, या यूएनसी -54 3 ' यूटीआर के साथ एक प्लास्मिड का निर्माण करके और इस प्लास्मिड को 15-25 एनजी /

लिन -15 (एन 765 टी) उत्परिवर्ती कीड़े के गोनाड में सीए 2 + संकेतक और लिन -15 + युक्त प्लास्मिड के सफल माइक्रोइंजेक्शन से एक एफ 1 संतान उत्पन्न होगी जो सीए 2 + संकेतक को व्यक्त करती है और बहु-वल्वा फेनोटाइप के लिए बचाई जाती है। एफ 1 पीढ़ी का केवल एक उप-समूह (30% -80%) सिंथेटिक डीएनए को एफ 2 पीढ़ी तक पहुंचाएगा। सीए 2 + संकेतक की अभिव्यक्ति का मूल्यांकन 1 दिन के वयस्कों में प्रतिदीप्ति को बढ़ाकर और इमेजिंग करके सिंथेटिक डीएनए के <60% संचरण के साथ प्लेटों पर बचाए गए एफ2 या एफ 3 संतान ों में किया जाना चाहिए, जिन्हें मल्टी-वल्वा फेनोटाइप के लिए बचाया जाता है। आदर्श अभिव्यक्ति स्तर सीए2 + संकेतक के गुणों और स्थान के साथ-साथ जैविक प्रश्न के आधार पर निर्धारित किया जाता है। यदि तेजी से छवि अधिग्रहण वांछित है, तो अपेक्षाकृत उच्च अभिव्यक्ति आदर्श है। हालांकि, सीए2 + संकेतकों की एक अत्यंत उच्च अभिव्यक्ति को उपकोशिकीय मिसलोकलाइजेशन के साथ-साथ अन्य कोशिकाओं या ऊतकों में गैर-विशिष्ट अभिव्यक्ति का कारण पाया गया है।

आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड सीए 2 + संकेतकों को व्यापक रूप से सी एलिगेंस में सीए2 + के विवो विश्लेषण के साथ-साथ अन्य मॉडल जीवों में नियोजित किया गया है। इनमें से कुछ अध्ययनों ने न्यूरोनल सेल बॉडी 21,22,23,24 में सीए 2+ स्तरों की एकल-सेल रिज़ॉल्यूशन निगरानी हासिल की है। न्यूरोनल उप-डिब्बों में सीए 2 + प्रवाह का माप सी एलिगेंस के साथ-साथ कशेरुक प्रणालियों में विवो में हासिल किया गया है, लेकिन केवल पूरे न्यूराइट 25,26 या डेंड्राइट 27 की आबादी में सीए2 + संकेतक गतिविधि को रिकॉर्ड करके। यद्यपि न्यूरोनल सेल निकायों और डेंड्राइट में सीए 2 + गतिविधि को एक पूरे के रूप में मापना सेल की स्पाइकिंग गतिविधि को प्रतिबिंबित करता है, लेकिन यह सीए 2 + प्रवाह (यानी, प्रसार की दिशा या दर) या उप-थ्रेशोल्ड सीए 2 + क्षणिक की गतिशीलता के अवलोकन की अनुमति नहीं देता है। विवो अध्ययनों में कुछ ही न्यूरॉन्स में सीए2 + हैंडलिंग को यहां प्रदर्शित स्थानिक और लौकिक संकल्प में समझने में सक्षम हैं। यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि अधिकांश सी एलिगेंस न्यूरॉन्स28 में सीए2 + प्रवाह की अस्थायी गतिशीलता कशेरुक न्यूरॉन्स29 की तुलना में धीमी प्रतीत होती है, इसलिए यह संभावना है कि यह रैपिड इमेजिंग प्रोटोकॉल कशेरुक प्रणालियों में समान अस्थायी गतिशीलता को पकड़ने के लिए अपर्याप्त होगा। हालांकि, दो-फोटॉन माइक्रोस्कोपी में हालिया प्रगति स्वतंत्र रूप से व्यवहार करने वाले चूहों30 में व्यक्तिगत हिप्पोकैम्पल डेंड्राइट में कैल्शियम की अल्ट्रा-फास्ट (120 हर्ट्ज), उपकोशिकीय इमेजिंग की अनुमति देती है, जो कशेरुक में समान उच्च-रिज़ॉल्यूशन सीए2 + इमेजिंग प्राप्त करने का वादा प्रदान करती है।

यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि विवो सीए2 + इमेजिंग में इस गैर-अनुपातमीट्रिक दृष्टिकोण के लिए म्यूसिमोल के उपयोग की आवश्यकता होती है, जो शरीर की दीवार की मांसपेशियों के संकुचन को रोकता है, इस प्रकार इमेजिंग31 के दौरान कृमि आंदोलन को सीमित करता है। यदि इमेजिंग के दौरान अत्यधिक आंदोलन होता है (~ 20% से अधिक कीड़े में लगातार आंदोलन), तो एक नया रोलिंग समाधान म्यूसिमोल के एक नए पिघले हुए एलिकोट के साथ बनाया जाना चाहिए, और जिस समय के लिए एक कीड़ा रोलिंग से पहले रोलिंग समाधान में स्नान करता है, उसे बढ़ाया जाना चाहिए। Muscimol एक GABA रिसेप्टर एगोनिस्ट है, जिसका अर्थ है कि यह GABARgic न्यूरॉन्स को रोकता है, जिसमें वे भी शामिल हैं जो एवीए न्यूरॉन्स को इनपुट प्रदान करते हैं। इसके अतिरिक्त, एवीए सहित कई उत्तेजक न्यूरॉन्स, जीएबीए रिसेप्टर्स के निम्न स्तर को व्यक्त करते हैं, इसलिए यह संभावना है कि इस प्रोटोकॉल में म्यूसिमोल का उपयोग न्यूरोनल गतिविधि को कम करता है। हालांकि, इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके, एवीए का समग्र सहज सक्रियण म्यूसिमोल (अप्रकाशित डेटा) की उपस्थिति में केवल ~ 29% कम हो जाता है। अन्य न्यूरॉन्स की सक्रियता को म्यूसिमोल द्वारा अधिक कम किया जा सकता है, और इसका परीक्षण रोलिंग समाधान में एम 9 के लिए म्यूसिमोल को प्रतिस्थापित करके और कम आवर्धन32 पर न्यूरोनल सेल शरीर में इमेजिंग का संचालन करके किया जा सकता है। म्यूसिमोल का उपयोग करने का एक विकल्प अनुपातमेट्रिक सीए2 + संकेतक33,34 का उपयोग करना होगा, जो कृमि आंदोलन के कारण प्रतिदीप्ति सुधार की अनुमति देगा। इस दृष्टिकोण का नकारात्मक पक्ष यह है कि इसके लिए दोहरी-तरंग दैर्ध्य इमेजिंग में सक्षम ऑप्टिकल सेटअप की आवश्यकता होती है और कई अन्य फ्लोरोसेंट टूल के साथ संयोजन में सीए2 + संकेतक का उपयोग करने की क्षमता को सीमित करता है।

वर्णित माइक्रोस्कोपी प्रणाली की एक प्रमुख सीमा स्पिनिंग डिस्क द्वारा उत्सर्जित प्रकाश की कमी है, जिसके परिणामस्वरूप जानकारी का नुकसान होता है। इस प्रणाली को बड़े व्यास वाले पिन छेद के साथ एक डिस्क को लागू करके उत्सर्जित प्रकाश के बढ़ते कैप्चर की अनुमति देने के लिए संशोधित किया जा सकता है। हालांकि, यह परिवर्तन अक्षीय (जेड-प्लेन) रिज़ॉल्यूशन को कम करेगा और पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति को बढ़ाएगा। इस उद्देश्य के लिए एक और संभावित माइक्रोस्कोपी सेटअप फास्ट-स्कैनिंग लाइट शीट माइक्रोस्कोप होगा, जिसे हाल के वर्षों में सीटू और विवो35 में तेजी से (50 हर्ट्ज तक) इमेजिंग की अनुमति देने के लिए सुधार किया गया है।

साइटोप्लाज्मिक और माइटोकॉन्ड्रियल सीए 2 + की स्थानिक गतिशीलता का आकलन करने से इस बात की बेहतर समझ होगी कि स्थानीय सीए2 + क्षणिक, और यहां तक कि सबथ्रेशोल्ड घटनाएं, कैल्शियम-निर्भर सिग्नलिंग को ट्रिगर कर सकती हैं या माइटोकॉन्ड्रियल जीव विज्ञान को संशोधित कर सकती हैं। विवो सीए2 + इमेजिंग में यह उपकोशिकीय, सिनैप्टिक प्लास्टिसिटी, न्यूरोनल चयापचय में गतिविधि-निर्भर परिवर्तन और न्यूरोनल उत्तेजना के होमियोस्टैटिक मॉड्यूलेशन के अध्ययन के लिए विशेष रूप से उपयोगी हो सकता है। स्थानीय, उपकोशिकीय वातावरण न्यूरोनल गतिविधि की परिभाषित अवस्थाओं (यानी, स्थानिक रूप से विशिष्ट सांद्रता और सीए 2 + के जीवनकाल) के आसपास कैसे अनुकूलन करते हैं, इसकी आगे की जांच इस बात की अंतर्दृष्टि प्रदान करेगी कि सीए2 + डिस्होमोस्टेसिस न्यूरोनल फ़ंक्शन में रोगजनक परिवर्तन कैसे करता है। एक जीवित, बरकरार जीव में इसका अध्ययन करने की क्षमता विशेष रूप से उपयोगी है क्योंकि यह अनुदैर्ध्य अध्ययनों को सक्षम करता है जो इस बात पर प्रकाश डालेंगे कि प्राकृतिक उम्र बढ़ने और रोग से संबंधित न्यूरोडीजेनेरेशन के साथ सीए2 + होमियोस्टैसिस कैसे और क्यों बदलता है। उम्र बढ़ने और न्यूरोडीजेनेरेशन का अध्ययन करने के लिए इस पद्धति को लागू करना कुछ हद तक सी एलिगेंस (वयस्कता के <4 दिनों) में प्रारंभिक जैविक उम्र तक सीमित है। दरअसल, इमेजिंग के लिए कीड़े को माउंट करने और स्थिति देने के दौरान शारीरिक हेरफेर वयस्कता के लगभग 5 दिनों के बाद मुश्किल होता है जब मांसपेशियों की टोन और छल्ली अखंडता में कमी के कारण कीड़े शिथिल हो जाते हैं।

सीए2 + की गतिशीलता और उपकोशिकीय हैंडलिंग के विवो इमेजिंग में तेजी से हमारी समझ में महत्वपूर्ण भूमिका होगी कि न्यूरोनल उत्तेजना और इंट्रासेल्युलर सिग्नलिंग को स्थानिक और अस्थायी रूप से कैसे विनियमित किया जाता है। यह प्रोटोकॉल सीए2 + -निर्भर प्रक्रियाओं की विविधता और न्यूरोनल फ़ंक्शन में उनकी केंद्रीय भूमिका के कारण कई क्षेत्रों में अनुसंधान और शोधकर्ताओं की एक विस्तृत श्रृंखला को लाभान्वित कर सकता है। उदाहरण के लिए, स्वस्थ न्यूरॉन्स में इस विधि का अनुप्रयोग इस बात की अंतर्दृष्टि प्रदान करेगा कि उम्र बढ़ने के दौरान ऊंचा साइटोप्लाज्मिक सीए2 + सिनैप्टिक प्लास्टिसिटी, अक्षम माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन, साथ ही अन्य शिथिलता36,37 में हानि के साथ क्यों होता है। इसके अतिरिक्त, इस विधि का उपयोग उम्र से जुड़े सीए2 + डिस्होमोस्टेसिस38 के कारणों की जांच करने के लिए किया जा सकता है। हालांकि, उम्र बढ़ने और न्यूरोडीजेनेरेशन से संबंधित प्रश्नों के लिए इस पद्धति का आवेदन कुछ हद तक उम्र बढ़ने के शुरुआती चरणों (<वयस्कता के 5 दिन) तक सीमित है। जैसा कि ऊपर उल्लेख किया गया है, पुराने वयस्क कीड़े (वयस्कता के >5 दिन) की इमेजिंग हमारी रोलिंग विधि का उपयोग करके मुश्किल है, लेकिन सी एलिगेंस माइक्रोफ्लुइडिक्स में प्रगति वयस्कता के 12 दिनों तक39,40 तक समान स्थानिक संकल्प के साथ इमेजिंग का वादा दिखाती है।

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Disclosures

लेखक ों ने कोई प्रतिस्पर्धी हितों की घोषणा नहीं की है।

Acknowledgments

इस काम को राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (एनआईएच) (आर 01- एनएस 115947 एफ होर्न्डली को सम्मानित) द्वारा समर्थित किया गया था। हम पीएएस 1 प्लास्मिड के लिए डॉ अटिला स्टेटक को भी धन्यवाद देना चाहते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100x/1.40 Oil objective   Olympus   UPlanSApo
10x/0.40 Objective  Olympus   UPlanSApo
22 mm x 22 mm Cover glass  VWR  48366-227 
Agarose SFR  VWR  J234-100G 
Beam homogenizer Andor Technologies Borealis upgrade to CSU-X1
CleanBench laboratory table  TMC  With vibration control
Disposable culture tubes VWR  47729-572  13 mm x 100 mm
Environmental chamber Thermo Scientific 3940 Set to 20 °C
Filter wheel or slider ASI For 25 mm diameter filters
FJH 185 Caenorhabditis Genetics Center  FJH 185 Worm strain
FJH 597 Caenorhabditis Genetics Center FJH 597 Worm strain
GFP bandpass emission filter  Chroma  525 ± 50 nm (25 mm diameter)
ILE laser combiner  Andor Technologies  4 laser lines 
ILE solid state 488 nm laser Andor Technologies  50 mW
ImageJ National Institutes of Health Version 1.52a
IX83 Spinning disk confocal microscope  Olympus  With Yokogawa CSU-X1 spinning disc
iXon Ultra EMCCD camera  Andor Technologies 
Low auto-fluorescence immersion oil  Olympus  Z-81226
MetaMorph  Molecular Devices  Version 7.10.1 
Microscope control box Olympus IX3-CBH
Muscimol  MP Biomedical / Sigma 02195336-CF 
pAS1 AddGene 194970 Plasmid
pBSKS Stratagene
pCT61 Plasmid available from Hoerndli/Maricq lab upon request
pJM23 Plasmid available from Hoerndli/Maricq lab upon request
pKK1  AddGene  194969 Plasmid
Polybead microspheres  Polysciences Inc.  00876-15  0.094 µm
Stability chamber Norlake Scientific NSRI241WSW/8H Set to 15 °C
Stage controller ASI With filter wheel control
Standard microscope slide Premiere 9108W-E 75 mm x 25 mm x 1 mm
Touch panel controller Olympus I3-TPC
Z-drift corrector  Olympus  IX3-ZDC2

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References

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तंत्रिका विज्ञान अंक 193
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