Summary
描述了一个简单的推车结构，用于在站立的清醒小猪中进行研究超声心动图，以及构建注意事项、训练技术和代表性超声图像。
Abstract
超声心动图使用超声波无创评估心脏结构和功能，是心脏评估和监测的标准护理。微型猪或迷你猪越来越多地被用作医学研究中心脏病的模型。众所周知，猪很难约束和安全处理，因此，该物种的研究超声心动图几乎总是在麻醉或重度镇静下进行。麻醉剂和镇静剂普遍影响心血管功能，并可能导致心输出量和血压降低、心率和全身血管阻力增加或减少、心律改变和冠状动脉血流改变。因此，镇静或麻醉超声心动图可能无法准确描述大型动物模型中心脏病的进展，从而限制了这些重要研究的转化价值。本文描述了一种允许在迷你猪中站立清醒超声心动图的新型设备。此外，还描述了用于教猪耐受这种无痛和非侵入性手术而无需改变血流动力学的麻醉剂的培训技术。站立清醒超声心动图代表了一种安全可行的方法，可以在小型猪中进行最常见的心脏监测测试，以进行心血管研究。
Introduction
心力衰竭是美国和国外医疗机构日益沉重的负担，全球患病率为3800万患者1。2020年，全球约有1900万人死于心血管疾病，比2010年增加了18.7%2。新疗法的开发速度很慢，无法赶上这一令人担忧的趋势。因此，心力衰竭是一个关键的研究领域，高保真工具对于捕捉疾病发展和进展的重要性怎么强调都不为过。
超声心动图是目前非侵入性测量心脏病进展的临床上最重要的工具，但在大型动物研究模型中，实施可能具有挑战性3。超声心动图使用超声波来评估心脏结构和功能，是临床环境中心脏评估和监测的标准护理4。临床前心脏病大型动物模型，如猪，在将基础科学转化为心血管疗法开发方面发挥着关键作用5。因此，在开发这些疗法时，将超声心动图转化为大型动物模型是这一关键努力的重要组成部分。
猪是通常用作缺血、压力超负荷和心力衰竭快节奏模拟的大型动物模型的几种物种之一5，6。猪在临床前研究中尤为重要，因为神经激素补偿机制和心脏重塑与人类病理生理学密切相关6，7。最近，微型猪或迷你猪已经显示出作为心脏病的多种合并症模型的希望，肥胖，高血压，高胆固醇血症和糖尿病可靠地导致心功能障碍和重塑8，9。
在大多数大型动物中安全地进行超声心动图检查需要大量镇静或全身麻醉。然而，所有麻醉和镇静药物都以剂量依赖性方式抑制心脏功能10，11。麻醉剂和镇静剂可能导致心输出量和血压降低，心率和全身血管阻力增加或减少，电节律改变，冠状动脉血流改变12。在大多数情况下，麻醉剂会降低交感神经张力，减少静脉回流并降低血压13。重要的是，麻醉剂也会影响超声心动图参数，使该检查在监测动物模型中的心脏病的解释复杂化14。清醒超声心动图是最接近自体心脏功能的代表。
本文介绍了一种猪约束装置，该装置很容易被清醒的迷你猪接受，可用于基本的超声心动图监测，而无需施用改变血流动力学的麻醉剂。
Protocol
超声心动图推车的建造和使用符合犹他大学机构动物护理和使用委员会的动物处理和培训标准。
1. 构建超声心动图推车的注意事项
- 建立一个装置，允许进入侧和腹侧站立超声心动图成像窗口。
- 使用侧面、正面和背面较高的推车，以防止猪在超声心动图检查期间攀爬或跳出。
- 使用长度和宽度可调的推车来容纳各种大小和年龄的猪;然而，在所有猪的大小、品种和年龄相同的研究中，这可能不是必需的。
- 购买用于安装和拆卸推车的防滑坡道。猪喜欢向前走，所以向后下马是不可取的。在此示例中，使用了可拆卸的坡道，以便在安装推车后可以从一端断开连接，然后移动到推车的另一端进行拆卸。
- 使用带锁定轮的轮式推车，因为这可以将装置从仓库移动到动物室。
- 为符合动物饲养场清洁和消毒标准，请使用塑料、金属和橡胶材料。
- 最后，在推车前部包括一个可拆卸的饲喂槽，以便在超声心动图检查期间为猪提供分心。
2. 推车制造规格
注意：我们研究中使用的猪是5-10个月大的尤卡坦和哥廷根微型猪，因此，我们的推车在制造时考虑到了这种尺寸。
- 虽然可以从头开始构建类似的结构，但为了减少一些建筑工作，请从预制的重型多功能车开始（图 1）。建议使用锁定轮。
- 锯掉并拆除多功能车的前后，并更换由PVC管和链节制成的门。使用链节材料通过挂钩或登山扣悬挂食品槽（图2）。随着前后的移除，塑料的完整性和保持强度降低，因此对于更大和较重的猪，在推车架的底部用金属条加固。
- 在推车的顶层创建一个足够大的孔径，以通过握着超声波探头的手。保留一个安装在孔径顶部的塑料盖片，一旦猪安全站在推车中，就可以将其取下以进行剑下超声心动图访问（图3）。
- 作为定制配合，使用铝材（例如，方管、棒材和金属板）构建带有加固的金属安装/拆卸坡道，以在某些连接点连接到改装后的推车上。添加可拆卸橡胶衬垫，以便使用螺栓和垫圈进行抓握（图4）。
- 为侧门创建一个铰链机构，使用简单的销来缩小回收球站立区域，以提高约束性（图5）。这为猪在推车内提供了紧密的贴合，并确保猪被限制在朝前的方向上，而没有转身的能力。
3. 训练迷你猪站在推车里
- 必须训练猪长时间从槽中进食，走上坡道，走下坡道。
- 用冷冻零食填充食槽可以延长猪的站立时间。使用果汁、代餐饮料或酸奶与麦片和标准食物、饼干和/或水果棒的组合。将这些组合冷冻在一起以创建持久的冷冻治疗槽（图6）。另一个需要考虑的选择是保留动物的正常进食，而是在超声心动图期间将其喂入推车的水槽中。
- 在教猪吃冷冻零食之前，在地面上引入冷冻零食槽，鼓励人们认识到冷冻零食槽是一种高价值的零食。
- 训练猪接受站立超声心动图5-7天，每天一次训练。执行以下步骤来执行此操作。
- 将猪引入推车，用高价值的零食（饼干或麦片）包围推车1-2天。
- 将猪引入坡道1-2天，方法是沿着坡道放置高价值的零食，并在猪走上坡道时提供额外的奖励。
- 让猪站在推车上而不接合侧约束装置或门（这可能会引起恐惧），并在前门提供冷冻治疗槽 2-3 天。在过去的1-2天里，当猪从槽中进食时，将带有超声波凝胶的超声探头放在猪身上，使它们习惯与探头接触的感觉。
- 在这种训练方案之后，猪将很容易关闭约束装置和门，并进行超声检查以获取超声心动图成像。
4. 图像采集
- 在超声心动图推车中获取图像，该推车允许探头定位在以下位置，如下所述。
- 通过推车的两侧向左右腋窝拍摄图像。这些位置用于获得左右胸骨旁成像平面。
- 通过推车的地板拍摄图像到剑突下区域以获得顶端视图。
- 从这些站立位置拍摄 B 型和 M 型成像的图像。
- 有关模拟唤醒回声录制过程，请参阅视频 1。在视频中，动物主体由一个真实大小的迷你猪娃娃代表，像真正的迷你猪一样被限制，推车中的移动空间有限。还显示了记录超声心动图探头的最佳访问窗口和位置。
Representative Results
这里展示了在尤卡坦迷你猪大约8个月大时获得的代表性图像。该动物从未被镇静，并且在图像采集期间享受饲料或冷冻零食槽。
超声心动图推车主要用于从B模式或M模式图像和视频获取用于计算左心室腔容积和射血分数（EF）的简单图像。更灵敏的成像，如血管成像或组织多普勒，可能被证明对这种技术太具有挑战性，因为清醒的猪保持有限的活动能力，并且成像时间框架受到喂养时间的限制。
实验室使用床边超声机，没有事后图像分析功能。因此，视频和静止图像需要使用编辑软件进行处理，并使用科学的图像分析软件进行测量。
通过推车的侧面获得短轴横视图M模式图像（图7），用于分析收缩期和舒张期的左心室内径（分别为LVIDs和LVIDd）以及随后的射血分数（EF）的计算，其中EF = （EDV - ESV）/EDV ×100%（EDV：舒张末期容积;ESV：收缩末期容积），基于用 Teichholz 公式计算的体积（体积 = 7D3/[2.4 + D]）（D：线性左心室直径）15。 表1包括从两只迷你猪获得的四次M模式扫描产生的代表性数据，以及在镇静回波期间从同一动物记录的M模式扫描产生的数据。正如预期的那样，镇静回声会话产生的EF往往低于意识回声会话产生的EF。
还从推车侧面获得胸骨旁长轴视图B模式图像（图8）。在这些B模图像16中，使用计算EF的面积长度方法。首先，使用公式EDV = （0.85 ×面积2）/长度，根据舒张末期左心室长轴长度和腔面积计算左心室EDV。使用收缩压测量以相同的方式计算左心室ESV。然后将射血分数计算为EF = （EDV - ESV）/EDV ×100%。 表2包括从两头迷你猪获得的八次B模式扫描产生的代表性数据。为了进行比较，还包括在镇静回声会话期间从同一动物记录的B模式扫描生成的数据。使用B模式图像，由镇静和意识回声会话产生的EF彼此紧密匹配（表2）。
图 1：超声心动图推车的侧视图。超声心动图推车是使用预制的重型多功能推车制造的。请点击此处查看此图的大图。
图 2：超声心动图推车的头视图。预制推车的正面和背面被PVC管和链节（A）制成的铰链门所取代，该门还可容纳悬挂式食品槽（B）。请点击此处查看此图的大图。
图 3：超声心动图推车的俯视图。 在推车的顶层创建一个孔，用于通过握着超声波探头的手。安装塑料外件，用于安全安装和拆卸推车。请点击此处查看此图的大图。
图 4：铝制斜坡。 铝制坡道连接到推车的前部或后部，并添加了可拆卸的橡胶衬垫，以便使用螺栓和垫圈进行抓握。 请点击此处查看此图的大图。
图 5：侧门。 为侧门创建了铰链，带有销钉，以实现更准确的尺寸和约束。 请点击此处查看此图的大图。
图 6：治疗有意识的回声会话。 果汁、代餐饮料或酸奶与谷物和标准食物、饼干和/或水果棒的组合被冷冻，以制作持久的冷冻零食槽。 请点击此处查看此图的大图。
图 7：从有意识的动物获得的代表性 M 模式扫描。 用于从 M 模式成像计算左心室射血分数的示例图像分析。 请点击此处查看此图的大图。
图 8：从有意识的动物获得的代表性 B 模式扫描。 用于从 B 模式成像计算左心室射血分数的样本图像分析。 请点击此处查看此图的大图。
| 平均±标清 | LVIDd （厘米） | 低密度（厘米） | EF （%） |
| 有意识回声 （N=4/2） | 3.8 ± 0.5 | 2.5 ± 0.5 | 64.3 ± 5.4 |
| 镇静回波 （N=4/2） | 3.9 ± 0.2 | 3.0 ± 0.0 | 48.5 ± 7.9 |
| EF，射血分数;标清，标准差。 | |||
| N = 4 次从两只动物获得的回波扫描 | |||
表1：从镇静迷你猪中记录的M模式图像生成的参数与限制在推车中的意识迷你猪的比较。
| LV-MALd （厘米） | 左心室-MAL（厘米） | 低压-钙（厘米2） | 低压钙 （厘米2） | EF （%） | |
| 有意识的回声 （N=8/2） | 5.8 ± 0.8 | 4.5 ± 0.6 | 18.6 ± 5.0 | 10.7 ± 2.8 | 57.3 ± 5.2 |
| 镇静回声 （N=8/2） | 5.9 ± 0.5 | 4.8 ± 0.4 | 21.8 ± 2.7 | 13.1 ± 2.4 | 55.3 ± 9.0 |
| 左心室-MAL，左心室长轴长度;左心室-CA，左心室腔区; | |||||
| EF，射血分数;标清，标准差。N = 8 从 2 只动物获得的回声扫描 | |||||
表2：在镇静的迷你猪中记录的B模式图像与在推车中约束的有意识的迷你猪生成的参数比较。
视频1：使用超声心动图推车在真实大小的迷你猪娃娃上进行的模拟清醒超声心动图记录程序。请点击此处下载此视频。
Discussion
超声心动图推车代表了一种易于复制的方法，用于监测重要的心脏研究模型迷你猪中的心脏结构和功能。推车的新颖之处在于能够捕获超声心动图图像，而没有最大的警告：必须使用麻醉剂或镇静剂来改变动物的心脏功能并改变用于评估心脏治疗效果的测量结果。此外，推车安全、便宜，并且是猪的简单训练目标。
作者首先确定了推车的所需功能，然后与木匠密切合作设计产品。标准的正强化训练技术简单快捷，可以教猪无所畏惧地接受推车并使用它。通过超声检查实践，作者能够快速找到并记录标准的二维超声心动图成像平面以供以后处理。在这些站立超声心动图期间，从未使用镇静剂或麻醉剂，因此，视频和图像代表了清醒的心脏功能。
对于经验丰富的木匠或杂工来说，在确定了对研究小组很重要的关键特征（例如，尺寸可调性、高度或超声探头接入点）后，超声心动图推车的构建相对简单。在构建过程中，可以改变推车的功能以满足各个实验室的需求。这些材料基本上很便宜，建造推车可以节省使用通常使用的镇静剂和麻醉剂进行超声心动图检查的成本。
该技术的局限性包括运动和获取图像的有限时间。虽然推车可以调整成不同的尺寸来约束猪，虽然动物不能转身，只能向每个方向移动几英寸，但动物仍然能够在推车的范围内移动。头门、挤压滑槽或支柱，例如用于农场动物的支柱，可以通过额外的训练提供更好的约束。同样，成功的成像依赖于动物在超声心动图期间被饲料或冷冻零食分散注意力。通常，这允许大约15分钟的成像，这并不总是足以获得所有所需的图像。在动物保持束缚的情况下轻松更换食物槽或添加饲料的能力可能会延长成像持续时间。最后，由于上述两个限制，更灵敏的成像技术，如组织多普勒，被证明很难在站立式超声心动图推车中进行。
其他猪实验模型通常使用非麻醉处理技术，例如市售的Panepto吊带17。然而，作者发现吊带技术对于训练猪来说更麻烦，并且吊带不能让超声医师进入超声心动图所需的成像平面。超声心动图推车的其他潜在应用可能包括其他非疼痛程序，例如腹部超声检查、皮肤病变观察或从血管通路端口获取血液样本。例如，作者经常利用推车轻松约束猪进行心电图检查和程序起搏器。
总之，所描述的清醒超声心动图技术易于执行，并且对于获得心脏的基本超声成像很有价值，而没有麻醉剂或镇静剂使用典型的心血管抑制。该技术可用于将麻醉图像与大型动物的清醒图像进行比较，或在有价值的猪心脏病和衰竭临床前转化模型中对心脏病进展进行日常监测。
Disclosures
作者没有需要披露的财务利益冲突。
Acknowledgments
这项研究的资金包括NIH-T32（T.H.），R01HL133286（TT.H.），R01HL094414（R.M.S.），R01HL138577（R.M.S.），R01HL159983和R21AG074593（RMS和TT.H.）。我们感谢犹他大学Nora Eccles Harrison心血管研究和培训研究所和比较医学的研究小组的所有成员，兼职研究人员和工作人员。我们还要感谢Joseph Palatinus MD博士，感谢他宝贵的超声心动图培训和帮助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Access Ramp | N/A - shop built | 58" L x 18" W. Rise of 19" not to exceed 22.5 degree angle. | Any removable aluminum ramp with capacity to hold weight of pigs |
| Fence Feeder with Clips | DuraFlex | E011772 | Feed trough with clips for hanging on chain link, used for frozen treats or feed to distract pigs during echocardiography |
| Heavy Duty Utility Cart | Baxter Medical Equipment & Supplies | Cart # unk / 45x25x33"; Pipes, sch 40 PVC | Made of heavy plastic, with three shelves |
| Image Analysis Software | Image J FIJI | https://imagej.net/software/fiji/ | Free scientific image analysis software |
| Lumify Ultrasound with S4-1 Phased Array Transducer | Philips | FUS6884 | Handheld bedside ultrasound with cardiac probe, used with a tablet device and proprietary software |
| Video Editing Software | Adobe Premiere Pro 2022 | https://www.adobe.com/products/premiere.html | Commen software part of Adobe Creative Cloud. |
References
- Braunwald, E. The war against heart failure: The Lancet lecture. Lancet. 385, 812-824 (2015).
- Tsao, C. W., Aday, A. W., Almarzooq, Z. I., et al. Heart disease and stroke statistics - 2022 Update: A report from the American Heart Association. Circulation. 145 (5), e153-e639 (2022).
- Billig, S., et al. Transesophageal echocardiography in swine: evaluation of left and right ventricular structure, function, and myocardial work. International Journal of Cardiovascular Imaging. 37 (3), 835-846 (2021).
- Boon, J. A. Veterinary Echocardiography., 2nd edition. , Wiley-Blackwell. West. Sussex, UK. (2011).
- Silva, K. A. S., Emter, C. A. Large animal models of heart failure: A translational bridge to clinical success. Journal of the American College of Cardiology: Basic to Translational Science. 5 (8), 840-856 (2020).
- Pilz, P. M., et al. Large and small animal models of heart failure with reduced ejection fraction. Circulation Research. 130 (12), 1888-1905 (2022).
- Paslawska, U., et al. Normal electrocardiographic and echocardiographic (M-mode and two-dimensional) values in Polish Landrace pigs. Acta Veterinaria Scandinavica. 56 (1), 54 (2014).
- Sharp, T. E., et al. Novel Gottingen miniswine model of heart failure with preserved ejection fraction integrating multiple comorbidities. Journal of the American College of Cardiology: Basic to Translational Science. 6 (2), 154-170 (2021).
- Olver, T. D., et al. Western diet-fed, aortic-banded Ossabaw swine: A preclinical model of cardio-metabolic heart failure. Journal of the American College of Cardiology: Basic to Translational Science. 4 (3), 404-421 (2019).
- Merin, R. G. Effect of anesthetic drugs on myocardial performance in man. Annual Review of Medicine. 28, 75-83 (1977).
- El Mourad, M. B., Shaaban, A. E., El Sharkawy, S. I., Afandy, M. E. Effects of propofol, dexmedetomidine, or ketofol on respiratory and hemodynamic profiles in cardiac patients undergoing transesophageal echocardiography: A prospective randomized study. Journal of Cardiothoracic and Vascular Anesthesia. 35 (9), 2743-2750 (2021).
- Stoelting, R. K., Hillier, S. C. Handbook of Pharmacology & Physiology in Anesthetic Practice., 2nd edition. , Lippincott Williams & Wilkins. Philadelphia, PA. (2006).
- Kristensen, S. D., et al. ESC/ESA Guidelines on non-cardiac surgery: Cardiovascular assessment and management: The Joint Task Force on non-cardiac surgery: Cardiovascular assessment and management of the European Society of Cardiology (ESC) and the European Society of Anaesthesiology (ESA). European Heart Journal. 35 (35), 2383-2431 (2014).
- Roth, D. M., Swaney, J. S., Dalton, N. D., Gilpin, E. A., Ross Jr, J. Impact of anesthesia on cardiac function during echocardiography in mice. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 282 (6), H2134-H2140 (2002).
- Chengode, S. Left ventricular global systolic function assessment by echocardiography. Annals of Cardiac Anaesthesia. 19 (Suppl 1), S26-S34 (2016).
- Cacciapuoti, F. Echocardiographic evaluation of ejection fraction: 3DE versus 2DE and M-Mode. Heart Views. 9 (2), 71-79 (2008).
- Yang, H., Galang, K. G., Gallegos, A., Ma, B. W., Isseroff, R. R. Sling training with positive reinforcement to facilitate porcine wound studies. JID Innovations. 1 (2), 100016 (2021).
