Summary
TrackMate Analysis of Calcium Imaging (TACI) er et open source ImageJ-plugin til 3D-calciumbilledanalyse, der undersøger bevægelse på z-aksen og identificerer den maksimale værdi af hver z-stak for at repræsentere en celles intensitet på det tilsvarende tidspunkt. Det kan adskille neuroner, der overlapper hinanden i lateral (x / y) retning, men på forskellige z-planer.
Abstract
Forskning i neurovidenskab har udviklet sig til at bruge komplekse billeddannelses- og beregningsværktøjer til at udtrække omfattende information fra datasæt. Calciumbilleddannelse er en meget anvendt teknik, der kræver sofistikeret software for at opnå pålidelige resultater, men mange laboratorier kæmper for at vedtage beregningsmetoder, når de opdaterer protokoller for at opfylde moderne standarder. Vanskeligheder opstår på grund af manglende programmeringskendskab og betalingsmure til software. Derudover viser celler af interesse bevægelser i alle retninger under calciumbilleddannelse. Mange tilgange er blevet udviklet til at korrigere bevægelsen i lateral (x / y) retning.
Dette papir beskriver en arbejdsgang ved hjælp af et nyt ImageJ-plugin, TrackMate Analysis of Calcium Imaging (TACI), til at undersøge bevægelse på z-aksen i 3D-calciumbilleddannelse. Denne software identificerer den maksimale fluorescensværdi fra alle de z-positioner, en neuron vises i, og bruger den til at repræsentere neuronens intensitet ved den tilsvarende t-position. Derfor kan dette værktøj adskille neuroner, der overlapper hinanden i lateral (x / y) retning, men vises på forskellige z-planer. Som et ImageJ-plugin er TACI et brugervenligt, open source-beregningsværktøj til 3D-calciumbilledanalyse. Vi validerede denne arbejdsgang ved hjælp af fluelarvens termofølsomme neuroner, der viste bevægelser i alle retninger under temperaturudsving og et 3D-calciumbilleddannelsesdatasæt erhvervet fra fluehjernen.
Introduction
Niveauet af intracellulært calcium er en præcis markør for neuronal excitabilitet. Calciumbilleddannelse måler ændringerne i intracellulært calcium for at forstå neuronal aktivitet1. Undersøgelser inden for neurovidenskab har i stigende grad brugt denne metode på grund af udviklingen af teknikker til måling af intracellulær calciumkoncentration, herunder genetisk kodede calciumindikatorer (GECI'er), såsom GCaMP2,3, som kan udtrykkes ikke-invasivt i specifikke sæt neuroner gennem genetiske tilgange. De lavere omkostninger til lasere og mikroskopkomponenter har også øget brugen af calciumbilleddannelse4. Det er vigtigt, at calciumbilleddannelse giver mulighed for registrering og undersøgelse af enkelte neuroner såvel som store neuronpopulationer samtidigt i frit bevægelige dyr5.
Ikke desto mindre er analysen af calciumbilleddannelsesdata udfordrende, fordi (1) det involverer sporing af ændringer i fluorescens af individuelle celler over tid, (2) fluorescenssignalet forsvinder intermitterende eller dukker op igen med neuronale reaktioner, og (3) neuronerne kan bevæge sig i alle retninger, specifikt ind og ud af et brændplan eller vises på flere planer4, 6. Manuel analyse er tidskrævende og bliver upraktisk, da længden af optagelser og antallet af neuroner stiger. Forskellige softwareprogrammer er blevet udviklet til at fremskynde processen med at analysere calciumbilleddannelse. Tidligere blev software designet i en begrænset eksperimentel sammenhæng, hvilket gjorde det vanskeligt for andre laboratorier at vedtage det. Nylige bestræbelser på at opfylde moderne standarder for softwaredeling har ført til udviklingen af flere værktøjer, der konsekvent kan analysere calciumbilleddata på tværs af forskellige grupper 7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19 . De fleste af disse værktøjer kræver dog programmeringskendskab og / eller afhænger af kommerciel software. Mangel på programmeringsviden og softwarebetalingsmure afskrækker forskere fra at vedtage disse metoder. Desuden fokuserer mange af disse værktøjer på at korrigere x / y-bevægelsen, selvom bevægelse på z-aksen også skal eksplicit diagnosticeres og korrigeres6. Der er behov for et beregningsværktøj til at analysere 3D-calciumbilleddannelse, der fokuserer på neuroner, der udviser z-drift og vises på flere z-planer. Ideelt set bør dette værktøj bruge open source-software og ikke kræve programmeringskendskab for at give andre laboratorier mulighed for let at vedtage det.
Her udviklede vi et nyt ImageJ-plugin, TACI, til at analysere 3D-calciumbilleddata. Først omdøber softwaren om nødvendigt og organiserer 3D-calciumbilleddataene efter z-positioner. De interessante celler spores i hver z-position, og deres fluorescensintensiteter ekstraheres af TrackMate eller andre beregningsværktøjer. TACI anvendes derefter til at undersøge bevægelsen på z-aksen. Den identificerer den maksimale værdi af en z-stak og bruger den til at repræsentere en celles intensitet på det tilsvarende tidspunkt. Denne arbejdsgang er velegnet til at analysere 3D-calciumbilleddannelse med bevægelse i alle retninger og / eller med neuroner, der overlapper hinanden i lateral (x / y) retning, men vises i forskellige z-positioner. For at validere denne arbejdsgang blev 3D-calciumbilleddannelsesdatasæt fra fluelarvstermofølsomme neuroner og svampeneuroner i hjernen brugt. Bemærk, TACI er et open source ImageJ-plugin og kræver ingen programmeringskendskab.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Billeddannelse af calcium
- Forberedelse af fluelarver
BEMÆRK: Fluer og larver holdes ved 25 °C under en 12 h:12 timers lys:mørk cyklus.- Bedøv fluerne med CO2. Sorter 20-45 hanner og 20-45 hunner i hvert hætteglas, og giv dem mindst 24 timer til 48 timer for at komme sig efter CO2 -eksponeringen.
BEMÆRK: Flueeksponering for CO2 skal vare i kortest mulig tid. - For at synkronisere larvernes alder skal du trykke over fluerne i nye hætteglas, der indeholder gærgranulat, og lade dem lægge æg i 4-8 timer. Fjern fluerne ved at vende dem i nye hætteglas.
- Larverne opsamles ved 72 timer med 10 ml 20% w/v saccharoseopløsning.
- Bedøv fluerne med CO2. Sorter 20-45 hanner og 20-45 hunner i hvert hætteglas, og giv dem mindst 24 timer til 48 timer for at komme sig efter CO2 -eksponeringen.
- Opsætning af mikroskop og temperaturkontrol
- Udfør billeddannelsen på et konfokalmikroskop (se materialetabellen) og et z-akse piezo-trin med en sceneindsats ved hjælp af følgende indstillinger: laser, Argon; scanningstilstand, ramme; rammestørrelse, 512 x 512; hastighed, maksimum; kanaler / bitdybde, 1/8 bit; zoom, 1,5; z-stak, skive = 15, Keep = udsnit; fokusenheder og strategi, Bestemt fokus; fokus, Klart fokus på.
- Fastgør et Peltier-kølemodul til en køleplade ved hjælp af varmeoverførselsforbindelsen for at opbygge en termoelektrisk køler. Peltier drives af en 2 A strømforsyning.
- Fastgør en termoelementmikrosonde til en dataindsamlingsenhed for at registrere temperaturen.
- Billeddannelse af calcium
- Skyl larverne 3x i 1x fosfatbufret saltvand (PBS).
- Pipette 75 μL 1x PBS på midten af et glasglas.
- Sæt en eller to larver i 1x PBS og placer termoelementmikrosonden nær larverne.
BEMÆRK: Afstanden mellem larverne og mikrosonden skal være ~5 mm. Larverne kan bevæge sig, hvis mikrosonden er placeret for tæt på dem. En stor afstand kan resultere i unøjagtige temperaturaflæsninger. - Dæk larverne og termoelementmikrosonden med et glasdæksel. Forsegl dækslet med neglelak.
- Placer diaset på mikroskopets scene, find fokus ved hjælp af et 25x mål, og placer den termoelektriske køler på diaset.
BEMÆRK: Peltier placeres direkte på objektglasset, hvor larverne skal levere temperaturstimuli. - I konfokal software skal du fokusere på de fluorescerende celler af interesse. Juster lasereffekten for at undgå overmætning. Angiv den første og sidste udsnitsposition i z-stack-indstillingen.
BEMÆRK: Brug den lavest mulige lasereffekt før optagelse for at forhindre fotoblegning. - Start z-stack-scanningen og temperaturregistreringen på samme tid.
- Kontroller strømforsyningen, der driver Peltier, for at ændre Peltier-overfladetemperaturen. Tænd for strømforsyningen for at sænke temperaturen, og sluk den for at øge temperaturen.
- Stop z-stack-scanningen og temperaturregistreringen.
2. Analyse af 3D-calciumbilleddata
- Eksporter calciumbilleddataene til TIFF-filer, og gem dem i en mappe med samme navn som basisnavnet på TIFF-filerne indeni.
BEMÆRK: Filnavnet må ikke indeholde kommaer.- Brug følgende parametre til at eksportere calciumbilleddata fra ZEN (sort udgave): filtype, TIFF; kompression, LZW; kanaler, 2; Z-position, alle; tid, alle; fase, 1; region, fuld.
- Installation
- Download TACI-Calcium_Imaging.jar fra Github (https://github.com/niflylab/TACI_CalciumImagingPlugin/releases).
- Installer plugin i FIJI ved at klikke på Plugins i menulinjen og derefter klikke på Installer i rullemenuen (Plugins | Installer). Genstart derefter FIJI.
BEMÆRK: Brug IKKE plugins | Installer plugin. - Kør plugin ved at klikke på Plugins og derefter vælge TACI-Calcium Imaging (Plugins | TACI-calciumbilleddannelse).
- Brug funktionen OMDØB til at konvertere TIFF-filnavnene til den ønskede struktur.
BEMÆRK: Værktøjet bruger filename_h#t#z#c#.tif som standardstruktur (h# og c# er valgfrie; #: et positivt heltal). Hvis billedfilnavnene ikke findes i standardstrukturen, skal funktionen OMDØB udføres.- Vælg den mappe, hvor TIFF-billederne skal omdøbes, ved at klikke på Gennemse mapper.
- Udfyld parameteroplysningerne. Der vises fem parametre, herunder filnavn, fase, maks. T-position, maks. Z-position og kanal. Hver parameter har tre værdier: Foregående tekst, Parameterværdi og Rækkefølge.
BEMÆRK: Der skelnes mellem store og små bogstaver i oplysningerne. Hvis billedfilnavnene indeholder en sætning før en parameter, skal du udfylde sætningen som den foregående tekst for den tilsvarende parameter. Hvis billedfilnavnene indeholder en sætning efter alle parametre, skal du udfylde sætningen som Posttekst.- Sørg for at indtaste filnavn, maks. T-position og maks. Z-position, og at parameterværdierne for Maks. T-position og Maks. Z-position indeholder alle cifre.
- Vent på, at filnavnet automatisk udfyldes ved hjælp af mappenavnet.
- Hvis TIFF-filnavnene ikke indeholder fasen og kanalen, skal du lade den tilsvarende parameterværdi være tom og vælge Na i rækkefølge.
- Klik på Omdøb for at oprette en mappe med samme navn og _r. Bemærk, at TIFF-filnavnene i mappen er blevet omstruktureret, så de er kompatible med funktionen ORGANISER .
BEMÆRK: _r er føjet til filnavnene på TIFF-billederne.
- Brug funktionen ORGANISER til at gemme TIFF-billederne fra samme z-position i én mappe.
BEMÆRK: Mappenavnet skal have samme navn som basisnavnet på TIFF-filerne indeni og må IKKE have kommaer.- Vælg den mappe, hvor TIFF-billederne skal organiseres, ved at klikke på Gennemse mapper.
- Hvis parameteren CSV-fil (param.csv) findes, skal du vente på, at parameterværdierne udfyldes automatisk.
BEMÆRK: Param.csv filen har et påkrævet format. Parametrene, herunder filnavn, fase, position_t, position_z, kanal og is_gray, skal udfyldes i række 1 fra venstre mod højre startende fra kolonne A. Tilsvarende værdier for hver parameter skal udfyldes i række 2. - Hvis parameteren CSV-fil (param.csv) ikke findes, skal du udfylde parameterværdierne manuelt. Sørg for, at parameterværdierne for fase og kanal indeholder bogstaver, mens parameterværdierne for T-position og Z-position skal være de største tal for t- og z-positionerne. Hvis billedfilnavnene ikke indeholder fasen eller kanalen, skal du indtaste Na.
- Opret gråtone-TIFF-billeder, når det er nødvendigt. Lad feltet Er billeder grå? ikke markeret for at gråtone billederne.
- Klik på Organiser for at oprette en mappe med samme navn og _gray_stacks og for at generere mapper med samme navn og _# (#: z-positioner) i mappen. Bemærk, at TIFF-filerne sorteres i tilsvarende mapper efter z-positioner, og at der genereres en fil med navnet param.csv, hvor parametrene og deres værdier kan findes.
- Brug TrackMate i FIJI til at udtrække fluorescensintensiteterne af cellerne af interesse fra hver z-position.
BEMÆRK: Dette trin kan også udføres af anden billedbehandlingssoftware.- Åbn TIFF-billederne i en z-positionsmappe af FIJI.
- Kør TrackMate ved at klikke på Plugins | Sporing | TrackMate, og juster følgende parametre, hvis det er nødvendigt.
- Brug DoG- eller LoG-detektorer.
- Skift blobdiameter, tærskel og medianfilter. Juster blobdiameteren , så den svarer til cellernes diameter. Hvis cellerne er ovale, skal du justere blobdiameteren , så den svarer til den underordnede akse.
BEMÆRK: En forøgelse af tærsklen hjælper med at undgå, at baggrundsstøj opfanges som signaler, uden at signalintensiteten påvirkes (supplerende figur 1). En forhøjelse af tærsklen kan dog overse sande signaler (supplerende figur 1). Hvis signalerne er stærke, skal du bruge medianfilteret til at reducere salt- og peberstøjen. - Indstil filtrene til at fjerne nogle, hvis ikke alle, af de irrelevante signaler. Filtrene X og Y er rumlige filtre. Brug filtrene X og Y til at fjerne de irrelevante signaler, der er fjernt fra de virkelige signaler.
BEMÆRK: Når filtre er indstillet på et billede, er det afgørende at kontrollere alle de andre billeder for at sikre, at de reelle signaler ikke fjernes. - Indstil den maksimale forbindelsesafstand, den maksimale afstand til åbning og den maksimale billedafstand til lukning af mellemrum. Indstil den maksimale forbindelsesafstand og den maksimale afstand til lukning af mellemrum til at være 3x-5x blobdiameteren, især når prøverne bevæger sig betydeligt over tid, for at hjælpe med at reducere antallet af spor. Indstil det maksimale rammegab, der lukker mellemrum, til antallet af billeder i stakken.
- Eksportér fluorescensintensiteterne for interesseområderne (ROI'er) til en CSV-fil. Hvis der bruges en gammel TrackMate-version, skal du vælge Eksporter statistik over alle pletter i vinduet Vælg en handling. Hvis TrackMate-versionen er 7.6.1 eller højere, skal du vælge Spots i vinduet Skærmindstillinger. Eksporter eller gem som de interaktive filer til CSV-filer.
BEMÆRK: Begge filer er interaktive med billedvinduet; Fremhævning af et investeringsafkast viser det tilsvarende investeringsafkast i billedvinduet. Disse filer omfatter de gennemsnitlige intensiteter (MEAN_INTENSITY eller MEAN_INTENSITY_CH1) af de relevante celler på tilsvarende tidspunkter (POSITION_T). Den samme TRACK_IDs skal repræsentere det samme investeringsafkast på forskellige tidspunkter. Dette er dog ikke altid sandt og skal muligvis rettes manuelt, når det er nødvendigt. Hvis TrackMate ikke genkender ROI'erne på nogle tidspunkter, vises disse tidspunkter ikke.
- Udpak baggrundsfluorescensintensiteten, og opret Background_list.csv filen.
BEMÆRK: I denne undersøgelse blev baggrundsintensiteten for hver z-position estimeret ved hjælp af gennemsnitsværdien af tre til fem nærliggende klatter af samme størrelse, der ikke indeholdt fluorescenssignaler og var fra forskellige tidspunkter.- Den Background_list.csv fil har et påkrævet format: hver kolonne indeholder oplysningerne om en neuron, startende fra Neuron 0. Udfyld neurontallene, f.eks. neuron 0, i række 1. Angiv derefter baggrundsintensiteten for hver z-position, der analyseres - hvis fem z-positioner analyseres for Neuron 0, skal du udfylde fem baggrundsintensitetsværdier under Neuron 0.
BEMÆRK: Den Background_list.csv fil kræves til funktionen TACI EXTRACT . Hvis baggrunden er ubetydelig, skal Background_list.csv med nul-baggrundsintensiteten af hver neuron angives.
- Den Background_list.csv fil har et påkrævet format: hver kolonne indeholder oplysningerne om en neuron, startende fra Neuron 0. Udfyld neurontallene, f.eks. neuron 0, i række 1. Angiv derefter baggrundsintensiteten for hver z-position, der analyseres - hvis fem z-positioner analyseres for Neuron 0, skal du udfylde fem baggrundsintensitetsværdier under Neuron 0.
- Brug funktionen EKSTRAKT til at identificere de maksimale fluorescensintensiteter ved hver t-position og beregne ΔF/F0 som vist i ligning (1).
(1)- Opret en mappe, og navngiv den ved hjælp af neuronnummeret, startende fra Neuron 0. Gem CSV-filerne, der indeholder fluorescensoplysningerne for den tilsvarende neuron i mappen. Hver CSV-fil indeholder oplysningerne om én z-position, så antallet af CSV-filer svarer til antallet af analyserede z-positioner. Navngiv CSV-filerne som Mean_Intensity#.csv (# repræsenterer z-positionen), og hver CSV-fil indeholder mindst to kolonner: POSITION_T og MEAN_INTENSITY eller MEAN_INTENSITY_CH1.
BEMÆRK: Opret en mappe til hver celle af interesse. - Gem den Background_list.csv fil og mapper, der blev oprettet i trin 2.7.1, i én mappe. Vælg denne mappe ved at klikke på Gennemse filer.
BEMÆRK: Antallet af baggrundsværdier i Background_list.csv-filen skal svare til antallet af Mean_Intensity#.csv-filer for hver neuron. - Baggrundsfilen udfyldes automatisk. Udfyld det største antal t-positioner for antallet af T-positioner.
- Klik på Udpak for at oprette en resultatmappe, herunder CSV-filer og plots for hver neuron. CSV-filerne indeholder oplysninger om den maksimale fluorescensintensitet og ΔF / F0 ved hver t-position. Plottene er kurvediagrammer over ΔF/F0 over t-positioner.
BEMÆRK: I denne undersøgelse blev ΔF/F0 beregnet ved hjælp af ligning (1). Den første værdi af hver z-position blev brugt somF0. Hvis denne F0 ikke er passende20, giver pluginet filer inklusive rådata for hver neuron i python_files-mappen.
- Opret en mappe, og navngiv den ved hjælp af neuronnummeret, startende fra Neuron 0. Gem CSV-filerne, der indeholder fluorescensoplysningerne for den tilsvarende neuron i mappen. Hver CSV-fil indeholder oplysningerne om én z-position, så antallet af CSV-filer svarer til antallet af analyserede z-positioner. Navngiv CSV-filerne som Mean_Intensity#.csv (# repræsenterer z-positionen), og hver CSV-fil indeholder mindst to kolonner: POSITION_T og MEAN_INTENSITY eller MEAN_INTENSITY_CH1.
- Brug funktionen FLET til at beregne gennemsnittet af hver neurons ΔF/F 0, beregne SEM og plotte den gennemsnitlige ΔF/F0 over t-positioner.
- Vælg resultatmappen oprettet af EXTRACT-funktionen ved at klikke på Gennemse filer.
- Udfyld antallet af T-positioner med det største antal t-positioner.
- Klik på Flet for at oprette en merged_data mappe, herunder en merged_data.csv fil og en Average_dF_F0.png afbildning. CSV-filen indeholder oplysningerne om gennemsnittet og SEM ΔF/F0 ved hver t-position. Plottet er et linjediagram over den gennemsnitlige ΔF / F0 over t-positioner.
(1)Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Arbejdsproces for 3D-calciumbilledanalyse
I denne undersøgelse udviklede vi et nyt ImageJ-plugin, TACI, og beskrev en arbejdsgang til at spore z-drift og analysere 3D-calciumbilleddannelse, der lokaliserer reaktionerne fra individuelle celler, der vises i flere z-positioner (figur 1). Dette værktøj har fire funktioner: RENAME, ORGANIZE, EXTRACT og MERGE. For det første, hvis billednavnene ikke er kompatible med funktionen ORGANISER, kan funktionen OMDØB konvertere billednavnene til den ønskede struktur. Derefter gråtoner funktionen ORGANISER (hvis nødvendigt) og organiserer 3D-calciumbilleddannende TIFF-data efter z-positioner. Billeder fra samme z-position gemmes i en mappe. Dernæst kan forskellige billedanalyseværktøjer bruges til at detektere og spore ROI'erne og udtrække deres fluorescensintensiteter over tid for hver z-position. Et ImageJ-plugin, TrackMate, blev brugt til at udføre dette trin. TrackMate er et open source ImageJ-plugin til sporing af enkeltpartikler21. Det har været meget udbredt til at spore partikler i forskellige biologiske undersøgelser, der involverer levende cellebilleddannelse, herunder calciumbilleddannelse 11,21,22,23. TrackMate sporer på en automatiseret måde celler i lateral (x / y) retning, registrerer ROI'er og udtrækker signaler fra et live-imaging datasæt 4,12. For hver celle af interesse sorterer funktionen EXTRACT fluorescensintensiteterne fra alle z-positionerne efter t-positioner, identificerer de maksimale værdier for hver t-position, trækker baggrunden fra og beregner og plotter ΔF / F0. Endelig beregner og plotter funktionen FLET gennemsnittet af ΔF / F0 af flere celler.
Calciumresponser af fluelarv køler neuroner til temperaturændringer
Vi validerede denne metode ved hjælp af calciumændringer som reaktion på temperaturudsving i fluelarvekøleneuroner. En genetisk kodet calciumindikator, GCaMP6m 24, blev udtrykt i larvekøleneuroner af Ir21a-Gal425. Når de blev udsat for ca. 27 °C, havde neuronerne lave intracellulære calciumniveauer (figur 2A og figur 3). Når temperaturen blev sænket til ca. 10 °C og holdt der, steg de intracellulære calciumniveauer hurtigt og blev opretholdt (figur 2B og figur 3). Calciumniveauerne faldt hurtigt, når temperaturen blev forhøjet (figur 3).
Analyse af et 3D-calciumbilleddatasæt til fluehjerne
Vi validerede også denne metode ved hjælp af et fluehjerne 3D-calciumbilleddannelsesdatasæt11. De afbildede transgene fluer (VT50339-Gal4; UAS-GCaMP6f) udtrykte GCaMP6f i svampekroppen i hjernen11. Data fra 45 z-positioner (fordelt med 1,5 μm intervaller) blev indsamlet ved 50 Hz i 225 s (250 tidspunkter), og den første halvdel af datasættet (125 tidspunkter) blev analyseret. Da optagelsen begyndte, havde syv neuroner åbenlys fluorescens, og fire af dem blev analyseret (figur 4A). Intensiteterne i disse neuroner faldt over tid (figur 4B). Når octanol blev påført (figur 4C), blev flere neuroner lysere. Fluorescensen af 10 neuroner viste sig at stige samtidigt på tidspunktet 92 (figur 4D), hvilket tyder på, at disse svampeneuroner reagerer på oktanollugt. Selvom octanol blev anvendt i 5 s, blev høj fluorescens i disse neuroner observeret på kun et tidspunkt (0,9 s) og faldt derefter hurtigt, hvilket tyder på, at responsen er fasisk og forbigående.
Adskillelse af overlappende celler
Figur 5A viser et maksimalt projektionsbillede af tre neuroner. Den hvide pilespids peger på to neuroner, der overlappede hinanden i x / y-planet, men var separate i ortho-visningen (blå og orange pilespidser i figur 5B), hvilket indikerer, at disse neuroner optrådte i forskellige z-positioner; den orange celle havde det stærkeste signal på z7 (figur 5C), mens den blå celle havde det stærkeste signal på z10 (figur 5D). Værktøjet skelnede mellem disse to celler og afslørede den forsinkede, men stærke aktivering af den orange celle (figur 5E).
Figur 1: Arbejdsproces ved hjælp af TACI til analyse af 3D-calciumbilleddannelse. TACI har fire funktioner: RENAME, ORGANIZE, EXTRACT og MERGE. For det første, hvis TIFF-navnene ikke er kompatible med funktionen ORGANISER, kan funktionen OMDØB konvertere billednavnene til den ønskede struktur. Derefter gråtoner funktionen ORGANISER (hvis nødvendigt) og organiserer 3D-calciumbilleddannende TIFF-data efter z-positioner. Billeder fra samme z-position gemmes i en mappe. Dernæst kan forskellige billedanalyseværktøjer bruges til at detektere og spore ROI'erne og ekstrahere deres fluorescensintensiteter i hver z-position. For hver celle af interesse sorterer funktionen EXTRACT fluorescensintensiteterne efter de tilsvarende tidspunkter, identificerer de maksimale værdier for hver t-position, trækker baggrunden fra og beregner og plotter ΔF / F0. Endelig beregner og plotter funktionen FLET gennemsnittet af ΔF / F0 af flere celler. Forkortelser: TACI = TrackMate analyse af calciumbilleddannelse; ROI'er = interesseregioner ΔF/F0 = forholdet mellem ændring i fluorescens og initial fluorescensintensitet. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Calciumbilleddannelse af fluelarvekøleceller i inaktive og aktive tilstande . (A) Cellerne er næppe synlige i inaktiv tilstand. (B) Cellerne er stærkt fluorescerende i aktiv tilstand. Forskellige farve pilespidser angiver forskellige celler. Genotypen er Ir21a-Gal4; UAS-GCaMP6m. Z5-13: Billeder i z-positioner fra 5 til 13. I B vises cellen angivet med de hvide pilespidser på z5 til z8; Cellerne angivet med orange og blå pilespidser vises på Z8 til Z13. Skalabjælke = 10 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Kvantificering af fluorescens som ændringen i fluorescensintensitet (F) sammenlignet med begyndelsesintensiteten (F0). Genotypen er Ir21a-Gal4; UAS-GCaMP6m. n = 7 celler fra tre dyr. Spor = middel ± SEM. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Analyse af et 3D-calciumbilleddatasæt til fluehjerner. (A) Det maksimale projektionsbillede på tidspunktet punkt 1 (t1). Tallene 0-3 angiver de fire analyserede neuroner. (B) Fluorescensændringer af neuroner 0-3 i A i tidspunkterne 0 til 125. C) Det maksimale projektionsbillede på tidspunktet 92 (t92). Tallene 0-9 angiver de 10 analyserede neuroner. (D) Fluorescensændringer af neuroner 0-9 i C i tidspunkterne 0 til 125. Enten 5 s luft eller 5 s octanol blev påført, som vist i gråt. Skalabjælke = 10.000 enheder rå fluorescensintensitet. Forkortelse: OCT = octanol. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Adskillelse af overlappende celler baseret på den maksimale værdi. (A) To neuroner overlapper hinanden (hvid pilespids) i et maksimalt projektionsbillede (m). Genotypen er Ir21a-Gal4; UAS-GCaMP6m. (B) Disse neuroner er separate i ortho-visningen (blå og orange pilespidser). (C,D) Den orange celle vises på z7 (C), mens den blå celle vises på z10 (D). Skalabjælke = 10 μm. E) Fluorescensændringerne i de orange og blå celler kvantificeres ved hjælp af maksimumsværdierne fra individuelle z-positioner. Forkortelse: ΔF/F0 = forholdet mellem ændring i fluorescens og initial fluorescensintensitet. Klik her for at se en større version af denne figur.
Supplerende figur 1: To neuroner med svage calciumsignaler analyseres ved hjælp af DoG- og LoG-detektorer ved forskellige tærskler. (A-C) Den første neuron (Ir21a-Gal80 26/UAS-GCaMP6;Ir93a-Gal427) analyseres af DoG og LoG ved forskellige tærskler. A) Tærsklen er fastsat til 0,1. Både DoG og LoG registrerer alle 36 tidspunkter. B) Tærsklen er fastsat til 0,3. Blandt de 36 tidspunkter registrerer DoG 36, og LoG registrerer 35. C) Tærsklen er fastsat til 1,0. Blandt de 36 tidspunkter registrerer DoG 34, og LoG registrerer 15. (D-F) Den anden neuron (UAS-GCaMP6; Ir68a-Gal428) analyseres af DoG og LoG ved forskellige tærskler. D) Tærsklen er fastsat til 0,1. DoG registrerer alle 36 tidspunkter, og LoG registrerer 34. E) Tærsklen er fastsat til 0,3. Blandt de 36 tidspunkter registrerer DoG 33, og LoG registrerer 18. (F) Tærsklen er fastsat til 1,0. Blandt de 36 tidspunkter registrerer DoG 14, og LoG registrerer kun et. Bemærk, at forøgelse af tærsklen ikke påvirker dens intensitetslæsning, hvis et investeringsafkast genkendes. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende figur 2: Den maksimale værdi er en god repræsentant for en celles intensitet. (A) Z-stakke med forskellige z-afstande simuleres. (B) Z-stakke med forskellige z-positioner simuleres. (C) Z-stakke er skabt af simulerede celler med forskellige intensiteter. Forkortelser: max = den maksimale værdi af en z-stak; ground_truth = produktet af den simulerede celles volumen og dens fyldte intensitet. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende figur 3: Sammenligning mellem TACI- og 3D-ROI-metoder. (A) Fluorescensændringer i to celler angivet med orange og blå kvantificeres ved hjælp af TACI og et brugerdefineret software skrevet i IGOR Pro. Genotypetypen er R11F02-Gal429; UAS-GCaMP6m. B) Fluorescensændringer i to felter angivet med orange og blåt kvantificeres ved hjælp af TACI og IMARIS. Genotypetypen er Ir21a-Gal4; UAS-GCaMP6m. Forkortelse: ΔF/F0 = forholdet mellem ændring i fluorescens og initial fluorescensintensitet. Klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne undersøgelse udviklede et nyt ImageJ-plugin, TACI, og beskrev en arbejdsgang, der analyserede 3D-calciumbilleddannelse. Mange aktuelt tilgængelige værktøjer fokuserer på at korrigere x / y-bevægelsen, selvom bevægelse på z-aksen også skal diagnosticeres eksplicit eller korrigeres6. Under billedoptagelse i en levende organisme er bevægelse på z-aksen uundgåelig, selv når organismen er immobiliseret, og nogle stimuli, såsom temperaturændring, forårsager ofte betydelig z-drift. Forøgelse af højden på z-stablerne giver mulighed for optagelse af cellerne af interesse under hele billeddannelsesprocessen; Det er dog ikke trivielt at analysere bevægelse på Z-aksen, især når individuelle celler vises i flere Z-positioner. Hvis en sådan bevægelse ignoreres, vil forskerne ikke opnå de præcise calciumresponser fra disse celler. TACI korrigerer z-driften ved at udtrække fluorescenssignalerne fra hver z-position. Et kritisk trin i TACI er at sortere den maksimale værdi på hvert tidspunkt og bruge den til at repræsentere en celles intensitet. Derfor er det nøglen til at inkludere alle z-positionerne i cellerne af interesse under billeddannelsesprocessen. Derudover anbefaler vi at lade en celle vises i fem eller flere z-positioner, så z-afstandene og z-positionerne ikke påvirker den maksimale værdi (supplerende figur 2A, B). Derudover giver TACI mulighed for adskillelse af celler, der overlapper hinanden i lateral (x/y) retning, men vises i forskellige z-positioner.
Z-drift kan også korrigeres ved at udtrække fluorescensintensiteter fra 3D ROIs 8,11,29. Vi sammenlignede TACI med to 3D-ROI-metoder. Først skabte Klein et al. en brugerdefineret software skrevet i IGOR Pro, der bruger de lyseste 100 pixels i hver 3D ROI til at generere det rå signal29. Denne metode og TACI gav lignende resultater (supplerende figur 3A). For det andet anvendte vi IMARIS (version 9.8.2), en kommerciel software, til at modellere 3D-ROI'erne og udtrække deres gennemsnitlige intensiteter. Selv om resultaterne fra TACI og IMARIS viste lignende tendenser, var foldændringerne forskellige (supplerende figur 3B). Denne uoverensstemmelse kan skyldes algoritmer. Det skal bemærkes, at den maksimale værdi, TACI ekstraherer, er proportional med intensiteten af jordbundens sandhed (supplerende figur 2C).
Selvom denne arbejdsgang er halvautomatisk og stadig kræver manuel indsats fra forskere, giver den en beregningsmæssig tilgang til 3D-calciumbilleddannelsesanalyse. Det er vigtigt, at denne arbejdsgang er baseret på ImageJ og ikke kræver kommerciel software eller programmeringskendskab. Begrænsningerne og potentielle løsninger for denne arbejdsgang er som følger. For det første accepterer TACI kun TIFF-filer og en bestemt filnavnstruktur: filename_h#t#z#c#.tif (h# og c# er valgfrie). Andre filformater, der er kompatible med ImageJ, kan dog nemt konverteres til TIFF-filer af ImageJ. Desuden har pluginet en NAME-funktion , der konverterer billednavnene til den krævede struktur, så den er kompatibel med calciumbilleddata opnået fra forskellige systemer.
For det andet er pluginet designet til calciumbilleddata med konstant baggrund. At trække de tilsvarende baggrundsoplysninger fra ROI-intensiteterne på hvert tidspunkt er en måde at korrigere svingende baggrunde på. Værktøjet giver ROI-intensiteter på hvert tidspunkt i python_files-mappen. Baggrundsintensiteterne kan repræsenteres af (1) billedernes gennemsnitlige intensiteter eller (2) gennemsnitsintensiteterne af ROI'erne uden aktive celler. ImageJ giver metoder til at opnå billedernes gennemsnitlige intensiteter (ved at klikke på Billede | Stak | Mål stak) og de gennemsnitlige intensiteter af tilfældige ROI'er (ved at klikke på Analysér | Værktøjer | ROI Manager | Multi foranstaltning). Hvis fotoblegning sker under calciumbilleddannelse, er blegemiddelkorrektionsfunktionen (ved at klikke på Billede | Juster | Bleach Correction) kan køres før TrackMate.
Endelig skal celleregistrering på tværs af z-positioner inkluderes i denne arbejdsgang, hvis TACI bruges til at analysere et stort antal neuroner samtidigt. Derfor skal der udvikles en yderligere funktion, der organiserer oplysningerne om fluorescensintensiteter i den datastruktur, der kræves af FLE-funktionen .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter at oplyse.
Acknowledgments
En Zeiss LSM 880 i Fralin Imaging Center blev brugt til at indsamle calciumbilleddata. Vi anerkender Dr. Michelle L Olsen og Yuhang Pan for deres hjælp med IMARIS softwaren. Vi anerkender Dr. Lenwood S. Heath for konstruktive kommentarer til manuskriptet og Steven Giavasis for kommentarer til GitHub README-filen. Dette arbejde blev støttet af NIH R21MH122987 (https://www.nimh.nih.gov/index.shtml) og NIH R01GM140130 (https://www.nigms.nih.gov/) til L.N. Bidragyderne havde ingen rolle i undersøgelsens design, dataindsamling og analyse, beslutning om at offentliggøre eller udarbejdelse af manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Blunt Fill Needel | BD | 303129 | |
| Calcium chloride dihydrate | Fisher Scientific | 10035-04-8 | Fly food ingredient |
| Carbon dioxide | Airgas | UN1013 | Size 200 High Pressure Steel Cylinder |
| CO2 bubbler kit | Genesee | 59-180 | |
| Confocal microscope LSM880 | Zeiss | 4109002107876000 | An inverted Axio Observer Z1, equipped with 5 lasers, 2 standard PMT detectors, 32-channel GaAsP dectectors, an Airyscan detector, and Definite Focus.2. |
| DAQami software | Measurement Computing | ||
| Dextrose | Genesee | 62-113 | Fly food ingredient |
| Drosophila Agar | Genesee | 66-111 | Fly food ingredient |
| Ethanol | Decon Labs, Inc. | 64-17-5 | Fly food ingredient |
| Fly line: Ir21a-Gal4 | Dr. Paul Garrity lab | A kind gift | |
| Fly line: Ir21a-Gal80 | Dr. Lina Ni lab | ||
| Fly line: Ir68a-Gal4 | Dr. Aravinthan DT Samuel lab | A kind gift | |
| Fly line: Ir93a-Gal4 | Dr. Paul Garrity lab | A kind gift | |
| Fly line: UAS-GCaMP6 | Bloomington Drosophila Stock Center | 42750 | |
| Flypad | Genesee | 59-114 | |
| General purpose forged brass regulator | Gentec | G152 | |
| Gibco PBS pH 7.4 (1x) | Thermo Fisher Scientific | 10010-031 | |
| Green Drosophila tubing | Genesee | 59-124 | |
| Heat transfer compound | MG Chemicals | 860-60G | |
| Heatsink | Digi-Key Electronics | ATS2193-ND | Resize to 12.9 x 5.5 cm |
| Illuminator | AmScope | LED-6W | |
| Inactive Dry Yeast | Genesee | 62-108 | Fly food ingredient |
| Incubator | Pervical | DR-41VL | Light: dark cycle: 12h:12h; temperature: 25 °C; humidity: 40-50% RH. |
| Methyl-4-hydroxybenzoate | Thermo Scientific | 126965000 | Fly food ingrediete |
| Micro cover glass | VWR | 48382-126 | 22 x 40 mm |
| Microscope slides | Fisher Scientific | 12-544-2 | 25 x 75 x 1.0 mm |
| Nail polish | Kleancolor | ||
| Narrow Drosophila vials | Genesee | 32-113RL | |
| Objective | Zeiss | 420852-9871-000 | LD LCI Plan-Apochromat 25x/0.8 Imm Corr DIC M27 |
| Peltier cooling module | TE Technology | TE-127-1.0-0.8 | 30 x 30 mm |
| Plugs | Genesee | 49-102 | |
| Power Supply | Circuit Specialists | CSI1802X | 10 volt DC 2.0 amp linear bench power supply |
| Princeton Artist Brush Nepture | Princeton Artist Brush Co. | Series 4750, size 2 | |
| Sodium potassium L-tartrate tetrahydrate | Thermo Scientific | 033241-36 | Fly food ingredient |
| Stage insert | Wienecke and Sinske | 432339-9030-000 | |
| Stereo Microscope | Olympus | SZ61 | Any stereo microscope works |
| T-Fitting | Genesee | 59-123 | |
| Thermocouple data acquisition device | Measurement Computing | USB-2001-TC | Single channel |
| Thermocouple microprobe | Physitemp | IT-24P | |
| Yellow Cornmeal | Genesee | 62-101 | Fly food ingredient |
| Z-axis piezo stage | Wienecke and Sinske | 432339-9000-000 |
References
- Grienberger, C., Konnerth, A.
- Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein. Nature Biotechnology. 19 (2), 137-141 (2001).
- Zhang, Y., et al. jGCaMP8 fast genetically encoded calcium indicators. Janelia Research Campus. , (2020).
- Robbins, M., Christensen, C. N., Kaminski, C. F., Zlatic, M. Calcium imaging analysis - How far have we come. F1000Research. 10, 258 (2021).
- Oh, J., Lee, C., Kaang, B. K. Imaging and analysis of genetically encoded calcium indicators linking neural circuits and behaviors. The Korean Journal of Physiology & Pharmacology. 23 (4), 237-249 (2019).
- Stringer, C., Pachitariu, M. Computational processing of neural recordings from calcium imaging data. Current Opinion in Neurobiology. 55, 22-31 (2019).
- Pnevmatikakis, E. A., Giovannucci, A. NoRMCorre: An online algorithm for piecewise rigid motion correction of calcium imaging data. Journal of Neuroscience Methods. 291, 83-94 (2017).
- Nguyen, J. P., Linder, A. N., Plummer, G. S., Shaevitz, J. W., Leifer, A. M. Automatically tracking neurons in a moving and deforming brain. PLoS Computational Biology. 13 (5), 1005517 (2017).
- Lagache, T., Hanson, A., Pérez-Ortega, J. E., Fairhall, A., Yuste, R. EMC2: A versatile algorithm for robust tracking of calcium dynamics from individual neurons in behaving animals. bioRxiv. , (2021).
- Giovannucci, A., et al. CaImAn an open source tool for scalable calcium imaging data analysis. Elife. 8, 38173 (2019).
- Delestro, F., et al. In vivo large-scale analysis of Drosophila neuronal calcium traces by automated tracking of single somata. Scientific Reports. 10, 7153 (2020).
- Cantu, D. A., et al. EZcalcium: Open-source toolbox for analysis of calcium imaging data. Frontiers in Neural Circuits. 14, 25 (2020).
- Eglen, S. J., et al. Toward standard practices for sharing computer code and programs in neuroscience. Nature Neuroscience. 20 (6), 770-773 (2017).
- Pachitariu, M., et al. Suite2p: Beyond 10,000 neurons with standard two-photon microscopy. bioRxiv. , (2017).
- Corder, G., et al. An amygdalar neural ensemble that encodes the unpleasantness of pain. Science. 363 (6424), 276-281 (2019).
- Lagache, T., Hanson, A., Pérez-Ortega, J. E., Fairhall, A., Yuste, R. Tracking calcium dynamics from individual neurons in behaving animals. PLoS Computational Biology. 17 (10), 1009432 (2021).
- Kolar, K., Dondorp, D., Zwiggelaar, J. C., Høyer, J., Chatzigeorgiou, M. Mesmerize is a dynamically adaptable user-friendly analysis platform for 2D and 3D calcium imaging data. Nature Communications. 12, 6569 (2021).
- Moein, M., et al. CaSiAn: A Calcium Signaling Analyzer tool. Bioinformatics. 34 (17), 3052-3054 (2018).
- Zhou, P., et al. Efficient and accurate extraction of in vivo calcium signals from microendoscopic video data. Elife. 7, 28728 (2018).
- Neugornet, A., O'Donovan, B., Ortinski, P. I. Comparative effects of event detection methods on the analysis and interpretation of Ca(2+) imaging data. Frontiers in Neuroscience. 15, 620869 (2021).
- Tinevez, J. Y., et al. TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking. Methods. 115, 80-90 (2017).
- Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Fazeli, E., et al. Automated cell tracking using StarDist and TrackMate. F1000Research. 9, 1279 (2020).
- Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
- Ni, L., et al. The ionotropic receptors IR21a and IR25a mediate cool sensing in Drosophila. Elife. 5, 13254 (2016).
- Omelchenko, A. A., et al. Cool and warm ionotropic receptors control multiple thermotaxes in Drosophila larvae. Frontiers in Molecular Neuroscience. , (2022).
- Sanchez-Alcaniz, J. A., et al. An expression atlas of variant ionotropic glutamate receptors identifies a molecular basis of carbonation sensing. Nature Communications. 9 (1), 4252 (2018).
- Hernandez-Nunez, L., et al. Synchronous and opponent thermosensors use flexible cross-inhibition to orchestrate thermal homeostasis. Science Advances. 7 (35), (2021).
- Klein, M., et al. Sensory determinants of behavioral dynamics in Drosophila thermotaxis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (2), 220-229 (2015).
