Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Realtidsmåling af mitokondriel bioenergetisk profil af neutrofiler

Published: June 2, 2023 doi: 10.3791/64971
Automatic Translation
1, 2,3, 1
1Department of Immunology, School of Medicine, UConn Health, 2Arthritis and Clinical Immunology Program, Oklahoma Medical Research Foundation, 3Department of Microbiology and Immunology, University of Oklahoma Health Science Center

Summary

Vi beskriver trinvise protokoller, der måler mitokondriel respiration af muse- og humane neutrofiler og HL60-celler ved hjælp af den metaboliske ekstracellulære fluxanalysator.

Abstract

Neutrofiler er den første forsvarslinje og de mest rigelige leukocytter hos mennesker. Disse effektorceller udfører funktioner såsom fagocytose og oxidativ burst og skaber neutrofile ekstracellulære fælder (NET'er) til mikrobiel clearance. Ny indsigt i neutrofilers metaboliske aktiviteter udfordrer det tidlige koncept, at de primært er afhængige af glykolyse. Præcis måling af metaboliske aktiviteter kan udfolde forskellige metaboliske krav til neutrofiler, herunder tricarboxylsyre (TCA) cyklus (også kendt som Krebs cyklus), oxidativ phosphorylering (OXPHOS), pentosephosphatvej (PPP) og fedtsyreoxidation (FAO) under fysiologiske forhold og i sygdomstilstande. Dette papir beskriver en trinvis protokol og forudsætninger for at måle iltforbrugshastigheden (OCR) som en indikator for mitokondriel respiration på museknoglemarvsafledte neutrofiler, humane blodafledte neutrofiler og den neutrofillignende HL60-cellelinje ved hjælp af metabolisk fluxanalyse på en metabolisk ekstracellulær fluxanalysator. Denne metode kan anvendes til kvantificering af mitokondriefunktionerne hos neutrofiler under normale og sygdomsbetingelser.

Introduction

Mitokondrier spiller en vigtig rolle i cellebioenergetik, som genererer adenosintrifosfat (ATP) ved oxidativ phosphorylering (OXPHOS). Ud over dette strækker mitokondriernes rolle sig ind i generering og afgiftning af reaktive iltarter, cytoplasmatisk og mitokondriel matrixcalciumregulering, cellulær syntese, katabolisme og transport af metabolitter i cellen1. Mitokondriel respiration er afgørende i alle celler, da deres dysfunktion kan resultere i metaboliske problemer 2, herunder hjerte-kar-sygdomme3 og en lang række neurodegenerative sygdomme, såsom aldersrelateret makuladegeneration4, Parkinsons og Alzheimers sygdomme5 og Charcot-Marie-Tooth sygdom2 A (CMT2A)6.

Elektronmikroskopiske undersøgelser af neutrofiler afslørede, at der er relativt få mitokondrier7, og de er stærkt afhængige af glykolyse for deres energiproduktion, da mitokondrie respirationshastigheder er meget lave8. Imidlertid er mitokondrier afgørende for neutrofile funktioner, såsom kemotakse9 og apoptose10,11,12. En tidligere undersøgelse afslørede et komplekst mitokondrienetværk i humane neutrofiler med højt membranpotentiale. Mitokondriemembranens potentielle tab er en tidlig indikator for neutrofil apoptose10. Behandling med mitokondriel afkobler carbonylcyanid m-chlorphenylhydrazon (CCCP) viste signifikant hæmning i kemotaksi sammen med en ændring i mitokondriemorfologi 9,10.

Selvom den primære energikilde for neutrofiler er glykolyse, tilvejebringer mitokondrier ATP, der initierer neutrofilaktivering ved at brænde den første fase af purinerg signalering, hvilket øger Ca2+ signalering, forstærker mitokondriel ATP-produktion og initierer neutrofile funktionelle reaktioner13. Dysfunktion af mitokondrie-respirationskæden resulterer i overdreven produktion af toksiske reaktive iltarter (ROS) og fører til patogene skader14,15,16. NETosis, som er processen med at danne neutrofile ekstracellulære fælder (NET'er), er en kritisk egenskab ved neutrofiler, der hjælper dem med at bekæmpe patogener17 og bidrager til mange patologiske tilstande, herunder kræft, trombose og autoimmune lidelser18. Mitokondrieafledt ROS bidrager til NETosis19, mitokondrie-DNA kan være en komponent i NETs18, og ændret mitokondriehomeostase svækker NETosis 20,21,22,23,24. Desuden bliver neutrofil metabolisk omprogrammering under normal differentiering eller modning vendt ved at begrænse glykolytisk aktivitet, og de engagerer sig i mitokondriel respiration og mobiliserer intracellulære lipider25,26.

Den metaboliske ekstracellulære fluxanalysator kan kontinuerligt overvåge og kvantificere levende celle mitokondriel respiration og glykolyse. Analysatoren anvender en 96-brønds pladeformatsensorpatron og to fluoroforer til at kvantificere iltkoncentration (O2) og pH-ændringer. Sensorpatronen er over cellemonolaget under analysen og danner et ~ 200 nm højt mikrokammer. De optiske fiberbundter i analysatoren bruges til at excitere fluoroforerne og detektere de fluorescerende intensitetsændringer. Ændringer i realtid iO2-koncentration og pH beregnes automatisk og vises som iltforbrugshastighed (OCR) og ekstracellulær forsuringshastighed (ECAR). Der er fire porte på sensorpatronen, der gør det muligt at indlæse op til fire forbindelser i hver brønd under analysemålingerne. Denne protokol fokuserer på kvantificering af mitokondriel respiration af mus og humane neutrofiler samt de neutrofillignende HL60-celler ved hjælp af den metaboliske ekstracellulære fluxanalysator.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Hepariniserede fuldblodsprøver blev opnået fra raske humane donorer efter at have opnået informeret samtykke, som godkendt af Institutional Review Board of UConn Health i overensstemmelse med Helsingfors-erklæringen. Alle dyreforsøg fulgte UConn Health Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) retningslinjer, og godkendelse til brug af gnavere blev opnået fra UConn Health IACUC i henhold til kriterier skitseret i vejledningen til pleje og brug af forsøgsdyr fra National Institutes of Health. C57BL/6-hanmus i 6-ugers alderen blev anvendt i dette studie.

1. Fremstilling af 96-brøndpladen til det metaboliske ekstracellulære fluxassay

  1. En sensorpatron er pakket oven på den specialdesignede 96-brønds plade til metabolisk ekstracellulær fluxanalyse. Cylinderampullen hydreres ved forsigtigt at løfte den, og der anbringes 200 μL/hul kalibreringsmedium i hvert hul i den underliggende plade. Cylinderampullen anbringes over pladen med kalibrering i en ikke-CO2 befugtet 37 °C inkubator natten over for at hydrere.
  2. Baseret på celletypen skal du bruge en specifik belægning til kulturpladen for at sikre celleadhæsion. For humane neutrofiler - udifferentierede og differentierede HL60-celler - belæg 96-brøndpladen med sterilt fosfatbufret saltvand (PBS) indeholdende 50 μL 5 μg/ml renset museanti-humant CD18-antistof (klon TS1/18) ved 4 °C natten over. For museneutrofiler skal du belægge 96-brøndpladen med 25 μL 22,4 μg/ml celletak ved pH 8,0 i 0,1 M NaHCO3 ved stuetemperatur (RT) i 20 minutter.
  3. Pladerne vaskes to gange med 200 μL sterilt PBS.
  4. Tilsæt komplet medium til hjørnehullerne (A1, A12, H1 og H12) på cellekulturpladen (uden celler) til baggrundskorrektion i cellekulturpladerne under såning.
    BEMÆRK: Fordampning under belægning og kalibrering kan påvirke kalibreringsmediets volumen og normalisering. Brug en bakke eller et kammer med sterilt vandbefugtet væv, og placer pladen med kalibranten over den for at forhindre fordampning.

2. Forberedelse og såning af celler

  1. Fremstilling af analysemedium
    1. Forbered analysemedium ved at tilsætte 1 mM pyruvat, 10 mM glucose og 2 mM glutamin til Dulbeccos modificerede Eagle medium (DMEM).
  2. Isolering af museneutrofiler fra knoglemarv
    1. Isoler museneutrofiler fra knoglemarv ved hjælp af musens neutrofile berigelsessæt i henhold til producentens anvisninger.
    2. Bedøv musene ved intraperitoneal (i.p.) injektion af ketamin (125 mg / kg) og xylazin (12,5 mg / kg) og aflive derefter musene ved cervikal dislokation.
    3. Høst lårbenene og tibierne, som beskrevet tidligere27. Skær kort huden for at udsætte benet med musklerne. Skær hofteleddet for at fjerne benet fra kroppen. Fjern derefter musklerne for at samle lårbenet og skinnebenet.
    4. Skær de mindre ender af lårbenene og tibias. Hold de afskårne ender nede, anbring dem i et 0,5 ml centrifugerør med to 25 G sprøjtenålestansede huller i bunden, og anbring 0,5 ml røret i et 1,5 ml centrifugerør (figur 1A). Tilsæt 50 μL PBS i 0,5 ml røret for at forhindre tørring af knoglemarvsceller.
    5. Der centrifugeres ved 5.900 × g ved RT i 15 s for at opsamle knoglemarven i bunden af 1,5 ml røret. Resuspender knoglemarvscellerne med 1 ml DMEM. Tilsæt 50 μL rotteserum fra sættet, bland forsigtigt ved pipettering, og overfør cellesuspensionen til et 5 ml reagensglas af polystyrenkultur.
    6. Tilsæt 50 μL berigelsescocktail fra Mouse Neutrophil Enrichment Kit og inkuber i 15 minutter ved RT. Centrifuger ved 300 × g ved RT i 5 min.
    7. Resuspender cellerne med 1 ml DMEM, tilsæt 50 μL biotinudvælgelsescocktail fra sættet, bland forsigtigt ved pipettering og inkuber i 15 minutter ved RT.
    8. Tilsæt 150 μL hvirvelmagnetiske partikler fra sættet, bland forsigtigt ved pipettering og inkuber i 10 minutter ved RT.
    9. Der tilsættes ~1,3 ml DMEM, blandes forsigtigt ved pipettering, anbring røret i magneten i 3 minutter, og overfør supernatanten indeholdende rensede museneutrofiler til et nyt 5 ml reagensglas af polystyrenkultur ved at vende det originale glas om på hovedet sammen med magneten.
    10. Der centrifugeres ved 300 × g ved RT i 5 min. Efter fjernelse af supernatanten ved vakuumaspiration resuspenderes cellerne med 1 ml analysemedium.
    11. Tæl cellerne manuelt ved hjælp af et hæmocytometer.
    12. Celletætheden justeres til 1,1 × 106 celler/ml ved tilsætning af analysemedium, frø 180 μL af musens neutrofile suspension (2 × 105 celler) pr. hul i den forberedte 96-brøndplade (trin 1.2-1.4), og centrifuger pladen ved 300 × g ved RT i 3 minutter uden bremse for at sikre, at cellerne på bunden af pladen klæber korrekt.
    13. Pladen inkuberes i en befugtet 37 °C inkubator uden CO2 i 1 time for at præekvilibrere cellerne med analysemediet.
      BEMÆRK: Renheden af neutrofilerne er kritisk for analysen, da det er en potentiel bias. Renheden af musens neutrofile isolering er 69,9% -88,7% ved denne protokol. Der er andre metoder til isolering af neutrofiler fra museknoglemarv, såsom densitetsgradientcentrifugering28. Der er også alternative neutrofile isolationssæt fra andre leverandører, baseret på den negative magnetiske udvælgelse ved hjælp af de monoklonale antistoffer mod antigener, der ikke udtrykkes på neutrofiler.
  3. Dyrkning af humane neutrofiler fra perifert blod
    1. Tilsæt 8 ml polysaccharidopløsning i et 15 ml centrifugeglas, og lag derefter over 4 ml perifert blod oven på polysaccharidopløsningen uden blanding.
    2. Der centrifugeres ved 550 × g ved 20 °C i 30 minutter. Få rotoren til at decelerere ved 1.
      BEMÆRK: Den neutrofile separationstid kan variere mellem donorer. Det er mindst 30 minutter, og yderligere 10-20 minutter kan være nødvendige, hvis neutrofil adskillelse ikke lykkes.
    3. Plasma/trombocytter og mononukleære celler observeres efter centrifugeringen, som vist i figur 1B. Fjern forsigtigt den øverste gule væske ovenpå (plasma og blodplader) og det øvre uklare bånd (mononukleære celler) uden at forstyrre det nedre uklare bånd (neutrofiler) ved hjælp af en 1 ml pipette.
    4. Det nederste uklare bånd og ~3-4 ml af den klare væske nedenunder samles i et nyt 15 ml centrifugerør indeholdende 10 ml PBS.
    5. Der centrifugeres ved 400 × g ved 20 °C i 10 minutter, og supernatanten fjernes ved vakuumaspiration.
    6. Cellerne resuspenderes med 5 ml PBS og centrifugeres ved 300 × g ved 20 °C i 5 minutter.
    7. Efter fjernelse af supernatanten resuspenderes cellerne med 1 ml analysemedium.
    8. Tæl cellerne manuelt ved hjælp af et hæmocytometer.
      BEMÆRK: Da erytrocytter i blodet ikke har mitokondrier, påvirker erytrocytforurening ikke mitokondriestresstestanalysen og forhindrer neutrofilaktivering / priming29,30. Erytrocytter skal lyseres under celletælling for at få en nøjagtig neutrofilkoncentration. Tilsæt 10 μL af cellesuspensionen til 891 μL deioniseret vand i 10-30 s for at lyse erytrocytterne, tilsæt derefter 99 μL 10x PBS for at afbalancere det osmotiske tryk, undgå lysis af neutrofilerne.
    9. Celletætheden justeres til 2,2 × 106 celler/ml ved tilsætning af analysemedium, frø 180 μL humane neutrofiler (~4 × 105) pr. brønd i den forberedte 96-brøndplade, og centrifuger pladen ved 300 × g ved RT i 3 minutter uden bremse for at sikre korrekt vedhæftning af cellerne i bunden af pladen.
    10. Pladen inkuberes i en ikke-CO2, befugtet 37 °C inkubator i 1 time for at præekvilibrere cellerne med analysemediet.
      BEMÆRK: Renheden af neutrofiler er kritisk for analysen, da det er en potentiel bias. Renheden af human neutrofilisolering er 86,6% -96,8%. Der er andre densitetsgradientcentrifugeringsmetoder til isolering af neutrofiler fra humant blod, herunder Percoll-isolering samt en kombination af Ficoll-isolering og dextransedimentering31.
  4. HL60-cellekultur og neutrofil-rettet differentiering
    1. Oprethold HL60-celler i Roswell Park Memorial Institute (RPMI)-1640-medium indeholdende 10% føtalt bovint serum (FBS), 100 μg / ml penicillin, 100 μg / ml streptomycin og 250 ng / ml amphotericin B ved 37 ° C og 5% CO2.
    2. Til neutrofilrettet differentiering opretholdes HL60-cellerne (suspenderede celler) i en T25-kolbe ved en densitet på 1 × 10 5 celler / ml i RPMI-1640-medium indeholdende 10% FBS, 100 μg / ml penicillin, 100 μg / ml streptomycin, 250 ng / ml amphotericin B og 1,3% dimethylsulfoxid (DMSO) ved 37 ° C og5 % CO2 i 6 dage.
    3. På prøvedagen tælles cellerne manuelt ved hjælp af hæmocytometeret, centrifugeres differentierede eller udifferentierede HL60-celler ved 300 × g ved RT i 5 minutter, vaskes med DMEM én gang og resuspenderes cellerne med analysemediet for at få en celletæthed på 1,39 × 106 celler / ml.
    4. Der sås 180 μL differentierede eller udifferentierede HL60-celler (~2,5 × 105) pr. brønd i den forberedte plade med 96 brønde, og pladen centrifugeres ved 300 × g ved RT i 3 minutter uden bremse for at sikre, at cellerne på bunden af pladen sidder korrekt fast.
    5. Pladen inkuberes i en befugtet 37 °C inkubator uden CO2 i 1 time for at præekvilibrere cellerne med analysemediet.
      BEMÆRK: Bekræft den fuldstændige vedhæftning af celler ved hjælp af et mikroskop inden næste trin.

Figure 1
Figur 1: Skematisk diagram over isolering af knoglemarvsceller og neutrofiler. (A) Høstning af knoglemarvsceller fra en mus og (B) isolering af neutrofiler fra humant blod. Klik her for at se en større version af denne figur.

Celletype Celler pr. Brønd Forbindelser/reagenser Koncentration af arbejdsløsning Injektionsvolumen til porte Endelig koncentration i brønde
Mus neutrofiler 2 × 105 Oligomycin 25 μM 20 μL 2,5 μM
FCCP 7,5 μM 17,6 μL 0,61 μM
Rotenone Antimycin En blanding 10 μM 24 μL 1 μM
Menneskelige neutrofiler 4 × 105 Oligomycin 10 μM 20 μL 1 μM
FCCP 12,5 μM 22 μL 1,25 μM
Rotenone Antimycin En blanding 10 μM 24 μL 1 μM
Udifferentierede eller differentierede HL60-celler 2.5 × 105 Oligomycin 25 μM 20 μL 2,5 μM
FCCP 15 μM 22 μL 1,5 μM
Rotenone Antimycin En blanding 10 μM 24 μL 1 μM

Tabel 1: Celleantal og reagenskoncentrationer til mitokondriestresstesten.

3. Forberedelse af forbindelser i mitokondrie-stresstestsættet

  1. Åbn mitokondriestresstestsættet, og forbered reagenserne.
    BEMÆRK: De forskellige arbejdsopløsningskoncentrationer, injektionsvolumen i hullerne og endelige koncentrationer i brøndene af oligomycin, carbonylcyanid p-trifluoromethoxyphenylhydrazon (FCCP) og rotenon / antimycin En blanding anvendt til museneutrofiler, humane neutrofiler og HL60-celler er vist i tabel 1.
    1. Der fremstilles oligomycinstamopløsning ved rekonstituering af oligomycin med 630 μl analysesubstrat til opnåelse af en 100 μM stamopløsning.
      BEMÆRK: Det anbefales at bruge stamopløsningen samme dag.
      1. Forbered oligomycin arbejdsløsning til museneutrofil- og HL60-celleassays ved at blande 630 μL stamopløsning med 1.890 μL analysemedium for at opnå en 25 μM arbejdsopløsning.
      2. Oligomycin arbejdsløsning fremstilles til human neutrofilanalyse ved at blande 300 μL stamopløsning med 2.700 μL analysemedium for at opnå en 10 μM arbejdsopløsning.
        BEMÆRK: Bindingen af oligomycin til Fo-baseplate-underenheden af Fo/F1 ATPase (ATP-syntase) forhindrer genindtrængen af protoner i mitokondrier og hæmmer ATP-syntese32. Dette reducerer elektronstrømmen gennem elektrontransportkæden og OCR betydeligt. Imidlertid stopper elektronstrømmen ikke fuldstændigt på grund af protonlækage over den indre mitokondriemembran33.
    2. FCCP-stamopløsningen fremstilles ved at rekonstituere FCCP med 720 μL analysesubstrat for at opnå en 100 μM stamopløsning.
      1. Forbered arbejdsløsning til museneutrofilanalysen ved at blande 300 μL stamopløsning med 3.700 μL analysemedium for at opnå en 7,5 μM arbejdsløsning.
      2. Forbered arbejdsløsning til det humane neutrofile assay ved at blande 375 μL stamopløsning med 2.625 μL analysemedium for at opnå en 12,5 μM arbejdsløsning.
      3. Forbered arbejdsløsning til HL60-celleanalysen ved at blande 720 μL stamopløsning med 4.080 μL analysemedium for at opnå en 15 μM arbejdsløsning.
        BEMÆRK: Tilføjelsen af FCCP afslører mitokondriernes maksimale kapacitet til at bruge OXPHOS. Det er en lipidopløselig, svag syre, der er gennemtrængelig for mitokondrier, resulterer i spredning af transmembranpotentiale. Afladning af protongradienten over mitokondriets indre membran og omdirigering af protonfluxen fra Fo / F1 ATP-syntase resulterer i mitokondriel afkobling. Denne afkoblingseffekt øger pludselig mitokondriets iltforbrug for at bevare protongradienten34.
    3. Rotenon/antimycin A-stamopløsning fremstilles ved rekonstitution af rotenon/antimycin A-blandingen med 540 μL analysesubstrat for at opnå en 50 μM stamopløsning.
      1. Forbered rotenon/antimycin En arbejdsløsning til alle analyser ved at blande 540 μL stamopløsning med 2.160 μL analysemedium for at opnå en 10 μM arbejdsopløsning.
        BEMÆRK: Rotenon blokerer kompleks I ved at hæmme elektronoverførsel fra jern-svovlcentrene i kompleks I til ubiquinon, mens antimycin A blokerer kompleks III i elektrontransportkæden, hvilket fører til en blokade af OXPHOS med en begrænset syntese af ATP35. Derved afslører dette ikke-mitokondriel respiration36,37.
  2. Læg patronen med reagenser; fyld forberedt oligomycin, FCCP og rotenon/antimycin A-blanding i henholdsvis A-, B- og C-portene i cylinderampullen til injektionsvæsker (figur 2). Brug skabelonindsatsen, der er tilgængelig sammen med patronen, for at lette indlæsningen af reagenser i portene. Fyld de ubrugte porte med 20 μL analysemedium.
    1. Til museneutrofilanalysen indlæses 20 μL oligomycin (25 μM; hver brønd i 96-brøndpladen har 180 μL analysemedium i begyndelsen, således at den endelige koncentration er 2,5 μM) i A-portene. Læg 17,6 μL FCCP (7,5 μM; endelig koncentration: ~0,61 μM) i B-portene. Læg 24 μL rotenon/antimycin A-blanding (10 μM; endelig koncentration: ~1 μM) i C-portene.
    2. Til det humane neutrofile assay indlæses 20 μL oligomycin (10 μM; hver brønd i 96-brøndpladen har 180 μL analysemedium i begyndelsen, således at den endelige koncentration er 1 μM) i A-portene. Læg 22 μL FCCP (12,5 μM; endelig koncentration: ~1,25 μM) i B-portene. Læg 24 μL rotenon/antimycin A-blanding (10 μM; endelig koncentration: ~1 μM) i C-portene.
    3. For HL60- og dHL60-celleanalysen indlæses 20 μL oligomycin (25 μM; hver brønd i 96-brøndpladen har 180 μL analysemedium i begyndelsen, således at den endelige koncentration er 2,5 μM) i A-portene. Læg 22 μL FCCP (15 μM; endelig koncentration: ~1,5 μM) i B-portene. Læg 24 μL rotenon/antimycin A-blanding (10 μM; endelig koncentration: ~1 μM) i C-portene.
      BEMÆRK: Afpipetter lægemiddelopløsningen i porten uden at røre bunden af porten. Bank ikke på pladen efter påfyldning for at undgå lækage, da væskerne holdes af kapillærkræfterne. Kulturpladens baggrundsbrønde og portene på sensorpatronen fyldes med analysemedium eller med samme port til påfyldning af reagenser som i prøvehullerne for at normalisere reagensernes virkning på baggrundsværdierne. Reagenserne skal føjes til de respektive porte uden at løfte patronen fra den kalibrantholdige brugsplade for at undgå luftfælde. Fyld den sidste port i alle brønde med mediet som vist i figur 2.

Figure 2
Figur 2: Mitokondriespændingsanalysecylinderampullen og deres injektionsporte. Billedet viser patronen af mitokondriespændingsanalysen og et forstørret billede, der viser indlæsningen af individuelle lægemidler / medium til portene. Forkortelse: FCCP = carbonylcyanid p-trifluoromethoxyphenylhydrazon. Klik her for at se en større version af denne figur.

4. Kørsel af mitokondriestressanalysen

  1. Tænd for den metaboliske analysator og computeren, åbn Wave-softwaren , og klik på Heater On for at indstille maskinen til 37 °C mindst 5 timer i forvejen. Efter at have nået temperaturen viser det nederste venstre hjørne af bølgesoftwaren klar.
  2. Åbn en skabelon til mitokondriestressanalysesættet i softwaren. Klik på Gruppedefinition i den øverste menulinje.
  3. Separat forudindstil hver definition på venstre side, såsom injektionsstrategier, forbehandlinger, analysemedier og (anvendt biomateriale) celletyper.
  4. Klik på injektionsstrategier i venstre side, klik derefter på Tilføj og navngiv injektionstilstanden som Human neutrofiler / Mus neutrofiler / HL60. Vælg port A-D ved at klikke på hver og klik på Tilføj forbindelse og indtast Oligomycin / FCCP / Rotenone Antimycin A med de respektive koncentrationer (tabel 1).
  5. Klik på forbehandling i venstre side, klik derefter på Tilføj og navngiv dem som CD18 og Cell Tak separat. Klik på det anvendte biomateriale på venstre side, klik derefter på Tilføj og navngiv dem som humane neutrofiler, museneutrofiler og HL60 / dHL60 med såtæthed.
  6. Definer grupperne ved at klikke på Tilføj gruppe (f.eks. for det humane neutrofile assay) og ved at klikke på den underliggende definition (f.eks. Injektionsstrategier i henhold til tabel 1 - Human neutrofiler, Forbehandling som CD18 og celletype som humane neutrofiler).
  7. Klik på Pladekort i topmenuen for at observere alle grupperne med definitioner i venstre side og pladekortet til højre. Træk og slip for at føje hvert felt til gruppen, mens de fire hjørnefelter bevares som baggrund (standard).
  8. Opsæt protokollen ved at klikke på Protokol i topmenuen og definer tre cyklusser af baseline, oligomycin, FCCP, rotenon og antimycin A-blanding ved at indstille tiden til blanding som 3 min, hvile som 0 min og måling som 7 min.
  9. Gå til siden Kør analyse , angiv projektoversigtsoplysningerne som reference, og klik på Start kørsel.
  10. Angiv placeringen for at gemme filerne, så alle resultaterne gemmes efter afslutningen af analysen.
  11. Efter automatisk ilægning af analysen skal du vente på, at bakken åbnes, for at placere sensorpatronen og pladen med 200 μL kalibrant (trin 1.1). Indstil patronens stregkoderetning mod højre. Kør kalibreringen ved at klikke på Jeg er klar, hvilket tager ca. 20 min.
  12. Efter kalibreringen skal du klikke på Åbn bakke. Udskift pladen med den celleseedede plade, og klik på Vejecelleplade for at fortsætte analysen.
  13. Efter afslutningen af analysen gemmes dataene automatisk. Klik på Vis resultater , og eksporter det som et regneark eller en anden analysesoftwarefil.
  14. Lav grafer og analyser dataene (figur 3 og figur 4).
  15. Beregn respirationsparametre, herunder basal mitokondriel respiration, protonlækagebundet respiration, ATP-bundet respiration, maksimal respiration, ekstra respirationskapacitet og ikke-mitokondriel respiration (figur 4A) 38,39,40,41.
    1. Basal mitokondriel respiration beregnes ved at trække OCR-værdien målt efter tilsætning af rotenon/antimycin A-blanding fra OCR før injektion af oligomycin (figur 4A, a).
    2. Beregn protonlækagebundet respiration ved at trække OCR-værdien efter rotenon/antimycin A-blandingsinjektion fra OCR-værdien målt efter oligomycininjektion (figur 4A,b).
    3. Anslå den ATP-bundne respiration ved at beregne forskellen mellem den basale mitokondrie respiration og protonlækagebundet respiration. Den første OCR-værdi målt efter oligomycininjektion trækkes fra den første OCR-værdi før oligomycininjektion (figur 4A,c).
    4. Maksimal respiration er den maksimale respirationshastighed, som en celle kan opnå efter tilsætning af FCCP. Dette beregnes ved at trække OCR-værdien efter rotenon/antimycin A-blandingsinjektion fra OCR-værdien målt efter FCCP-injektion (figur 4A,d).
    5. Ekstra åndedrætskapacitet refererer til en celles kapacitet til at imødekomme det højere energibehov gennem OXPHOS. Beregn dette ved at finde forskellen mellem den maksimale respiration og basal mitokondriel respiration (figur 4A, e).
    6. Ikke-mitokondriel respiration er mængden af ilt, der forbruges af ikke-mitokondrie kilder. Dette måles efter tilsætning af rotenon/antimycin A-blanding (figur 4A,f).
  16. Udfør statistisk analyse ved hjælp af elevens t-test for at sammenligne forskellige respirationsparametre for udifferentierede og differentierede HL60-celler. Betragt p < 0,05 som statistisk signifikant.
    BEMÆRK: Replikater med OCR- eller ECAR-værdier under nul betragtes som en fejl i prøveforberedelse, sammensat injektion eller måling. De er udelukket fra fremtidig analyse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Repræsentativ OCR-dynamik vises, hvilket indikerer mitokondrierespirationsændringer som reaktion på oligomycin, FCCP og rotenon/antimycin En blanding af museneutrofiler (figur 3A), humane neutrofiler (figur 3B) og udifferentierede og differentierede HL60-celler (figur 3C). I alle celler nedsætter oligomycinbehandling OCR-værdien ved at hæmme protonkanalen i ATP-syntase; FCCP-behandling gendanner OCR-værdien ved at øge strømmen af elektroner og iltforbrug for at opretholde membranpotentialet og opnå maksimal respiration; og rotenon/antimycin A-blandingsbehandling eliminerer mitokondriel respiration ved at blokere komplekserne I og III i elektrontransportkæden.

Vi observerede, at efter neutrofil-rettet differentiering viste HL60-celler nedsat mitokondriel respiration (figur 3C). Efter kvantificering af forskellige respirationsparametre, nævnt ovenfor, viste differentierede HL60-celler signifikant lavere basal mitokondriel (figur 4B) respiration, protonlækagebundet respiration (figur 4C), ATP-bundet respiration (figur 4D) og ikke-mitokondriel respiration (figur 4G). Maksimal respiration (figur 4E) i differentierede HL60-celler blev øget, men ikke signifikant. Den ekstra respirationskapacitet (figur 4F) blev signifikant øget.

Figure 3
Figur 3: Repræsentative grafer, der viser de dynamiske ændringer af OCR under mitokondriestresstestanalysen. (A) Gennemsnit ± SD fra n = 3 replikater af museneutrofiler. (B) Gennemsnit ± SD fra n = 3 replikater af humane neutrofiler. (C) Gennemsnit ± SD fra n = 3 replikater af udifferentierede (HL60, blå) og differentierede (dHL60, røde) HL60-celler. Forkortelse: OCR = iltforbrug. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: Respirationsparametre opnået fra OCR-dynamik. (A) Skematisk, der viser, hvordan man beregner (a) basal mitokondriel respiration, (b) protonlækagebundet respiration, (c) ATP-bundet respiration, (d) maksimal respiration, (e) ekstra respirationskapacitet og (f) ikke-mitokondriel respiration. (B-G) Gennemsnitlig ± SD på n = 3; (B) basal mitokondriel respiration, (C) protonlækagebundet respiration, (D) ATP-bundet respiration, (E) maksimal respiration, (F) ekstra respirationskapacitet og (G) ikke-mitokondriel respiration af udifferentierede (HL60) og differentierede (dHL60) HL60-celler. ns (ikke-signifikant) p > 0,05, *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001 ved uparret elevs t-test. Klik her for at se en større version af denne figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Standardproceduren, der måler mitokondriel respiration af neutrofiler ved hjælp af den metaboliske ekstracellulære fluxanalysator, er begrænset af mange faktorer, herunder celleantal, cellevækst og levedygtighed. Hver sammensat koncentration varierer mellem typen og kilden til celler i dette assay. Oligomycin og rotenon/antimycin A anvendes mest i en lignende koncentration blandt de fleste celletyper. Da den FCCP-inducerede maksimale respirationsfrekvens varierer mellem forskellige celler, kræves der imidlertid omhyggelig titrering af FCCP for at optimere koncentrationen42. Det er også bedre at udføre sekventielle tilføjelser af FCCP under optimeringen. Selvom den metaboliske ekstracellulære fluxanalysator injicerer lægemidlerne i pladen under lufttryk43, begrænser cellemembranens uigennemtrængelighed for nogle mitokondriekomplekshæmmere deres anvendelse i tilfælde af intakte celler sammenlignet med isolerede mitokondrier44. Indlæsningen i havnene skal udføres omhyggeligt for at undgå krydskontaminering. Substratkoncentrationen (f.eks. glucose, pyruvat, glutamin) i mediet kan også påvirke mitokondrieaktiviteten og skal optimeres.

Bortset fra lægemiddelkoncentrationerne er cellesåningstætheden også en kritisk parameter for at opnå en god OCR-værdi. Optimal cellesåtæthed varierer efter celletype, og det anbefales at bruge forskellige såtætheder i indledende forsøg for at teste effektiviteten af målingen. Nøjagtig celletælling er obligatorisk for at sænke variabiliteten mellem grupper, og de passende belægningsmaterialer til kulturpladen skal testes for at sikre, at cellerne i bunden af pladen klæber. Centrifugering af kulturpladen med en hastighed på 300 × g ved RT i 5 min uden bremse hjælper hurtig sedimentering og fastgørelse af cellerne. Før såning af cellerne er tilstrækkelig vask ønskelig efter opsugning af belægningsmaterialet.

Såning af celler udføres ved pipettering af celler i den nederste kant for at undgå kanteffekter og for at sikre ensartet spredning af cellerne45. Cellerne holdes ved 37 °C og får lov til at hvile i mindst 1 time for at minimere kanteffekten46. Det anbefales at opretholde dem i en ikke-CO2 -inkubator for at afgasse cellekulturpladen før måling, da iltniveauet i gasblandingen kan variere alt efter eksperimentet og celletypen med forskellige hypoxiværdier for forskellige væv og celletyper47. Analysesubstratet skal fremstilles på analysedagen (70 ml substrat er tilstrækkeligt til assayet). Normalisering af dataene med cellenummeret kan foretages ved hjælp af 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-2,5-tetrazoliumbromid-assayet (MTT), kernefragmenteringsanalysen med Hoechst, celletællingsanalysen eller protein- eller DNA-kvantificeringsassay48. Da der anvendes forskellige mitokondriehæmmere, skal cellelevedygtighed overvejes som en faktor for resultatet. Det anbefales at udføre en cellelevedygtighedstest ved afslutningen af analysen for at udelukke en mulig cytotoksisk virkning af de anvendte lægemidler.

Ud over OCR kan den metaboliske ekstracellulære fluxanalysator også måle ECAR, som almindeligvis anvendes til kvantificering af glykolyse49. I mitokondriestressanalysen afspejler ECAR-værdier imidlertid surhedsgraden genereret af både glykolyse og tricarboxylsyrecyklussen (via CO2) i mitokondriel respiration. For at måle glykolyse anbefales et glykolysestresstestkit. Indledningsvis viser OCR før tilsætning af forbindelserne neutrofilernes basale respiration. Basal respiration opstår på grund af protonerne, der transporteres fra mitokondriematrixen til intermembranrummet, der passerer gennem den indre mitokondriemembran, afhængigt af den indre mitokondriemembransammensætning. Basal respiration tegner sig for ~ 30% -50% af den metaboliske hastighed af hvileceller 1,50.

Beregninger baseret på assayets basale respiration kunne reducere variabiliteten mellem grupper og typer af celler. Normalisering af dataene er opnået ved sammenligning med basal respiration uden tilsætning af lægemidler, hvilket muliggør normalisering af ændringer afhængigt af celletal og bænkfejl på assayet. Ekstra åndedrætskapacitet er forskellen mellem maksimal OCR og basal OCR og er en indikator for, hvor tæt cellerne fungerer på deres bioenergetiske grænse. Et fald i maksimal respiration indikerer reduceret elektrontransport i luftvejskæden fra komplekser I og II til komplekser III og IV og til sidst til molekylært oxygen. Figur 4A viser den skematiske gengivelse af beregningerne af assayet.

Stigningen i ekstra åndedrætskapacitet indikerer, at celler kan reagere godt på yderligere energibehov, hvilket er en forudsætning i tilfælde af neutrofiler, da de ender i åndedrætsudbrud ved aktivering 51,52,53,54,55. ECAR-data for mitokondriestressanalysen kan imidlertid ikke repræsentere neutrofilernes glykolysehastighed. Der kan foretages visse vurderinger af dataene; for eksempel indebærer reduktionen i ECAR-værdier i både muse- og humane neutrofiler efter tilsætning af rotenon og antimycin A, at ECAR-værdierne før tilsætning af disse komplekse I- og III-hæmmere primært skyldes CO2 -produktion fra TCA-cyklussen. I tilfælde af cellelinjer er ECAR-værdierne konstante efter tilsætning af rotenon og antimycin A, hvilket tyder på, at ECAR-værdierne før tilsætningen skyldes glykolyse45.

Mitokondrie lidelser er kliniske tilstande karakteriseret ved defekt OXPHOS. I tilfælde af neutrofiler er måling af OCR lav på grund af ingen celleproliferation, lavt mitokondrietal og tidlig ældning56. I neurodegenerative lidelser, neutrofiler ekstravasate i amyloid-β (Aβ) deponeringsområder. Aβ42-peptidet udløser integrinaktivering og hurtig neutrofil adhæsion57. Under apoptose frigiver neutrofile mitokondrier proapoptotiske proteiner i cytosolen58. Det er også vist, at den neutrofile migrationshastighed reduceres, og kemotakse afskaffes, når den behandles med CCCP9. Dette antyder den potentielle rolle mitokondrier og mitokondriel respiration i neutrofil funktion. Mitokondrieaktiviteter i forskellige celletyper under mange patologiske tilstande er blevet rapporteret og forbundet med patogenese, såsom Alzheimers5, skizofreni59, kroniske luftvejssygdomme60, bipolære lidelser, sepsis, diabetikere, astma, pulmonal hypertension og seglcellesygdom. Nye terapier, såsom forbedring af respirationskædeflux ved hjælp af antioxidanter (f.eks. CoQ10, idebenon, alfa-liponsyre, C-vitamin og E) og / eller cofaktorer (f.eks. riboflavin, thiamin) og administration af mitokondriesubstrater såsom L-carnitin, er blevet anvendt til behandling af mitokondrieforstyrrelser. Disse behandlinger er dog ikke standardiserede og er muligvis ikke effektive61. En ikke-invasiv standardiseret metode, såsom anvendelse af den metaboliske ekstracellulære fluxanalysator, til at kvantificere mitokondriefunktioner i sygdomsrelevante celler, såsom neutrofiler, kan tjene som en diagnostisk biomarkør i terapi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer ingen konkurrerende økonomisk interesse.

Acknowledgments

Vi anerkender Dr. Anthony T. Vella og Dr. Federica Aglianoin fra Institut for Immunologi ved UConn Health for deres træning i at bruge den metaboliske ekstracellulære fluxanalysator og Dr. Lynn Puddington i Institut for Immunologi ved UConn Health for hendes støtte til instrumenterne. Vi anerkender Dr. Geneva Hargis fra UConn School of Medicine for hendes hjælp med videnskabelig skrivning og redigering af dette manuskript. Denne forskning blev støttet af tilskud fra National Institutes of Health, National Heart, Lung and Blood Institute (R01HL145454), National Institute of General Medical Sciences (R35GM147713 og P20GM139763), en opstartsfond fra UConn Health og et karriere-genindrejsestipendium fra American Association of Immunologer.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
37 °C non-CO2 incubator Precision Economy Model 2EG Instrument
Biorender Software Application
Centrifuge Eppendorf Model 5810R Instrument
Corning Cell-Tak Cell and Tissue Adhesive Corning 102416-100 Reagent
EasySep Magnet STEMCELL 18000 Magnet
EasySepMouse Neutrophil Enrichment kit STEMCELL 19762A Reagents
Graphpad Prism 9 Software Application
Human Serum Albumin Solution (25%) GeminiBio 800-120 Reagents
Ketamine (VetaKet) DAILYMED NDC 59399-114-10 Anesthetic
PBS Cytiva SH30256.01 Reagents
Plate buckets Eppendorf UL155 Accessory
PolymorphPrep PROGEN 1895 (previous 1114683) polysaccharide solution
Purified mouse anti-human CD18 antibody Biolegend 302102 Clone TS1/18
RPMI 1640 Medium Gibco 11-875-093 Reagents
Seahorse metabolic extracellular flux analyzer Agilent XFe96 Instrument
Seahorse XF Cell Mito Stress Test Kit Agilent 103015-100 mitochondrial stress test Kit
Swing-bucket rotor Eppendorf A-4-62 Rotor
Vactrap 2 Vacum Trap Fox Lifesciences 3052101-FLS Instrument
Wave Software Application
XF 1.0 M Glucose Solution Agilent 103577-100 Reagent
XF 100 mM Pyruvate Solution Agilent 103578-100 Reagent
XF 200 mM Glutamine Solution Agilent 103579-100 Reagent
XF DMEM medium Agilent 103575-100 Reagent
XFe96 FluxPak Agilent 102601-100 Material
Xylazine (AnaSed Injection) DAILYMED NDC 59399-110-20 Anesthetic

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Demine, S., Renard, P., Arnould, T. Mitochondrial uncoupling: a key controller of biological processes in physiology and diseases. Cells. 8 (8), 795 (2019).
  2. Noguchi, M., Kasahara, A. Mitochondrial dynamics coordinate cell differentiation. Biochemical and Biophysical Research Communications. 500 (1), 59-64 (2018).
  3. Zhu, L., et al. Correlation between mitochondrial dysfunction, cardiovascular diseases, and traditional Chinese medicine. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine. 2020, e2902136 (2020).
  4. Kaarniranta, K., et al. Mechanisms of mitochondrial dysfunction and their impact on age-related macular degeneration. Progress in Retinal and Eye Research. 79, 100858 (2020).
  5. Onyango, I. G., Khan, S. M., Bennett, J. P. Mitochondria in the pathophysiology of Alzheimer's and Parkinson's diseases. Frontiers in Bioscience. 22 (5), 854-872 (2017).
  6. Loiseau, D., et al. Mitochondrial coupling defect in Charcot-Marie-Tooth type 2A disease. Annals of Neurology. 61 (4), 315-323 (2007).
  7. Zucker-Franklin, D. Electron microscopic studies of human granulocytes: structural variations related to function. Seminars in Hematology. 5 (2), 109-133 (1968).
  8. Karnovsky, M. L. The metabolism of leukocytes. Seminars in Hematology. 5 (2), 156-165 (1968).
  9. Bao, Y., et al. mTOR and differential activation of mitochondria orchestrate neutrophil chemotaxis. The Journal of Cell Biology. 210 (7), 1153-1164 (2015).
  10. Fossati, G., et al. The mitochondrial network of human neutrophils: role in chemotaxis, phagocytosis, respiratory burst activation, and commitment to apoptosis. Journal of Immunology. 170 (4), 1964-1972 (2003).
  11. Pryde, J. G., Walker, A., Rossi, A. G., Hannah, S., Haslett, C. Temperature-dependent arrest of neutrophil apoptosis. Failure of Bax insertion into mitochondria at 15 degrees C prevents the release of cytochrome c. The Journal of Biological Chemistry. 275 (43), 33574-33584 (2000).
  12. Maianski, N. A., Mul, F. P. J., van Buul, J. D., Roos, D., Kuijpers, T. W. Granulocyte colony-stimulating factor inhibits the mitochondria-dependent activation of caspase-3 in neutrophils. Blood. 99 (2), 672-679 (2002).
  13. Bao, Y., et al. Mitochondria regulate neutrophil activation by generating ATP for autocrine purinergic signaling. The Journal of Biological Chemistry. 289 (39), 26794-26803 (2014).
  14. Chouchani, E. T., et al. Ischaemic accumulation of succinate controls reperfusion injury through mitochondrial ROS. Nature. 515 (7527), 431-435 (2014).
  15. Hayashi, G., Cortopassi, G. Oxidative stress in inherited mitochondrial diseases. Free Radical Biology and Medicine. 88, 10-17 (2015).
  16. Mailloux, R. J. An update on mitochondrial reactive oxygen species production. Antioxidants. 9 (6), 472 (2020).
  17. Abuaita, B. H., et al. The IRE1α stress signaling axis is a key regulator of neutrophil antimicrobial effector function. Journal of Immunology. 207 (1), 210-220 (2021).
  18. Lood, C., et al. Neutrophil extracellular traps enriched in oxidized mitochondrial DNA are interferogenic and contribute to lupus-like disease. Nature Medicine. 22 (2), 146-153 (2016).
  19. Douda, D. N., Khan, M. A., Grasemann, H., Palaniyar, N. SK3 channel and mitochondrial ROS mediate NADPH oxidase-independent NETosis induced by calcium influx. Proceedings of the National Academy of Sciencesa. 112 (9), 2817-2822 (2015).
  20. Monteith, A. J., et al. Altered mitochondrial homeostasis during systemic lupus erythematosus impairs neutrophil extracellular trap formation rendering neutrophils ineffective at combating Staphylococcus aureus. Journal of Immunology. 208 (2), 454-463 (2022).
  21. Monteith, A. J., Miller, J. M., Beavers, W. N., Juttukonda, L. J., Skaar, E. P. Increased dietary manganese impairs neutrophil extracellular trap formation rendering neutrophils ineffective at combating Staphylococcus aureus. Infection and Immunity. 90 (3), 0068521 (2022).
  22. Monteith, A. J., et al. Mitochondrial calcium uniporter affects neutrophil bactericidal activity during Staphylococcus aureus infection. Infection and Immunity. 90 (2), 0055121 (2022).
  23. Cao, Z., et al. Roles of mitochondria in neutrophils. Frontiers in Immunology. 13, 934444 (2022).
  24. Papayannopoulos, V., Metzler, K. D., Hakkim, A., Zychlinsky, A. Neutrophil elastase and myeloperoxidase regulate the formation of neutrophil extracellular traps. The Journal of Cell Biology. 191 (3), 677-691 (2010).
  25. Fan, Z., Ley, K. Developing neutrophils must eat…themselves. Immunity. 47 (3), 393-395 (2017).
  26. Riffelmacher, T., et al. Autophagy-dependent generation of free fatty acids is critical for normal neutrophil differentiation. Immunity. 47 (3), 466-480 (2017).
  27. Amend, S. R., Valkenburg, K. C., Pienta, K. J. Murine hind limb long bone dissection and bone marrow isolation. Journal of Visualized Experiments. (110), e53936 (2016).
  28. Swamydas, M., Isolation Lionakis, M. S. purification and labeling of mouse bone marrow neutrophils for functional studies and adoptive transfer experiments. Journal of Visualized Experiments. (77), e50586 (2013).
  29. Gerner, M. C., et al. Packed red blood cells inhibit T-cell activation via ROS-dependent signaling pathways. The Journal of Biological Chemistry. 296, 100487 (2021).
  30. Zhang, Z. -W., et al. Red blood cell extrudes nucleus and mitochondria against oxidative stress. IUBMB Life. 63 (7), 560-565 (2011).
  31. Kuhns, D. B., Priel, D. A. L., Chu, J., Zarember, K. A. Isolation and functional analysis of human neutrophils. Current Protocols in Immunology. 111, 1-16 (2015).
  32. Hearne, A., Chen, H., Monarchino, A., Wiseman, J. S. Oligomycin-induced proton uncoupling. Toxicology In Vitro. 67, 104907 (2020).
  33. Plitzko, B., Loesgen, S. Measurement of oxygen consumption rate (OCR) and extracellular acidification rate (ECAR) in culture cells for assessment of the energy metabolism. Bio-Protocol. 8 (10), e2850 (2018).
  34. Nath, S. The molecular mechanism of ATP synthesis by F1F0-ATP synthase: a scrutiny of the major possibilities. Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. 74, 65-98 (2002).
  35. Heinz, S., et al. Mechanistic investigations of the mitochondrial complex I inhibitor rotenone in the context of pharmacological and safety evaluation. Scientific Reports. 7 (1), 45465 (2017).
  36. Hytti, M., et al. Antimycin A-induced mitochondrial damage causes human RPE cell death despite activation of autophagy. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2019, 1583656 (2019).
  37. Malecki, M., Kamrad, S., Ralser, M., Bähler, J. Mitochondrial respiration is required to provide amino acids during fermentative proliferation of fission yeast. EMBO Reports. 21 (11), e50845 (2020).
  38. Divakaruni, A. S., Paradyse, A., Ferrick, D. A., Murphy, A. N., Jastroch, M. Analysis and interpretation of microplate-based oxygen consumption and pH data. Methods in Enzymology. 547, 309-354 (2014).
  39. Marchetti, P., Fovez, Q., Germain, N., Khamari, R., Kluza, J. Mitochondrial spare respiratory capacity: Mechanisms, regulation, and significance in non-transformed and cancer cells. The FASEB Journal. 34 (10), 13106-13124 (2020).
  40. Nicholas, D., et al. Advances in the quantification of mitochondrial function in primary human immune cells through extracellular flux analysis. PLoS One. 12 (2), e0170975 (2017).
  41. Tur, J., et al. Mitofusin 2 in macrophages links mitochondrial ROS production, cytokine release, phagocytosis, autophagy, and bactericidal activity. Cell Reports. 32 (8), 108079 (2020).
  42. Benz, R., McLaughlin, S. The molecular mechanism of action of the proton ionophore FCCP (carbonylcyanide p-trifluoromethoxyphenylhydrazone). Biophysical Journal. 41 (3), 381-398 (1983).
  43. Wettmarshausen, J., Perocchi, F. Assessing calcium-stimulated mitochondrial bioenergetics using the seahorse XF96 analyzer. Methods in Molecular Biology. 1925, 197-222 (2019).
  44. Forkink, M., et al. Mitochondrial hyperpolarization during chronic complex I inhibition is sustained by low activity of complex II, III, IV and V. Biochimica et Biophysica Acta. 1837 (8), 1247-1256 (2014).
  45. Methods for Reducing Cell Growth Edge Effects in Agilent Seahorse XF Cell Culture Microplates. , Available from: https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/user-manual-methods-for-reducing-cell-growth-edge-effect-cell-analysis-5994-0240en-agilent.pdf (2019).
  46. Lundholt, B. K., Scudder, K. M., Pagliaro, L. A simple technique for reducing edge effect in cell-based assays. Journal of Biomolecular Screening. 8 (5), 566-570 (2003).
  47. Wu, D., Yotnda, P. Induction and testing of hypoxia in cell culture. Journal of Visualized Experiments. (54), e2899 (2011).
  48. Normalisation of Seahorse XFe96 metabolic assaysto cell number with Hoechst stain using well-scan mode on the CLARIOstar Plus. BMG Labtech. , Available from: https://www.bmglabtech.com/cn/normalisation-of-seahorse-xfe96-metabolic-assays-to-cell-number-with-hoechst-stain/ (2020).
  49. Yetkin-Arik, B., et al. The role of glycolysis and mitochondrial respiration in the formation and functioning of endothelial tip cells during angiogenesis. Scientific Reports. 9 (1), 12608 (2019).
  50. Jastroch, M., Divakaruni, A. S., Mookerjee, S., Treberg, J. R., Brand, M. D. Mitochondrial proton and electron leaks. Essays in Biochemistry. 47, 53-67 (2010).
  51. Jandl, R. C., et al. Termination of the respiratory burst in human neutrophils. The Journal of Clinical Investigation. 61 (5), 1176-1185 (1978).
  52. Azevedo, E. P., et al. A metabolic shift toward pentose phosphate pathway is necessary for amyloid fibril- and phorbol 12-myristate 13-acetate-induced neutrophil extracellular trap (NET) formation. The Journal of Biological Chemistry. 290 (36), 22174-22183 (2015).
  53. Six, E., et al. AK2 deficiency compromises the mitochondrial energy metabolism required for differentiation of human neutrophil and lymphoid lineages. Cell Death & Disease. 6 (8), e1856 (2015).
  54. Kumar, S., Dikshit, M. Metabolic insight of neutrophils in health and disease. Frontiers in Immunology. 10, 2099 (2019).
  55. Rodríguez-Espinosa, O., Rojas-Espinosa, O., Moreno-Altamirano, M. M. B., López-Villegas, E. O., Sánchez-García, F. J. Metabolic requirements for neutrophil extracellular traps formation. Immunology. 145 (2), 213-224 (2015).
  56. Invernizzi, F., et al. Microscale oxygraphy reveals OXPHOS impairment in MRC mutant cells. Mitochondrion. 12 (2), 328-335 (2012).
  57. Zenaro, E., et al. Neutrophils promote Alzheimer's disease-like pathology and cognitive decline via LFA-1 integrin. Nature Medicine. 21 (8), 880-886 (2015).
  58. Maianski, N. A., et al. Functional characterization of mitochondria in neutrophils: a role restricted to apoptosis. Cell Death and Differentiation. 11 (2), 143-153 (2004).
  59. Bergman, O., Ben-Shachar, D. Mitochondrial oxidative phosphorylation system (OXPHOS) deficits in schizophrenia. Canadian Journal of Psychiatry. 61 (8), 457-469 (2016).
  60. Zhou, W., Qu, J., Xie, S., Sun, Y., Yao, H. Mitochondrial dysfunction in chronic respiratory diseases: implications for the pathogenesis and potential therapeutics. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2021, 5188306 (2021).
  61. Hirano, M., Emmanuele, V., Quinzii, C. M. Emerging therapies for mitochondrial diseases. Essays in Biochemistry. 62 (3), 467-481 (2018).

Tags

Immunologi og infektion nummer 196
Realtidsmåling af mitokondriel bioenergetisk profil af neutrofiler
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Pulikkot, S., Zhao, M., Fan, Z.… More

Pulikkot, S., Zhao, M., Fan, Z. Real-Time Measurement of the Mitochondrial Bioenergetic Profile of Neutrophils. J. Vis. Exp. (196), e64971, doi:10.3791/64971 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter