Summary
Detta protokoll beskriver hur man utför effektiv adeninbasredigering utan PAM-begränsning för att konstruera en exakt zebrafisksjukdomsmodell med zSpRY-ABE8e.
Abstract
CRISPR / Cas9-tekniken har ökat värdet av zebrafisk för modellering av mänskliga genetiska sjukdomar, studier av sjukdomspatogenes och läkemedelsscreening, men begränsningar av protospacer intilliggande motiv (PAM) är ett stort hinder för att skapa exakta djurmodeller av mänskliga genetiska störningar orsakade av enkelnukleotidvarianter (SNV). Hittills har vissa SpCas9-varianter med bred PAM-kompatibilitet visat effektivitet i zebrafisk. Tillämpningen av den optimerade SpRY-medierade adeninbasredigeraren (ABE), zSpRY-ABE8e och syntetiskt modifierade gRNA i zebrafisk har möjliggjort effektiv adenin-guaninbasomvandling utan PAM-begränsning. Här beskrivs ett protokoll för effektiv adeninbasredigering utan PAM-begränsning i zebrafisk med zSpRY-ABE8e. Genom att injicera en blandning av zSpRY-ABE8e mRNA och syntetiskt modifierat gRNA i zebrafiskembryon konstruerades en zebrafisksjukdomsmodell med en exakt mutation som simulerade en patogen plats för TSR2-ribosommognadsfaktorn (tsr2). Denna metod ger ett värdefullt verktyg för att etablera noggranna sjukdomsmodeller för att studera sjukdomsmekanismer och behandlingar.
Introduction
Single-nucleotide varianter (SNV) som orsakar missense eller nonsensmutationer är den vanligaste källan till mutationer i det mänskliga genomet1. För att avgöra om en viss SNV är patogen och för att belysa dess patogenes krävs exakta djurmodeller2. Zebrafiskar är bra mänskliga sjukdomsmodeller, uppvisar en hög grad av fysiologisk och genetisk homologi med människor, en kort utvecklingscykel och stark reproduktionsförmåga, vilket är fördelaktigt för forskning om patogena egenskaper och mekanismer, samt läkemedelsscreening3.
Det klustrade regelbundet interspaced korta palindromiska upprepningarna (CRISPR) / Cas9-systemet har använts i stor utsträckning vid genomredigering av olika arter, inklusive zebrafisk4. Med gRNA-vägledning kan CRISPR / Cas9-systemet generera DNA-dubbelsträngade brott (DSB) på målplatsen, vilket sedan möjliggör enkelbassubstitution genom rekombination av målplatsen med donator-DNA-mallar via homologi-riktad reparationsväg (HDR). Effektiviteten hos denna basersättningsmetod är emellertid ganska låg eftersom den cellulära DNA-reparationsprocessen huvudsakligen utförs av den icke-homologa ändfogningsvägen (NHEJ), som vanligtvis åtföljs av insättnings- och deletionsmutationer (indel)5. Lyckligtvis lindrar CRISPR / Cas9-baserad redigeringsteknik med en bas avsevärt detta problem genom att använda basredigerare, vilket möjliggör effektivare redigering med en bas utan att inducera DSB. Två huvudklasser av basredigerare, adeninbasredigerare (ABE) och cytosinbasredigerare (CBE), har utvecklats för att implementera bassubstitutionsredigering för A· T till G· C och C·G till T· A, respektive 6,7,8,9,10,11. Dessa fyra typer av bassubstitutioner täcker 30% av humana patogena varianter12. Båda klasserna av basredigerare, inklusive PmCDA1, BE-system, CBE4max, ABE7.10 och ABE8e, har rapporterats fungera i zebrafisk, med BE4max och ABE8e särskilt rapporterade för att uppnå hög redigeringsaktivitet 13,14,15,16,17,18,19.
Cas9-proteiner från olika arter, inklusive Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes och S. canis, har implementerats i zebrafiskgenredigering, med Streptococcus pyogenes Cas9 (SpCas9) som används mest20,21,22,23. SpCas9 kan dock bara känna igen målplatser med ett NGG-protospacer-intilliggande motiv (PAM), vilket begränsar dess redigerbara intervall och kan resultera i att ingen lämplig sekvens hittas nära den patogena platsen av intresse24. För att utöka målområdet har en mängd olika SpCas9-varianter konstruerats för att känna igen olika PAMs genom riktad utveckling och strukturstyrd design. Få varianter är dock effektiva hos djur, särskilt i zebrafiskar, vilket begränsar tillämpningen av zebrafisk i SNV-relaterad sjukdomsforskning25,26,27,28. Nyligen har två varianter av SpCas9, SpG och SpRY, med mindre stränga PAM-begränsningar (NGN för SpG och NNN för SpRY med högre preferens för NRN än NYN) rapporterats uppvisa hög redigeringsaktivitet i mänskliga celler och växter 29,30,31,32. Därefter har SpG och SpRY, liksom ett antal av deras medierade basredaktörer, såsom SpRY-medierade CBE och SpRY-medierade ABE, också rapporterats arbeta i zebrafisk, vilket kommer att förbättra tillämpningen av zebrafiskmodeller i den mekanistiska studien och läkemedelsscreening av SNV-relaterade sjukdomar 18,33,34,35. Vidare föreslogs i-Silence som en effektiv och korrekt genknockoutstrategi genom ABE-medierad startkodonkonvertering från ATG till GTG eller ACG36. Kombinationen av i-Silence-strategin och den SpRY-medierade basredigeraren zSpRY-ABE8e ger en ny metod för sjukdomsmodellering18. Detta protokoll visar hur man utför genredigering med zSpRY-ABE8e i zebrafisk för att konstruera en tsr2 (M1V) modell med hjälp av i-Silence-strategin. Redigeringseffektiviteten och fenotyperna som förekommer i zebrafiskmodeller bedömdes och analyserades.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denna studie genomfördes i strikt överensstämmelse med riktlinjerna från Care and Use Committee of the South China Normal University.
1. Beredning av syntetiskt modifierat gRNA och zSpRY-ABE8e mRNA
- Designa gRNA enligt tidigare publikationer37,38.
- Välj företrädesvis NRN som PAM-sekvens, eftersom zSpRY-ABE8e visar en högre preferens för NRN PAM än NYN PAM (där R är A eller G och Y är C eller T)18. Se till att måladeninnukleotiden finns i det mycket aktiva redigeringsfönstret (tredje till nionde nukleotiden längs protospacern).
- Beställ EasyEdit sgRNA (EE gRNA) modifierat med 2′-O-metyl-3′-fosforotiat (MS) i båda ändar (figur 1).
OBS: EE-gRNA bör lösas i RNas-fritt vatten och förvaras vid -80 ° C. - Linjärisera zSpRY-ABE8e-plasmiden18.
- Linjärisera 6 μg av plasmiden med enzymet XbaI (Table of Materials) i ett metallbad vid 37 °C i 3 timmar.
- Rena den linjäriserade plasmiden med hjälp av DNA-reningssatsen (se materialförteckning) enligt tillverkarens anvisningar.
- Transkribera mRNA med hjälp av in vitro-transkriptionssatsen (Table of Materials).
- Transkribera zSpRY-ABE8e mRNA med den linjäriserade plasmiden som mall enligt tillverkarens instruktioner.
OBS: Alla operationer som involverar mRNA och gRNA kräver användning av RNase-fria laboratorietillbehör.
- Transkribera zSpRY-ABE8e mRNA med den linjäriserade plasmiden som mall enligt tillverkarens instruktioner.
- Använd RNA-reningssatsen (Table of Materials) för att rena mRNA enligt tillverkarens instruktioner.
OBS: Före eluering måste etanolen torkas för att undvika cytotoxicitet, och mRNA ska förvaras vid -80 ° C om det inte används omedelbart.
2. Förbereda mikroinjektion glaskapillärer
- Ställ in mikropipettavdragarsystemet och förvärm i minst 30 minuter.
- Kör ett ramptest för att bestämma det värmevärde som behövs för att smälta borosilikatglaskapillärerna (med 1 mm ytterdiameter och 0,58 mm innerdiameter) enligt tillverkarens instruktioner.
- Välj ett program och klicka på numret på tangentbordet för att ange parametervärdena. Ställ in följande parametrar för att dra glaskapillärerna: värme = ramptestvärde, drag = 50, hastighet = 100, tid = 50 och tryck = 30.
- Installera kapillärröret och se till att det är i spåret. Tryck på PULL START/STOP för att köra programmet.
- Bevara de dragna kapillärerna genom att sätta in dem i skum som innehåller luckor och håll nålen upphängd.
3. Mikroinjektion av zSpRY-ABE8e-mRNA- och EE-gRNA-blandningen i zebrafiskembryon
- Sätt upp avelstankar natten före injektionen. Sätt i en avdelare, placera två honor och en hane av ab-stam zebrafisk (3-18 månader gammal) i varje tank och täck med locket. Se tidigare publikationer för könsskillnader39.
OBS: För att få fler embryon, välj fisk som inte har odlats i minst 1 vecka. - Nästa morgon före injektionen, tina zSpRY-ABE8e mRNA och EE gRNA på is. Blanda mRNA och gRNA till slutliga koncentrationer på 400 ng/μl respektive 200 ng/μl.
- Utför hela proceduren på is med RNase-fria spetsar och rör och hantera med handskar.
- Konfigurera den pneumatiska mikroinjektorn. Stäng luftpumpens partialtrycksventil och öppna huvudventilen först, skruva loss gascylindern och justera trycket på partialtrycksventilen till 0,2 MPa / 29 psi.
- Slå på den pneumatiska mikroinjektorn, ställ in läget på TIMER och justera initialparameterns tryckvärde till 20,0 psi och TIMER-värdet till 0,040 s.
- Använd fina pincett för att försiktigt bryta nålarna i de dragna glaskapillärerna under ett stereomikroskop, se till att nålarna skärs i en vinkel för att underlätta genomträngningen av korionen och ägget.
OBS: Nålens brytpunkt måste vara på rätt plats och vara tillräckligt stark för att genomborra ägget men ändå tillräckligt tunn för att minimera skador på ägget. - Tillsätt blandningen av zSpRY-ABE8e mRNA och gRNA till spetsen av en glaskapillär med hjälp av en mikrolastarpipettspets och undvik bubblor i kapillären. Fäst nålen på mikromanipulatorn och konfigurera injektorns tryck och TIMER-värde för att säkerställa att 2 nL blandning produceras per injektion med hjälp av en mikrokapsyl.
- Koppla ur avdelarna på odlingstankarna och låt fisken häcka i 10-15 minuter. Samla äggen med en sil och undersök cellstadiet och kvaliteten på äggen under ett stereomikroskop. Välj äggen i encellstillstånd för injektion för att förbättra redigeringseffektiviteten.
- Linja äggen på en 1,5% agarosinjektionsplatta och injicera 2 nL av blandningen i cellen, inte äggulan, av embryon under ett mikroskop för att förbättra redigeringseffektiviteten. Behåll minst 15 ägg som kontrollgrupp.
- Använd 1x E3-buffert för att samla äggen i petriskålar och placera dem i en inkubator vid 28 ° C. Ta bort de döda äggen och byt odlingsbuffert var 12: e timme tills 48 timmar efter befruktning (hpf).
4. Effektivitetsanalys av basredigering med EditR
- Vid 48 hpf, samla tre pooler med sex slumpmässigt utvalda injicerade embryon respektive sex slumpmässigt utvalda kontrollembryon i PCR-rör. Använd en pipett för att aspirera den återstående E3-bufferten.
- Tillsätt 40 μl 50 mM NaOH i PCR-rören. Sätt rören i ett metallbad vid 95 °C i 20 minuter och virvel sedan i 15 sekunder.
- Tillsätt 4 μL 1 M Tris· HCl (pH 8,0) i varje rör för att neutralisera NaOH. Centrifugera kort vid 2 000 x g i 10 s vid rumstemperatur för att avlägsna droppar från rörväggen. Samla upp supernatanten i nya PCR-rör och förvara dem vid −20 °C.
- Designa lämpliga primrar uppströms och nedströms om gRNA-målplatserna. Använd 1 μl av ovanstående supernatant som mall för PCR-reaktioner med en volym på 50 μl. De primrar som används för PCR i denna studie listas i kompletterande tabell 1.
- Utför en DNA-agarosgelelektrofores för att säkerställa korrekta och specifika band, följt av Sanger-sekvensering som tidigare beskrivits40.
- Analysera Sanger-sekvenseringsdata med programmet EditR (1.0.10)41.
- Ladda upp sekvenseringsfilen (ab1-format) i rutan "Ladda upp .ab1-fil".
- Ange 20 bp gRNA-sekvensen i 5′-3′ orientering i rutan "Enter gRNA sequence".
- Öppna sekvenseringsfilen (ab1-format) och bekräfta baspositionerna där 20 bp gRNA-sekvensen börjar och slutar. Ange motsvarande basposition i rutorna "5′ start" och "3′ end".
- Klicka på Förutsagd redigering för att få basredigeringseffektiviteten. Kontrollera kvaliteten på sekvenseringsdata nära gRNA-målsekvensen för att undvika oordnade toppar eller indels.
OBS: I allmänhet kan de oordnade topparna effektivt avlägsnas genom att justera PCR-glödgningstemperaturen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Mutationen av TSR2 har rapporterats orsaka Diamond Blackfan-anemi (DBA)42. Här konstruerades en DBA-zebrafiskmodell med en tsr2 (M1V) mutation med hjälp av i-Silence-strategin. Adeninet i startkodonet för zebrafisken tsr2 omvandlades framgångsrikt till guanin med zSpRY-ABE8e (figur 3).
EditR-analysen av Sanger-sekvenseringsresultaten visade att det fanns en A/G-överlappning vid adeninbasen i tsr2-startkodonet (figur 4).
Efter att F0-grundarna parats med en tidigare genererad tsr2 heterozygot mutant vuxen observerades embryofenotyperna 2 dagar efter befruktning (dpf) under mikroskopet. Flera embryon uppvisade en fenotyp av mindre ögon och ett svullet hjärtsäck jämfört med kontroller (figur 5). Embryona bedövades med 0,03% trikain, fixerades på 4% metylcellulosa och fotograferades.
Figur 1: Schematiskt diagram över sekvensen och sekundärstrukturen för EE-gRNA laddat i zSpRY-ABE8e-protein. De kemiskt modifierade nukleotiderna är märkta med svarta stjärnor. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Schematiskt diagram över mRNA-strukturen zSpRY-ABE8e innehållande kodonoptimerad TadA8e (zTadA8e) och kodonoptimerad SpRYCas9 (zSpRYCas9). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Schematiskt diagram över zebrafiskmutationen tsr2 (M1V) med zSpRY-ABE8e. PAM-sekvenserna är markerade i rött, de redigerade baserna är markerade i blått och de riktade aminosyrorna är i fetstil. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Sekvenseringskromatogramresultat för zebrafiskmutationen tsr2 (M1V) med zSpRY-ABE8e. X-axeln representerar bassekvensen, y-axeln representerar topphöjden och den redigerade basen indikeras med en röd pilspets. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: Fenotyp för tsr2 (M1V) embryon vid 2 dpf jämfört med kontroller. (A, C) Sidovy och (B,D) ryggvy av (A,B) vildtyp AB zebrafisk och (C,D) tsr2 (M1V) embryon vid 2 dpf. Den röda pilspetsen i C indikerar perikardiell svullnad. Den röda ramen och diametern återspeglar ögonstorleken. Skalstapel: 500 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Kompletterande tabell 1: Klicka här för att ladda ner den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta protokoll beskriver konstruktionen av en zebrafisksjukdomsmodell med hjälp av basredigeraren zSpRY-ABE8e. Jämfört med den traditionella HDR-vägen för bassubstitution kan detta protokoll uppnå effektivare basredigering och minska förekomsten av indels. Samtidigt innebär detta protokoll att implementera den nyligen föreslagna i-Silence-genknockoutstrategin i zebrafisk. Sammantaget kommer zSpRY-ABE8e att förbättra tillämpningen av zebrafiskmodeller i sjukdomsforskning.
Off-target effekter är ett vanligt problem i CRISPR / Cas9-system. Med tanke på den PAM-mindre begränsningen kan off-target-effekten av zSpRY-ABE8e vara högre, även om ingen signifikant off-target hittades i en tidigare studie inklusive tsr2 riktad mot18. Lyckligtvis kan detta problem undvikas genom strikta gRNA-designstandarder, vilket säkerställer att endast en genomsekvens matchar gRNA med PAM exakt och håller det totala antalet förutsagda off-target-platser till ett minimum. Dessutom har en studie visat att injektion av ribonukleoprotein (RNP) och gRNA minskar sannolikheten utanför målet jämfört med injektion av mRNA och gRNA43. Dessutom kan modifieringen av gRNA och Cas9 också minska off-target effekter44,45. I zebrafisk kan flera generationer av avel också screenas för målfenotyperna för att få djurmodeller med låga off-target-effekter.
Det finns fortfarande vissa begränsningar i detta protokoll. Även om zSpRY-ABE8e inte har någon PAM-begränsning, uppvisar den fortfarande PAM-preferens, med NRN föredragen framför NYN i zebrafisk. Dessutom kan ABE endast implementera två typer av bassubstitution, vilket innebär att den endast är tillämplig på konstruktion av partiella modeller. Fler basredigerare behöver fortfarande utvecklas för att implementera de återstående bassubstitutionerna i zebrafisk.
Sammanfattningsvis ger detta protokoll detaljerad vägledning för användningen av zSpRY-ABE8e enda basredigerare i zebrafisk. Det ger en genomförbar och effektiv metod för att konstruera exakta zebrafisksjukdomsmodeller, vilket utvidgar tillämpningen av zebrafiskmodeller i studier av patogenes och behandling av SNV-relaterade sjukdomar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna deklarerar inga intressekonflikter.
Acknowledgments
Vi tackar Barbara Garbers, PhD, från Liwen Bianji (Edanz) för att redigera den engelska texten till ett utkast till detta manuskript. Detta arbete stöddes av Key-Area Research and Development Program i Guangdongprovinsen (2019B030335001), Kinas nationella Key R&D Program (2019YFE0106700), National Natural Science Foundation of China (32070819, 31970782) och Research Fund Program of Guangdong Provincial Key Lab of Pathogen Biology and Epidemiology for Aquatic Economic Animals (PBEA2020YB05).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | 1.5% Agarose used to make an injection plate |
| Borosilicate Glass Capillaries | Harvard Apparatus | BS4 30-0016 | |
| Cell culture dishes | Falcon | 351029 | |
| ClonExpress Ultra One Step Cloning Kit | Vazyme | C115 | Kit for Infusion clone |
| Codon optimization service | Sangon Biotech | ||
| Drummond Microcaps | Drummond Microcaps | P1299-1PAK | Length:32 mm, capacity:0.5 μL |
| EasyEdit gRNA service | GenScript | ||
| Fine Forceps | Fine Scientific Instrument | 11254-20 | Used to break meedle |
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Stutter Instrument | P-97 | Used to pull the glass capillaries |
| HotStart Taq PCR StarMix | Genstar | A033-101 | Used for PCR reaction |
| Intelligent artificial climate box | TENLIN | PRX-1000A | Used to culture zebrafish embryos |
| Methylcellulose | Sigma-Aldrich | M0512 | Used to fix zebrafish when photographing |
| Microloader pipette tips | Eppendorf | 5242956003 | |
| mMACHINE kit | |||
| Mut Express II Fast Mutagenesis Kit V2 | Vazyme | C214-01 | Kit for site-directed mutagenesis |
| Pneumatic Microinjector | ZGene Biotech | ZGPCP-1500 PLUS | |
| pT3TS-zSpCas9 | Addgene | 46757 | |
| RNeasy FFPE kit | Qiagen | 73504 | Kit for RNA purification |
| Sanger Sequencing service | Sangon Biotech | ||
| Sodium hydroxide, granular | Sangon | A100173-0500 | NaOH used for genome extraction |
| Stereo Microscope | Olympus | SZX10 | Used for photograph of phenotype |
| SZ Series Zoom Stereo Microscope | CNOPTEC | SZ650 | |
| T3 mMESSAGE | Ambion | AM1348 | Kit for in vitro transcription |
| TIANprep Mini Plasmid Kit | TIANGEN | DP103-03 | Kit for plasmid extraction kit |
| TIANquick Mini Purification Kit | TIANGEN | DP203-02 | Kit for purification for linearized plasmid |
| Tricaine | Sigma-Aldrich | E10521 | Used to anesthetize zebrafish |
| Tris (hydroxymethyl) aminomethane | Sangon | A600194-0500 | Component of Tris·HCl used for genome extraction |
| XbaI | New England Biolabs | R0145S | Restriction endonuclease used for plasmid linearization |
References
- Eichler, E. E., et al. Completing the map of human genetic variation. Nature. 447 (7141), 161-165 (2007).
- Koukouli, F., et al. Nicotine reverses hypofrontality in animal models of addiction and schizophrenia. Nature Medicine. 23 (3), 347-354 (2017).
- Kalueff, A. V., Stewart, A. M., Gerlai, R. Zebrafish as an emerging model for studying complex brain disorders. Trends in Pharmacological Sciences. 35 (2), 63-75 (2014).
- Anzalone, A. V., Koblan, L. W., Liu, D. R. Genome editing with CRISPR-Cas nucleases, base editors, transposases and prime editors. Nature Biotechnology. 38 (7), 824-844 (2020).
- Sander, J. D., Joung, J. K. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nature Biotechnology. 32 (4), 347-355 (2014).
- Komor, A. C., Kim, Y. B., Packer, M. S., Zuris, J. A., Liu, D. R. Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage. Nature. 533 (7603), 420-424 (2016).
- Nishida, K., et al. Targeted nucleotide editing using hybrid prokaryotic and vertebrate adaptive immune systems. Science. 353 (6305), (2016).
- Gaudelli, N. M., et al. Directed evolution of adenine base editors with increased activity and therapeutic application. Nature Biotechnology. 38 (7), 892-900 (2020).
- Liu, Z., et al. Highly efficient RNA-guided base editing in rabbit. Nature Communications. 9, 2717 (2018).
- Levy, J. M., et al. Cytosine and adenine base editing of the brain, liver, retina, heart and skeletal muscle of mice via adeno-associated viruses. Nature Biomedical Engineering. 4 (1), 97-110 (2020).
- Liu, Z., et al. Efficient generation of mouse models of human diseases via ABE- and BE-mediated base editing. Nature Communications. 9, 2338 (2018).
- Landrum, M. J., et al. ClinVar: Public archive of interpretations of clinically relevant variants. Nucleic Acids Research. 44, 862-868 (2016).
- Qin, W., et al. Precise A•T to G•C base editing in the zebrafish genome. BMC Biology. 16 (1), 139 (2018).
- Tanaka, S., et al. In vivo targeted single-nucleotide editing in zebrafish. Scientific Reports. 8, 11423 (2018).
- Carrington, B., Weinstein, R. N., Sood, R. BE4max and AncBE4max are efficient in germline conversion of C:G to T:A base pairs in zebrafish. Cells. 9 (7), 1690 (2020).
- Zhang, Y., et al. Programmable base editing of zebrafish genome using a modified CRISPR-Cas9 system. Nature Communications. 8, 118 (2017).
- Rosello, M., et al. Precise base editing for the in vivo study of developmental signaling and human pathologies in zebrafish. eLife. 10, 65552 (2021).
- Liang, F., et al. SpG and SpRY variants expand the CRISPR toolbox for genome editing in zebrafish. Nature Communications. 13, 3421 (2022).
- Qin, W., Lu, X., Lin, S. Programmable base editing in zebrafish using a modified CRISPR-Cas9 system. Methods. 150, 19-23 (2018).
- Feng, Y., et al. Expanding CRISPR/Cas9 genome editing capacity in zebrafish using SaCas9. G3. 6 (8), 2517-2521 (2016).
- Liu, Y., et al. Genome editing in zebrafish by ScCas9 recognizing NNG PAM. Cells. 10 (8), 2099 (2021).
- Kleinstiver, B. P., et al. Engineered CRISPR-Cas9 nucleases with altered PAM specificities. Nature. 523 (7561), 481-485 (2015).
- Liu, K., Petree, C., Requena, T., Varshney, P., Varshney, G. K. Expanding the CRISPR toolbox in zebrafish for studying development and disease. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 13 (2019).
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- Hu, J. H., et al. Evolved Cas9 variants with broad PAM compatibility and high DNA specificity. Nature. 556 (7699), 57-63 (2018).
- Nishimasu, H., et al. Engineered CRISPR-Cas9 nuclease with expanded targeting space. Science. 361 (6408), 1259-1262 (2018).
- Endo, M., et al. Genome editing in plants by engineered CRISPR-Cas9 recognizing NG PAM. Nature Plants. 5, 14-17 (2019).
- Li, J., et al. Plant genome editing using xCas9 with expanded PAM compatibility. Journal of Genetics and Genomics. 46 (5), 277-280 (2019).
- Ren, Q., et al. PAM-less plant genome editing using a CRISPR-SpRY toolbox. Nature Plants. 7, 25-33 (2021).
- Xu, Z., et al. SpRY greatly expands the genome editing scope in rice with highly flexible PAM recognition. Genome Biology. 22 (1), 6 (2021).
- Walton, R. T., Christie, K. A., Whittaker, M. N., Kleinstiver, B. P. Unconstrained genome targeting with near-PAMless engineered CRISPR-Cas9 variants. Science. 368 (6488), 290-296 (2020).
- Li, J., et al. Genome editing mediated by SpCas9 variants with broad non-canonical PAM compatibility in plants. Molecular Plant. 14 (2), 352-360 (2021).
- Vicencio, J., et al. Genome editing in animals with minimal PAM CRISPR-Cas9 enzymes. Nature Communications. 13, 2601 (2022).
- Rosello, M., et al. Disease modeling by efficient genome editing using a near PAM-less base editor in vivo. Nature Communications. 13, 3435 (2022).
- Cornean, A., et al. Precise in vivo functional analysis of DNA variants with base editing using ACEofBASEs target prediction. eLife. 11, 72124 (2022).
- Wang, X., et al. Efficient gene silencing by adenine base editor-mediated start codon mutation. Molecular Therapy. 28 (2), 431-440 (2020).
- Hanna, R. E., Doench, J. G. Design and analysis of CRISPR-Cas experiments. Nature Biotechnology. 38 (7), 813-823 (2020).
- Doench, J. G., et al. Optimized sgRNA design to maximize activity and minimize off-target effects of CRISPR-Cas9. Nature Biotechnology. 34 (2), 184-191 (2016).
- Kossack, M. E., Draper, B. W. Genetic regulation of sex determination and maintenance in zebrafish (Danio rerio). Current Topics in Developmental Biology. 134, 119-149 (2019).
- Crossley, B. M., et al. Guidelines for Sanger sequencing and molecular assay monitoring. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation. 32 (6), 767-775 (2020).
- Kluesner, M. G., et al. EditR: A method to quantify base editing from Sanger sequencing. The CRISPR Journal. 1 (3), 239-250 (2018).
- Gripp, K. W., et al. Diamond-Blackfan anemia with mandibulofacial dystostosis is heterogeneous, including the novel DBA genes TSR2 and RPS28. American Journal of Medical Genetics Part A. 164 (9), 2240-2249 (2014).
- Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins. Genome Research. 24 (6), 1012-1019 (2014).
- Ramakrishna, S., et al. Gene disruption by cell-penetrating peptide-mediated delivery of Cas9 protein and guide RNA. Genome Research. 24 (6), 1020-1027 (2014).
- Fu, Y., Reyon, D., Joung, J. K. Targeted genome editing in human cells using CRISPR/Cas nucleases and truncated guide RNAs. Methods in Enzymology. 546, 21-45 (2014).
