Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

مراقبة كعب 1 بوساطة Pexophagy

Published: May 12, 2023 doi: 10.3791/65010
Automatic Translation
1, 1,2
1Institute of Biological Chemistry, Academia Sinica, 2Institute of Biochemical Sciences, College of Life Sciences, National Taiwan University

Summary

يوفر هذا البروتوكول تعليمات لتحفيز ومراقبة الكسوفاجي بوساطة Stub1 في الخلايا الحية.

Abstract

يمكن لخلايا الثدييات أن تقلب البيروكسيسومات من خلال البكسوفاجي بوساطة Stub1. من المحتمل أن يسمح المسار بالتحكم الخلوي في كمية ونوعية البيروكسيسومات. خلال هذه العملية ، ينتقل بروتين الصدمة الحرارية 70 و ubiquitin E3 ligase ، Stub1 ، إلى البيروكسيسومات ليتم قلبها لبدء pexophagy. يسمح نشاط Stub1 ligase بتراكم يوبيكويتين والوحدات الأخرى المتعلقة بالالتهام الذاتي على البيروكسيسومات المستهدفة. يمكن أن يؤدي رفع مستويات أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) داخل تجويف البيروكسيسومال إلى تنشيط pexophagy بوساطة Stub1. لذلك ، يمكن للمرء استخدام توليد ROS بمساعدة الصبغة لتشغيل هذا المسار ومراقبته. توضح هذه المقالة إجراءات استخدام فئتين من الأصباغ ، البروتينات الفلورية والفلوروفورات الاصطناعية ، لبدء pexophagy داخل مزارع خلايا الثدييات. لا يمكن استخدام هذه البروتوكولات القائمة على توليد أنواع الأكسجين التفاعلية بمساعدة الصبغة لاستهداف جميع البيروكسيسومات داخل مجموعة الخلايا على مستوى العالم فحسب ، بل يمكن أن تسمح أيضا بمعالجة البيروكسيسومات الفردية داخل الخلايا المفردة. نصف أيضا كيف يمكن متابعة pexophagy بوساطة Stub1 باستخدام مجهر الخلايا الحية.

Introduction

البيروكسيسومات عضيات أحادية الغشاء موجودة في معظم الخلايا الحقيقية النواة. البيروكسيسومات هي حجرة استقلابية ضرورية لتنفيذ أكسدة بيتا للأحماض الدهنية طويلة السلسلة ، وهدم البيورين ، وتخليق فوسفوليبيد الأثيروحمض الصفراء 1. يتحكم الأسيتيل CoA المشتق من البيروكسيسوم في توازن الدهون عن طريق تنظيم الإشارات المركزية في التمثيل الغذائي2. لذلك ، ليس من المستغرب أن وظائف البيروكسيسومال المعرضة للخطر متضمنة في أمراض مختلفة ، بما في ذلك الاضطرابات التنكسية العصبية والشيخوخة والسرطانات والسمنة والسكري3،4،5. عملية أساسية في الحفاظ على عملية peroxisomal هي pexophagy. Pexophagy هي عملية تقويضية للدوران الانتقائي للبيروكسيسومات عن طريق الالتهام الذاتي. تستخدم الخلايا pexophagy للمساعدة في التحكم في كمية ونوعية البيروكسيسومات ، وبالتالي ضمان وظيفة بيروكسيسومال المناسبة. أظهرت دراسة حديثة أن فقدان البيروكسيسوم الناجم عن الطفرات في عوامل التكوين الحيوي البيروكسيسومالي PEX1 1 و 6 ينتج عن pexophagy6 غير المنضبط. والجدير بالذكر أن 65٪ من جميع مرضى اضطراب التكوين الحيوي البيروكسيسوم (PBD) يعانون من نقص في مركب ATPase AAA البيروكسيسومالي ، المكون من PEX1 و PEX6 و PEX26 في خلايا الثدييات7.

يمكن استخدام عدد من الطرق لبدء ودراسة pexophagy. في الخميرة ، يتم تشغيل pexophagy عندما يتم تحويل العناصر الغذائية الموردة من مصادر الكربون المعتمدة على البيروكسيسوم إلى مصادر الكربون المستقلة عن البيروكسيسوم (لخفض أعداد البيروكسيسوم الخلوية)8. على سبيل المثال ، يؤدي نقل خلايا Pichia pastoris المزروعة بالميثانول من وسط الميثانول إلى وسط الجلوكوز ووسط الإيثانول إلى تحفيز micropexophagy و macropexophagy ، على التوالي8،9،10. قامت عوازل micropexophagy بتجميع البيروكسيسومات للتحلل عن طريق إعادة تشكيل الفجوة لتشكيل أغشية عزل فراغية تشبه الكوب وهيكل يشبه الغطاء يسمى جهاز الغشاء الخاص بالميكروبيكسوفاجي (MIPA). في macropexophagy ، يتم غمر البيروكسيسومات الفردية بواسطة هياكل غشاء مزدوج تعرف باسم pexophagosomes ، تليها الانصهار مع الفجوة للتحلل8،9،10. تعد فسفرة مستقبلات pexophagy ، مثل Atg36p في Saccharomyces cerevisiae و Atg30p في Pichia pastoris ، أمرا بالغ الأهمية للمستقبلات لتوظيف آلات الالتهام الذاتي الأساسية وتسهيل استهداف البيروكسيسومال للجسيمات الذاتية 8,11.

في خلايا الثدييات ، يمكن أن يحدث pexophagy عن طريق الوجود في كل مكان. وضع علامات على بروتينات الغشاء البيروكسيسومالي PMP34 أو PEX3 مع يوبيكويتين على الجانب الخلوي يحفز pexophagy12. يؤدي الإفراط في التعبير عن PEX3 إلى انتشار البيروكسيسوم في كل مكان والتخلص من البيروكسيسوم بواسطة الجسيمات الحالة13. بالإضافة إلى ذلك ، فإن اندماج PEX5 مع EGFP الطرفي C يضعف تصدير PEX5 أحادي الكل وينتج عنه pexophagy14. من ناحية أخرى ، يمكن أيضا تشغيل pexophagy عن طريق علاج H 2 O2. تنتج البيروكسيسومات أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) ؛ على وجه التحديد ، لا ينتج إنزيم بيروكسيسومال Acox1 ، الذي يحفز الخطوة الأولى من أكسدة بيتا للأحماض الدهنية طويلة السلسلة (> 22 كربون) ، ليس فقط أسيتيل-CoA ولكن أيضا بيروكسيسومال ROS. استجابة لمستويات أنواع الأكسجين التفاعلية المرتفعة تحت علاج H 2O2 ، تقوم خلايا الثدييات بتنشيط pexophagy لخفض إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية وتخفيف التوتر. تم الإبلاغ عن أن علاج H 2O2 يدفع تجنيد الرنح وتوسع الشعيرات المتحور (ATM) إلى البيروكسيسومات. ثم يقوم ATM بفسفرة PEX5 لتعزيز دوران البيروكسيسومال بواسطة pexophagy15.

نظرا لأن البيروكسيسومات هي مراكز مولدة لأنواع الأكسجين التفاعلية ، فهي أيضا عرضة لتلف أنواع الأكسجين التفاعلية. تجبر إصابات البيروكسيسومال المستحثة ب ROS الخلايا على تنشيط pexophagy لبدء مسارات مراقبة جودة البيروكسيسوم (إزالة البيروكسيسوم التالف عن طريق الالتهام الذاتي). هنا ، نحدد نهجا للتسبب عند الطلب لإصابة بيروكسيسومال المستحثة ب ROS. يستفيد البروتوكول من إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية المنشطة بالضوء داخل العضيات16،17،18،19،20 (الشكل 1). يتم إضاءة البيروكسيسومات ذات العلامات الصبغية ، مما يؤدي إلى إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية داخل تجويف البيروكسيسومال ، والذي يؤدي على وجه التحديد إلى إصابة البيروكسيسومالي. باستخدام هذا البروتوكول ، تبين أن البيروكسيسومات المجهدة ب ROS تتم إزالتها من خلال مسار تحلل يعتمد على يوبيكوتين. تقوم البيروكسيسومات المجهدة ب ROS بتجنيد ubiquitin E3 ligase Stub1 للسماح بابتلاعها في البلعمة الذاتية لإزالتها الفردية بواسطة pexophagy16. يمكن للمرء استخدام هذا البروتوكول لمقارنة مصير البيروكسيسومات المصابة والصحية داخل نفس الخلية عن طريق الفحص المجهري بفاصل زمني. يمكن أيضا استخدام هذه الطريقة لإتلاف جميع البيروكسيسومات (في جميع الخلايا) على طبق الاستزراع عالميا ، مما يسمح بالتحليل الكيميائي الحيوي لمسار pexophagy.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. تحضير الخلايا التي تعبر عن diKillerRed أو البروتينات ذاتية الوسم (SLPs) في تجويف البيروكسيسوم

  1. بذر الخلايا المرغوبة على أطباق زراعة الخلايا ذات القاع الزجاجي. بالنسبة للتجربة هنا ، قم بالبذور 2 × 105 خلايا SHSY5Y بشرية في 840 ميكرولتر من وسط الاستزراع (DMEM / F-12 مكمل بمصل بقري جنيني بنسبة 10٪ و 1٪ بنسلين / ستربتومايسين) أو 6 × 104 خلايا NIH3T3 للفأر في 840 ميكرولتر من وسط الاستزراع (DMEM مكمل ب 10٪ مصل بقري و 1٪ بنسلين / ستربتومايسين) على طبق استزراع 35 مم مع ميكروويل زجاجي قطره 20 مم.
    ملاحظة: يجب تعديل عدد الخلايا المصنفة بشكل متناسب وفقا لمنطقة microwell الزجاجية عند استخدام أطباق القاع الزجاجي ذات المواصفات الأخرى.
  2. تنمو الخلايا تحت 5٪ CO2/37 °C لمدة 24 ساعة.
  3. نقل الخلايا مع البلازميدات المطلوبة باستخدام كاشف النقل.
    1. استخدم PMP34-TagBFP لتسمية البيروكسيسومات في الخلايا الحية. استخدم إما diKillerRed-VKSKL الذي يستهدف البيروكسيسوم أو SLP-VKSKL (+ روابط SLP ذات العلامات الصبغية) لتوليد ROS في تجويف البيروكسيسوم (من خلال إنتاج ROS المنشط بالضوء). في هذا البروتوكول ، نستخدم بروتين الملصقات الذاتية HaloTag-VKSKL21. لمراقبة انتقال Stub1 / Hsp70 ، وتراكم البروتينات في كل مكان ، وتشكيل البلعمة الذاتية على البيروكسيسومات المجهدة ب ROS ، فإن نقل EGFP-Stub1 أو EGFP-Hsp70 أو EGFP-Ub أو EGFP-LC3B ، على التوالي. للتحقق من توليد ROS في تجويف البيروكسيسومال ، شارك في نقل diKillerRed-VKSKL مع مسبار الأكسدة والاختزال الفلوري الموضعي البيروكسيسوم roGFP2-VKSKL22.
    2. لنقل الخلايا SHSY5Y ، قم بتخفيف البلازميدات في 55 ميكرولتر من DMEM / F-12 الخالي من المصل ، وقم بتخفيف 1 ميكرولتر من كاشف النقل في 55 ميكرولتر من DMEM / F12 الخالي من المصل. الجمع بين الحمض النووي المخفف مع الكاشف المخفف. تخلط برفق ، وتحتضن لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    3. أضف المركب إلى الميكروويل 20 مم المطلي مسبقا ب 100 ميكرولتر من وسط الاستزراع ل SHSY5Y بدون مضادات حيوية (DMEM / F-12 مع مصل بقري جنيني 10٪). هز الطبق برفق ذهابا وإيابا.
    4. لنقل الخلايا NIH3T3 ، استبدل وسط المصل المخفض ب DMEM / F-12 الخالي من المصل لتخفيف البلازميدات وكاشف النقل. استبدل وسط زراعة الطلاء ب SHSY5Y بوسط استزراع لخلايا NIH3T3 بدون مضادات حيوية (DMEM مع مصل بقري 10٪).
  4. بعد 2 ساعة من النقل ، قم بإزالة الوسط المحتوي على كاشف النقل ، وأضف 1 مل من وسط الاستزراع الطازج. احتضان خلايا NIH3T3 أو SHSY5Y عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 لمدة 24 ساعة.
    ملاحظة: يمكن أيضا استخدام خطوط الخلايا الأخرى لدراسة البكسفاجي بوساطة Stub1 (على سبيل المثال ، خلايا هيلا).

2. تلطيخ البيروكسيسومات بروابط SLP ذات العلامات الصبغية (لإنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية المنشطة بالضوء)

  1. في 24 ساعة بعد النقل ، قم بإزالة وسط الاستزراع ، وأضف 100 ميكرولتر من 200 نانومتر HaloTag TMR ligand أو 200 نانومتر Janelia Fluor 646 HaloTag ligand على البئر الزجاجي الصغير 20 مم.
    ملاحظة: يجب تخفيف روابط SLP ذات العلامات الصبغية باستخدام وسيط الاستزراع المعني لكل خط خلية. سيؤدي اختيار الروابط التي تحمل علامة Janelia Fluor 646 إلى تحرير القنوات الزرقاء والخضراء والحمراء للتصوير الفلوري في اتجاه مجرى النهر.
  2. انقل الطبقإلى حاضنة CO 2 37 درجة مئوية ، 5٪. وصمة عار لمدة 1 ساعة. بعد 1 ساعة ، قم بإزالة وسط التلوين جيدا ، وأضف 1 مل من وسط الاستزراع الطازج.

3. ضغط ROS للبيروكسيسومات على مجهر متحد البؤر للمسح بالليزر

  1. ضع طبقا ذو قاع زجاجي يحتوي على الخلايا المطلوبة على مجهر متحد البؤر للمسح بالليزر مزود بحاضنة على سطح المسرح.
  2. انقر فوق نافذة الأداة ، واختر العين ، وانقر فوق الزر DIA (الشكل 2 أ) لتشغيل الضوء المرسل. اعرض الطبق من خلال عدسة المجهر ، واجعل الخلايا في بؤرة التركيز عن طريق تدوير مقبض التركيز.
  3. اختر LSM ، وانقر على زر تحديد الصبغة والكاشف (الشكل 2 ب). انقر نقرا مزدوجا فوق الأصباغ المطلوبة في النافذة المنبثقة لتحديد إعدادات الليزر والمرشح المناسبة لتصوير الخلايا (الشكل 2C). انقر فوق Livex4 في اللوحة الحية لبدء المسح السريع بالليزر لبدء فحص إشارات التألق للخلايا (الشكل 2D).
  4. حرك المرحلة باستخدام وحدة التحكم بعصا التحكم ، وحدد موقع الخلايا المتوسطة التي تعبر عن diKillerRed-VKSKL- أو SLP-VKSKL لتطبيق ضغط ROS (على البيروكسيسومات). الحصول على صورة للخلية المطلوبة.
  5. انقر فوق نافذة الأداة ، واختر تحفيز LSM (الشكل 2E). انقر فوق الزر الناقص ، وفي نافذة الصورة الحية ، استخدم الماوس لرسم عائد استثمار دائري يبلغ قطره 15 ميكرومتر (الشكل 2F) يحتوي على البيروكسيسومات المرغوبة المكتسبة في الخطوة 3.4 والتي سيتم تطبيق ضغط ROS عليها (انظر الشكل 3 للحصول على مثال).
  6. لتطبيق إجهاد ROS ، استخدم 561 نانومتر للخلايا التي تحتوي على ليجند SLP المسمى diKillerRed-PTS1 أو TMR ، واستخدم 640 نانومتر للخلايا الملطخة ب Janelia Fluor 646 المسمى SLP ligand.
  7. حدد الطول الموجي لليزر لتطبيق إجهاد ROS. أدخل نسبة الليزر المطلوبة والمدة (الشكل 2G).
  8. انقر فوق اكتساب ، وانقر فوق زر التحفيز (الشكل 2H) لبدء المسح بضوء 561/640 نانومتر من خلال عائد الاستثمار لمدة 30 ثانية لكل منهما. هذا يتوافق مع إعداد طاقة الليزر ~ 5٪ لكل من 561 نانومتر و 640 نانومتر على المجهر متحد البؤر المستخدم هنا. ستؤدي هذه العملية إلى إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية في البيروكسيسومات.
    ملاحظة: يمكن للمرء تحديد عائد الاستثمار بأحجام مختلفة. يجب على المرء ضبط وقت الإضاءة بشكل متناسب لكل عائد استثمار وفقا لمنطقته.
  9. بعد 30 ثانية من إضاءة الليزر ، ستفقد البيروكسيسومات داخل عائد الاستثمار إشارات diKillerRed-PTS1 / TMR / Janelia Fluor 646. يسمح فقدان الإشارة هذا للمرء بالتمييز بين البيروكسيسومات المضيئة وغير المضيئة (التالفة مقابل السليمة) داخل الخلية.

4. مراقبة pexophagy في الخلايا الحية عن طريق التصوير بفاصل زمني

  1. اتبع نقل Stub1 أو Hsp70 أو Ub أو p62 أو LC3B الموسوم بعلامة EGFP إلى البيروكسيسومات المضيئة / المجهدة ب ROS عن طريق التصوير بفاصل زمني باستخدام فواصل زمنية مدتها 10 دقائق بين الإطارات (على سبيل المثال ، انظر الأشكال 3-7).
    ملاحظة: تبدأ إشارات EGFP-Stub1 أو EGFP-Hsp70 في الظهور بعد 10-20 دقيقة من الإضاءة وتبقى على جميع البيروكسيسومات التالفة حتى ~ 40 دقيقة بعد الإضاءة. تظهر إشارات EGFP-Ub بعد 30 دقيقة من الإضاءة وتستمر لمدة 2-3 ساعات. يظهر إزفاء EGFP-p62 بعد 60 دقيقة من الإضاءة ، وتصبح إشارات EGFP-LC3B مرئية ~ 3 ساعات بعد الإضاءة.
  2. حدد إشارات EGFP على البيروكسيسومات التالفة (من Stub1 أو Ub أو p62 أو LC3B) باستخدام ImageJ. قم بتنفيذ الخطوات التالية لاستخدام ImageJ لتحديد كمية صورة ثلاثية القنوات (PMP34-TagBFP/EGFP-LC3B/HaloTag-VKSKL).
    1. افتح الصورة ، وقم بتطبيق التحديدات الإهليلجية أو التحديدات اليدوية لإحاطة المنطقة التي تحتوي على جميع البيروكسيسومات المضيئة (إشارة PMP34-TagBFP موجبة وإشارة HaloTag ligand مبيضة ؛ الشكل 8 أ).
    2. انقر فوق تكرار لاختيار قناة PMP34-TagBFP (الشكل 8 أ). قم بتعيين عتبة باستخدام القائمة المنسدلة Image > ضبط عتبة > لتمييز البيروكسيسومات (الشكل 8B).
    3. حدد تحليل > تحليل الجسيمات لتحديد المناطق الدقيقة للبيروكسيسومات المضيئة. تسجل ImageJ مناطق الاهتمام هذه (ROIs) في مدير عائد الاستثمار (الشكل 8C).
    4. انقر فوق تكرار لاختيار قناة EGFP لتحليل إشارة التألق من UB أو p62 أو LC3B المترافق EGFP (الشكل 8D). حدد جميع عائد الاستثمار في مدير عائد الاستثمار (الشكل 8E).
    5. تطبيق القياس في مدير عائد الاستثمار لقياس إشارات EGFP على البيروكسيسومات (الشكل 8E). أوجد قيمة المساحة والكثافة المتكاملة (مجموع كل كثافة البكسل) لكل عائد استثمار في جدول النتائج (الشكل 8E).
    6. للحصول على متوسط شدة مضان EGFP في نقاط زمنية مختلفة بعد الإضاءة ، قسم شدة EGFP المتكاملة على المساحة الإجمالية للبيروكسيسومات المضيئة (إشارة PMP34-TagBFP الموجبة والمناطق السلبية لإشارة HaloTag). للحصول على الإشارة المتراكمة على البيروكسيسومات ، اطرح متوسط الشدة في نقطة زمنية بمتوسط الشدة في الوقت = 0 ، ثم قم بالتطبيع بمتوسط الشدة في الوقت = 0.

5. إتلاف جميع البيروكسيسومات (في كل خلية) على طبق الاستزراع عالميا

  1. نفذ الخطوة 1 (تحضير الخلايا التي تعبر عن ثنائي القاتل الأحمر المستهدف للبيروكسيسوم [diKillerRed-VKSKL] أو SLP [SLP-VKSKL]) والخطوة 2 (تلطيخ البيروكسيسومات باستخدام ليجند SLP [لإنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية المنشطة بالضوء]).
  2. بعد ساعة واحدة من تلطيخ الربيطة المسمى TMR ، قم بإزالة وسط التلوين ، وأضف 1 مل من وسط الاستزراع الذي يحتوي على 30 mM 3-AT (3-amino-1،2،4-triazole ؛ مثبط الكاتالاز).
    ملاحظة: Catalase هو كاسح ROS يتم التعبير عنه في تجويف البيروكسيسوم ، لذلك يساعد علاج 3-AT على زيادة الضرر التأكسدي الناتج عن الضوء على البيروكسيسومات.
  3. ضع طبق الاستزراع فوق مصباح LED (555-570 نانومتر). إلقاء الضوء على جميع الخلايا بكثافة طاقة 1.8 واط / سم2 لمدة 9 ساعات في حاضنة.
    ملاحظة: لتنفيذ هذه الخطوة خارج الحاضنة ، ضع طبق الاستزراع على طبق تسخين 37 درجة مئوية. أضف 20 mM HEPES إلى الوسط المحتوي على 3-AT ، وقم بتغطية طبق الاستزراع بغشاء شفاف لتقليل تبادل الغازات. HEPES هو عامل تخزين مؤقت يحافظ على درجة الحموضة الفسيولوجية في زراعة الخلايا خارج حاضنة CO2 أثناء إضاءة LED.
  4. تحقق من نجاح الضرر المستمد من LED عن طريق تصوير إشارات EGFP-Ub أو EGFP-p62 أو EGFP-LC3B على البيروكسيسومات. باستخدام حالة الإضاءة الموضحة أعلاه ، عرضت 82٪ من خلايا SHSY5Y التي تعبر بثبات عن HaloTag-VKSKL pexophagy بوساطة Stub1.
  5. حصاد الخلايا للتحليل الكيميائي الحيوي المصب.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

يستفيد مخطط تحريض pexophagy بوساطة Stub1 الموضح هنا من توليد ROS بمساعدة الصبغة داخل تجويف البيروكسيسوم. تتطلب هذه العملية الحد الأدنى من شدة الضوء. وبالتالي ، يمكن إضاءة البيروكسيسومات التي تحتوي على بروتينات أو أصباغ فلورية باستخدام المجاهر البؤرية القياسية للمسح بالليزر. تؤدي الإضاءة البؤرية إلى إنتاج ROS فوري وموضعي داخل البيروكسيسومات الفردية ، كما هو موضح من قبل المراسل الفلوري roGFP2-VKSKL (الشكل 9). لم نقم بتصوير diKillerRed-VKSKL في قياسات roGFP2-VKSKL لتجنب توليد ROS إضافي أثناء التصوير. تم التقاط صورة diKillerRed-VKSKL السفلية اليمنى في الشكل 9 بعد إجراء جميع قياسات roGFP2-VKSKL للإشارة بوضوح إلى مكان وجود البيروكسيسومات التالفة13. تظهر البيانات أيضا أن البيروكسيسومات غير المضيئة لا تتأثر ، مما يشير إلى دقة المنهجية. يؤدي ROS إلى أكسدة جزء صغير من جزيئات البيروكسيسوم المقيمة ، مما يؤدي إلى خلل وظيفي في البيروكسيسوم. تسمح هذه العملية الحادة للمرء بالتحقيق في مسارات مراقبة جودة البيروكسيسوم المختلفة بقوة.

تمكنا من استخدام هذه المنهجية لمراقبة البكسوفاجي بوساطة Stub1. في pexophagy بوساطة Stub1 ، يقوم Hsp70 بتجنيد Stub1 على البيروكسيسومات المجهدة ب ROS لبدء دوران البيروكسيسوم عن طريق الالتهام الذاتي. خلال هذه العملية ، يظهر Hsp70 و Stub1 والبروتينات المنتشرة في كل مكان ومحول الالتهام الذاتي p62 و LC3B بالتتابع على البيروكسيسومات المجهدة ب ROS لدفع pexophagy (الشكل 3 ، الشكل 4 ، الشكل 5 ، الشكل 6 ، الشكل 7)13. من خلال التصوير بفاصل زمني ، كان من الممكن متابعة توقيت وترتيب تجنيد هذه العوامل الحاسمة في pexophagy. باستخدام المنهجية لإصابة البيروكسيسومات بشكل بؤري ، يمكننا بسهولة إثبات أن آلية Hsp70 / Stub1 تستهدف على وجه التحديد البيروكسيسومات التالفة (ولكن ليس الوظيفية). بصرف النظر عن استنباط إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية داخل البيروكسيسومات الفردية ، كان من الممكن استخدام نفس الإستراتيجية لإتلاف جميع البيروكسيسومات في نفس الوقت على طبق الاستزراع للتوصيف الكيميائي الحيوي ل pexophagy بوساطة Stub1 (الشكل 10).

Figure 1
الشكل 1: رسم تخطيطي لإنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية المنشطة بالضوء في البيروكسيسومات. (أ) رسم تخطيطي لكيفية تحفيز توليد أنواع الأكسجين التفاعلية البيروكسيسومية بواسطة الضوء. يتم استهداف الأصباغ مثل دايمرات KillerRed الترادفية أو روابط SLP الفلورية في البيروكسيسومات من خلال استخدام تسلسلات استهداف البيروكسيسوم (VKSKL). (ب) يثبط 3-AT الكاتالاز ويمكن استخدامه جنبا إلى جنب مع المخطط الموضح هنا لزيادة مستويات أنواع الأكسجين التفاعلية في تجويف البيروكسيسوميل. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: استخدام مجهر متحد البؤر لتنشيط إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية في البيروكسيسومات. (أ) لقطة شاشة للخطوة 3.2 في البروتوكول. (ب-د) لقطات شاشة للخطوة 3.3 في البروتوكول. (إ-و) لقطات شاشة للخطوة 3.5 في البروتوكول. (ز) لقطة شاشة للخطوة 3.7 في البروتوكول. (H) لقطة شاشة للخطوة 3.8 في البروتوكول. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: نقل EGFP-Stub1 على البيروكسيسومات المجهدة ب ROS. تم نقل خلايا SHSY5Y باستخدام HaloTag-VKSKL و PMP34-TagBFP و EGFP-Stub1. بعد يوم واحد من النقل ، تم تلطيخ الخلايا ب HaloTag TMR ligand عند 37 درجة مئوية (200 نانومتر ، 1 ساعة). هنا، تظهر البيانات من إحدى الخلايا في هذه العينة. (أ) اختيرت المنطقة الدائرية البيضاء في هذه الخلية لإضاءة 561 نانومتر. (ب) فقدت البيروكسيسومات المضيئة في المنطقة الدائرية البيضاء مضان TMR على الفور. (C) EGFP-Stub1 تم نقله إلى البيروكسيسومات المضيئة عند t = 20 دقيقة. الأجزاء العلوية اليسرى: منظر مكبرة لمناطق المربع الأبيض. جميع أشرطة المقياس: 5 ميكرومتر. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 4
الشكل 4: توظيف EGFP-Hsp70 بواسطة البيروكسيسومات المجهدة ب ROS. تم تلطيخ البيروكسيسومات في خلايا SHSY5Y التي تعبر عن HaloTag-VKSKL و PMP34-TagBFP و EGFP-Hsp70 ب 200 نانومتر HaloTag TMR ligand لمدة 1 ساعة. هنا، تظهر البيانات من إحدى الخلايا في هذه العينة. (أ) تعرضت المنطقة الدائرية البيضاء في الخلية لإضاءة 561 نانومتر. (ب) فقدت البيروكسيسومات المضيئة في هذه المنطقة المضيئة على الفور مضان TMR بسبب التبييض الضوئي. (ج) نقل EGFP-Hsp70 إلى البيروكسيسومات المضيئة بعد 20 دقيقة. الأجزاء السفلية اليمنى: عرض مكبر لمناطق المربع الأبيض. جميع أشرطة المقياس: 5 ميكرومتر. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 5
الشكل 5: تصوير الفاصل الزمني لتراكم البروتين في كل مكان على البيروكسيسومات المجهدة بأنواع الأكسجين التفاعلية (ROS). (A) بعد 1 ساعة من تلطيخ ليجند HaloTag TMR ، أضاءت البيروكسيسومات داخل المنطقة الدائرية البيضاء في خلية SHSY5Y تعبر عن EGFP-Ub و PMP34-TagBFP و HaloTag-VKSKL ب 561 نانومتر. (ب) تم تبييض مضان TMR داخل المنطقة بعد الإضاءة. تراكم EGFP-Ub لاحقا على وجه التحديد على البيروكسيسومات المضيئة (t = 40 دقيقة و 2 ساعة بعد عرض إضاءة 561 نانومتر. الإدخالات السفلية اليمنى: منظر مكبرة لمناطق المربع الأبيض في (C). جميع أشرطة المقياس: 5 ميكرومتر. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 6
الشكل 6: تراكم محول الالتهام الذاتي p62 على البيروكسيسومات المجهدة ب ROS . (أ) المنطقة الدائرية البيضاء في خلية SHSY5Y التي تعبر عن EGFP-p62 و PMP34-TagBFP و HaloTag-VKSKL (ملطخة ب HaloTag TMR ligand ؛ 200 نانومتر ، 1 ساعة) مضاءة بضوء 561 نانومتر. (ب) تسببت الإضاءة في فقدان فوري لإشارات TMR على البيروكسيسومات المستهدفة. (ج) عند 2.5 ساعة بعد الإضاءة، جندت البيروكسيسومات EGFP-p62. الإدخالات العلوية اليمنى: طرق عرض مكبرة لمناطق المربع الأبيض في (C). جميع أشرطة المقياس: 5 ميكرومتر. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 7
الشكل 7: نقل EGFP-LC3B إلى البيروكسيسومات المجهدة ب ROS. (أ) بعد تلطيخ ليجند HaloTag TMR (200 نانومتر ، 1 ساعة) ، أضاءت خلية SHSY5Y تعبر عن EGFP-LC3B و PMP34-TagBFP و HaloTag-VKSKL ب 561 نانومتر داخل المنطقة الدائرية البيضاء. (ب) بعد الإضاءة، تم تبييض إشارة TMR للبيروكسيسومات في المنطقة الدائرية البيضاء. (C) عند 3.5 ساعة بعد الإضاءة ، تم نقل EGFP-LC3B إلى البيروكسيسومات المجهدة ب ROS. الإدخالات العلوية اليمنى: طرق عرض مكبرة لمناطق المربع الأبيض في (C). جميع أشرطة المقياس: 5 ميكرومتر. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 8
الشكل 8: القياس الكمي لإشارات التألق على البيروكسيسومات التالفة باستخدام ImageJ . (A) لقطة شاشة للخطوتين 4.2.1 والخطوة 4.2.2 في البروتوكول. (ب) لقطة شاشة للخطوة 4.2.2 في البروتوكول. (ج) لقطة شاشة للخطوات 4.2.3 في البروتوكول. (د) لقطة شاشة للخطوة 4.2.4 في البروتوكول. (ه) لقطة شاشة للخطوتين 4.2.4 والخطوة 4.2.5 في البروتوكول. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 9
الشكل 9: إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية المنشطة بالضوء داخل البيروكسيسومات الفردية. تم استخدام مسبار الأكسدة والاختزال الموضعي البيروكسيسوم roGFP2-VKSKL للتحقق من صحة إنتاج ROS المنشط بالضوء داخل البيروكسيسومات المستهدفة. تمت إضاءة البيروكسيسومات داخل المنطقة الدائرية البيضاء لخلية NIH3T3 التي تعبر عن diKillerRed-VKSKL و roGFP2-VKSKL بضوء 561 نانومتر ، وتظهر هذه (A) قبل إضاءة الضوء 561 نانومتر و (B) بعد إضاءة الضوء 561 نانومتر. اليسار: انبعاث roGFP2-VKSKL مع إثارة 405 نانومتر (أرجواني) ؛ الوسط: انبعاث roGFP2-VKSKL مع إثارة 488 نانومتر (أخضر). نسبة إشارة انبعاث roGFP2-VKSKL المثارة بواسطة 405 نانومتر (أرجواني) على إشارة الانبعاث المثارة بواسطة 488 نانومتر (أخضر) تتعقب مستويات ROS داخل البيروكسيسومات. تظهر المنطقة الدائرية البيضاء في (B) الفقدان الفوري لانبعاث diKillerRed-VKSKL بعد إضاءة 561 نانومتر. جميع أشرطة المقياس: 5 ميكرومتر. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 10
الشكل 10: إتلاف جميع البيروكسيسومات على مستوى العالم في طبق مستزرع. تم تلطيخ خلايا SHSY5Y التي تعبر عن HaloTag-VKSKL و EGFP-Ub و PMP34-TagBFP ب HaloTag TMR ligand لمدة 1 ساعة. (A) قبل إضاءة LED ، كان مضان EGFP-Ub متجانسا في السيتوبلازم ولم يتزامن مع البيروكسيسومات (تم تمييزه بواسطة HaloTag TMR ligand و PMP34-TagBFP). (B) بعد 9 ساعات من إضاءة LED ، تراكمت إشارة EGFP-Ub على جميع البيروكسيسومات في الخلايا المزروعة في طبق متحد البؤر ، كما هو موضح في اللوحين في (B). جميع أشرطة المقياس: 5 ميكرومتر. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

يوضح هذا البروتوكول كيفية تشغيل pexophagy بوساطة Stub1 داخل مزارع الخلايا عن طريق رفع مستويات ROS البيروكسيسومال بالضوء. نظرا لأن البروتوكول يعتمد على توليد أنواع الأكسجين التفاعلية بمساعدة الصبغة ، يحتاج المرء إلى ضمان التعبير الكافي عن diKillerRed-VKSKL أو تلطيخ ليجند SLP المسمى بالصبغة داخل الخلايا محل الاهتمام. بالنظر إلى أن أنواع الخلايا المختلفة أو الخلايا ذات الخلفيات الجينية المختلفة يمكن أن تؤوي البيروكسيسومات ذات الخصائص المختلفة قليلا ، فقد يحتاج المرء إلى ضبط ظروف الإضاءة الدقيقة لضمان تحريض pexophagy. يتمثل أحد الإجراءات القوية لفحص تنشيط pexophagy بوساطة Stub1 في مراقبة ما إذا كان EGFP-Ub ينتقل إلى البيروكسيسومات المضيئة (1 ساعة بعد الإضاءة)13. في الخلايا السليمة ، عادة ما يتم توزيع إشارات EGFP-Ub بالتساوي في السيتوبلازم. لذلك ، من السهل ملاحظة انتقاله إلى البيروكسيسومات المضيئة. لتحسين حالة الإضاءة ، يمكن تغيير شدة الضوء أو وقت الإضاءة. من الأفضل أيضا تجنب الإفراط في إضاءة الأصباغ عند محاولة إتلاف البيروكسيسومات ، حيث قد يخضع بعضها لعمليات كيميائية ضوئية يمكن أن تتداخل مع التصوير النهائي. على سبيل المثال ، لقد ثبت أن الإضاءة المفرطة ل KillerRed يمكن أن تتسبب في أن تصبح فلورية خضراء ضعيفة. يولد الإفراط في الإضاءة إشارات خضراء باهتة على البيروكسيسومات المضيئة مباشرة بعد الإضاءة23 (على عكس نقل المراسلين المقيمين في EGFP ، والذي قد يستغرق عشرات الدقائق إلى ساعات حتى يحدث).

تسمح المنهجية للباحثين باستخدام المجاهر القياسية للمسح بالليزر لإضعاف جزء صغير من البيروكسيسومات داخل الخلية ، مما يسمح بإجراء مقارنات مباشرة للفرق في المصير بين البيروكسيسومات السليمة والتالفة. بالمقارنة مع الطرق الحالية ، فإن البروتوكول هنا يسبب إجهاد ROS لجزء صغير فقط من البيروكسيسومات بدلا من جميع البيروكسيسومات أو العضيات الأخرى في الخلايا. لذلك ، من الممكن دراسة تأثير البيروكسيسومات الصحية المتبقية على pexophagy من البيروكسيسومات المجهدة ROS في نفس الخلية.

من خلال إضاءة طبق كامل ، من الممكن أيضا استهداف جميع البيروكسيسومات داخل ثقافة الخلية ، مما يسمح بالتحليل الكيميائي الحيوي ل pexophagy بوساطة Stub1. كيف يتعرف Hsc70 / Stub1 على البيروكسيسومات التالفة وما هي ركائز البيروكسيسومال Stub1 في كل مكان كلها أسئلة يمكن استكشافها باستخدام هذا البروتوكول. بشكل عام ، يمكن أيضا استخدام بروتوكول ضعف البيروكسيسوم للتحقيق في مسارات مراقبة جودة البيروكسيسوم الأخرى. بالنظر إلى أن البيروكسيسومات مرتبطة ارتباطا وثيقا بالعديد من العضيات الخلوية المختلفة داخل الخلية ، بما في ذلك الشبكة الإندوبلازمية والميتوكوندريا وقطرات الدهون ، فسيكون من المثير للاهتمام أيضا دراسة كيفية تعديل الخلايا بشكل منهجي لسلوكيات جميع الهياكل الخلوية استجابة لضعف البيروكسيسوم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

يعلن أصحاب البلاغ عدم وجود مصالح مالية متنافسة.

Acknowledgments

تم دعم هذا العمل جزئيا من خلال منحة بحثية MOST 111-2311-B-001-019-MY3 من المجلس الوطني للعلوم والتكنولوجيا في تايوان.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
35 mm culture dish with a 20 mm diameter glass microwell  MatTek P35G-1.5-20-C 20 mm glass bottomed
3-amino-1,2,4-triazole (3-AT) Sigma Aldrich A8056
bovine serum ThermoFisher Scientific 16170060
Cell culture incubator Nuaire NU-4750
diKillerRed-PTS1 Academia Sinica made by appending the KillerRed tandem dimer with PTS1(VKSKL)
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) ThermoFisher Scientific 11965092
Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F-12) ThermoFisher Scientific 11330032
EGFP-C1 Clontech pEGFP-C1 The backbone of EGFP-C1 was used for cloning EGFP-Stub1, EGFP-Hsp70, EGFP-p62
EGFP-Hsp70 Academia Sinica Hsp70 gene (HSPA1A) PCR amplified from HeLa cDNA and cloned into EGFP-C1
EGFP-LC3B Addgene 11546
EGFP-p62 Academia Sinica generated by inserting the human SQSTM1 gene (through PCR amplification of the HeLa cell cDNA) into EGFP-C1
EGFP-Stub1 Academia Sinica generated by inserting the mouse Stub1 gene (through PCR amplification of the total mouse kidney cDNA) into EGFP-C1
EGFP-Ub Addgene 11928
fetal bovine serum ThermoFisher Scientific 10437028
HaloTag TMR ligand  Promega G8252
HaloTag-PTS1 Academia Sinica PTS1 appended and cloned into EGFP-C1 backbone
HEPES ThermoFisher Scientific 15630080
Inverted Confocal Microscope  Olympus FV3000RS 405 nm Ex, 488 nm Ex, 561 nm Ex,  microscope with a TOKAI HIT chamber incubator and the UNIV2-D35 dish attachment
Janelia Fluor 646 HaloTag Ligand Promega GA1120
LED VitaStar PAR64 80 W, 555-570 nm
lipofectamine 2000  ThermoFisher Scientific 11668 transfection reagent
NIH3T3 cell ATCC CRL-1658 adherent
Opti-MEM ThermoFisher Scientific 319850 reduced serum media
penicillin/streptomycin ThermoFisher Scientific 15140
PMP34-TagBFP Academia Sinica PMP34 PCR amplified from HeLa cDNA and cloned intoTagBFP-C (Evrogen FP171)
roGFP2-PTS1 Academia Sinica generated by appending eroGFP (taken from Addgene plasmid 20131) with the amino acid sequence VKSKL, and cloned into the EGFP-C1
SHSY5Y cell ATCC CRL-2266 adherent

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wanders, R. J., Waterham, H. R., Ferdinandusse, S. Metabolic interplay between peroxisomes and other subcellular organelles including mitochondria and the endoplasmic reticulum. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 3, 83 (2016).
  2. He, A., et al. Acetyl-CoA derived from hepatic peroxisomal β-oxidation inhibits autophagy and promotes steatosis via mTORC1 activation. Molecular Cell. 79 (1), 30.e4-42.e4 (2020).
  3. Cipolla, C. M., Lodhi, I. J. Peroxisomal dysfunction in age-related diseases. Trends in Endocrinology & Metabolism. 28 (4), 297-308 (2017).
  4. Fransen, M., Nordgren, M., Wang, B., Apanasets, O., Veldhoven, P. P. V. Aging, age-related diseases and peroxisomes. Peroxisomes and their Key Role in Cellular Signaling and Metabolism. 69, Springer. Dordrecht, the Netherlands. 45-65 (2013).
  5. Puri, P., et al. The plasma lipidomic signature of nonalcoholic steatohepatitis. Hepatology. 50 (6), 1827-1838 (2009).
  6. Law, K. B., et al. The peroxisomal AAA ATPase complex prevents pexophagy and development of peroxisome biogenesis disorders. Autophagy. 13 (5), 868-884 (2017).
  7. Nazarko, T. Y. Pexophagy is responsible for 65% of cases of peroxisome biogenesis disorders. Autophagy. 13 (5), 991-994 (2017).
  8. Eberhart, T., Kovacs, W. J. Pexophagy in yeast and mammals: An update on mysteries. Histochemistry and Cell Biology. 150 (5), 473-488 (2018).
  9. Manjithaya, R., Nazarko, T. Y., Farré, J. -C., Subramani, S. Molecular mechanism and physiological role of pexophagy. FEBS Letters. 584 (7), 1367-1373 (2010).
  10. Till, A., Lakhani, R., Burnett, S. F., Subramani, S. Pexophagy: The selective degradation of peroxisomes. International Journal of Cell Biology. 2012, 512721 (2012).
  11. Germain, K., Kim, P. K. Pexophagy: A model for selective autophagy. International Journal of Molecular Sciences. 21 (2), 578 (2020).
  12. Kim, P. K., Hailey, D. W., Mullen, R. T., Lippincott-Schwartz, J. Ubiquitin signals autophagic degradation of cytosolic proteins and peroxisomes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (52), 20567-20574 (2008).
  13. Yamashita, S., Abe, K., Tatemichi, Y., Fujiki, Y. The membrane peroxin PEX3 induces peroxisome-ubiquitination-linked pexophagy. Autophagy. 10 (9), 1549-1564 (2014).
  14. Nordgren, M., et al. Export-deficient monoubiquitinated PEX5 triggers peroxisome removal in SV40 large T antigen-transformed mouse embryonic fibroblasts. Autophagy. 11 (8), 1326-1340 (2015).
  15. Zhang, J., et al. ATM functions at the peroxisome to induce pexophagy in response to ROS. Nature Cell Biology. 17 (10), 1259-1269 (2015).
  16. Chen, B. -H., Chang, Y. -J., Lin, S., Yang, W. Y. Hsc70/Stub1 promotes the removal of individual oxidatively stressed peroxisomes. Nature Communications. 11 (1), 5267 (2020).
  17. Hung, Y. H., Chen, L. M., Yang, J. Y., Yang, W. Y. Spatiotemporally controlled induction of autophagy-mediated lysosome turnover. Nature Communications. 4, 2111 (2013).
  18. Mageswaran, S. K., Yang, W. Y., Chakrabarty, Y., Oikonomou, C. M., Jensen, G. J. A cryo-electron tomography workflow reveals protrusion-mediated shedding on injured plasma membrane. Science Advances. 7 (13), eabc6345 (2021).
  19. Yang, J. Y., Yang, W. Y. Spatiotemporally controlled initiation of parkin-mediated mitophagy within single cells. Autophagy. 7 (10), 1230-1238 (2011).
  20. Yang, J. Y., Yang, W. Y. Bit-by-bit autophagic removal of parkin-labelled mitochondria. Nature Communications. 4, 2428 (2013).
  21. Los, G. V., et al. HaloTag: A novel protein labeling technology for cell imaging and protein analysis. ACS Chemical Biology. 3 (6), 373-382 (2008).
  22. Lismont, C., Walton, P. A., Fransen, M. Quantitative monitoring of subcellular redox dynamics in living mammalian cells using RoGFP2-based probes. Methods in Molecular Biology. 1595, 151-164 (2017).
  23. Nordgren, M., et al. Potential limitations in the use of KillerRed for fluorescence microscopy. Journal of Microscopy. 245 (3), 229-235 (2012).

Tags

علم الأحياء ، العدد 195 ، Pexophagy ، البيروكسيسومات ، Hsc70 ، Stub1 ، الالتهام الذاتي ، ROS
مراقبة كعب 1 بوساطة Pexophagy
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chen, B. H., Yang, W. Y. Monitoring… More

Chen, B. H., Yang, W. Y. Monitoring Stub1-Mediated Pexophagy. J. Vis. Exp. (195), e65010, doi:10.3791/65010 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter