Summary
Dieses Protokoll enthält Anweisungen zum Auslösen und Überwachen der Stub1-vermittelten Pexophagie in lebenden Zellen.
Abstract
Säugetierzellen können Peroxisomen durch Stub1-vermittelte Pexophagie umwandeln. Der Signalweg ermöglicht möglicherweise die zelluläre Kontrolle der Quantität und Qualität von Peroxisomen. Während dieses Prozesses translozieren das Hitzeschockprotein 70 und die Ubiquitin-E3-Ligase Stub1 auf Peroxisomen, die umgedreht werden, um die Pexophagie zu initiieren. Die Aktivität der Stub1-Ligase ermöglicht die Akkumulation von Ubiquitin und anderen Autophagie-relevanten Modulen auf gezielten Peroxisomen. Eine Erhöhung des Spiegels der reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) im peroxisomalen Lumen kann die Stub1-vermittelte Pexophagie aktivieren. Man kann daher die farbstoffgestützte ROS-Generierung nutzen, um diesen Signalweg auszulösen und zu überwachen. Dieser Artikel beschreibt die Verfahren zur Verwendung von zwei Klassen von Farbstoffen, fluoreszierenden Proteinen und synthetischen Fluorophoren, um die Pexophagie in Säugetierzellkulturen zu initiieren. Diese farbstoffgestützten Protokolle, die auf der ROS-Generierung basieren, können nicht nur verwendet werden, um alle Peroxisomen innerhalb einer Zellpopulation weltweit anzusprechen, sondern können auch die Manipulation einzelner Peroxisomen innerhalb einzelner Zellen ermöglichen. Wir beschreiben auch, wie die Stub1-vermittelte Pexophagie mit Hilfe der Lebendzellmikroskopie verfolgt werden kann.
Introduction
Peroxisomen sind an eine einzelne Membran gebundene Organellen, die in den meisten eukaryotischen Zellen vorkommen. Peroxisomen sind ein metabolisches Kompartiment, das für die Beta-Oxidation von sehr langkettigen Fettsäuren, den Purinkatabolismus und die Synthese von Etherphospholipiden und Gallensäuren unerlässlichist 1. Peroxisom-abgeleitetes Acetyl-CoA steuert die Lipidhomöostase, indem es die zentrale Signalübertragung im Stoffwechselreguliert 2. Daher ist es nicht verwunderlich, dass beeinträchtigte peroxisomale Funktionen bei verschiedenen Krankheiten impliziert sind, darunter neurodegenerative Erkrankungen, Alterung, Krebs, Fettleibigkeit und Diabetes 3,4,5. Ein wesentlicher Prozess bei der Aufrechterhaltung der peroxisomalen Operation ist die Pexophagie. Die Pexophagie ist ein kataboler Prozess für den selektiven Umsatz von Peroxisomen durch Autophagie. Zellen nutzen die Pexophagie, um die Quantität und Qualität der Peroxisomen zu kontrollieren und so eine ordnungsgemäße peroxisomale Funktion zu gewährleisten. Eine kürzlich durchgeführte Studie zeigte, dass der Peroxisomverlust, der durch Mutationen in den peroxisomalen PEX1-Biogenesefaktoren 1 und 6 verursacht wird, auf eine unkontrollierte Pexophagie zurückzuführenist 6. Bemerkenswert ist, dass 65 % aller Patienten mit Peroxisom-Biogenese-Störung (PBD) einen Mangel im peroxisomalen AAA-ATPase-Komplex aufweisen, der in Säugetierzellen aus PEX1, PEX6 und PEX26 besteht7.
Es gibt eine Reihe von Methoden, um die Pexophagie zu initiieren und zu untersuchen. In Hefe wird die Pexophagie ausgelöst, wenn die zugeführten Nährstoffe von peroxisomabhängigen Kohlenstoffquellen auf peroxisomunabhängige Kohlenstoffquellen umgestellt werden (um die zelluläre Peroxisomzahl zu senken)8. Zum Beispiel induziert der Transfer von Methanol-gezüchteten Pichia pastoris-Zellen von Methanolmedium auf Glukosemedium und Ethanolmedium Mikropexophagie bzw. Makropexophagie 8,9,10. Mikropexophagie sequestrierte gruppierte Peroxisomen für den Abbau, indem sie die Vakuole umbauten, um becherartige vakuoläre Sequestrierungsmembranen und eine deckelartige Struktur zu bilden, die als Mikropexophagie-spezifischer Membranapparat (MIPA) bezeichnet wird. Bei der Makropexophagie werden einzelne Peroxisomen von Doppelmembranstrukturen, den sogenannten Pexophagosomen, umhüllt, gefolgt von einer Fusion mit der Vakuole zum Abbau 8,9,10. Die Phosphorylierung von Pexophagierezeptoren, wie Atg36p in Saccharomyces cerevisiae und Atg30p in Pichia pastoris, ist entscheidend für die Rezeptoren, um die zentrale Autophagie-Maschinerie zu rekrutieren und das peroxisomale Targeting auf Autophagosomen zu erleichtern 8,11.
In Säugetierzellen kann Pexophagie durch Ubiquitinierung induziert werden. Die Markierung der peroxisomalen Membranproteine PMP34 oder PEX3 mit Ubiquitin auf der zytosolischen Seite induziert eine Pexophagie12. Die Überexpression von PEX3 induziert Peroxisom-Ubiquitinierung und Peroxisom-Eliminierung durch Lysosomen13. Darüber hinaus beeinträchtigt die Fusion von PEX5 mit einem C-terminalen EGFP den Export von monoubiquitiniertem PEX5 und führt zu einer Pexophagie14. Andererseits kann die Pexophagie auch durch eineH2O2-Behandlungausgelöst werden. Peroxisomen produzieren reaktive Sauerstoffspezies (ROS); Insbesondere das peroxisomale Enzym Acox1, das den ersten Schritt der Beta-Oxidation von sehr langkettigen Fettsäuren (> 22-Kohlenstoff) katalysiert, produziert nicht nur Acetyl-CoA, sondern auch peroxisomales ROS. Als Reaktion auf die erhöhten ROS-Werte unter H2O2-Behandlungaktivieren Säugetierzellen die Pexophagie, um die ROS-Produktion zu senken und Stress abzubauen. Es wurde berichtet, dass die Behandlung mit H 2 O2die Rekrutierung von Ataxie-Teleangiektasie-mutierten (ATM) zu Peroxisomen vorantreibt. ATM phosphoryliert dann PEX5, um den peroxisomalen Umsatz durch Pexophagie zu fördern15.
Da Peroxisomen ROS-erzeugende Zentren sind, sind sie auch anfällig für ROS-Schäden. ROS-induzierte peroxisomale Verletzungen zwingen die Zellen, die Pexophagie zu aktivieren, um Peroxisom-Qualitätskontrollwege zu initiieren (Entfernung des beschädigten Peroxisoms durch Autophagie). In dieser Arbeit skizzieren wir einen Ansatz für die On-Demand-Auslösung von ROS-induzierten peroxisomalen Verletzungen. Das Protokoll macht sich die lichtaktivierte ROS-Produktion in den Organellen 16,17,18,19,20 zunutze (Abbildung 1). Farbstoffmarkierte Peroxisomen werden beleuchtet, was zu einer ROS-Produktion im peroxisomalen Lumen führt, die spezifisch eine peroxisomale Schädigung auslöst. Mit Hilfe dieses Protokolls konnte gezeigt werden, dass ROS-gestresste Peroxisomen über einen Ubiquitin-abhängigen Abbauweg entfernt werden. ROS-gestresste Peroxisomen rekrutieren die Ubiquitin-E3-Ligase Stub1, damit sie in Autophagosomen einfließen können, um sie durch Pexophagie einzeln entfernenzu können 16. Man kann dieses Protokoll verwenden, um das Schicksal von verletzten und gesunden Peroxisomen innerhalb derselben Zelle durch Zeitraffermikroskopie zu vergleichen. Die Methode kann auch verwendet werden, um alle Peroxisomen (in allen Zellen) auf einer Kulturschale global zu schädigen, was die biochemische Analyse des Pexophagie-Signalwegs ermöglicht.
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Protocol
1. Präparation von Zellen, die diKillerRed oder selbstmarkierende Proteine (SLPs) im Peroxisomlumen exprimieren
- Säen Sie die gewünschten Zellen auf Zellkulturschalen mit Glasboden. Für das hier durchgeführte Experiment werden 2 x 105 humane SHSY5Y-Zellen in 840 μl Nährmedium (DMEM/F-12 ergänzt mit 10 % fötalem Kälberserum und 1 % Penicillin/Streptomycin) oder 6 x 104 NIH3T3-Mäusezellen in 840 μl Nährmedium (DMEM ergänzt mit 10 % Kälberserum und 1 % Penicillin/Streptomycin) auf einer 35-mm-Kulturschale mit einem Glasmikroloch mit 20 mm Durchmesser aussaatgut.
Anmerkungen: Die Anzahl der ausgesäten Zellen sollte proportional zur Glasmikrotiterfläche angepasst werden, wenn Glasbodenschalen mit anderen Spezifikationen verwendet werden. - Züchten Sie die Zellen 24 h lang unter 5% CO2/37 °C.
- Transfizieren Sie die Zellen mit den gewünschten Plasmiden unter Verwendung eines Transfektionsreagenzes.
- Verwenden Sie PMP34-TagBFP, um die Peroxisomen in lebenden Zellen zu markieren. Verwenden Sie entweder peroxisom-gerichtete diKillerRed-VKSKL oder SLP-VKSKL (+ farbstoffmarkierte SLP-Liganden) für die ROS-Erzeugung im Peroxisomlumen (durch lichtaktivierte ROS-Produktion). In diesem Protokoll verwenden wir das selbstmarkierende Protein HaloTag-VKSKL21. Um die Translokation von Stub1/Hsp70, die Akkumulation von ubiquitinierten Proteinen und die Bildung von Autophagosomen auf ROS-gestressten Peroxisomen zu überwachen, transfizieren Sie EGFP-Stub1, EGFP-Hsp70, EGFP-Ub bzw. EGFP-LC3B. Um die ROS-Erzeugung im peroxisomalen Lumen zu überprüfen, wird diKillerRed-VKSKL mit der Peroxisom-lokalisierten Fluoreszenz-Redox-Sonde roGFP2-VKSKL22 co-transfekiert.
- Für die SHSY5Y-Zelltransfektion werden die Plasmide in 55 μl serumfreiem DMEM/F-12 verdünnt und 1 μl Transfektionsreagenz in 55 μl serumfreiem DMEM/F12 verdünnt. Kombinieren Sie die verdünnte DNA mit dem verdünnten Reagenz. Vorsichtig mischen und 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.
- Geben Sie den Komplex in das 20-mm-Mikroloch, das zuvor mit 100 μl Nährmedium für SHSY5Y ohne Antibiotika (DMEM/F-12 mit 10% fötalem Kälberserum) plattiert wurde. Schütteln Sie die Schüssel vorsichtig hin und her.
- Für die NIH3T3-Zelltransfektion wird das serumfreie DMEM/F-12 durch reduziertes Serummedium ersetzt, um die Plasmide und das Transfektionsreagenz zu verdünnen. Ersetzen Sie das Beschichtungsnährmedium durch SHSY5Y durch Nährmedium für NIH3T3-Zellen ohne Antibiotika (DMEM mit 10% Kälberserum).
- Entfernen Sie nach 2 Stunden Transfektion das transfektionsreagenzhaltige Medium und fügen Sie 1 ml frisches Nährmedium hinzu. Inkubieren Sie die NIH3T3- oder SHSY5Y-Zellen bei 37 °C und 5 % CO2 für 24 h.
HINWEIS: Zur Untersuchung der Stub1-vermittelten Pexophagie können auch andere Zelllinien verwendet werden (z. B. HeLa-Zellen).
2. Färbung von Peroxisomen mit farbstoffmarkierten SLP-Liganden (für lichtaktivierte ROS-Produktion)
- Entfernen Sie 24 Stunden nach der Transfektion das Nährmedium und geben Sie 100 μl 200 nM HaloTag TMR-Ligand oder 200 nM Janelia Fluor 646 HaloTag-Ligand auf die 20-mm-Glasmikrovertiefung.
HINWEIS: Die farbstoffmarkierten SLP-Liganden sollten mit dem jeweiligen Kulturmedium für jede Zelllinie verdünnt werden. Wenn Sie sich für Janelia Fluor 646-markierte Liganden entscheiden, werden die blauen, grünen und roten Kanäle für die nachgeschaltete Fluoreszenzbildgebung frei. - Übertragen Sie die Schüssel in einen Inkubator mit 37 °C und 5 % CO2 . 1 Stunde färben. Entfernen Sie nach 1 Stunde das Färbemedium gründlich und fügen Sie 1 ml frisches Nährmedium hinzu.
3. ROS-Beanspruchung von Peroxisomen an einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop
- Stellen Sie eine Schale mit Glasboden und den gewünschten Zellen auf ein konfokales Laser-Scanning-Mikroskop, das mit einem Tischinkubator ausgestattet ist.
- Klicken Sie auf Werkzeugfenster, wählen Sie Okular und klicken Sie auf die DIA-Schaltfläche (Abbildung 2A), um das Durchlicht einzuschalten. Betrachten Sie die Schüssel durch das Mikroskopokular und bringen Sie die Zellen durch Drehen des Fokusknopfes in den Fokus.
- Wählen Sie LSM und klicken Sie auf die Schaltfläche Dye &; Detector Select (Abbildung 2B). Doppelklicken Sie im Pop-up-Fenster auf die gewünschten Farbstoffe, um die entsprechenden Laser- und Filtereinstellungen für die Abbildung der Zellen auszuwählen (Abbildung 2C). Klicken Sie im Live-Bedienfeld auf Livex4, um ein schnelles Laserscanning zu starten und das Screening nach den Fluoreszenzsignalen der Zellen zu starten (Abbildung 2D).
- Bewegen Sie den Tisch mit dem Joystick-Controller und lokalisieren Sie die medialen diKillerRed-VKSKL- oder SLP-VKSKL-exprimierenden Zellen, um ROS-Stress (auf die Peroxisomen) auszuüben. Erfassen Sie ein Bild der gewünschten Zelle.
- Klicken Sie auf Werkzeugfenster und wählen Sie LSM-Stimulation (Abbildung 2E). Klicken Sie auf die Schaltfläche Ellipse und zeichnen Sie im Livebildfenster mit der Maus einen kreisförmigen ROI von 15 μm Durchmesser (Abbildung 2F), der die gewünschten Peroxisomen enthält, die in Schritt 3.4 erfasst wurden und auf die ROS-Spannung angewendet wird (siehe Abbildung 3 für ein Beispiel).
- Um ROS-Stress auszuüben, verwenden Sie 561 nm für Zellen mit dem diKillerRed-PTS1- oder TMR-markierten SLP-Liganden und 640 nm für Zellen, die mit dem Janelia Fluor 646-markierten SLP-Liganden gefärbt sind.
- Wählen Sie die Laserwellenlänge für die Aufbringung der ROS-Spannung. Geben Sie den gewünschten Laserprozentsatz und die Dauer ein (Abbildung 2G).
- Klicken Sie auf " Erfassen" und dann auf die Schaltfläche " Stimulation" (Abbildung 2H), um den Scanvorgang mit 561/640 nm Licht durch die ROIs für jeweils 30 s zu starten. Dies entspricht einer Einstellung von ~5% Laserleistung sowohl für 561 nm als auch für 640 nm am hier verwendeten konfokalen Mikroskop. Dieser Vorgang wird zur ROS-Produktion in den Peroxisomen führen.
HINWEIS: Man kann ROIs unterschiedlicher Größe auswählen. Man sollte die Beleuchtungszeit für jeden ROI proportional entsprechend seiner Fläche anpassen. - Nach 30 s Laserbeleuchtung haben Peroxisomen innerhalb der ROIs ihre diKillerRed-PTS1/TMR/Janelia Fluor 646 Signale verloren. Dieser Signalverlust ermöglicht es, die beleuchteten von den nicht beleuchteten Peroxisomen (beschädigt vs. gesund) innerhalb einer Zelle zu unterscheiden.
4. Überwachung der Pexophagie in lebenden Zellen durch Zeitraffer-Bildgebung
- Verfolgen Sie die Translokation von EGFP-markierten Stub1, Hsp70, Ub, p62 oder LC3B auf die beleuchteten/ROS-gestressten Peroxisomen durch Zeitrafferaufnahmen in 10-Minuten-Intervallen zwischen den Bildern (Beispiele siehe Abbildungen 3-7).
HINWEIS: EGFP-Stub1- oder EGFP-Hsp70-Signale beginnen 10-20 Minuten nach der Beleuchtung zu erscheinen und bleiben auf allen beschädigten Peroxisomen bis ~40 Minuten nach der Beleuchtung. Die EGFP-Ub-Signale erscheinen 30 Minuten nach der Beleuchtung und dauern 2-3 h an. Die EGFP-p62-Translokation erscheint 60 Minuten nach der Belichtung, und die EGFP-LC3B-Signale werden ~3 h nach der Beleuchtung sichtbar. - Quantifizieren Sie die EGFP-Signale auf den beschädigten Peroxisomen (von Stub1, Ub, p62 oder LC3B) mit ImageJ. Führen Sie die folgenden Schritte aus, um ImageJ zur Quantifizierung eines Dreikanalbildes (PMP34-TagBFP/EGFP-LC3B/HaloTag-VKSKL) zu quantifizieren.
- Öffnen Sie das Bild und wenden Sie elliptische Auswahlen oder Freihandauswahlen an, um den Bereich einzuschließen, der alle beleuchteten Peroxisomen enthält (PMP34-TagBFP-Signal positiv und HaloTag-Ligandensignal gebleicht; Abbildung 8A).
- Klicken Sie auf Duplizieren , um den PMP34-TagBFP-Kanal auszuwählen (Abbildung 8A). Legen Sie einen Schwellenwert über das Dropdown-Menü Bild > Passen Sie > Schwellenwert an , um die Peroxisomen zu markieren (Abbildung 8B).
- Wählen Sie " Analysieren" > "Partikel analysieren ", um die genauen Bereiche der beleuchteten Peroxisomen zu bestimmen. ImageJ zeichnet diese Regions of Interest (ROIs) im ROI-Manager auf (Abbildung 8C).
- Klicken Sie auf Duplizieren , um den EGFP-Kanal für die Analyse des Fluoreszenzsignals von EGFP-konjugiertem Ub, p62 oder LC3B auszuwählen (Abbildung 8D). Wählen Sie alle ROIs im ROI-Manager aus (Abbildung 8E).
- Wenden Sie Measure im ROI-Manager an, um die EGFP-Signale auf den Peroxisomen zu messen (Abbildung 8E). Ermitteln Sie den Wert der Fläche und der integrierten Dichte (die Summe aller Pixelintensitäten) für jede ROI in der Ergebnistabelle (Abbildung 8E).
- Um die durchschnittlichen EGFP-Fluoreszenzintensitäten zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Beleuchtung zu erhalten, dividieren Sie die integrierte EGFP-Intensität durch die Gesamtfläche der beleuchteten Peroxisomen (PMP34-TagBFP-Signal-positive und HaloTag-Liganden-Signal-negative Bereiche). Um das akkumulierte Signal auf den Peroxisomen zu erhalten, subtrahieren Sie die gemittelte Intensität zu einem bestimmten Zeitpunkt von der gemittelten Intensität zum Zeitpunkt = 0 und normalisieren Sie dann um die gemittelte Intensität zum Zeitpunkt = 0.
5. Globale Schädigung aller Peroxisomen (in jeder Zelle) auf einer Kulturschale
- Führen Sie Schritt 1 (Präparation von Zellen, die Peroxisom-gerichtetes diKillerRed [diKillerRed-VKSKL] oder SLP [SLP-VKSKL]) exprimieren) und Schritt 2 (Färbung von Peroxisomen mit dem SLP-Liganden [für lichtaktivierte ROS-Produktion]) durch.
- Entfernen Sie nach 1 Stunde TMR-markierter Ligandenfärbung das Färbemedium und fügen Sie 1 ml Nährmedium hinzu, das 30 mM 3-AT (3-Amino-1,2,4-triazol; ein Katalasehemmer) enthält.
HINWEIS: Katalase ist ein ROS-Fänger, der im Peroxisom-Lumen exprimiert wird, so dass die 3-AT-Behandlung dazu beiträgt, die durch Licht hervorgerufenen oxidativen Schäden an den Peroxisomen zu verstärken. - Stellen Sie die Kulturschale über eine LED (555-570 nm). Beleuchten Sie alle Zellen mit einer Leistungsdichte von 1,8 W/cm2 für 9 h in einem Inkubator.
Anmerkungen: Um diesen Schritt außerhalb eines Inkubators durchzuführen, stellen Sie die Kulturschale auf eine Heizplatte bei 37 °C. Geben Sie 20 mM HEPES in das 3-AT-haltige Medium und decken Sie die Kulturschale mit einer transparenten Folie ab, um den Gasaustausch zu minimieren. HEPES ist ein Puffermittel, das den physiologischen pH-Wert in Zellkulturen außerhalb eines CO2 -Inkubators während der LED-Beleuchtung aufrechterhält. - Validieren Sie den Erfolg der LED-induzierten Schädigung, indem Sie die EGFP-Ub-, EGFP-p62- oder EGFP-LC3B-Signale auf den Peroxisomen abbilden. Unter Verwendung der oben beschriebenen Beleuchtungsbedingung zeigten 82% der SHSY5Y-Zellen, die HaloTag-VKSKL stabil exprimierten, eine Stub1-vermittelte Pexophagie.
- Ernten Sie die Zellen für die nachgelagerte biochemische Analyse.
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Representative Results
Das hier gezeigte Stub1-vermittelte Pexophagie-Induktionsschema nutzt die Vorteile der farbstoffgestützten ROS-Generierung innerhalb des Peroxisomlumens. Dieser Vorgang erfordert minimale Lichtintensitäten. Peroxisomen, die fluoreszierende Proteine oder Farbstoffe enthalten, können daher mit handelsüblichen konfokalen Laser-Scanning-Mikroskopen beleuchtet werden. Fokale Beleuchtung führt zu einer sofortigen und lokalisierten ROS-Produktion innerhalb einzelner Peroxisomen, wie der Fluoreszenzreporter roGFP2-VKSKL zeigt (Abbildung 9). Wir haben diKillerRed-VKSKL in den roGFP2-VKSKL-Messungen nicht abgebildet, um eine zusätzliche ROS-Erzeugung während der Bildgebung zu vermeiden. Das Bild von diKillerRed-VKSKL unten rechts in Abbildung 9 wurde aufgenommen, nachdem alle roGFP2-VKSKL-Messungen durchgeführt wurden, um deutlich zu zeigen, wo sich die beschädigten Peroxisomenbefanden 13. Die Daten zeigen auch, dass unbeleuchtete Peroxisomen nicht betroffen sind, was auf die Präzision der Methodik hinweist. ROS führt zur Oxidation eines kleinen Teils der Peroxisom-residenten Moleküle, was zu einer Peroxisom-Dysfunktion führt. Diese akute Operation ermöglicht es, die verschiedenen Peroxisom-Qualitätskontrollwege robust zu untersuchen.
Wir konnten diese Methodik nutzen, um die Stub1-vermittelte Pexophagie zu überwachen. In der Stub1-vermittelten Pexophagie rekrutiert Hsp70 Stub1 auf ROS-gestresste Peroxisomen, um den Peroxisomumsatz durch Autophagie zu initiieren. Während dieses Prozesses erscheinen Hsp70, Stub1, ubiquitinierte Proteine, der Autophagieadapter p62 und LC3B sequentiell auf ROS-gestressten Peroxisomen, um die Pexophagie anzutreiben (Abbildung 3, Abbildung 4, Abbildung 5, Abbildung 6 , Abbildung 7)13. Durch Zeitrafferaufnahmen war es möglich, den Zeitpunkt und die Reihenfolge der Rekrutierung dieser kritischen Faktoren in der Pexophagie zu verfolgen. Durch die Verwendung der Methodik zur fokalen Schädigung von Peroxisomen konnten wir leicht zeigen, dass die Hsp70/Stub1-Maschinerie spezifisch auf beschädigte Peroxisomen (aber nicht auf funktionelle) abzielt. Abgesehen von der Auslösung der ROS-Produktion innerhalb einzelner Peroxisomen war es möglich, mit der gleichen Strategie alle Peroxisomen gleichzeitig auf einer Kulturschale zu schädigen, um die Stub1-vermittelte Pexophagie zu charakterisieren (Abbildung 10).
Abbildung 1: Schematische Darstellung der lichtaktivierten ROS-Produktion in Peroxisomen. (A) Schematische Darstellung der Auslösung der peroxisomalen ROS-Erzeugung durch Licht. Farbstoffe wie KillerRed-Tandemdimere oder fluoreszierende SLP-Liganden werden durch die Verwendung von Peroxisom-Targeting-Sequenzen (VKSKL) in Peroxisomen eingebracht. (B) Das 3-AT hemmt die Katalase und kann in Verbindung mit dem hier gezeigten Schema verwendet werden, um die ROS-Spiegel im peroxisomalen Lumen zu erhöhen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Verwendung eines konfokalen Mikroskops zur Aktivierung der ROS-Produktion in Peroxisomen. (A) Screenshot für Schritt 3.2 im Protokoll. (B-D) Screenshots für Schritt 3.3 im Protokoll. (E-F) Screenshots für Schritt 3.5 im Protokoll. (G) Screenshot für Schritt 3.7 im Protokoll. (H) Screenshot für Schritt 3.8 im Protokoll. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Translokation von EGFP-Stub1 auf ROS-gestressten Peroxisomen. SHSY5Y-Zellen wurden mit HaloTag-VKSKL, PMP34-TagBFP und EGFP-Stub1 transfiziert. Einen Tag nach der Transfektion wurden die Zellen mit dem HaloTag TMR-Liganden bei 37°C (200 nM, 1 h) gefärbt. Hier werden Daten aus einer der Zellen in diesem Beispiel angezeigt. (A) Der weiße kreisförmige Bereich in dieser Zelle wurde für eine Beleuchtung von 561 nm ausgewählt. (B) Die beleuchteten Peroxisomen im weißen Kreisbereich verloren sofort ihre TMR-Fluoreszenz. (C) EGFP-Stub1 transloziert auf die beleuchteten Peroxisomen bei t = 20 min. Einschübe oben links: vergrößerte Ansicht der weißen quadratischen Bereiche . Alle Maßstabsleisten: 5 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4: Rekrutierung von EGFP-Hsp70 durch ROS-gestresste Peroxisomen. Peroxisomen in den SHSY5Y-Zellen, die HaloTag-VKSKL, PMP34-TagBFP und EGFP-Hsp70 exprimieren, wurden mit 200 nM HaloTag TMR-Liganden für 1 h gefärbt. Hier werden Daten aus einer der Zellen in diesem Beispiel angezeigt. (A) Der weiße, kreisförmige Bereich in der Zelle wurde mit 561 nm beleuchtet. (B) Die beleuchteten Peroxisomen in diesem beleuchteten Bereich verloren aufgrund der Photobleichung sofort ihre TMR-Fluoreszenz. (C) EGFP-Hsp70 transloziert 20 min später auf die beleuchteten Peroxisomen. Einschübe unten rechts: vergrößerte Ansicht der weißen quadratischen Bereiche. Alle Maßstabsleisten: 5 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 5: Zeitraffer-Bildgebung der ubiquitinierten Proteinakkumulation auf ROS-gestressten Peroxisomen. (A) Nach 1 h HaloTag TMR-Ligandenfärbung wurden Peroxisomen innerhalb der weißen kreisförmigen Region in einer SHSY5Y-Zelle, die EGFP-Ub, PMP34-TagBFP und HaloTag-VKSKL exprimiert, mit 561 nm beleuchtet. (B) Die TMR-Fluoreszenz innerhalb der Region wurde nach der Beleuchtung gebleicht. EGFP-Ub akkumulierte sich später spezifisch auf den beleuchteten Peroxisomen (t = 40 min und 2 h nach der 561 nm Beleuchtung). Einschübe unten rechts: vergrößerte Ansicht der weißen quadratischen Bereiche in (C). Alle Maßstabsleisten: 5 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 6: Akkumulation des Autophagie-Adapters p62 auf ROS-gestressten Peroxisomen (A) Die weiße kreisförmige Region in einer SHSY5Y-Zelle, die EGFP-p62, PMP34-TagBFP und HaloTag-VKSKL exprimiert (gefärbt mit dem HaloTag TMR-Liganden; 200 nM, 1 h) wurde mit 561 nm Licht beleuchtet. (B) Die Beleuchtung verursachte den sofortigen Verlust der TMR-Signale auf den anvisierten Peroxisomen. (C) 2,5 h nach der Beleuchtung rekrutierten die Peroxisomen EGFP-p62. Einschübe oben rechts: vergrößerte Ansichten der weißen quadratischen Bereiche in (C). Alle Maßstabsleisten: 5 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 7: Translokation von EGFP-LC3B auf ROS-gestresste Peroxisomen (A) Nach der HaloTag TMR-Ligandenfärbung (200 nM, 1 h) wurde eine SHSY5Y-Zelle, die EGFP-LC3B, PMP34-TagBFP und HaloTag-VKSKL exprimierte, mit 561 nm innerhalb des weißen Kreisbereichs beleuchtet. (B) Nach der Beleuchtung wurde das TMR-Signal der Peroxisomen im weißen Kreisbereich gebleicht. (C) 3,5 h nach der Beleuchtung translozierte EGFP-LC3B auf die ROS-gestressten Peroxisomen. Einschübe oben rechts: vergrößerte Ansichten der weißen quadratischen Bereiche in (C). Alle Maßstabsleisten: 5 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 8: Quantifizierung der Fluoreszenzsignale auf beschädigten Peroxisomen mit ImageJ . (A) Screenshot für Schritt 4.2.1 und Schritt 4.2.2 im Protokoll. (B) Screenshot für Schritt 4.2.2 im Protokoll. (C) Screenshot für die Schritte 4.2.3 im Protokoll. (D) Screenshot für Schritt 4.2.4 im Protokoll. (E) Screenshot für Schritt 4.2.4 und Schritt 4.2.5 im Protokoll. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 9: Lichtaktivierte ROS-Produktion in einzelnen Peroxisomen. Die Peroxisom-lokalisierte Redoxsonde roGFP2-VKSKL wurde verwendet, um die lichtaktivierte ROS-Produktion innerhalb der Zielperoxisomen zu validieren. Die Peroxisomen in der weißen kreisförmigen Region einer NIH3T3-Zelle, die diKillerRed-VKSKL und roGFP2-VKSKL exprimieren, wurden mit 561 nm Licht beleuchtet, und diese sind (A) vor der 561 nm Lichtbeleuchtung und (B) nach der 561 nm Lichtbeleuchtung dargestellt. Links: roGFP2-VKSKL-Emission mit 405 nm Anregung (magenta); Mitte: roGFP2-VKSKL-Emission mit 488 nm Anregung (grün). Das Verhältnis des von 405 nm (magenta) angeregten roGFP2-VKSKL-Emissionssignals zu dem von 488 nm (grün) angeregten Emissionssignals verfolgt die ROS-Konzentrationen innerhalb der Peroxisomen. Der weiße Kreisbereich in (B) zeigt den unmittelbaren Verlust der diKillerRed-VKSKL-Emission nach 561 nm Beleuchtung. Alle Maßstabsleisten: 5 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 10: Globale Schädigung aller Peroxisomen auf einer Kulturschale. SHSY5Y-Zellen, die HaloTag-VKSKL, EGFP-Ub und PMP34-TagBFP exprimieren, wurden 1 h lang mit dem HaloTag TMR-Liganden gefärbt. (A) Vor der LED-Beleuchtung war die EGFP-Ub-Fluoreszenz im Zytoplasma homogen und kolokalisierte nicht mit den Peroxisomen (markiert durch den HaloTag TMR-Liganden und PMP34-TagBFP). (B) Nach 9 h LED-Beleuchtung akkumulierte das EGFP-Ub-Signal auf allen Peroxisomen in den Zellen, die in einer konfokalen Schale gezüchtet wurden, wie in den beiden Tafeln in (B) angegeben. Alle Maßstabsleisten: 5 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
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Discussion
Dieses Protokoll beschreibt, wie Stub1-vermittelte Pexophagie in Zellkulturen ausgelöst werden kann, indem der peroxisomale ROS-Spiegel mit Licht erhöht wird. Da das Protokoll auf farbstoffgestützter ROS-Generierung beruht, muss eine ausreichende Expression von diKillerRed-VKSKL oder farbstoffmarkierten SLP-Liganden in den interessierenden Zellen sichergestellt werden. Angesichts der Tatsache, dass verschiedene Zelltypen oder Zellen mit unterschiedlichem genetischen Hintergrund Peroxisomen mit leicht unterschiedlichen Eigenschaften beherbergen können, muss man möglicherweise die genauen Beleuchtungsbedingungen einstellen, um die Induktion der Pexophagie zu gewährleisten. Ein robustes Maß für das Screening auf die Aktivierung der Stub1-vermittelten Pexophagie ist die Überwachung, ob EGFP-Ub auf die beleuchteten Peroxisomen transloziert (1 h nach der Beleuchtung)13. In gesunden Zellen sind EGFP-Ub-Signale in der Regel gleichmäßig im Zytoplasma verteilt. Seine Translokation auf beleuchtete Peroxisomen ist daher leicht zu beobachten. Um den Beleuchtungszustand zu optimieren, kann die Lichtintensität oder die Beleuchtungszeit verändert werden. Es ist auch am besten, die Überbelichtung von Farbstoffen zu vermeiden, wenn Sie versuchen, die Peroxisomen zu beschädigen, da einige photochemische Prozesse durchlaufen können, die die nachgeschaltete Bildgebung beeinträchtigen können. So konnte beispielsweise gezeigt werden, dass die Überleuchtung von KillerRed dazu führen kann, dass es schwach grün fluoreszierend wird. Eine Überbeleuchtung erzeugt schwache grüne Signale auf den beleuchteten Peroxisomen unmittelbar nach der Beleuchtung23 (im Gegensatz zur Translokation von EGFP-basierten Reportern, die Dutzende von Minuten bis Stunden dauern kann).
Die Methodik ermöglicht es den Forschern, Standard-Laser-Scanning-Konfokalmikroskope zu verwenden, um einen Teil der Peroxisomen innerhalb einer Zelle zu beeinträchtigen, was einen direkten Vergleich des Schicksalsunterschieds zwischen gesunden und beschädigten Peroxisomen ermöglicht. Im Vergleich zu den bisherigen Methoden bewirkt das Protokoll hier ROS-Stress nur auf einen kleinen Teil der Peroxisomen und nicht auf alle Peroxisomen oder andere Organellen in den Zellen. Es ist also möglich, die Wirkung der verbleibenden gesunden Peroxisomen auf die Pexophagie der ROS-gestressten Peroxisomen in derselben Zelle zu untersuchen.
Durch die Beleuchtung einer ganzen Schale ist es auch möglich, alle Peroxisomen innerhalb einer Zellkultur anzusprechen, was die biochemische Analyse der Stub1-vermittelten Pexophagie ermöglicht. Wie Hsc70/Stub1 beschädigte Peroxisomen erkennt und welche peroxisomalen Substrate Stub1 ubiquitiniert, sind alles Fragen, die mit diesem Protokoll untersucht werden können. Allgemeiner kann das Peroxisom-Beeinträchtigungsprotokoll auch verwendet werden, um nach anderen Peroxisom-Qualitätskontrollwegen zu suchen. Angesichts der Tatsache, dass Peroxisomen eng mit vielen verschiedenen zellulären Organellen innerhalb der Zelle verbunden sind, einschließlich des endoplasmatischen Retikulums, der Mitochondrien und der Lipidtröpfchen, wäre es auch interessant zu untersuchen, wie Zellen das Verhalten aller zellulären Strukturen als Reaktion auf Peroxisom-Beeinträchtigung systematisch modulieren.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass keine konkurrierenden finanziellen Interessen bestehen.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde zum Teil durch ein Forschungsstipendium MOST 111-2311-B-001-019-MY3 des National Science and Technology Council in Taiwan unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 35 mm culture dish with a 20 mm diameter glass microwell | MatTek | P35G-1.5-20-C | 20 mm glass bottomed |
| 3-amino-1,2,4-triazole (3-AT) | Sigma Aldrich | A8056 | |
| bovine serum | ThermoFisher Scientific | 16170060 | |
| Cell culture incubator | Nuaire | NU-4750 | |
| diKillerRed-PTS1 | Academia Sinica | made by appending the KillerRed tandem dimer with PTS1(VKSKL) | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | ThermoFisher Scientific | 11965092 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F-12) | ThermoFisher Scientific | 11330032 | |
| EGFP-C1 | Clontech | pEGFP-C1 | The backbone of EGFP-C1 was used for cloning EGFP-Stub1, EGFP-Hsp70, EGFP-p62 |
| EGFP-Hsp70 | Academia Sinica | Hsp70 gene (HSPA1A) PCR amplified from HeLa cDNA and cloned into EGFP-C1 | |
| EGFP-LC3B | Addgene | 11546 | |
| EGFP-p62 | Academia Sinica | generated by inserting the human SQSTM1 gene (through PCR amplification of the HeLa cell cDNA) into EGFP-C1 | |
| EGFP-Stub1 | Academia Sinica | generated by inserting the mouse Stub1 gene (through PCR amplification of the total mouse kidney cDNA) into EGFP-C1 | |
| EGFP-Ub | Addgene | 11928 | |
| fetal bovine serum | ThermoFisher Scientific | 10437028 | |
| HaloTag TMR ligand | Promega | G8252 | |
| HaloTag-PTS1 | Academia Sinica | PTS1 appended and cloned into EGFP-C1 backbone | |
| HEPES | ThermoFisher Scientific | 15630080 | |
| Inverted Confocal Microscope | Olympus | FV3000RS | 405 nm Ex, 488 nm Ex, 561 nm Ex, microscope with a TOKAI HIT chamber incubator and the UNIV2-D35 dish attachment |
| Janelia Fluor 646 HaloTag Ligand | Promega | GA1120 | |
| LED | VitaStar | PAR64 | 80 W, 555-570 nm |
| lipofectamine 2000 | ThermoFisher Scientific | 11668 | transfection reagent |
| NIH3T3 cell | ATCC | CRL-1658 | adherent |
| Opti-MEM | ThermoFisher Scientific | 319850 | reduced serum media |
| penicillin/streptomycin | ThermoFisher Scientific | 15140 | |
| PMP34-TagBFP | Academia Sinica | PMP34 PCR amplified from HeLa cDNA and cloned intoTagBFP-C (Evrogen FP171) | |
| roGFP2-PTS1 | Academia Sinica | generated by appending eroGFP (taken from Addgene plasmid 20131) with the amino acid sequence VKSKL, and cloned into the EGFP-C1 | |
| SHSY5Y cell | ATCC | CRL-2266 | adherent |
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