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Biology

स्टब 1-मध्यस्थता पेक्सोफैगी की निगरानी

Published: May 12, 2023 doi: 10.3791/65010
Automatic Translation
1, 1,2
1Institute of Biological Chemistry, Academia Sinica, 2Institute of Biochemical Sciences, College of Life Sciences, National Taiwan University

Summary

यह प्रोटोकॉल जीवित कोशिकाओं में स्टब 1-मध्यस्थता पेक्सोफैगी को ट्रिगर करने और निगरानी करने के लिए निर्देश प्रदान करता है।

Abstract

स्तनधारी कोशिकाएं स्टब 1-मध्यस्थता पेक्सोफैगी के माध्यम से पेरोक्सीसोम को बदल सकती हैं। मार्ग संभावित रूप से पेरोक्सीसोम की मात्रा और गुणवत्ता के सेलुलर नियंत्रण की अनुमति देता है। इस प्रक्रिया के दौरान, हीट शॉक प्रोटीन 70 और यूबिकिटिन ई 3 लिगेज, स्टब 1, पेक्सोफैगी शुरू करने के लिए पेरॉक्सिसोम पर स्थानांतरित हो जाते हैं। स्टब 1 लिगेज गतिविधि लक्षित पेरोक्सीसोम पर यूबिकिटिन और अन्य ऑटोफैगी से संबंधित मॉड्यूल के संचय की अनुमति देती है। पेरोक्सिसोमल लुमेन के भीतर प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओएस) के स्तर को बढ़ाने से स्टब 1-मध्यस्थता पेक्सोफैगी सक्रिय हो सकता है। इसलिए, इस मार्ग को ट्रिगर करने और निगरानी करने के लिए डाई-असिस्टेड आरओएस पीढ़ी का उपयोग किया जा सकता है। यह लेख स्तनधारी कोशिका संस्कृतियों के भीतर पेक्सोफैगी शुरू करने के लिए रंगों, फ्लोरोसेंट प्रोटीन और सिंथेटिक फ्लोरोफोरेस के दो वर्गों का उपयोग करने के लिए प्रक्रियाओं को रेखांकित करता है। इन डाई-असिस्टेड आरओएस जनरेशन-आधारित प्रोटोकॉल का उपयोग न केवल विश्व स्तर पर सेल आबादी के भीतर सभी पेरोक्सीसोम को लक्षित करने के लिए किया जा सकता है, बल्कि एकल कोशिकाओं के भीतर व्यक्तिगत पेरोक्सीसोम के हेरफेर की अनुमति भी दे सकता है। हम यह भी वर्णन करते हैं कि लाइव-सेल माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके स्टब 1-मध्यस्थता पेक्सोफैगी का पालन कैसे किया जा सकता है।

Introduction

पेरोक्सीसोम अधिकांश यूकेरियोटिक कोशिकाओं में मौजूद एकल-झिल्ली-बाध्य अंग हैं। पेरोक्सीसोम एक चयापचय कम्पार्टमेंट है जो बहुत लंबी श्रृंखला फैटी एसिड, प्यूरीन अपचय और ईथर फॉस्फोलिपिड और पित्त एसिड संश्लेषण 1 के बीटा-ऑक्सीकरण को पूरा करनेके लिए आवश्यक है। पेरोक्सीसोम-व्युत्पन्न एसिटाइल-सीओए चयापचय में केंद्रीय सिग्नलिंग को विनियमित करके लिपिड होमियोस्टेसिस को नियंत्रित करताहै। इसलिए, यह कोई आश्चर्य की बात नहीं है कि न्यूरोडीजेनेरेटिव विकारों, उम्र बढ़ने, कैंसर, मोटापा और मधुमेह 3,4,5 सहित विभिन्न बीमारियों में पेरोक्सीसोमल कार्यों से समझौता किया जाता है। पेरोक्सिसोमल ऑपरेशन के रखरखाव में एक आवश्यक प्रक्रिया पेक्सोफैगी है। ऑटोफैगी द्वारा पेरोक्सीसोम के चयनात्मक कारोबार के लिए पेक्सोफैगी एक कैटोबोलिक प्रक्रिया है। कोशिकाएं पेरोक्सीसोम की मात्रा और गुणवत्ता को नियंत्रित करने में मदद करने के लिए पेक्सोफैगी का उपयोग करती हैं, जिससे उचित पेरोक्सिसोमल फ़ंक्शन सुनिश्चित होता है। हाल के एक अध्ययन से पता चला है कि पीईएक्स 1 पेरोक्सिसोमल बायोजेनेसिस कारक 1 और 6 में उत्परिवर्तन के कारण होने वाली पेरोक्सीसोम हानि अनियंत्रित पेक्सोफैगी6 के परिणामस्वरूप होती है। विशेष रूप से, सभी पेरोक्सीसोम बायोजेनेसिस डिसऑर्डर (पीबीडी) रोगियों में से 65% स्तनधारी कोशिकाओं में पीईएक्स 1, पीईएक्स 6 और पीईएक्स 26 से बने पेरोक्सीसोमल एएए एटीपीस कॉम्प्लेक्स में कमियांरखते हैं।

पेक्सोफैगी शुरू करने और अध्ययन करने के लिए कई तरीकों का उपयोग किया जा सकता है। खमीर में, पेक्सोफैगी तब ट्रिगर होता है जब आपूर्ति किए गए पोषक तत्वों को पेरोक्सीसोम-निर्भर कार्बन स्रोतों से पेरोक्सीसोम-स्वतंत्र कार्बन स्रोतों (सेलुलर पेरोक्सीसोम संख्या को कम करने के लिए) में बदल दिया जाता है। उदाहरण के लिए, मेथनॉल माध्यम से ग्लूकोज माध्यम और इथेनॉल माध्यम में मेथनॉल-विकसित पिचिया पास्टरिस कोशिकाओं का हस्तांतरण क्रमशः माइक्रोपेक्सोफैगी और मैक्रोपेक्सोफैगी को प्रेरित करता है, क्रमशः 8,9,10। माइक्रोपेक्सोफैगी ने रिक्तिका को फिर से तैयार करके क्षरण के लिए पेरोक्सीसोम को अनुक्रमित किया ताकि कप जैसी वैक्यूलर अनुक्रमण झिल्ली और एक ढक्कन जैसी संरचना बनाई जा सके जिसे माइक्रोपेक्सोफैगी-विशिष्ट झिल्ली तंत्र (एमआईपीए) कहा जाता है। मैक्रोपेक्सोफैगी में, व्यक्तिगत पेरोक्सीसोम को डबल-झिल्ली संरचनाओं द्वारा घेर लिया जाता है जिसे पेक्सोफैगोसोम के रूप में जाना जाता है, इसके बाद क्षरण के लिए रिक्तिका के साथ संलयन 8,9,10 होता है। पेक्सोफैगी रिसेप्टर्स का फॉस्फोराइलेशन, जैसे कि सैक्रोमाइसेस सेरेविसिया में एटीजी 36 पी और पिचिया पास्टरिस में एटीजी 30 पी, रिसेप्टर्स के लिए कोर ऑटोफैगी मशीनरी की भर्ती करने और ऑटोफैगोसोम 8,11 को पेरोक्सिसोमल लक्ष्यीकरण की सुविधा के लिए महत्वपूर्ण है।

स्तनधारी कोशिकाओं में, पेक्सोफैगी को सर्वव्यापी द्वारा प्रेरित किया जा सकता है। साइटोसोलिक पक्ष पर यूबिकिटिन के साथ पेरोक्सिसोमल झिल्ली प्रोटीन पीएमपी 34 या पीईएक्स 3 को टैग करना पेक्सोफैगी12 को प्रेरित करता है। पीईएक्स 3 का ओवरएक्प्रेशन लाइसोसोम13 द्वारा पेरोक्सीसोम सर्वव्यापी और पेरोक्सीसोम उन्मूलन को प्रेरित करता है। इसके अलावा, सी-टर्मिनल ईजीएफपी के साथ पीईएक्स 5 का संलयन मोनोयूबिकिटिनेटेड पीईएक्स 5 के निर्यात को बाधित करता है और इसके परिणामस्वरूप पेक्सोफैगी14 होता है। दूसरी ओर, पेक्सोफैगी को एच2ओ2 उपचार द्वारा भी ट्रिगर किया जा सकता है। पेरोक्सीसोम प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओएस) का उत्पादन करते हैं; विशेष रूप से, पेरोक्सीसोमल एंजाइम Acox1, जो बहुत लंबी श्रृंखला फैटी एसिड (> 22 कार्बन) के बीटा-ऑक्सीकरण के प्रारंभिक चरण को उत्प्रेरित करता है, न केवल एसिटाइल-सीओए बल्कि पेरोक्सिसोमल आरओएस भी पैदा करता है। एच 2ओ 2 उपचार के तहत बढ़े हुए आरओएसस्तरोंके जवाब में, स्तनधारी कोशिकाएं आरओएस उत्पादन को कम करने और तनाव को कम करने के लिए पेक्सोफैगी को सक्रिय करती हैं। यह बताया गया है कि एच2ओ2 उपचार पेरोक्सीसोम के लिए गतिभंग-टेलेंजीक्टेसिया उत्परिवर्तित (एटीएम) की भर्ती को चलाता है। एटीएम तब पेक्सोफैगी15 द्वारा पेरोक्सिसोमल टर्नओवर को बढ़ावा देने के लिए पीईएक्स 5 को फॉस्फोराइलेट करता है।

चूंकि पेरोक्सीसोम आरओएस-जनरेटिंग केंद्र हैं, इसलिए वे आरओएस क्षति से भी ग्रस्त हैं। आरओएस-प्राप्त पेरोक्सिसोमल चोटें कोशिकाओं को पेरोक्सीसोम गुणवत्ता नियंत्रण मार्ग (ऑटोफैगी द्वारा क्षतिग्रस्त पेरोक्सीसोम को हटाने) शुरू करने के लिए पेक्सोफैगी को सक्रिय करने के लिए मजबूर करती हैं। यहां, हम आरओएस-प्राप्त पेरोक्सीसोमल चोट के ऑन-डिमांड ट्रिगरिंग के लिए एक दृष्टिकोण की रूपरेखा तैयार करते हैं। प्रोटोकॉल ऑर्गेनेल 16,17,18,19,20 (चित्रा 1) के भीतर प्रकाश-सक्रिय आरओएस उत्पादन का लाभ उठाता है। डाई-लेबल पेरोक्सीसोम को रोशन किया जाता है, जिससे पेरोक्सिसोमल लुमेन के भीतर आरओएस उत्पादन होता है, जो विशेष रूप से पेरोक्सिसोमल चोट को ट्रिगर करता है। इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके, यह दिखाया गया है कि आरओएस-तनावग्रस्त पेरोक्सीसोम को यूबिकिटिन-निर्भर गिरावट मार्ग के माध्यम से हटा दिया जाता है। आरओएस-तनावग्रस्त पेरोक्सीसोम यूबिकिटिन ई 3 लिगेज स्टब 1 की भर्ती करते हैं ताकि वे पेक्सोफैगी16 द्वारा व्यक्तिगत निष्कासन के लिए ऑटोफैगोसोम में फंस सकें। टाइम-लैप्स माइक्रोस्कोपी द्वारा एक ही सेल के भीतर घायल और स्वस्थ पेरोक्सीसोम के भाग्य की तुलना करने के लिए इस प्रोटोकॉल का उपयोग किया जा सकता है। विधि का उपयोग विश्व स्तर पर एक संस्कृति डिश पर सभी पेरोक्सीसोम (सभी कोशिकाओं में) को नुकसान पहुंचाने के लिए भी किया जा सकता है, जिससे पेक्सोफैगी मार्ग के जैव रासायनिक विश्लेषण की अनुमति मिलती है।

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Protocol

1. पेरोक्सीसोम लुमेन में डिकिलरेड या सेल्फ-लेबलिंग प्रोटीन (एसएलपी) व्यक्त करने वाली कोशिकाओं की तैयारी

  1. ग्लास-बॉटम सेल कल्चर व्यंजनों पर वांछित कोशिकाओं को बीज दें। यहां प्रयोग के लिए, कल्चर माध्यम के 840 μL (DMEM/F-12 के साथ पूरक) या 6 x 10 4 माउस NIH3T3 कोशिकाओं में840 μL कल्चर माध्यम (DMEM के साथ पूरक) में 2 x 10 5 मानव SHSY5Y कोशिकाएं 35 मिमी व्यास के ग्लास डिश पर 20 मिमी व्यास के ग्लास डिश पर 10% गोजातीय सीरम और 1% पेनिसिलिन /स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ पूरक हैं।
    नोट: अन्य विनिर्देशों के ग्लास बॉटम व्यंजनों का उपयोग करते समय बीजित कोशिकाओं की संख्या को ग्लास माइक्रोवेल क्षेत्र के अनुसार आनुपातिक रूप से समायोजित किया जाना चाहिए।
  2. 24 घंटे के लिए 5% सीओ 2/37 डिग्री सेल्सियस के तहत कोशिकाओं को बढ़ाएं।
  3. अभिकर्मक अभिकर्मक का उपयोग करके वांछित प्लास्मिड के साथ कोशिकाओं को स्थानांतरित करें।
    1. जीवित कोशिकाओं में पेरोक्सीसोम को लेबल करने के लिए पीएमपी 34-टैगबीएफपी का उपयोग करें। पेरोक्सीसोम लुमेन (प्रकाश-सक्रिय आरओएस उत्पादन के माध्यम से) में आरओएस पीढ़ी के लिए या तो पेरोक्सीसोम-टारगेटिंग डिकिलरेड-वीकेएसकेएल या एसएलपी-वीकेएसकेएल (+ डाई-लेबल एसएलपी लिगेंड) का उपयोग करें। इस प्रोटोकॉल में, हम स्व-लेबलिंग प्रोटीन हेलोटैग-वीकेएसकेएल21 का उपयोग करते हैं। स्टब 1 / एचएसपी 70 के स्थानांतरण की निगरानी के लिए, सर्वव्यापी प्रोटीन का संचय, और आरओएस-तनावग्रस्त पेरोक्सीसोम पर ऑटोफैगोसोम का गठन, क्रमशः ईजीएफपी-स्टब 1, ईजीएफपी-एचएसपी 70, ईजीएफपी-यूबी, या ईजीएफपी-एलसी 3 बी। पेरोक्सीसोमल लुमेन में आरओएस उत्पादन की जांच करने के लिए, पेरोक्सीसोम-स्थानीयकृत फ्लोरोसेंट रेडॉक्स जांच आरओजीएफपी 2-वीकेएसकेएल 22 के साथ सह-ट्रांसक्रिप्ट डिकिलररेड-वीकेएसकेएल।
    2. SHSY5Y सेल अभिकर्मक के लिए, सीरम-मुक्त DMEM/F-12 के 55 μL में प्लास्मिड को पतला करें, और सीरम-मुक्त DMEM/F12 के 55 μL में अभिकर्मक अभिकर्मक के 1 μL को पतला करें। पतला अभिकर्मक के साथ पतला डीएनए मिलाएं। धीरे से मिलाएं, और कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
    3. कॉम्प्लेक्स को 20 मिमी माइक्रोवेल में जोड़ें जिसे पहले एंटीबायोटिक दवाओं के बिना SHSY5Y के लिए 100 μL कल्चर माध्यम के साथ चढ़ाया गया था (10% भ्रूण गोजातीय सीरम के साथ DMEM / F-12)। धीरे से पकवान को आगे और पीछे हिलाएं।
    4. एनआईएच 3 टी 3 सेल अभिकर्मक के लिए, प्लास्मिड और अभिकर्मक अभिकर्मक को पतला करने के लिए सीरम-मुक्त डीएमईएम / एफ -12 के लिए सीरम माध्यम को कम करें। एंटीबायोटिक दवाओं के बिना एनआईएच 3 टी 3 कोशिकाओं के लिए संस्कृति माध्यम के साथ एसएचएसवाई 5 वाई के साथ प्लेटिंग कल्चर माध्यम को बदलें (डीएमईएम 10% गोजातीय सीरम के साथ)।
  4. अभिकर्मक के 2 घंटे के बाद, अभिकर्मक अभिकर्मक युक्त माध्यम को हटा दें, और 1 एमएल ताजा संस्कृति माध्यम जोड़ें। एनआईएच 3 टी 3 या एसएचएसवाई 5 वाई कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 पर 24 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
    नोट: अन्य सेल लाइनों का उपयोग स्टब 1-मध्यस्थता पेक्सोफैगी (जैसे, हेला कोशिकाओं) का अध्ययन करने के लिए भी किया जा सकता है।

2. डाई-लेबल एसएलपी लिगेंड के साथ धुंधला पेरोक्सीसोम (प्रकाश-सक्रिय आरओएस उत्पादन के लिए)

  1. 24 घंटे के पोस्ट-अभिकर्मक पर, कल्चर माध्यम को हटा दें, और 20 मिमी ग्लास माइक्रोवेल पर 200 एनएम हेलोटैग टीएमआर लिगैंड या 200 एनएम जेनेलिया फ्लोर 646 हेलोटैग लिगैंड के 100 μL जोड़ें।
    नोट: डाई-लेबल एसएलपी लिगेंड को प्रत्येक सेल लाइन के लिए संबंधित संस्कृति माध्यम के साथ पतला किया जाना चाहिए। जेनेलिया फ्लोर 646-लेबल लिगेंड चुनने से डाउनस्ट्रीम फ्लोरेसेंस इमेजिंग के लिए नीले, हरे और लाल चैनल मुक्त हो जाएंगे।
  2. डिश को 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2 इनक्यूबेटर में स्थानांतरित करें। 1 घंटे के लिए दाग। 1 घंटे के बाद, धुंधला माध्यम को अच्छी तरह से हटा दें, और 1 एमएल ताजा संस्कृति माध्यम जोड़ें।

3. लेजर-स्कैनिंग कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप पर पेरोक्सीसोम का आरओएस-तनाव

  1. स्टेज-टॉप इनक्यूबेटर से लैस लेजर-स्कैनिंग कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप पर वांछित कोशिकाओं से युक्त ग्लास-बॉटम डिश रखें।
  2. टूल विंडो पर क्लिक करें, ओकुलर चुनें, और प्रेषित प्रकाश को चालू करने के लिए डीआईए बटन (चित्रा 2 ए) पर क्लिक करें। माइक्रोस्कोप आईपीस के माध्यम से डिश देखें, और फोकस नॉब को मोड़कर कोशिकाओं को फोकस में लाएं।
  3. एलएसएम चुनें, और डाई एंड डिटेक्टर चयन बटन (चित्रा 2 बी) पर क्लिक करें। कोशिकाओं की इमेजिंग के लिए उपयुक्त लेजर और फ़िल्टर सेटिंग्स का चयन करने के लिए पॉप-अप विंडो में वांछित रंगों पर डबल-क्लिक करें (चित्रा 2 सी)। कोशिकाओं के प्रतिदीप्ति संकेतों के लिए स्क्रीनिंग शुरू करने के लिए तेजी से लेजर स्कैनिंग शुरू करने के लिए लाइव पैनल में लाइवएक्स 4 पर क्लिक करें (चित्रा 2 डी)।
  4. जॉयस्टिक नियंत्रक का उपयोग करके मंच को चारों ओर घुमाएं, और आरओएस तनाव (पेरोक्सीसोम पर) को लागू करने के लिए मध्यम डिकिलररेड-वीकेएससीएल- या एसएलपी-वीकेएसकेएल-व्यक्त करने वाली कोशिकाओं का पता लगाएं। वांछित सेल की एक छवि प्राप्त करें।
  5. टूल विंडो पर क्लिक करें, और LSM उत्तेजना (चित्रा 2E) चुनें। दीर्घवृत्त बटन पर क्लिक करें, और लाइव छवि विंडो में, माउस का उपयोग 15 μm व्यास (चित्रा 2F) का एक गोलाकार ROI खींचने के लिए करें जिसमें चरण 3.4 में प्राप्त वांछित पेरोक्सीसोम होते हैं जिस पर ROS तनाव लागू किया जाएगा (उदाहरण के लिए चित्रा 3 देखें)।
  6. आरओएस तनाव को लागू करने के लिए, डिकिलररेड-पीटीएस 1- या टीएमआर-लेबल एसएलपी लिगैंड के साथ कोशिकाओं के लिए 561 एनएम का उपयोग करें, और जेनेलिया फ्लोर 646-लेबल एसएलपी लिगैंड से सना कोशिकाओं के लिए 640 एनएम का उपयोग करें।
  7. आरओएस तनाव को लागू करने के लिए लेजर तरंग दैर्ध्य का चयन करें। वांछित लेजर प्रतिशत और अवधि दर्ज करें (चित्रा 2 जी)।
  8. अधिग्रहण पर क्लिक करें, और 30 सेकंड के लिए आरओआई के माध्यम से 561/640 एनएम प्रकाश के साथ स्कैनिंग शुरू करने के लिए उत्तेजना बटन (चित्रा 2 एच) पर क्लिक करें। यह यहां उपयोग किए जाने वाले कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप पर 561 एनएम और 640 एनएम दोनों के लिए ~ 5% लेजर पावर सेटिंग से मेल खाती है। इस ऑपरेशन से पेरोक्सीसोम में आरओएस उत्पादन होगा।
    नोट: कोई विभिन्न आकारों के ROIs का चयन कर सकता है। किसी को अपने क्षेत्र के अनुसार प्रत्येक आरओआई के लिए रोशनी के समय को आनुपातिक रूप से समायोजित करना चाहिए।
  9. लेजर रोशनी के 30 सेकंड के बाद, आरओआई के भीतर पेरोक्सीसोम ने अपने डिकिलररेड-पीटीएस 1 / टीएमआर / जेनेलिया फ्लोर 646 संकेतों को खो दिया होगा। यह सिग्नल लॉस एक सेल के भीतर गैर-रोशन पेरोक्सीसोम (क्षतिग्रस्त बनाम स्वस्थ) से रोशन को अलग करने की अनुमति देता है।

4. टाइम-लैप्स इमेजिंग द्वारा जीवित कोशिकाओं में पेक्सोफैगी की निगरानी

  1. फ्रेम के बीच 10 मिनट के अंतराल का उपयोग करके टाइम-लैप्स इमेजिंग द्वारा रोशन/आरओएस-स्ट्रेस्ड पेरोक्सीसोम पर ईजीएफपी-टैग किए गए स्टब 1, एचएसपी 70, यूबी, पी 62, या एलसी 3 बी के स्थानांतरण का पालन करें (उदाहरण के लिए, आंकड़े 3-7 देखें)।
    नोट: ईजीएफपी-स्टब 1 या ईजीएफपी-एचएसपी 70 सिग्नल रोशनी के बाद 10-20 मिनट दिखाई देने लगते हैं और रोशनी के बाद ~ 40 मिनट तक सभी क्षतिग्रस्त पेरोक्सीसोम पर रहते हैं। ईजीएफपी-यूबी सिग्नल रोशनी के बाद 30 मिनट दिखाई देते हैं और 2-3 घंटे तक चलते हैं। ईजीएफपी-पी 62 ट्रांसलोकेशन रोशनी के 60 मिनट बाद दिखाई देता है, और ईजीएफपी-एलसी 3 बी सिग्नल रोशनी के बाद ~ 3 घंटे दिखाई देते हैं।
  2. इमेजजे का उपयोग करके क्षतिग्रस्त पेरोक्सीसोम (स्टब 1, यूबी, पी 62, या एलसी 3 बी से) पर ईजीएफपी संकेतों की मात्रा निर्धारित करें। तीन-चैनल छवि (PMP34-TagBFP/EGFP-LC3B/HaloTag-VKSKL) की मात्रा निर्धारित करने के लिए ImageJ का उपयोग करने के लिए निम्न चरणों का पालन करें।
    1. छवि खोलें, और सभी रोशन पेरोक्सीसोम (पीएमपी 34-टैगबीएफपी सिग्नल पॉजिटिव और हेलोटैग लिगैंड सिग्नल ब्लीच्ड) वाले क्षेत्र को संलग्न करने के लिए अण्डाकार चयन या फ्रीहैंड चयन लागू करें; चित्र 8 ए)।
    2. पीएमपी 34-टैगबीएफपी चैनल (चित्रा 8 ए) चुनने के लिए डुप्लिकेट पर क्लिक करें। पेरोक्सीसोम (चित्रा 8 बी) को चिह्नित करने के लिए ड्रॉप-डाउन मेनू छवि > > दहलीज समायोजित करें का उपयोग करके एक सीमा सेट करें।
    3. प्रकाशित पेरोक्सीसोम के सटीक क्षेत्रों को निर्धारित करने के लिए कणों का विश्लेषण > विश्लेषण करें का चयन करें। ImageJ ROI प्रबंधक (चित्रा 8C) में रुचि के इन क्षेत्रों (ROIs) को रिकॉर्ड करता है।
    4. ईजीएफपी-संयुग्मित यूबी, पी 62, या एलसी 3 बी (चित्रा 8 डी) से प्रतिदीप्ति संकेत का विश्लेषण करने के लिए ईजीएफपी चैनल चुनने के लिए डुप्लिकेट पर क्लिक करें। ROI प्रबंधक (चित्रा 8E) में सभी ROIs का चयन करें।
    5. पेरोक्सीसोम पर ईजीएफपी संकेतों को मापने के लिए आरओआई प्रबंधक में उपाय लागू करें (चित्रा 8 ई)। परिणाम तालिका (चित्रा 8E) में प्रत्येक ROI के लिए क्षेत्र और एकीकृत घनत्व (सभी पिक्सेल तीव्रता का योग) का मान ज्ञात कीजिये।
    6. रोशनी के बाद अलग-अलग समय बिंदुओं पर औसत ईजीएफपी फ्लोरेसेंस तीव्रता प्राप्त करने के लिए, एकीकृत ईजीएफपी तीव्रता को रोशन पेरोक्सीसोम (पीएमपी 34-टैगबीएफपी सिग्नल पॉजिटिव और हेलोटैग लिगैंड सिग्नल नकारात्मक क्षेत्रों) के कुल क्षेत्र से विभाजित करें। पेरोक्सीसोम पर संचित संकेत प्राप्त करने के लिए, एक समय बिंदु पर औसत तीव्रता को समय = 0 पर औसत तीव्रता से घटाएं, और फिर समय = 0 पर औसत तीव्रता से सामान्य करें।

5. विश्व स्तर पर एक संस्कृति डिश पर सभी पेरोक्सीसोम (हर कोशिका में) को नुकसान पहुंचाता है

  1. चरण 1 (पेरोक्सीसोम-लक्षित डिकिलररेड [डिकिलररेड-वीकेएससीएल] या एसएलपी [एसएलपी-वीकेएसकेएल]) और चरण 2 (एसएलपी लिगैंड के साथ पेरोक्सीसोम को धुंधला करना [प्रकाश-सक्रिय आरओएस उत्पादन के लिए]) निष्पादित करें।
  2. टीएमआर-लेबल लिगैंड धुंधला होने के 1 घंटे के बाद, धुंधला माध्यम को हटा दें, और 30 एमएम 3-एटी (3-एमिनो-1,2,4-ट्रायज़ोल; एक कैटालेस अवरोधक) युक्त कल्चर माध्यम का 1 एमएल जोड़ें।
    नोट: कैटालेज पेरोक्सीसोम लुमेन में व्यक्त एक आरओएस स्कैवेंजर है, इसलिए 3-एटी उपचार पेरोक्सीसोम पर प्रकाश-प्राप्त ऑक्सीडेटिव क्षति को बढ़ाने में मदद करता है।
  3. एक एलईडी (555-570 एनएम) के ऊपर संस्कृति डिश रखें। इनक्यूबेटर में 9 घंटे के लिए 1.8 W/cm2 के शक्ति घनत्व के साथ सभी कोशिकाओं को रोशन करें।
    नोट: इनक्यूबेटर के बाहर इस चरण को करने के लिए, कल्चर डिश को 37 डिग्री सेल्सियस हीटिंग प्लेट पर रखें। 3-एटी युक्त माध्यम में 20 एमएम एचईपीईएस जोड़ें, और गैस विनिमय को कम करने के लिए कल्चर डिश को पारदर्शी फिल्म के साथ कवर करें। एचईपीईएस एक बफरिंग एजेंट है जो एलईडी रोशनी के दौरान सीओ2 इनक्यूबेटर के बाहर सेल कल्चर में शारीरिक पीएच बनाए रखता है।
  4. पेरोक्सीसोम पर ईजीएफपी-यूबी, ईजीएफपी-पी 62, या ईजीएफपी-एलसी 3 बी संकेतों की इमेजिंग करके एलईडी-प्राप्त क्षति की सफलता को मान्य करें। ऊपर उल्लिखित रोशनी की स्थिति का उपयोग करते हुए, 82% SHSY5Y कोशिकाओं ने हेलोटैग-वीकेएसकेएल को स्थिर रूप से व्यक्त किया, स्टब 1-मध्यस्थता पेक्सोफैगी प्रदर्शित किया।
  5. डाउनस्ट्रीम जैव रासायनिक विश्लेषण के लिए कोशिकाओं की कटाई करें।

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Representative Results

यहां दिखाई गई स्टब 1-मध्यस्थता पेक्सोफैगी प्रेरण योजना पेरोक्सिसोम लुमेन के भीतर डाई-असिस्टेड आरओएस पीढ़ी का लाभ उठाती है। इस ऑपरेशन के लिए न्यूनतम प्रकाश तीव्रता की आवश्यकता होती है। फ्लोरोसेंट प्रोटीन या रंजक युक्त पेरोक्सीसोम को मानक लेजर-स्कैनिंग कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करके रोशन किया जा सकता है। फोकल रोशनी व्यक्तिगत पेरोक्सीसोम के भीतर तात्कालिक और स्थानीयकृत आरओएस उत्पादन की ओर ले जाती है, जैसा कि फ्लोरोसेंट रिपोर्टर आरओजीएफपी 2-वीकेएसकेएल (चित्रा 9) द्वारा इंगित किया गया है। हमने इमेजिंग के दौरान अतिरिक्त आरओएस पीढ़ी से बचने के लिए आरओजीएफपी 2-वीकेएसकेएल माप में डिकिलररेड-वीकेएसकेएल की छवि नहीं बनाई। चित्रा 9 में निचले दाएं डिकिलररेड-वीकेएसकेएल छवि को सभी आरओजीएफपी 2-वीकेएसकेएल मापों के बाद स्पष्ट रूप से इंगित करने के लिए लिया गया था कि क्षतिग्रस्त पेरोक्सीसोम13 कहां थे। डेटा यह भी दिखाता है कि अप्रयुक्त पेरोक्सीसोम प्रभावित नहीं होते हैं, जो कार्यप्रणाली की सटीकता को दर्शाता है। आरओएस पेरोक्सीसोम निवासी अणुओं के एक छोटे से अंश के ऑक्सीकरण की ओर जाता है, जिससे पेरोक्सीसोम डिसफंक्शन होता है। यह तीव्र ऑपरेशन विभिन्न पेरोक्सीसोम गुणवत्ता नियंत्रण मार्गों को मजबूती से जांचने की अनुमति देता है।

हम स्टब 1-मध्यस्थता पेक्सोफैगी की निगरानी के लिए इस पद्धति का उपयोग करने में सक्षम थे। स्टब 1-मध्यस्थता वाले पेक्सोफैगी में, एचएसपी 70 ऑटोफैगी द्वारा पेरोक्सीसोम टर्नओवर शुरू करने के लिए आरओएस-स्ट्रेस्ड पेरोक्सीसोम पर स्टब 1 की भर्ती करता है। इस प्रक्रिया के दौरान, एचएसपी 70, स्टब 1, सर्वव्यापी प्रोटीन, ऑटोफैगी एडाप्टर पी 62, और एलसी 3 बी पीएक्सोफैगी (चित्रा 3, चित्रा 4, चित्रा 5, चित्रा 6, चित्रा 7)13 को चलाने के लिए आरओएस-स्ट्रेस्ड पेरोक्सीसोम पर क्रमिक रूप से दिखाई देते हैं। टाइम-लैप्स इमेजिंग के माध्यम से, पेक्सोफैगी में इन महत्वपूर्ण कारकों की भर्ती के समय और क्रम का पालन करना संभव था। पेरोक्सीसोम को फोकल रूप से घायल करने के लिए पद्धति का उपयोग करके, हम आसानी से प्रदर्शित कर सकते हैं कि एचएसपी 70 / स्टब 1 मशीनरी विशेष रूप से क्षतिग्रस्त पेरोक्सीसोम (लेकिन कार्यात्मक नहीं) को लक्षित करती है। अलग-अलग पेरोक्सीसोम के भीतर आरओएस उत्पादन प्राप्त करने के अलावा, स्टब 1-मध्यस्थता पेक्सोफैगी के जैव रासायनिक लक्षण वर्णन के लिए एक संस्कृति डिश पर सभी पेरोक्सीसोम को एक साथ नुकसान पहुंचाने के लिए एक ही रणनीति का उपयोग करना संभव था (चित्रा 10)।

Figure 1
चित्र 1: पेरोक्सीसोम में प्रकाश-सक्रिय आरओएस उत्पादन के लिए योजनाबद्ध। (ए) प्रकाश द्वारा पेरोक्सिसोमल आरओएस पीढ़ी को ट्रिगर करने के तरीके का योजनाबद्ध। किलररेड टेंडम डिमर या फ्लोरोसेंट एसएलपी लिगेंड जैसे रंगों को पेरोक्सीसोम लक्ष्यीकरण अनुक्रमों (वीकेएसकेएल) के उपयोग के माध्यम से पेरोक्सीसोम में लक्षित किया जाता है। (बी) 3-एटी कैटालेज को रोकता है और पेरोक्सीसोमल लुमेन में आरओएस के स्तर को बढ़ाने के लिए यहां दिखाई गई योजना के साथ संयोजन के रूप में उपयोग किया जा सकता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: पेरोक्सीसोम में आरओएस उत्पादन को सक्रिय करने के लिए एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करना। (बी-डी) प्रोटोकॉल में चरण 3.3 के लिए स्क्रीनशॉट। (E-F) प्रोटोकॉल में चरण 3.5 के लिए स्क्रीनशॉट। (जी) प्रोटोकॉल में चरण 3.7 के लिए स्क्रीनशॉट। (एच) प्रोटोकॉल में चरण 3.8 के लिए स्क्रीनशॉट। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: आरओएस-तनावग्रस्त पेरोक्सीसोम पर ईजीएफपी-स्टब 1 का स्थानांतरण। SHSY5Y कोशिकाओं को हेलोटैग-वीकेएसकेएल, PMP34-TagBFP और EGFP-Stub1 के साथ स्थानांतरित किया गया था। अभिकर्मक के एक दिन बाद, कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस (200 एनएम, 1 घंटे) पर हेलोटैग टीएमआर लिगैंड के साथ दाग दिया गया था। यहां, इस नमूने में कोशिकाओं में से एक से डेटा दिखाया गया है। (ए) इस सेल में सफेद गोलाकार क्षेत्र को 561 एनएम रोशनी के लिए चुना गया था। (बी) सफेद गोलाकार क्षेत्र में रोशन पेरोक्सीसोम ने तुरंत अपना टीएमआर फ्लोरेसेंस खो दिया। (C) EGFP-Stub1 को t = 20 मिनट पर रोशन पेरोक्सीसोम पर स्थानांतरित किया गया। शीर्ष बाएं इनसेट: सफेद वर्ग क्षेत्रों का आवर्धित दृश्य। सभी स्केल पट्टियाँ: 5 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: आरओएस-स्ट्रेस्ड पेरोक्सीसोम द्वारा ईजीएफपी-एचएसपी 70 की भर्ती। हेलोटैग-वीकेएसकेएल, पीएमपी 34-टैगबीएफपी और ईजीएफपी-एचएसपी 70 को व्यक्त करने वाली एसएचएसवाई 5 वाई कोशिकाओं में पेरोक्सीसोम को 1 घंटे के लिए 200 एनएम हेलोटैग टीएमआर लिगैंड के साथ दाग दिया गया था। यहां, इस नमूने में कोशिकाओं में से एक से डेटा दिखाया गया है। (ए) सेल में सफेद गोलाकार क्षेत्र 561 एनएम रोशनी के अधीन था। (बी) इस रोशन क्षेत्र में रोशन पेरोक्सीसोम ने फोटो-ब्लीचिंग के कारण तुरंत अपना टीएमआर फ्लोरेसेंस खो दिया। (सी) ईजीएफपी-एचएसपी 70 20 मिनट बाद रोशन पेरोक्सीसोम पर स्थानांतरित हो गया। नीचे दाएं इनसेट: सफेद वर्ग क्षेत्रों का आवर्धित दृश्य। सभी स्केल पट्टियाँ: 5 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: आरओएस-तनावग्रस्त पेरोक्सीसोम पर सर्वव्यापी प्रोटीन संचय की टाइम-लैप्स इमेजिंग। (ए) हेलोटैग टीएमआर लिगैंड धुंधला होने के 1 घंटे के बाद, ईजीएफपी-यूबी, पीएमपी 34-टैगबीएफपी और हेलोटैग-वीकेएसकेएल को व्यक्त करने वाले एसएचएसवाई 5 वाई सेल में सफेद गोलाकार क्षेत्र के भीतर पेरोक्सीसोम को 561 एनएम के साथ रोशन किया गया था। (बी) रोशनी के बाद क्षेत्र के भीतर टीएमआर प्रतिदीप्ति को ब्लीच किया गया था। ईजीएफपी-यूबी बाद में विशेष रूप से रोशन पेरोक्सीसोम (टी = 40 मिनट और 561 एनएम रोशनी दिखाए जाने के बाद 2 घंटे) पर जमा हुआ। नीचे दाएं इनसेट: (सी) में सफेद वर्ग क्षेत्रों का आवर्धित दृश्य। सभी स्केल पट्टियाँ: 5 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 6
चित्र 6: आरओएस-स्ट्रेस्ड पेरोक्सीसोम पर ऑटोफैगी एडाप्टर पी 62 का संचय। (ए) ईजीएफपी-पी 62, पीएमपी 34-टैगबीएफपी, और हेलोटैग-वीकेएसकेएल (हेलोटैग टीएमआर लिगैंड से सना हुआ; 200 एनएम, 1 घंटे) को व्यक्त करने वाले एसएचएसवाई 5वाई सेल में सफेद गोलाकार क्षेत्र को 561 एनएम प्रकाश से रोशन किया गया था। (बी) रोशनी ने लक्षित पेरोक्सीसोम पर टीएमआर संकेतों के तत्काल नुकसान का कारण बना। (सी) रोशनी के बाद 2.5 घंटे पर, पेरोक्सीसोम ने ईजीएफपी-पी 62 की भर्ती की। शीर्ष दाएं इनसेट: (सी) में सफेद वर्ग क्षेत्रों के आवर्धित दृश्य। सभी स्केल पट्टियाँ: 5 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 7
(A) हेलोटैग टीएमआर लिगैंड स्टेनिंग (200 nM, 1 h) के बाद, EGFP-LC3B, PMP34-TagBFP और HaloTag-VKSKL को व्यक्त करने वाले एक SHSY5Y सेल को सफेद गोलाकार क्षेत्र के भीतर 561 nm के साथ रोशन किया गया था। (बी) रोशनी के बाद, सफेद गोलाकार क्षेत्र में पेरोक्सीसोम के टीएमआर सिग्नल को ब्लीच किया गया था। (सी) रोशनी के बाद 3.5 घंटे पर, ईजीएफपी-एलसी 3 बी आरओएस-तनावग्रस्त पेरोक्सीसोम पर स्थानांतरित हो गया। शीर्ष दाएं इनसेट: (सी) में सफेद वर्ग क्षेत्रों के आवर्धित दृश्य। सभी स्केल पट्टियाँ: 5 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 8
चित्रा 8: इमेजजे का उपयोग करके क्षतिग्रस्त पेरोक्सीसोम पर प्रतिदीप्ति संकेतों की मात्रा निर्धारित करना (ए) प्रोटोकॉल में चरण 4.2.1 और चरण 4.2.2 के लिए स्क्रीनशॉट। (बी) प्रोटोकॉल में चरण 4.2.2 के लिए स्क्रीनशॉट। (सी) प्रोटोकॉल में चरण 4.2.3 के लिए स्क्रीनशॉट। (डी) प्रोटोकॉल में चरण 4.2.4 के लिए स्क्रीनशॉट। (ई) प्रोटोकॉल में चरण 4.2.4 और चरण 4.2.5 के लिए स्क्रीनशॉट। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 9
चित्रा 9: व्यक्तिगत पेरोक्सीसोम के भीतर प्रकाश-सक्रिय आरओएस उत्पादन। पेरोक्सीसोम-स्थानीयकृत रेडॉक्स जांच आरओजीएफपी 2-वीकेएसकेएल का उपयोग लक्षित पेरोक्सीसोम के भीतर प्रकाश-सक्रिय आरओएस उत्पादन को मान्य करने के लिए किया गया था। एनआईएच 3 टी 3 सेल के सफेद गोलाकार क्षेत्र के भीतर पेरोक्सीसोम जो डिकिलररेड-वीकेएससीएल और आरओजीएफपी 2-वीकेएसकेएल को व्यक्त करते हैं, उन्हें 561 एनएम प्रकाश प्रकाश से पहले (ए) और 561 एनएम प्रकाश रोशनी के बाद (बी) दिखाया गया है। बाएं: 405 एनएम उत्तेजना (मैजेंटा) के साथ आरओजीएफपी 2-वीकेएसकेएल उत्सर्जन; मध्य: 488 एनएम उत्तेजना (हरे) के साथ आरओजीएफपी 2-वीकेएसकेएल उत्सर्जन। 488 एनएम (हरे) से उत्तेजित उत्सर्जन संकेत पर 405 एनएम (मैजेंटा) द्वारा उत्तेजित आरओजीएफपी 2-वीकेएसकेएल उत्सर्जन संकेत का अनुपात पेरोक्सीसोम के भीतर आरओएस स्तर को ट्रैक करता है। (बी) में सफेद गोलाकार क्षेत्र 561 एनएम रोशनी के बाद डिकिलररेड-वीकेएसकेएल उत्सर्जन के तत्काल नुकसान को दर्शाता है। सभी स्केल पट्टियाँ: 5 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 10
चित्र 10: विश्व स्तर पर एक संस्कृति पकवान पर सभी पेरोक्सीसोम को नुकसान पहुंचाता है। हेलोटैग-वीकेएसएल, ईजीएफपी-यूबी और पीएमपी 34-टैगबीएफपी को व्यक्त करने वाली SHSY5Y कोशिकाओं को 1 घंटे के लिए हेलोटैग टीएमआर लिगैंड के साथ दाग दिया गया था। (A) एलईडी रोशनी से पहले, ईजीएफपी-यूबी फ्लोरेसेंस साइटोप्लाज्म में समरूप था और पेरोक्सीसोम (हेलोटैग टीएमआर लिगैंड और पीएमपी 34-टैगबीएफपी द्वारा चिह्नित) के साथ सह-स्थानीयकरण नहीं करता था। (बी) एलईडी रोशनी के 9 घंटे के बाद, ईजीएफपी-यूबी सिग्नल एक कॉन्फोकल डिश में उगाए गए कोशिकाओं में सभी पेरोक्सीसोम पर जमा हो गया, जैसा कि (बी) में दो पैनलों में दर्शाया गया है। सभी स्केल पट्टियाँ: 5 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

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Discussion

यह प्रोटोकॉल प्रकाश के साथ पेरोक्सिसोमल आरओएस स्तर को बढ़ाकर सेल संस्कृतियों के भीतर स्टब 1-मध्यस्थता पेक्सोफैगी को ट्रिगर करने का विवरण देता है। चूंकि प्रोटोकॉल डाई-असिस्टेड आरओएस पीढ़ी पर निर्भर करता है, इसलिए किसी को रुचि की कोशिकाओं के भीतर डिकिलररेड-वीकेएसकेएल या डाई-लेबल एसएलपी लिगैंड स्टेनिंग की पर्याप्त अभिव्यक्ति सुनिश्चित करने की आवश्यकता होती है। यह देखते हुए कि विभिन्न आनुवंशिक पृष्ठभूमि के विभिन्न सेल प्रकार या कोशिकाएं थोड़ा अलग गुणों के साथ पेरोक्सीसोम को परेशान कर सकती हैं, किसी को पेक्सोफैगी के प्रेरण को सुनिश्चित करने के लिए सटीक रोशनी की स्थिति को ट्यून करने की आवश्यकता हो सकती है। स्टब 1-मध्यस्थता पेक्सोफैगी के सक्रियण के लिए स्क्रीन करने का एक मजबूत उपाय यह निगरानी करना है कि क्या ईजीएफपी-यूबी रोशन पेरोक्सीसोम (रोशनी के 1 घंटे बाद) पर स्थानांतरित होता है या नहीं। स्वस्थ कोशिकाओं में, ईजीएफपी-यूबी सिग्नल आमतौर पर साइटोप्लाज्म में समान रूप से वितरित होते हैं। इसलिए, रोशन पेरोक्सीसोम पर इसका स्थानांतरण निरीक्षण करना आसान है। रोशनी की स्थिति को अनुकूलित करने के लिए, प्रकाश की तीव्रता या रोशनी के समय को बदला जा सकता है। पेरोक्सीसोम को नुकसान पहुंचाने की कोशिश करते समय रंगों की अति-रोशनी से बचना भी सबसे अच्छा है, क्योंकि कुछ फोटोकैमिकल प्रक्रियाओं से गुजर सकते हैं जो डाउनस्ट्रीम इमेजिंग में हस्तक्षेप कर सकते हैं। उदाहरण के लिए, यह दिखाया गया है कि किलररेड की अधिक रोशनी इसे कमजोर हरे फ्लोरोसेंट बनने का कारण बन सकती है। अधिक रोशनी रोशनी23 के तुरंत बाद रोशन पेरोक्सीसोम पर हल्के हरे संकेत उत्पन्न करती है (ईजीएफपी-आधारित संवाददाताओं के स्थानांतरण के विपरीत, जिसे होने में दसियों मिनट से घंटों लग सकते हैं)।

कार्यप्रणाली शोधकर्ताओं को एक सेल के भीतर पेरोक्सीसोम के एक अंश को खराब करने के लिए मानक लेजर-स्कैनिंग कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करने की अनुमति देती है, जिससे स्वस्थ और क्षतिग्रस्त पेरोक्सीसोम के बीच भाग्य में अंतर की सीधी तुलना की जा सकती है। मौजूदा तरीकों की तुलना में, यहां प्रोटोकॉल कोशिकाओं में सभी पेरोक्सीसोम या अन्य ऑर्गेनेल के बजाय पेरोक्सीसोम के केवल एक छोटे से हिस्से में आरओएस तनाव का कारण बनता है। इसलिए, एक ही सेल में आरओएस-स्ट्रेस्ड पेरोक्सीसोम के पेक्सोफैगी पर शेष स्वस्थ पेरोक्सीसोम के प्रभाव का अध्ययन करना संभव है।

एक पूरे पकवान की रोशनी के माध्यम से, एक सेल संस्कृति के भीतर सभी पेरोक्सीसोम को लक्षित करना भी संभव है, जिससे स्टब 1-मध्यस्थता पेक्सोफैगी के जैव रासायनिक विश्लेषण की अनुमति मिलती है। Hsc70/Stub1 क्षतिग्रस्त पेरोक्सीसोम को कैसे पहचानता है और पेरोक्सीसोमल सब्सट्रेट्स स्टब 1 यूबिकिटिनेट्स सभी प्रश्न हैं जिन्हें इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके खोजा जा सकता है। अधिक आम तौर पर, पेरोक्सीसोम हानि प्रोटोकॉल का उपयोग अन्य पेरोक्सीसोम गुणवत्ता नियंत्रण मार्गों की जांच के लिए भी किया जा सकता है। यह देखते हुए कि पेरोक्सीसोम कोशिका के भीतर कई अलग-अलग सेलुलर ऑर्गेनेल से घनिष्ठ रूप से जुड़े हुए हैं, जिसमें एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम, माइटोकॉन्ड्रिया और लिपिड बूंदें शामिल हैं, यह जांचना भी दिलचस्प होगा कि कोशिकाएं पेरोक्सीसोम हानि के जवाब में सभी सेलुलर संरचनाओं के व्यवहार को व्यवस्थित रूप से कैसे संशोधित करती हैं।

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Disclosures

लेखक ों ने कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हितों की घोषणा नहीं की है।

Acknowledgments

इस काम को ताइवान में राष्ट्रीय विज्ञान और प्रौद्योगिकी परिषद से मोस्ट 111-2311-बी-001-019-एमवाई 3 अनुसंधान अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
35 mm culture dish with a 20 mm diameter glass microwell  MatTek P35G-1.5-20-C 20 mm glass bottomed
3-amino-1,2,4-triazole (3-AT) Sigma Aldrich A8056
bovine serum ThermoFisher Scientific 16170060
Cell culture incubator Nuaire NU-4750
diKillerRed-PTS1 Academia Sinica made by appending the KillerRed tandem dimer with PTS1(VKSKL)
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) ThermoFisher Scientific 11965092
Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F-12) ThermoFisher Scientific 11330032
EGFP-C1 Clontech pEGFP-C1 The backbone of EGFP-C1 was used for cloning EGFP-Stub1, EGFP-Hsp70, EGFP-p62
EGFP-Hsp70 Academia Sinica Hsp70 gene (HSPA1A) PCR amplified from HeLa cDNA and cloned into EGFP-C1
EGFP-LC3B Addgene 11546
EGFP-p62 Academia Sinica generated by inserting the human SQSTM1 gene (through PCR amplification of the HeLa cell cDNA) into EGFP-C1
EGFP-Stub1 Academia Sinica generated by inserting the mouse Stub1 gene (through PCR amplification of the total mouse kidney cDNA) into EGFP-C1
EGFP-Ub Addgene 11928
fetal bovine serum ThermoFisher Scientific 10437028
HaloTag TMR ligand  Promega G8252
HaloTag-PTS1 Academia Sinica PTS1 appended and cloned into EGFP-C1 backbone
HEPES ThermoFisher Scientific 15630080
Inverted Confocal Microscope  Olympus FV3000RS 405 nm Ex, 488 nm Ex, 561 nm Ex,  microscope with a TOKAI HIT chamber incubator and the UNIV2-D35 dish attachment
Janelia Fluor 646 HaloTag Ligand Promega GA1120
LED VitaStar PAR64 80 W, 555-570 nm
lipofectamine 2000  ThermoFisher Scientific 11668 transfection reagent
NIH3T3 cell ATCC CRL-1658 adherent
Opti-MEM ThermoFisher Scientific 319850 reduced serum media
penicillin/streptomycin ThermoFisher Scientific 15140
PMP34-TagBFP Academia Sinica PMP34 PCR amplified from HeLa cDNA and cloned intoTagBFP-C (Evrogen FP171)
roGFP2-PTS1 Academia Sinica generated by appending eroGFP (taken from Addgene plasmid 20131) with the amino acid sequence VKSKL, and cloned into the EGFP-C1
SHSY5Y cell ATCC CRL-2266 adherent

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References

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Chen, B. H., Yang, W. Y. Monitoring Stub1-Mediated Pexophagy. J. Vis. Exp. (195), e65010, doi:10.3791/65010 (2023).

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