Summary
このプロトコルは、生細胞におけるStub1を介したペキソファジーをトリガーおよびモニタリングするための指示を提供します。
Abstract
哺乳類細胞は、Stub1を介したペキソファジーを介してペルオキシソームをターンオーバーすることができます。この経路は、ペルオキシソームの量と質の細胞制御を可能にする可能性があります。このプロセスの間に、ヒートショックタンパク質70とユビキチンE3リガーゼStub1がペルオキシソーム上に移動し、ペキソファジーを開始するためにひっくり返されます。Stub1リガーゼ活性により、標的ペルオキシソーム上にユビキチンやその他のオートファジー関連モジュールを蓄積することができます。ペルオキシソーム内腔内の活性酸素種(ROS)レベルを上昇させると、Stub1を介したペキソファジーが活性化される可能性があります。したがって、色素支援ROS生成を使用して、この経路をトリガーおよび監視することができます。本稿では、蛍光タンパク質と合成蛍光色素の2つのクラスの色素を使用して、哺乳類細胞培養内でペキソファジーを開始する手順について概説します。これらの色素支援ROS生成ベースのプロトコルは、世界中の細胞集団内のすべてのペルオキシソームを標的とするために使用できるだけでなく、単一細胞内の個々のペルオキシソームの操作を可能にすることもできます。また、生細胞顕微鏡を使用してStub1を介したペキソファジーを追跡する方法についても説明します。
Introduction
ペルオキシソームは、ほとんどの真核細胞に存在する単膜結合オルガネラです。ペルオキシソームは、超長鎖脂肪酸のベータ酸化、プリン異化作用、およびエーテルリン脂質と胆汁酸の合成を行うために不可欠な代謝コンパートメントです1。ペルオキシソーム由来アセチルCoAは、代謝における中枢シグナル伝達を制御することにより、脂質恒常性を制御します2。したがって、ペルオキシソーム機能の低下が、神経変性疾患、老化、癌、肥満、および糖尿病を含む様々な疾患において暗示されることは驚くべきことではない3、4、5。ペルオキシソーム操作の維持に不可欠なプロセスはペキソファジーです。ペキソファジーは、オートファジーによるペルオキシソームの選択的代謝回転のための異化プロセスです。細胞はペキソファジーを使用してペルオキシソームの量と質を制御し、それによって適切なペルオキシソーム機能を確保します。最近の研究では、PEX1ペルオキシソーム生合成因子1および6の突然変異によって引き起こされるペルオキシソーム喪失は、制御されていないペキソファジー6に起因することが実証されました。特に、すべてのペルオキシソーム生合成障害(PBD)患者の65%は、哺乳類細胞のPEX1、PEX6、およびPEX26で構成されるペルオキシソームAAA ATPase複合体に欠損を抱いています7。
ペキソファジーを開始および研究するために、いくつかの方法を使用できます。酵母では、供給された栄養素がペルオキシソーム依存性炭素源からペルオキシソーム非依存炭素源(細胞ペルオキシソーム数の低下)に切り替えられたときにペキソファジーがトリガーされます8。例えば、メタノール培地からグルコース培地およびエタノール培地へのメタノール増殖ピキア牧草細胞の転写は、それぞれミクロペキソファジーおよびマクロペキソファジーを誘導する8、9、10。マイクロペキソファジー隔離剤は、液胞をリモデリングしてカップ状の液胞隔離膜と、マイクロペキソファジー特異的膜装置(MIPA)と呼ばれる蓋状の構造を形成することにより、ペルオキシソームをクラスター化して分解します。マクロペキソファジーでは、個々のペルオキシソームはペキソファゴソームとして知られる二重膜構造に飲み込まれ、続いて液胞と融合して分解されます8,9,10。サッカロミセス・セレビシエのAtg36pやピキア・パストリスのAtg30pなどのペキソファジー受容体のリン酸化は、受容体がコアオートファジー機構を動員し、オートファゴソームへのペルオキシソーム標的化を促進するために重要です8,11。
哺乳類細胞では、ユビキチン化によってペキソファジーを誘導することができます。ペルオキシソーム膜タンパク質PMP34またはPEX3を細胞質側にユビキチンでタグ付けすると、ペキソファジー12が誘導されます。PEX3の過剰発現は、ペルオキシソームユビキチン化およびリソソームによるペルオキシソーム排除を誘導する13。さらに、PEX5とC末端EGFPとの融合は、モノユビキチン化PEX5の輸出を損ない、ペキソファジーをもたらす14。一方、ペキソファジーはH2O2処理によっても引き起こされる可能性があります。ペルオキシソームは活性酸素種(ROS)を産生する。具体的には、超長鎖脂肪酸(炭素数22>)のベータ酸化の初期段階を触媒するペルオキシソーム酵素Acox1は、アセチルCoAだけでなくペルオキシソームROSも生成します。H2O2処理下で上昇したROSレベルに応答して、哺乳動物細胞はペキソファジーを活性化してROS産生を低下させ、ストレスを緩和する。H 2 O2治療は、ペルオキシソームへの毛細血管拡張運動失調(ATM)変異の動員を促進することが報告されています。次に、ATMはPEX5をリン酸化して、ペキソファジー15によるペルオキシソーム代謝回転を促進します。
ペルオキシソームはROS発生中心であるため、ROS損傷を受けやすい。ROS誘発性ペルオキシソーム損傷は、細胞にペキソファジーを活性化させ、ペルオキシソーム品質管理経路(オートファジーによる損傷したペルオキシソームの除去)を開始します。ここでは、ROS誘発性ペルオキシソーム損傷のオンデマンドトリガーへのアプローチを概説します。このプロトコルは、細胞小器官16、17、18、19、20内での光活性化ROS産生を利用します(図1)。色素標識されたペルオキシソームが照射され、ペルオキシソーム内腔内でROS産生が起こり、ペルオキシソーム損傷を特異的に引き起こします。このプロトコルを使用して、ROSストレスペルオキシソームがユビキチン依存性分解経路を介して除去されることが示されている。ROSストレスペルオキシソームは、ユビキチンE3リガーゼStub1をリクルートして、ペキソファジー16による個々の除去のためにオートファゴソームに飲み込むことを可能にします。このプロトコルを使用して、タイムラプス顕微鏡によって同じ細胞内の損傷したペルオキシソームと健康なペルオキシソームの運命を比較することができます。この方法は、培養皿上のすべてのペルオキシソーム(すべての細胞内)を全体的に損傷するためにも使用でき、ペキソファジー経路の生化学的分析を可能にします。
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Protocol
1. ペルオキシソーム内腔にジキラーレッドまたは自己標識タンパク質(SLP)を発現する細胞の調製
- ガラス底の細胞培養皿に目的の細胞を播種します。ここでの実験では、840 μLの培養液(10%ウシ胎児血清と1%ペニシリン/ストレプトマイシンを添加したDMEM/F-12)または840 μLの培養液(10%ウシ血清と1%ペニシリン/ストレプトマイシンを添加したDMEM)中の6 x 104マウスNIH3T3細胞を、直径20 mmのガラスマイクロウェルを備えた35 mmの培養皿に播種します。
注:播種する細胞の数は、他の仕様のガラス底皿を使用する場合、ガラスマイクロウェルの面積に応じて比例して調整する必要があります。 - 細胞を5%CO2/37°C下で24時間増殖させる。
- トランスフェクション試薬を使用して、細胞に目的のプラスミドをトランスフェクトします。
- PMP34-TagBFPを使用して、生細胞中のペルオキシソームを標識します。ペルオキシソーム内腔でのROS生成(+色素標識SLPリガンド)には、ペルオキシソーム標的ジキラーレッド-VKSKLまたはSLP-VKSKL(+色素標識SLPリガンド)のいずれかを使用します(光活性化ROS産生による)。このプロトコルでは、自己標識タンパク質HaloTag-VKSKL21を使用します。Stub1/Hsp70の転座、ユビキチン化タンパク質の蓄積、およびROSストレスペルオキシソーム上のオートファゴソームの形成をモニタリングするために、それぞれEGFP-Stub1、EGFP-Hsp70、EGFP-Ub、またはEGFP-LC3Bをトランスフェクトします。ペルオキシソーム内腔におけるROS生成を確認するために、diKillerRed-VKSKLをペルオキシソーム局在蛍光酸化還元プローブroGFP2-VKSKL22と同時トランスフェクトします。
- SHSY5Y細胞トランスフェクションでは、プラスミドを55 μLの無血清DMEM/F-12で希釈し、1 μLのトランスフェクション試薬を55 μLの無血清DMEM/F12で希釈します。希釈したDNAを希釈試薬と組み合わせます。穏やかに混合し、室温で30分間インキュベートします。
- 抗生物質を含まないSHSY5Y用の培養液100 μL(10%ウシ胎児血清を含むDMEM/F-12)を予め播種した20 mmマイクロウェルに複合体を追加します。皿を前後にそっと振る。
- NIH3T3細胞トランスフェクションでは、プラスミドおよびトランスフェクション試薬の希釈に、無血清DMEM/F-12の代わりに還元血清培地を使用してください。SHSY5Yのプレーティング培養液を、抗生物質を含まないNIH3T3細胞の培養液(10%ウシ血清を含むDMEM)と交換します。
- トランスフェクションの2時間後、トランスフェクション試薬含有培地を除去し、1 mLの新鮮な培養培地を加えます。NIH3T3またはSHSY5Y細胞を37°Cおよび5%CO2 で24時間インキュベートします。
注:他の細胞株は、Stub1を介したペキソファジー(HeLa細胞など)の研究にも使用できます。
2. 色素標識SLPリガンドによるペルオキシソームの染色(光活性化ROS産生用)
- トランスフェクション後24時間で培地を除去し、100 μLの200 nM HaloTag TMRリガンドまたは200 nM Janelia Fluor 646 HaloTagリガンドを20 mmガラスマイクロウェルに加えます。
注:色素標識SLPリガンドは、各細胞株のそれぞれの培地で希釈する必要があります。Janelia Fluor 646標識リガンドを選択すると、青、緑、赤のチャンネルが解放され、ダウンストリームの蛍光イメージングが可能になります。 - 皿を37°C、5%CO2 インキュベーターに移します。1時間染色します。1時間後、染色培地を完全に除去し、新鮮な培養培地1 mLを加えます。
3. レーザー走査型共焦点顕微鏡によるペルオキシソームのROSストレス
- 目的の細胞を含むガラス底の皿を、ステージトップインキュベーターを備えたレーザー走査型共焦点顕微鏡上に置きます。
- ツールウィンドウをクリックし、接眼レンズを選択し、DIAボタン(図2A)をクリックして透過光をオンにします。顕微鏡の接眼レンズを通して皿を見て、フォーカスノブを回して細胞に焦点を合わせます。
- LSMを選択し、色素と検出器の選択ボタンをクリックします(図2B)。ポップアップウィンドウで目的の色素をダブルクリックして、細胞をイメージングするための適切なレーザーとフィルターの設定を選択します(図2C)。ライブパネルのLivex4をクリックして高速レーザースキャンを開始し、細胞の蛍光シグナルのスクリーニングを開始します(図2D)。
- ジョイスティックコントローラーを使用してステージを移動し、培地のdiKillerRed-VKSKL-またはSLP-VKSKL発現細胞を見つけて、ROSストレス(ペルオキシソーム上)を適用します。目的のセルの画像を取得します。
- ツールウィンドウをクリックし、LSM刺激を選択します(図2E)。楕円ボタンをクリックし、ライブ画像ウィンドウでマウスを使用して、ROSストレスが適用されるステップ3.4で取得した目的のペルオキシソームを含む直径15 μmの円形ROI(図2F)を描画します(例については図3を参照)。
- ROSストレスを適用するには、diKillerRed-PTS1またはTMR標識SLPリガンドを有する細胞には561 nmを使用し、ジャネリア蛍光646標識SLPリガンドで染色された細胞には640 nmを使用します。
- ROSストレスを適用するレーザー波長を選択します。目的のレーザーのパーセンテージと持続時間を入力します(図2G)。
- [取得]をクリックし、[刺激]ボタン(図2H)をクリックして、ROIを通して561/640nmの光でそれぞれ30秒間スキャンを開始します。これは、ここで使用する共焦点顕微鏡の561nmと640nmの両方で~5%のレーザー出力設定に相当します。この操作は、ペルオキシソームにおけるROS産生をもたらすであろう。
注:さまざまなサイズのROIを選択できます。面積に応じて、各ROIの照明時間を比例的に調整する必要があります。 - レーザー照射を30秒後、ROI内のペルオキシソームはジキラーレッド-PTS1/TMR/ジャネリアフルーア646シグナルを失います。このシグナル損失により、細胞内の照らされたペルオキシソームと照らされていないペルオキシソーム(損傷したペルオキシソームと健康なペルオキシソーム)を区別することができます。
4. タイムラプスイメージングによる生細胞中のペキソファジーのモニタリング
- EGFPタグ付きStub1、Hsp70、Ub、p62、またはLC3Bの照明/ROSストレスペルオキシソームへの転座を、フレーム間の10分間隔を使用したタイムラプスイメージングにより追跡します(例については、 図3〜7を参照)。
注:EGFP-Stub1またはEGFP-Hsp70シグナルは、照明の10〜20分後に現れ始め、照明後~40分まで損傷したすべてのペルオキシソームに留まります。EGFP-Ubシグナルは照明後30分で現れ、2-3時間持続します。 EGFP-p62転座は照明後60分で現れ、EGFP-LC3Bシグナルは照明後~3時間で見えるようになります。 - ImageJを使用して、損傷したペルオキシソーム(Stub1、Ub、p62、またはLC3Bから)上のEGFPシグナルを定量します。ImageJ を使用して 3 チャンネル画像 (PMP34-TagBFP/EGFP-LC3B/HaloTag-VKSKL) を定量化するには、次の手順を実行します。
- 画像を開き、 楕円 選択または フリーハンド選択 を適用して、すべての照射ペルオキシソームを含む領域を囲みます(PMP34-TagBFPシグナル陽性およびHaloTagリガンドシグナル漂白; 図8A)。
- 複製をクリックして、PMP34-TagBFPチャネルを選択します(図8A)。ドロップダウンメニューの画像>>閾値を調整してペルオキシソームをマークして閾値を設定します(図8B)。
- [分析] > [粒子の分析] を選択して、照射されたペルオキシソームの正確な領域を決定します。ImageJは、これらの関心領域(ROI)をROIマネージャに記録します(図8C)。
- 複製をクリックして、EGFP結合Ub、p62、またはLC3Bからの蛍光シグナルを分析するためのEGFPチャンネルを選択します(図8D)。ROIマネージャですべてのROIを選択します(図8E)。
- ROIマネージャーで 測定 を適用して、ペルオキシソーム上のEGFPシグナルを測定します(図8E)。結果テーブルで、各ROIの面積と積分密度(すべてのピクセル強度の合計)の値を見つけます(図8E)。
- 照射後の異なる時点での平均EGFP蛍光強度を得るには、積分EGFP強度を照射されたペルオキシソームの総面積(PMP34-TagBFPシグナル陽性およびHaloTagリガンドシグナル陰性領域)で割ります。ペルオキシソーム上の蓄積シグナルを得るには、ある時点での平均強度を時間= 0で平均強度で減算し、次に時間= 0での平均強度で正規化します。
5.培養皿上のすべてのペルオキシソーム(すべての細胞内)を世界的に損傷する
- ステップ1(ペルオキシソームを標的としたジキラーレッド[diKillerRed-VKSKL]またはSLP [SLP-VKSKL]を発現する細胞の調製)およびステップ2(SLPリガンドによるペルオキシソームの染色[光活性化ROS産生用])を実行します。
- TMR標識リガンド染色の1時間後、染色培地を除去し、30 mM 3-AT(3-アミノ-1,2,4-トリアゾール;カタラーゼ阻害剤)を含む培養液1 mLを追加します。
注:カタラーゼはペルオキシソーム内腔に発現するROSスカベンジャーであるため、3-AT処理はペルオキシソームの光誘発酸化損傷を増強するのに役立ちます。 - 培養皿をLED(555-570 nm)の上に置きます。インキュベーター内で9時間、1.8 W / cm2 の出力密度ですべてのセルを照らします。
注:インキュベーターの外でこの手順を実行するには、培養皿を37°Cの加熱プレートに置きます。3-AT含有培地に20 mM HEPESを添加し、ガス交換を最小限に抑えるために培養皿を透明フィルムで覆います。HEPESは、LED照明中にCO2 インキュベーター外の細胞培養における生理学的pHを維持する緩衝剤です。 - ペルオキシソーム上のEGFP-Ub、EGFP-p62、またはEGFP-LC3Bシグナルをイメージングすることにより、LED誘発損傷の成功を検証します。上記で概説した照明条件を用いて、HaloTag-VKSKLを安定発現するSHSY5Y細胞の82%がStub1を介したペキソファジーを示した。
- 下流の生化学的分析のために細胞を回収します。
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Representative Results
ここに示すStub1を介したペキソファジー誘導スキームは、ペルオキシソーム内腔内での色素支援ROS生成を利用します。この操作には、最小限の光強度が必要です。したがって、蛍光タンパク質または色素を含むペルオキシソームは、標準的なレーザー走査型共焦点顕微鏡を使用して照明することができます。焦点照明は、蛍光レポーターroGFP2-VKSKLによって示されるように、個々のペルオキシソーム内で瞬間的かつ局所的なROS産生をもたらします(図9)。イメージング中の追加のROS生成を避けるために、roGFP2-VKSKL測定ではdiKillerRed-VKSKLをイメージングしませんでした。 図9 の右下のdiKillerRed-VKSKL画像は、損傷したペルオキシソームが13である場所を明確に示すために、すべてのroGFP2-VKSKL測定が行われた後に撮影されました。データはまた、照射されていないペルオキシソームが影響を受けないことを示しており、方法論の精度を示しています。ROSは、ペルオキシソーム常在分子のごく一部の酸化をもたらし、ペルオキシソーム機能障害を引き起こす。この急性手術により、さまざまなペルオキシソーム品質管理経路を堅牢に調べることができます。
この方法論を使用して、Stub1を介したペキソファジーをモニタリングすることができました。Stub1を介したペキソファジーでは、Hsp70はStub1をROSストレスペルオキシソームに動員し、オートファジーによるペルオキシソーム代謝回転を開始します。このプロセスでは、Hsp70、Stub1、ユビキチン化タンパク質、オートファジーアダプターp62、およびLC3BがROSストレスペルオキシソーム上に順次出現し、ペキソファジーを駆動します(図3、図4、図5、図6 、 図7)13。タイムラプスイメージングにより、ペキソファジーにおけるこれらの重要な要素の動員のタイミングと順序を追跡することができました。ペルオキシソームを局所的に損傷させる方法論を使用することにより、Hsp70 / Stub1機械が損傷したペルオキシソームを特異的に標的としていることを簡単に実証できました(機能的なペルオキシソームは標的にしません)。個々のペルオキシソーム内でROS産生を誘発する以外に、Stub1を介したペキソファジーの生化学的特性評価のために、培養皿上のすべてのペルオキシソームを同時に損傷するために同じ戦略を使用することが可能でした(図10)。
図1:ペルオキシソームにおける光活性化ROS産生の概略図。 (A)光によるペルオキシソームROS生成の誘導方法の概略図。KillerRedタンデムダイマーや蛍光SLPリガンドなどの色素は、ペルオキシソームターゲティング配列(VKSKL)を使用してペルオキシソームに標的化されます。(B)3-ATはカタラーゼを阻害し、ペルオキシソーム内腔のROSレベルを増強するためにここに示すスキームと組み合わせて使用 することができる。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:共焦点顕微鏡を使用してペルオキシソームのROS産生を活性化する。 (A)プロトコルのステップ3.2のスクリーンショット。(B-D)プロトコルの手順 3.3 のスクリーンショット。(E-F)プロトコルの手順 3.5 のスクリーンショット。(G)プロトコルのステップ3.7のスクリーンショット。(H)プロトコルのステップ3.8のスクリーンショット。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:ROSストレスペルオキシソームへのEGFP-Stub1の転座。 SHSY5Y細胞にHaloTag-VKSKL、PMP34-TagBFP、およびEGFP-Stub1をトランスフェクトしました。トランスフェクションの1日後、細胞をHaloTag TMRリガンドで37°C(200 nM、1時間)で染色しました。ここでは、このサンプルのセルの1つからのデータが表示されます。(a)このセル内の白色円形領域を561nmの照明用に選択した。(B)白色円形領域の照射されたペルオキシソームは、直ちにTMR蛍光を失った。(C)t=20分で照射されたペルオキシソーム上に位置移したEGFP-Stub1。 左上の挿入図:白い四角形の領域の拡大図。すべてのスケールバー:5μm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:ROSストレスペルオキシソームによるEGFP-Hsp70の動員。 HaloTag-VKSKL、PMP34-TagBFP、およびEGFP-Hsp70を発現するSHSY5Y細胞中のペルオキシソームを、200 nM HaloTag TMRリガンドで1時間染色した。ここでは、このサンプルのセルの1つからのデータが表示されます。(a)細胞内の白色円形領域を561nm照射を行った。(B)この照射領域の照射されたペルオキシソームは、光退色のために直ちにTMR蛍光を失った。(c)20分後に照射されたペルオキシソーム上に移行したEGFP-Hsp70。右下の挿入図:白い正方形の領域の拡大図。すべてのスケールバー:5μm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図5:ROSストレスペルオキシソーム上のユビキチン化タンパク質蓄積のタイムラプスイメージング。(A)HaloTag TMRリガンド染色の1時間後、EGFP-Ub、PMP34-TagBFP、およびHaloTag-VKSKLを発現するSHSY5Y細胞の白色円形領域内のペルオキシソームを561 nmで照射した。(B)領域内のTMR蛍光を照射後に漂白した。EGFP−Ubは、後に照射されたペルオキシソーム上に特異的に蓄積した(t=561nm照射の40分後および2時間後が示されている。右下の挿入図:(C)の白い四角形の領域の拡大図。すべてのスケールバー:5μm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図6:ROSストレスペルオキシソーム上のオートファジーアダプターp62の蓄積 。 (A)EGFP-p62、PMP34-TagBFP、およびHaloTag-VKSKLを発現するSHSY5Y細胞の白色円形領域(HaloTag TMRリガンドで染色;200nM、1時間)を561nmの光で照射した。(B)照明は、標的ペルオキシソーム上のTMRシグナルの即時損失を引き起こした。(C)照射後2.5時間で、ペルオキシソームはEGFP-p62をリクルートした。右上のインセット:(C)の白い正方形の領域の拡大図。すべてのスケールバー:5μm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図7:ROSストレスペルオキシソームへのEGFP-LC3Bの転座 。 (A)HaloTag TMRリガンド染色(200nM、1時間)後、EGFP-LC3B、PMP34-TagBFP、およびHaloTag-VKSKLを発現するSHSY5Y細胞を白色円形領域内に561 nmで照射した。(b)照射後、白色円形領域のペルオキシソームのTMRシグナルを漂白した。(C)照射後3.5時間で、EGFP-LC3BはROSストレスペルオキシソーム上に転移した。右上のインセット:(C)の白い正方形の領域の拡大図。すべてのスケールバー:5μm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図8:ImageJを用いた損傷したペルオキシソーム上の蛍光シグナルの定量化 。 (A)プロトコルのステップ4.2.1およびステップ4.2.2のスクリーンショット。(B)プロトコルのステップ4.2.2のスクリーンショット。(C)プロトコルの手順4.2.3のスクリーンショット。(D)プロトコルのステップ4.2.4のスクリーンショット。(E) プロトコルのステップ 4.2.4 およびステップ 4.2.5 のスクリーンショット。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図9:個々のペルオキシソーム内での光活性化ROS産生。 ペルオキシソーム局在化酸化還元プローブroGFP2-VKSKLを使用して、標的ペルオキシソーム内での光活性化ROS産生を検証しました。diKillerRed-VKSKLおよびroGFP2-VKSKLを発現するNIH3T3細胞の白色円形領域内のペルオキシソームを561nmの光で照射し、(A)561nmの光照射前と(B)561nmの光照射後に示した。左:405 nm励起によるroGFP2-VKSKL発光(マゼンタ);中央:488 nm励起によるroGFP2-VKSKL発光(緑色)。405 nm(マゼンタ)で励起されたroGFP2-VKSKL発光シグナルと488 nm(緑)で励起された発光シグナルの比率は、ペルオキシソーム内のROSレベルを追跡します。(B)の白い円形領域は、561nmの照射後のdiKillerRed-VKSKL発光の即時損失を示しています。すべてのスケールバー:5μm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図10:培養皿上のすべてのペルオキシソームに世界的に損傷を与える。HaloTag-VKSKL、EGFP-Ub、およびPMP34-TagBFPを発現するSHSY5Y細胞をHaloTag TMRリガンドで1時間染色した。 (A)LED照明前、EGFP-Ub蛍光は細胞質内で均一であり、ペルオキシソーム(HaloTag TMRリガンドおよびPMP34-TagBFPでマーク)と共局在しなかった。(B)LED照明の9時間後、(B)の2つのパネルに示すように、共焦点皿で増殖した細胞内のすべてのペルオキシソームにEGFP-Ubシグナルが蓄積した。すべてのスケールバー:5μm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
このプロトコルは、光でペルオキシソームROSレベルを上昇させることにより、細胞培養内でStub1を介したペキソファジーをトリガーする方法を詳述しています。このプロトコルは色素支援ROS生成に依存しているため、目的の細胞内でdiKillerRed-VKSKLまたは色素標識SLPリガンド染色の十分な発現を確保する必要があります。異なる細胞型または異なる遺伝的背景の細胞がわずかに異なる特性を有するペルオキシソームを有する可能性があることを考えると、ペキソファジーの誘導を確実にするために正確な照明条件を調整する必要があるかもしれない。Stub1を介したペキソファジーの活性化をスクリーニングするための強力な手段は、EGFP-Ubが照明されたペルオキシソームに転座するかどうかを監視することです(照明後1時間)13。健康な細胞では、EGFP-Ubシグナルは通常、細胞質内に均一に分布しています。したがって、照射されたペルオキシソームへのその転座は観察が容易である。照明条件を最適化するために、光強度または照明時間を変更することができます。また、ペルオキシソームを損傷しようとするときは、下流のイメージングを妨げる可能性のある光化学的プロセスを受ける可能性があるため、色素の過剰照明を避けることも最善です。たとえば、KillerRedの過剰な照明により、弱い緑色の蛍光灯になる可能性があることが示されています。過剰照明は、照明23 の直後に照明されたペルオキシソーム上にかすかな緑色の信号を生成する(EGFPベースのレポーターの転座とは異なり、発生するのに数十分から数時間かかることがある)。
この方法論により、研究者は標準的なレーザー走査型共焦点顕微鏡を使用して細胞内のペルオキシソームの一部を損なうことができ、健康なペルオキシソームと損傷したペルオキシソームの運命の違いを直接比較することができます。既存の方法と比較して、ここでのプロトコルは、細胞内のすべてのペルオキシソームまたは他の細胞小器官ではなく、ペルオキシソームのごく一部にのみROSストレスを引き起こします。したがって、同じ細胞内のROSストレスペルオキシソームのペキソファジーに対する残りの健康なペルオキシソームの効果を研究することは可能です。
ディッシュ全体の照明を通じて、細胞培養内のすべてのペルオキシソームを標的とすることも可能であり、Stub1を介したペキソファジーの生化学的分析を可能にします。Hsc70/Stub1が損傷したペルオキシソームをどのように認識するか、およびStub1ユビキチン酸のペルオキシソーム基質はすべて、このプロトコルを使用して調査できる問題です。より一般的には、ペルオキシソーム障害プロトコルは、他のペルオキシソーム品質管理経路をプローブするためにも使用できます。ペルオキシソームが小胞体、ミトコンドリア、脂肪滴など、細胞内のさまざまな細胞小器官と密接に関連していることを考えると、細胞がペルオキシソーム障害に応答してすべての細胞構造の挙動をどのように体系的に調節するかを調べることも興味深いでしょう。
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Disclosures
著者は、競合する金銭的利益を宣言していません。
Acknowledgments
この作業は、台湾の国家科学技術評議会からのMOST 111-2311-B-001-019-MY3研究助成金によって部分的にサポートされました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 35 mm culture dish with a 20 mm diameter glass microwell | MatTek | P35G-1.5-20-C | 20 mm glass bottomed |
| 3-amino-1,2,4-triazole (3-AT) | Sigma Aldrich | A8056 | |
| bovine serum | ThermoFisher Scientific | 16170060 | |
| Cell culture incubator | Nuaire | NU-4750 | |
| diKillerRed-PTS1 | Academia Sinica | made by appending the KillerRed tandem dimer with PTS1(VKSKL) | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | ThermoFisher Scientific | 11965092 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F-12) | ThermoFisher Scientific | 11330032 | |
| EGFP-C1 | Clontech | pEGFP-C1 | The backbone of EGFP-C1 was used for cloning EGFP-Stub1, EGFP-Hsp70, EGFP-p62 |
| EGFP-Hsp70 | Academia Sinica | Hsp70 gene (HSPA1A) PCR amplified from HeLa cDNA and cloned into EGFP-C1 | |
| EGFP-LC3B | Addgene | 11546 | |
| EGFP-p62 | Academia Sinica | generated by inserting the human SQSTM1 gene (through PCR amplification of the HeLa cell cDNA) into EGFP-C1 | |
| EGFP-Stub1 | Academia Sinica | generated by inserting the mouse Stub1 gene (through PCR amplification of the total mouse kidney cDNA) into EGFP-C1 | |
| EGFP-Ub | Addgene | 11928 | |
| fetal bovine serum | ThermoFisher Scientific | 10437028 | |
| HaloTag TMR ligand | Promega | G8252 | |
| HaloTag-PTS1 | Academia Sinica | PTS1 appended and cloned into EGFP-C1 backbone | |
| HEPES | ThermoFisher Scientific | 15630080 | |
| Inverted Confocal Microscope | Olympus | FV3000RS | 405 nm Ex, 488 nm Ex, 561 nm Ex, microscope with a TOKAI HIT chamber incubator and the UNIV2-D35 dish attachment |
| Janelia Fluor 646 HaloTag Ligand | Promega | GA1120 | |
| LED | VitaStar | PAR64 | 80 W, 555-570 nm |
| lipofectamine 2000 | ThermoFisher Scientific | 11668 | transfection reagent |
| NIH3T3 cell | ATCC | CRL-1658 | adherent |
| Opti-MEM | ThermoFisher Scientific | 319850 | reduced serum media |
| penicillin/streptomycin | ThermoFisher Scientific | 15140 | |
| PMP34-TagBFP | Academia Sinica | PMP34 PCR amplified from HeLa cDNA and cloned intoTagBFP-C (Evrogen FP171) | |
| roGFP2-PTS1 | Academia Sinica | generated by appending eroGFP (taken from Addgene plasmid 20131) with the amino acid sequence VKSKL, and cloned into the EGFP-C1 | |
| SHSY5Y cell | ATCC | CRL-2266 | adherent |
References
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