Summary
이 프로토콜은 살아있는 세포에서 Stub1 매개 pexophagy를 트리거하고 모니터링하기 위한 지침을 제공합니다.
Abstract
포유류 세포는 Stub1 매개 pexophagy를 통해 과산화소체를 뒤집을 수 있습니다. 이 경로는 잠재적으로 과산화소체의 양과 질에 대한 세포 제어를 허용합니다. 이 과정에서 열 충격 단백질 70과 유비퀴틴 E3 리가아제인 Stub1은 과산화소체로 전위되어 펙소파지를 시작합니다. Stub1 리가제 활성은 표적 과산화소체에 유비퀴틴 및 기타 자가포식 관련 모듈의 축적을 허용합니다. 퍼옥시좀 루멘 내에서 활성 산소종(ROS) 수준을 높이면 Stub1 매개 축척을 활성화할 수 있습니다. 따라서 염료 보조 ROS 생성을 사용하여 이 경로를 트리거하고 모니터링할 수 있습니다. 이 기사에서는 포유류 세포 배양 내에서 펙소파지를 시작하기 위해 형광 단백질과 합성 형광단의 두 가지 종류의 염료를 사용하는 절차를 간략하게 설명합니다. 이러한 염료 보조 ROS 생성 기반 프로토콜은 전 세계적으로 세포 집단 내의 모든 과산화소체를 표적으로 삼는 데 사용할 수 있을 뿐만 아니라 단일 세포 내에서 개별 과산화소체의 조작을 허용할 수도 있습니다. 또한 생세포 현미경을 사용하여 Stub1 매개 pexophagy를 추적하는 방법도 설명합니다.
Introduction
과산화소체는 대부분의 진핵 세포에 존재하는 단일 막 결합 소기관입니다. 과산화소체는 매우 긴 사슬 지방산의 베타 산화, 퓨린 이화 작용, 에테르 인지질 및 담즙산 합성을 수행하는 데 필수적인 대사 구획입니다1. 과산화소체 유래 아세틸-CoA는 대사에서 중추 신호 전달을 조절하여 지질 항상성을 조절합니다2. 따라서 손상된 과산화소체 기능이 신경퇴행성 장애, 노화, 암, 비만 및 당뇨병을 포함한 다양한 질병에 내포되어 있다는 것은 놀라운 일이 아닙니다 3,4,5. 퍼옥시솜 작동의 유지에 필수적인 과정은 pexophagy입니다. Pexophagy는 autophagy에 의한 peroxisomes의 선택적 회전율을위한 이화 작용 과정입니다. 세포는 펙소파지를 사용하여 과산화소체의 양과 질을 조절하여 적절한 과산화소체 기능을 보장합니다. 최근 연구에 따르면 PEX1 퍼옥시좀 생물 발생 인자 1 및 6의 돌연변이로 인한 과산화소체 손실은 제어되지 않은 pexophagy6의 결과입니다. 특히, 모든 과산화소체 생물발생 장애(PBD) 환자의 65%는 포유류 세포에서 PEX1, PEX6 및 PEX26으로 구성된 과산화소체 AAA ATPase 복합체의 결핍을 가지고 있다7.
pexophagy를 시작하고 연구하기 위해 여러 가지 방법을 사용할 수 있습니다. 효모에서 pexophagy는 공급된 영양소가 과산화소체 의존성 탄소원에서 과산화소체 비의존성 탄소원(세포 과산화소체 수를 낮추기 위해)으로 전환될 때 촉발됩니다.8. 예를 들어, 메탄올-성장한 Pichia pastoris 세포를 메탄올 배지로부터 글루코스 배지 및 에탄올 배지로 옮기는 것은 각각 미세 펙소파지 및 마크로펙소파지를 유도한다 8,9,10. Micropexophagy 격리기는 액포를 리모델링하여 컵 모양의 액포 격리 막과 미세 포식식 특이적 막 장치(MIPA)라고 하는 뚜껑 모양의 구조를 형성함으로써 분해를 위해 클러스터링된 과산화소체를 클러스터링했습니다. macropexophagy에서, 개별 peroxisomes는 pexophagosomes로 알려진 이중 막 구조에 의해 삼켜지고, 분해를 위해 액포와 융합됩니다 8,9,10. 사카로미세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae)의 Atg36p 및 피키아 파스토리스(Pichia pastoris)의 Atg30p와 같은 엑소포지(pexophagy) 수용체의 인산화는 수용체가 핵심 자가포식 기계를 모집하고 자가포식소체 8,11에 대한 과산화소체 표적화를 촉진하는 데 중요합니다.
포유류 세포에서, pexophagy는 유비퀴틴화에 의해 유도 될 수있다. 퍼옥시좀 막 단백질 PMP34 또는 PEX3에 세포질 측의 유비퀴틴을 태깅하면 pexophagy가 유도됩니다12. PEX3의 과발현은 리소좀에 의한 과산화소체 유비퀴틴화 및 과산화소체 제거를 유도한다13. 또한, PEX5와 C-말단 EGFP의 융합은 모노유비퀴틴화 PEX5의 수출을 손상시키고 펙소파지14를 초래한다. 한편, pexophagy는 또한 H 2 O2처리에 의해 유발 될 수 있습니다. 과산화소체는 활성 산소 종(ROS)을 생성합니다. 특히, 매우 긴 사슬 지방산 (> 22 탄소)의 베타 산화의 초기 단계를 촉매하는 퍼 옥시 솜 효소 Acox1은 아세틸 -CoA뿐만 아니라 퍼 옥시 솜 ROS도 생성합니다. H2O2 처리 하에서 증가된 ROS수준에 반응하여, 포유동물 세포는 ROS 생산을 낮추고 스트레스를 완화하기 위해 펙소파지를 활성화시킨다. H2O2 치료는 모세혈관확장증 변이된 운동실조증(ATM)을 과산화소체로 모집하는 것으로 보고되었습니다. 그런 다음 ATM은 PEX5를 인산화하여 pexophagy15에 의한 과산화소체 회전율을 촉진합니다.
과산화소체는 ROS 생성 센터이기 때문에 ROS 손상이 발생하기 쉽습니다. ROS로 유도된 과산화소체 손상은 세포가 과산화소체 품질 관리 경로(자가포식에 의해 손상된 과산화소체 제거)를 시작하기 위해 축과를 활성화하도록 합니다. 여기에서는 ROS로 유도된 과산화소체 손상의 주문형 트리거링에 대한 접근 방식을 간략하게 설명합니다. 이 프로토콜은 세포 소기관 16,17,18,19,20 내에서 광 활성화 ROS 생산을 활용합니다(그림 1). 염료 표지된 과산화소체가 조명되어 과산화소체 내강 내에서 ROS 생성을 유도하며, 이는 특히 과산화소체 손상을 유발합니다. 이 프로토콜을 사용하여 ROS 스트레스 과산화소체가 유비퀴틴 의존성 분해 경로를 통해 제거되는 것으로 나타났습니다. ROS 스트레스 과산화소체는 유비퀴틴 E3 리가제 Stub1을 모집하여 엑소포지에 의한 개별 제거를 위해 자가포식소체로 삼킬 수 있도록 합니다16. 이 프로토콜을 사용하여 타임랩스 현미경으로 동일한 세포 내에서 손상되고 건강한 과산화소체의 운명을 비교할 수 있습니다. 이 방법은 또한 배양 접시의 모든 과산화소체(모든 세포에서)를 전체적으로 손상시키는 데 사용할 수 있어 축식성 경로의 생화학적 분석이 가능합니다.
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Protocol
1. 퍼옥시좀 루멘에서 diKillerRed 또는 자가 표지 단백질(SLP)을 발현하는 세포의 제조
- 유리 바닥의 세포 배양 접시에 원하는 세포를 뿌립니다. 여기에서 실험을 위해 840μL의 배양 배지 (10% 소 태아 혈청 및 1% 페니실린/스트렙토마이신이 보충된 DMEM/F-12)의 2 x 10 5 인간 SHSY5Y 세포 또는 직경 20mm 유리 마이크로웰이 있는 35mm 배양 접시에 840μL의 배양 배지(10% 소 혈청 및 1% 페니실린/스트렙토마이신이 보충된 DMEM)의 6 x 104 마우스 NIH3T3 세포.
주: 씨를 뿌린 세포의 수는 다른 명세의 유리제 밑바닥 접시를 사용할 경우의 유리제 마이크로웰 지역에 따라 비례적으로 조정되어야 합니다. - 세포를 5%CO2/37°C 하에서 24시간 동안 성장시킨다.
- 형질주입 시약을 사용하여 원하는 플라스미드로 세포를 형질주입합니다.
- PMP34-TagBFP를 사용하여 살아있는 세포의 과산화소체를 라벨링합니다. 과산화소체 내강에서 ROS 생성을 위해 과산화소체 표적 diKillerRed-VKSKL 또는 SLP-VKSKL(+ 염료 표지 SLP 리간드)을 사용합니다(광 활성화 ROS 생산을 통해). 이 프로토콜에서는 자가 표지 단백질인 HaloTag-VKSKL21을 사용합니다. Stub1/Hsp70의 전좌, 유비퀴틴화 단백질의 축적 및 ROS 스트레스 과산화소체에 대한 자가포식소체의 형성을 모니터링하기 위해 EGFP-Stub1, EGFP-Hsp70, EGFP-Ub 또는 EGFP-LC3B를 각각 형질감염시킵니다. 과산화소체 내강에서 ROS 생성을 확인하기 위해 diKillerRed-VKSKL을 과산화소체 국소 형광 산화환원 프로브 roGFP2-VKSKL22와 함께 transfection합니다.
- SHSY5Y 세포 형질감염의 경우, 플라스미드를 55μL의 무혈청 DMEM/F-12에 희석하고 1μL의 형질주입 시약을 55μL의 무혈청 DMEM/F12에 희석합니다. 희석 된 DNA를 희석 된 시약과 결합하십시오. 부드럽게 혼합하고 실온에서 30분 동안 배양합니다.
- 항생제 없이 SHSY5Y용 배양 배지 100μL(10% 소 태아 혈청이 포함된 DMEM/F-12)로 미리 도금된 20mm 마이크로웰에 복합체를 추가합니다. 접시를 앞뒤로 부드럽게 흔든다.
- NIH3T3 세포 형질감염의 경우, 플라스미드 및 형질주입 시약을 희석하기 위해 무혈청 DMEM/F-12를 환원 혈청 배지로 대체합니다. 도금 배양 배지를 SHSY5Y로 교체하고 항생제가 없는 NIH3T3 세포용 배양 배지(DMEM with 10% bovine serum)로 교체합니다.
- 형질감염 2시간 후, 형질주입 시약 함유 배지를 제거하고, 새로운 배양 배지 1 mL를 첨가한다. NIH3T3 또는 SHSY5Y 세포를 37°C 및 5% CO2 에서 24시간 동안 배양합니다.
참고: 다른 세포주도 Stub1 매개 pexophagy(예: HeLa 세포)를 연구하는 데 사용할 수 있습니다.
2. 염료 표지 SLP 리간드로 과산화소체 염색(광 활성화 ROS 생산용)
- 형질감염 후 24시간에, 배양 배지를 제거하고, 200 nM HaloTag TMR 리간드 또는 200 nM Janelia Fluor 646 HaloTag 리간드 100 μL를 20 mm 유리 마이크로웰 상에 첨가한다.
참고: 염료 표지된 SLP 리간드는 각 세포주에 대해 각각의 배양 배지로 희석되어야 합니다. Janelia Fluor 646 표지 리간드를 선택하면 다운스트림 형광 이미징을 위한 청색, 녹색 및 적색 채널을 확보할 수 있습니다. - 접시를 37°C, 5%CO2 인큐베이터로 옮깁니다. 1 시간 동안 얼룩. 1시간 후, 염색 배지를 완전히 제거하고, 새로운 배양 배지 1 mL를 첨가한다.
3. 레이저 스캐닝 컨포칼 현미경에서 과산화소체의 ROS 스트레스
- 원하는 세포가 들어 있는 유리 바닥 접시를 스테이지 탑 인큐베이터가 장착된 레이저 스캐닝 컨포칼 현미경에 놓습니다.
- Tool Window(도구 창)를 클릭하고 Ocular(접안)를 선택한 다음 DIA 버튼(그림 2A)을 클릭하여 투과광을 켭니다. View 현미경 접안렌즈를 통해 접시를 보고 초점 손잡이를 돌려 세포에 초점을 맞춥니다.
- LSM을 선택하고 Dye & Detector Select 버튼을 클릭합니다(그림 2B). 팝업 창에서 원하는 염료를 두 번 클릭하여 세포 이미징을 위한 적절한 레이저 및 필터 설정을 선택합니다(그림 2C). 라이브 패널에서 Livex4를 클릭하여 빠른 레이저 스캐닝을 시작하여 세포의 형광 신호 스크리닝을 시작합니다(그림 2D).
- 스테이지를 움직여 조이스틱 컨트롤러를 사용하여 ROS 스트레스를 가할 중간 diKillerRed-VKSKL- 또는 SLP-VKSKL 발현 세포를 찾습니다(과산화소체에). 원하는 셀의 이미지를 획득합니다.
- Tool Window(도구 창)를 클릭하고 LSM Stimulation(LSM 자극)을 선택합니다(그림 2E). 타원 버튼을 클릭하고 라이브 이미지 창에서 마우스를 사용하여 ROS 응력이 적용될 3.4단계에서 획득한 원하는 과산화소체를 포함하는 직경 15μm의 원형 ROI(그림 2F)를 그립니다(그림 3 참조).
- ROS 스트레스를 적용하려면 diKillerRed-PTS1 또는 TMR 표지 SLP 리간드가 있는 세포에 561nm를 사용하고 Janelia Fluor 646 표지 SLP 리간드로 염색된 세포에 640nm를 사용합니다.
- ROS 응력을 가하기 위한 레이저 파장을 선택합니다. 원하는 레이저 백분율과 지속 시간을 입력합니다(그림 2G).
- 획득(Acquire)을 클릭하고 자극(Stimulation) 버튼(그림 2H)을 클릭하여 각각 30초 동안 ROI를 통해 561/640nm 빛으로 스캔을 시작합니다. 이는 여기에 사용된 컨포칼 현미경에서 561nm 및 640nm 모두에 대해 ~5% 레이저 출력 설정에 해당합니다. 이 작업은 과산화소체에서 ROS 생성으로 이어질 것입니다.
참고: 다양한 크기의 ROI를 선택할 수 있습니다. 면적에 따라 각 ROI에 대한 조명 시간을 비례적으로 조정해야 합니다. - 30초의 레이저 조명 후 ROI 내의 과산화소체는 diKillerRed-PTS1/TMR/Janelia Fluor 646 신호를 잃게 됩니다. 이 신호 손실을 통해 세포 내에서 조명된 과산화소체(손상 대 건강)와 조명되지 않은 과산화소체를 구별할 수 있습니다.
4. 타임랩스 이미징을 통한 살아있는 세포의 pexophagy 모니터링
- 프레임 간 1분 간격을 사용하여 타임랩스 이미징을 통해 EGFP 태그가 붙은 Stub1, Hsp70, Ub, p62 또는 LC3B를 조명/ROS 스트레스 과산화소체로 전좌를 따릅니다(예:amples, 그림 3-7 참조).
알림: EGFP-Stub1 또는 EGFP-Hsp70 신호는 조명 후 10-20분 후에 나타나기 시작하고 조명 후 ~40분 후까지 손상된 모든 과산화소체에 남아 있습니다. EGFP-Ub 신호는 조명 후 30분 동안 나타나고 2-3시간 동안 지속됩니다. EGFP-p62 전위는 조명 후 60분 후에 나타나고 EGFP-LC3B 신호는 조명 후 ~3시간 후에 볼 수 있습니다. - ImageJ를 사용하여 손상된 과산화소체(Stub1, Ub, p62 또는 LC3B)의 EGFP 신호를 정량화합니다. ImageJ를 사용하여 3채널 이미지(PMP34-TagBFP/EGFP-LC3B/HaloTag-VKSKL)를 정량화하려면 다음 단계를 수행합니다.
- 이미지를 열고 타원형 선택 또는 자유형 선택을 적용하여 조명된 모든 과산화소체(PMP34-TagBFP 신호 양성 및 표백된 HaloTag 리간드 신호)를 포함하는 영역을 둘러쌉니다. 그림 8A).
- 복제를 클릭하여 PMP34-TagBFP 채널을 선택합니다(그림 8A). 드롭다운 메뉴 Image > Adjust > Threshold를 사용하여 임계값을 설정하여 과산화소체를 표시합니다(그림 8B).
- Analyze(분석 ) > Analyze particles(입자 분석 )를 선택하여 조명된 과산화소체의 정확한 영역을 확인합니다. ImageJ는 이러한 관심 영역(ROI)을 ROI 관리자에 기록합니다(그림 8C).
- EGFP 결합 Ub, p62 또는 LC3B에서 형광 신호를 분석하기 위한 EGFP 채널을 선택하려면 복제를 클릭합니다(그림 8D). ROI 관리자에서 모든 ROI를 선택합니다(그림 8E).
- ROI Manager에서 Measure 를 적용하여 과산화소체의 EGFP 신호를 측정합니다(그림 8E). 결과 표에서 각 ROI에 대한 면적 및 적분 밀도 값(모든 픽셀 강도의 합)을 찾습니다(그림 8E).
- 조명 후 서로 다른 시점에서 평균 EGFP 형광 강도를 얻으려면 통합 EGFP 강도를 조명된 과산화소체의 총 면적(PMP34-TagBFP 신호 양성 및 HaloTag 리간드 신호 음성 영역)으로 나눕니다. 과산화소체에 축적된 신호를 얻으려면 시점의 평균 강도에서 시간 = 0의 평균 강도를 뺀 다음 시간 = 0의 평균 강도로 정규화합니다.
5. 배양 접시에 있는 모든 과산화소체(모든 세포에서)를 전체적으로 손상시킵니다.
- 1단계(과산화소체 표적 diKillerRed[diKillerRed-VKSKL] 또는 SLP[SLP-VKSKL]를 발현하는 세포의 준비) 및 2단계(SLP 리간드로 과산화소체 염색[광활성화 ROS 생산용])를 수행합니다.
- TMR 표지 리간드 염색 1시간 후, 염색 배지를 제거하고, 30 mM 3-AT(3-amino-1,2,4-triazole; 카탈라아제 억제제)를 함유하는 배양액 1 mL를 첨가하였다.
참고: 카탈라아제는 과산화소체 내강에서 발현되는 ROS 제거제이므로 3-AT 처리는 과산화소체의 광 유도 산화 손상을 증가시키는 데 도움이 됩니다. - 배양 접시를 LED(555-570nm) 위에 놓습니다. 인큐베이터에서 9시간 동안 1.8W/cm2 의 전력 밀도로 모든 셀을 비춥니다.
알림: 인큐베이터 외부에서 이 단계를 수행하려면 배양 접시를 37°C 가열판에 놓습니다. 3-AT 함유 배지에 20mM HEPES를 첨가하고 배양 접시를 투명 필름으로 덮어 가스 교환을 최소화합니다. HEPES는 LED 조명 중에CO2 인큐베이터 외부의 세포 배양에서 생리적 pH를 유지하는 완충제입니다. - 과산화소체에서 EGFP-Ub, EGFP-p62 또는 EGFP-LC3B 신호를 이미징하여 LED 유발 손상의 성공 여부를 검증합니다. 위에서 설명한 조명 조건을 사용하여 HaloTag-VKSKL을 안정적으로 발현하는 SHSY5Y 세포의 82%가 Stub1 매개 pexophagy를 나타냈습니다.
- 다운스트림 생화학 분석을 위해 세포를 수확합니다.
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Representative Results
여기에 표시된 Stub1 매개 pexophagy 유도 방식은 퍼옥시좀 내강 내에서 염료 보조 ROS 생성을 활용합니다. 이 작업에는 최소한의 광도가 필요합니다. 따라서 형광 단백질 또는 염료를 포함하는 과산화소체는 표준 레이저 스캐닝 컨포칼 현미경을 사용하여 조명할 수 있습니다. 초점 조명은 형광 리포터 roGFP2-VKSKL에 의해 표시된 바와 같이 개별 과산화소체 내에서 즉각적이고 국부적인 ROS 생성으로 이어집니다(그림 9). 이미징 중 추가 ROS 생성을 방지하기 위해 roGFP2-VKSKL 측정에서 diKillerRed-VKSKL을 이미지화하지 않았습니다. 그림 9 의 오른쪽 하단 diKillerRed-VKSKL 이미지는 손상된 과산화소체가13인 위치를 명확하게 나타내기 위해 모든 roGFP2-VKSKL 측정을 수행한 후에 촬영되었습니다. 데이터는 또한 조명되지 않은 과산화소체가 영향을 받지 않는다는 것을 보여주며, 이는 방법론의 정확성을 나타냅니다. ROS는 과산화소체 상주 분자의 작은 부분을 산화시켜 과산화소체 기능 장애를 유발합니다. 이 급성 수술을 통해 다양한 과산화소체 품질 관리 경로를 강력하게 조사할 수 있습니다.
우리는 이 방법론을 사용하여 Stub1 매개 pexophagy를 모니터링할 수 있었습니다. Stub1 매개 pexophagy에서 Hsp70은 Stub1을 ROS 스트레스 과산화소체에 모집하여 자가포식에 의한 과산화소체 회전을 시작합니다. 이 과정에서 Hsp70, Stub1, 유비퀴틴화 단백질, 자가포식 어댑터 p62 및 LC3B가 ROS 스트레스 과산화소체에 순차적으로 나타나 펙소파지를 구동합니다(그림 3, 그림 4, 그림 5, 그림 6 , 그림 7)13. 타임랩스 이미징을 통해 pexophagy에서 이러한 중요한 요소가 모집되는 시기와 순서를 따를 수 있었습니다. 과산화소체를 손상시키는 방법론을 사용함으로써 Hsp70/Stub1 기계가 손상된 과산화소체(기능적 과산화소체는 아님)를 구체적으로 표적으로 삼는다는 것을 쉽게 입증할 수 있습니다. 개별 과산화소체 내에서 ROS 생성을 유도하는 것 외에도 동일한 전략을 사용하여 Stub1 매개 축과식의 생화학적 특성화를 위해 배양 접시의 모든 과산화소체를 동시에 손상시킬 수 있었습니다(그림 10).
그림 1: 과산화소체에서 광 활성화 ROS 생산을 위한 개략도. (A) 빛에 의한 과산화소체 ROS 생성을 유발하는 방법의 개략도. KillerRed 탠덤 다이머 또는 형광 SLP 리간드와 같은 염료는 과산화소체 표적화 서열(VKSKL)을 사용하여 과산화소체로 표적화됩니다. (B) 3-AT는 카탈라아제를 억제하고 여기에 표시된 계획과 함께 사용하여 퍼옥시좀 루멘의 ROS 수준을 증가시킬 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 컨포칼 현미경을 사용하여 과산화소체에서 ROS 생산을 활성화합니다. (A) 프로토콜의 3.2단계에 대한 스크린샷. (B-D) 프로토콜의 3.3단계에 대한 스크린샷입니다. (전자) 프로토콜의 3.5단계에 대한 스크린샷입니다. (G) 프로토콜의 3.7 단계에 대한 스크린 샷. (H) 프로토콜의 3.8 단계에 대한 스크린 샷. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: ROS 스트레스 과산화소체에서 EGFP-Stub1의 전위. SHSY5Y 세포를 HaloTag-VKSKL, PMP34-TagBFP 및 EGFP-Stub1로 형질감염시켰다. 형질감염 하루 후, 세포를 37°C(200nM, 1시간)에서 HaloTag TMR 리간드로 염색했습니다. 여기서는 이 샘플에 있는 셀 중 하나의 데이터를 보여 줍니다. (A) 이 셀의 흰색 원형 영역은 561nm 조명을 위해 선택되었습니다. (B) 백색 원형 영역에서 조명된 과산화소체는 즉시 TMR 형광을 잃었습니다. (C) EGFP-Stub1은 t = 20분에서 조명된 과산화소체 상으로 전위됩니다. 왼쪽 상단 삽입물: 흰색 정사각형 영역의 확대 보기. 모든 스케일 바: 5 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: ROS 스트레스 과산화소체에 의한 EGFP-Hsp70 모집. HaloTag-VKSKL, PMP34-TagBFP 및 EGFP-Hsp70을 발현하는 SHSY5Y 세포에서 과산화소체를 200nM HaloTag TMR 리간드로 1시간 동안 염색했습니다. 여기서는 이 샘플에 있는 셀 중 하나의 데이터를 보여 줍니다. (a) 세포 내의 백색 원형 영역에 561 nm 조명을 실시하였다. (B) 이 조명 영역에서 조명된 과산화소체는 광표백으로 인해 즉시 TMR 형광을 잃었습니다. (C) EGFP-Hsp70은 20분 후 조명된 과산화소체 상으로 전위됩니다. 오른쪽 하단 삽입: 흰색 사각형 영역의 확대 보기. 모든 스케일 바: 5 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: ROS 스트레스 과산화소체에서 유비퀴틴화 단백질 축적의 타임랩스 이미징. (A) HaloTag TMR 리간드 염색 1시간 후, EGFP-Ub, PMP34-TagBFP 및 HaloTag-VKSKL을 발현하는 SHSY5Y 세포에서 백색 원형 영역 내의 과산화소체를 561nm로 조명했습니다. (B) 조명 후 영역 내의 TMR 형광을 표백하였다. EGFP-Ub는 나중에 조명된 과산화소체 상에 특이적으로 축적되었다(t = 561nm 조명 후 40분 및 2시간 후에 나타난다. 오른쪽 하단 삽입: 확대 view (C)의 흰색 사각형 영역. 모든 스케일 바: 5 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: ROS 스트레스 과산화소체에 대한 자가포식 어댑터 p62의 축적. (A) EGFP-p62, PMP34-TagBFP 및 HaloTag-VKSKL을 발현하는 SHSY5Y 세포의 흰색 원형 영역(HaloTag TMR 리간드로 염색됨; 200nM, 1시간)을 561nm 광으로 조명했습니다. (B) 조명은 표적 과산화소체에서 TMR 신호의 즉각적인 손실을 일으켰습니다. (C) 조명 후 2.5시간에, 과산화소체는 EGFP-p62를 모집하였다. 오른쪽 상단 삽입: 확대 view(C)에 있는 흰색 사각형 영역의 영역. 모든 스케일 바: 5 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 7: EGFP-LC3B를 ROS 스트레스 과산화소체로 전위. (A) HaloTag TMR 리간드 염색(200nM, 1시간) 후, EGFP-LC3B, PMP34-TagBFP 및 HaloTag-VKSKL을 발현하는 SHSY5Y 세포를 흰색 원형 영역 내에서 561nm로 조명했습니다. (B) 조명 후, 백색 원형 영역에서 과산화소체의 TMR 신호를 표백하였다. (C) 조명 후 3.5 시간에, EGFP-LC3B는 ROS- 스트레스 과산화 소체로 전위되었다. 오른쪽 상단 삽입: 확대 view(C)에 있는 흰색 사각형 영역의 영역. 모든 스케일 바: 5 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 8: ImageJ를 사용하여 손상된 과산화소체의 형광 신호 정량화 . (A) 프로토콜의 4.2.1 단계 및 4.2.2 단계에 대한 스크린 샷. (B) 프로토콜의 4.2.2 단계에 대한 스크린 샷. (C) 프로토콜의 4.2.3 단계에 대한 스크린 샷. (D) 프로토콜의 4.2.4 단계에 대한 스크린 샷. (E) 프로토콜의 4.2.4 단계 및 4.2.5 단계에 대한 스크린 샷. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 9: 개별 과산화소체 내에서 광 활성화 ROS 생성. 과산화소체 국소화 산화 환원 프로브 roGFP2-VKSKL을 사용하여 표적 과산화소체 내에서 광 활성화 ROS 생산을 검증했습니다. diKillerRed-VKSKL 및 roGFP2-VKSKL을 발현하는 NIH3T3 세포의 백색 원형 영역 내의 과산화소체를 561nm 광으로 조명하고, 이들은 (A) 561nm 광 조명 전과 (B) 561nm 광 조명 후를 나타냅니다. 왼쪽: 405nm 여기(자홍색)에서 roGFP2-VKSKL 방출; 중간: 488nm 여기(녹색)의 roGFP2-VKSKL 방출. 488nm(녹색)에 의해 여기된 방출 신호에 비해 405nm(자홍색)에 의해 여기된 roGFP2-VKSKL 방출 신호의 비율은 과산화소체 내의 ROS 수준을 추적합니다. (B)의 흰색 원형 영역은 561nm 조명 후 diKillerRed-VKSKL 방출의 즉각적인 손실을 보여줍니다. 모든 스케일 바: 5 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 10: 배양 접시에 있는 모든 과산화소체를 전체적으로 손상시킵니다. HaloTag-VKSKL, EGFP-Ub 및 PMP34-TagBFP를 발현하는 SHSY5Y 세포를 HaloTag TMR 리간드로 1시간 동안 염색하였다. (A) LED 조명 전에 EGFP-Ub 형광은 세포질에서 균질했으며 과산화소체와 공동 국소화되지 않았습니다(HaloTag TMR 리간드 및 PMP34-TagBFP로 표시됨). (B) LED 조명 9시간 후, EGFP-Ub 신호는 (B)의 두 패널에 표시된 바와 같이 공초점 접시에서 성장한 세포의 모든 과산화소체에 축적됩니다. 모든 스케일 바: 5 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
이 프로토콜은 빛으로 퍼옥시좀 ROS 수준을 높여 세포 배양 내에서 Stub1 매개 pexophagy를 유발하는 방법을 자세히 설명합니다. 이 프로토콜은 염료 보조 ROS 생성에 의존하기 때문에 관심 세포 내에서 diKillerRed-VKSKL 또는 염료 표지 SLP 리간드 염색의 충분한 발현을 보장해야 합니다. 서로 다른 세포 유형 또는 서로 다른 유전적 배경을 가진 세포가 약간 다른 특성을 가진 과산화소체를 보유할 수 있다는 점을 감안할 때, 축척의 유도를 보장하기 위해 정확한 조명 조건을 조정해야 할 수도 있습니다. Stub1 매개 pexophagy의 활성화를 스크리닝하기 위한 강력한 조치는 EGFP-Ub가 조명된 과산화소체(조명 후 1시간)로 전위되는지 여부를 모니터링하는 것입니다13. 건강한 세포에서 EGFP-Ub 신호는 일반적으로 세포질에 고르게 분포됩니다. 따라서 조명된 과산화소체로의 전위는 관찰하기 쉽습니다. 조명 조건을 최적화하기 위해 광도 또는 조명 시간을 변경할 수 있습니다. 또한 과산화소체를 손상시키려고 할 때 염료의 과도한 조명을 피하는 것이 가장 좋습니다., 일부는 다운스트림 이미징을 방해할 수 있는 광화학적 과정을 거칠 수 있기 때문입니다. 예를 들어, KillerRed의 과도한 조명으로 인해 약한 녹색 형광등이 될 수 있는 것으로 나타났습니다. 과잉 조명은 조명23 직후에 조명된 과산화소체에 희미한 녹색 신호를 생성합니다(발생하는 데 수십 분에서 몇 시간이 걸릴 수 있는 EGFP 기반 리포터의 전위와 달리).
이 방법론을 통해 연구자들은 표준 레이저 스캐닝 컨포칼 현미경을 사용하여 세포 내 과산화소체의 일부를 손상시킬 수 있으며, 이를 통해 건강한 과산화소체와 손상된 과산화소체 간의 운명 차이를 직접 비교할 수 있습니다. 기존 방법과 비교하여 여기의 프로토콜은 세포의 모든 과산화소체 또는 기타 소기관이 아닌 과산화소체의 작은 부분에만 ROS 스트레스를 유발합니다. 따라서 동일한 세포에서 ROS 스트레스 과산화소체의 외포식에 대한 나머지 건강한 과산화소체의 효과를 연구하는 것이 가능합니다.
전체 접시의 조명을 통해 세포 배양 내의 모든 과산화소체를 표적으로 삼을 수도 있으므로 Stub1 매개 pexophagy의 생화학적 분석이 가능합니다. Hsc70/Stub1이 손상된 과산화소체를 인식하는 방법과 Stub1 유비퀴틴산이 무엇인지는 모두 이 프로토콜을 사용하여 탐색할 수 있는 질문입니다. 보다 일반적으로, 퍼옥시좀 손상 프로토콜은 또한 다른 퍼옥시좀 품질 관리 경로를 조사하기 위해 사용될 수 있다. 과산화소체가 소포체, 미토콘드리아 및 지질 방울을 포함하여 세포 내의 많은 다른 세포 소기관과 밀접하게 연결되어 있다는 점을 감안할 때, 세포가 과산화소체 손상에 반응하여 모든 세포 구조의 행동을 체계적으로 조절하는 방법을 조사하는 것도 흥미로울 것입니다.
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Disclosures
저자는 경쟁하는 재정적 이익을 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
이 연구는 대만 국립 과학 기술위원회 (National Science and Technology Council)의 MOST 111-2311-B-001-019-MY3 연구 보조금으로 부분적으로 지원되었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 35 mm culture dish with a 20 mm diameter glass microwell | MatTek | P35G-1.5-20-C | 20 mm glass bottomed |
| 3-amino-1,2,4-triazole (3-AT) | Sigma Aldrich | A8056 | |
| bovine serum | ThermoFisher Scientific | 16170060 | |
| Cell culture incubator | Nuaire | NU-4750 | |
| diKillerRed-PTS1 | Academia Sinica | made by appending the KillerRed tandem dimer with PTS1(VKSKL) | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | ThermoFisher Scientific | 11965092 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F-12) | ThermoFisher Scientific | 11330032 | |
| EGFP-C1 | Clontech | pEGFP-C1 | The backbone of EGFP-C1 was used for cloning EGFP-Stub1, EGFP-Hsp70, EGFP-p62 |
| EGFP-Hsp70 | Academia Sinica | Hsp70 gene (HSPA1A) PCR amplified from HeLa cDNA and cloned into EGFP-C1 | |
| EGFP-LC3B | Addgene | 11546 | |
| EGFP-p62 | Academia Sinica | generated by inserting the human SQSTM1 gene (through PCR amplification of the HeLa cell cDNA) into EGFP-C1 | |
| EGFP-Stub1 | Academia Sinica | generated by inserting the mouse Stub1 gene (through PCR amplification of the total mouse kidney cDNA) into EGFP-C1 | |
| EGFP-Ub | Addgene | 11928 | |
| fetal bovine serum | ThermoFisher Scientific | 10437028 | |
| HaloTag TMR ligand | Promega | G8252 | |
| HaloTag-PTS1 | Academia Sinica | PTS1 appended and cloned into EGFP-C1 backbone | |
| HEPES | ThermoFisher Scientific | 15630080 | |
| Inverted Confocal Microscope | Olympus | FV3000RS | 405 nm Ex, 488 nm Ex, 561 nm Ex, microscope with a TOKAI HIT chamber incubator and the UNIV2-D35 dish attachment |
| Janelia Fluor 646 HaloTag Ligand | Promega | GA1120 | |
| LED | VitaStar | PAR64 | 80 W, 555-570 nm |
| lipofectamine 2000 | ThermoFisher Scientific | 11668 | transfection reagent |
| NIH3T3 cell | ATCC | CRL-1658 | adherent |
| Opti-MEM | ThermoFisher Scientific | 319850 | reduced serum media |
| penicillin/streptomycin | ThermoFisher Scientific | 15140 | |
| PMP34-TagBFP | Academia Sinica | PMP34 PCR amplified from HeLa cDNA and cloned intoTagBFP-C (Evrogen FP171) | |
| roGFP2-PTS1 | Academia Sinica | generated by appending eroGFP (taken from Addgene plasmid 20131) with the amino acid sequence VKSKL, and cloned into the EGFP-C1 | |
| SHSY5Y cell | ATCC | CRL-2266 | adherent |
References
- Wanders, R. J., Waterham, H. R., Ferdinandusse, S. Metabolic interplay between peroxisomes and other subcellular organelles including mitochondria and the endoplasmic reticulum. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 3, 83 (2016).
- He, A., et al. Acetyl-CoA derived from hepatic peroxisomal β-oxidation inhibits autophagy and promotes steatosis via mTORC1 activation. Molecular Cell. 79 (1), 30.e4-42.e4 (2020).
- Cipolla, C. M., Lodhi, I. J.
- Fransen, M., Nordgren, M., Wang, B., Apanasets, O., Veldhoven, P. P. V. Aging, age-related diseases and peroxisomes. Peroxisomes and their Key Role in Cellular Signaling and Metabolism. 69, Springer. Dordrecht, the Netherlands. 45-65 (2013).
- Puri, P., et al. The plasma lipidomic signature of nonalcoholic steatohepatitis. Hepatology. 50 (6), 1827-1838 (2009).
- Law, K. B., et al. The peroxisomal AAA ATPase complex prevents pexophagy and development of peroxisome biogenesis disorders. Autophagy. 13 (5), 868-884 (2017).
- Nazarko, T. Y. Pexophagy is responsible for 65% of cases of peroxisome biogenesis disorders. Autophagy. 13 (5), 991-994 (2017).
- Eberhart, T., Kovacs, W. J. Pexophagy in yeast and mammals: An update on mysteries. Histochemistry and Cell Biology. 150 (5), 473-488 (2018).
- Manjithaya, R., Nazarko, T. Y., Farré, J. -C., Subramani, S. Molecular mechanism and physiological role of pexophagy. FEBS Letters. 584 (7), 1367-1373 (2010).
- Till, A., Lakhani, R., Burnett, S. F., Subramani, S. Pexophagy: The selective degradation of peroxisomes. International Journal of Cell Biology. 2012, 512721 (2012).
- Germain, K., Kim, P. K. Pexophagy: A model for selective autophagy. International Journal of Molecular Sciences. 21 (2), 578 (2020).
- Kim, P. K., Hailey, D. W., Mullen, R. T., Lippincott-Schwartz, J. Ubiquitin signals autophagic degradation of cytosolic proteins and peroxisomes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (52), 20567-20574 (2008).
- Yamashita, S., Abe, K., Tatemichi, Y., Fujiki, Y. The membrane peroxin PEX3 induces peroxisome-ubiquitination-linked pexophagy. Autophagy. 10 (9), 1549-1564 (2014).
- Nordgren, M., et al. Export-deficient monoubiquitinated PEX5 triggers peroxisome removal in SV40 large T antigen-transformed mouse embryonic fibroblasts. Autophagy. 11 (8), 1326-1340 (2015).
- Zhang, J., et al. ATM functions at the peroxisome to induce pexophagy in response to ROS. Nature Cell Biology. 17 (10), 1259-1269 (2015).
- Chen, B. -H., Chang, Y. -J., Lin, S., Yang, W. Y. Hsc70/Stub1 promotes the removal of individual oxidatively stressed peroxisomes. Nature Communications. 11 (1), 5267 (2020).
- Hung, Y. H., Chen, L. M., Yang, J. Y., Yang, W. Y. Spatiotemporally controlled induction of autophagy-mediated lysosome turnover. Nature Communications. 4, 2111 (2013).
- Mageswaran, S. K., Yang, W. Y., Chakrabarty, Y., Oikonomou, C. M., Jensen, G. J. A cryo-electron tomography workflow reveals protrusion-mediated shedding on injured plasma membrane. Science Advances. 7 (13), eabc6345 (2021).
- Yang, J. Y., Yang, W. Y. Spatiotemporally controlled initiation of parkin-mediated mitophagy within single cells. Autophagy. 7 (10), 1230-1238 (2011).
- Yang, J. Y., Yang, W. Y. Bit-by-bit autophagic removal of parkin-labelled mitochondria. Nature Communications. 4, 2428 (2013).
- Los, G. V., et al. HaloTag: A novel protein labeling technology for cell imaging and protein analysis. ACS Chemical Biology. 3 (6), 373-382 (2008).
- Lismont, C., Walton, P. A., Fransen, M. Quantitative monitoring of subcellular redox dynamics in living mammalian cells using RoGFP2-based probes. Methods in Molecular Biology. 1595, 151-164 (2017).
- Nordgren, M., et al. Potential limitations in the use of KillerRed for fluorescence microscopy. Journal of Microscopy. 245 (3), 229-235 (2012).
