Summary
Denne protokollen gir instruksjoner for å utløse og overvåke Stub1-mediert pexophagy i levende celler.
Abstract
Pattedyrceller kan snu peroksisomer gjennom Stub1-mediert pexophagy. Banen tillater potensielt cellulær kontroll av mengden og kvaliteten på peroksisomer. Under denne prosessen translokerer varmesjokkprotein 70 og ubiquitin E3-ligasen, Stub1, på peroksisomer som skal overføres for å initiere pexophagy. Stub1-ligaseaktiviteten tillater akkumulering av ubiquitin og andre autofagirelaterte moduler på målrettede peroksisomer. Forhøyede nivåer av reaktive oksygenarter (ROS) i peroksisomale lumen kan aktivere Stub1-mediert pexophagy. Man kan derfor bruke fargeassistert ROS-generering for å utløse og overvåke denne banen. Denne artikkelen skisserer prosedyrene for bruk av to klasser av fargestoffer, fluorescerende proteiner og syntetiske fluoroforer, for å initiere pexophagy i pattedyrcellekulturer. Disse fargeassisterte ROS-generasjonsbaserte protokollene kan ikke bare brukes til å målrette alle peroksisomer i en cellepopulasjon globalt, men kan også tillate manipulering av individuelle peroksisomer i enkeltceller. Vi beskriver også hvordan Stub1-mediert pexophagy kan følges ved hjelp av levende cellemikroskopi.
Introduction
Peroksisomer er enkeltmembranbundne organeller tilstede i de fleste eukaryote celler. Peroksisomer er et metabolsk rom som er essensielt for å utføre beta-oksidasjon av svært langkjedede fettsyrer, purinkatabolisme og eterfosfolipid og gallesyresyntese1. Peroksisomavledet acetyl-CoA kontrollerer lipidhomeostase ved å regulere den sentrale signaleringen i metabolisme2. Derfor er det ingen overraskelse at kompromitterte peroksisomale funksjoner er underforstått i ulike sykdommer, inkludert nevrodegenerative lidelser, aldring, kreft, fedme og diabetes 3,4,5. En viktig prosess i vedlikehold av peroksisomal drift er pexophagy. Pexophagy er en katabolsk prosess for selektiv omsetning av peroksisomer ved autofagi. Celler bruker pexophagy for å kontrollere mengden og kvaliteten på peroksisomer, og dermed sikre riktig peroksisomalfunksjon. En nylig studie viste at peroksisomtap forårsaket av mutasjoner i PEX1 peroksisomal biogenesefaktor 1 og 6 skyldes ukontrollert pexophagy6. Spesielt har 65% av alle pasienter med peroksisombiogeneseforstyrrelse (PBD) mangler i det peroksisomale AAA ATPase-komplekset, sammensatt av PEX1, PEX6 og PEX26 i pattedyrceller7.
En rekke metoder kan brukes til å initiere og studere pexophagy. I gjær utløses peksofagi når de tilførte næringsstoffene byttes fra peroksisomavhengige karbonkilder til peroksisomuavhengige karbonkilder (til lavere cellulære peroksisomtall)8. For eksempel induserer overføringen av metanoldyrkede Pichia pastoris-celler fra metanolmedium til glukosemedium og etanolmedium mikropexophagy og makropexophagy, henholdsvis 8,9,10. Micropexophagy sekvestrere grupperte peroksisomer for nedbrytning ved å omforme vakuolen for å danne kopplignende vakuolære sekvestreringsmembraner og en lokklignende struktur kalt mikropexophagy-spesifikk membranapparat (MIPA). I makropexophagy blir individuelle peroksisomer oppslukt av dobbeltmembranstrukturer kjent som pexophagosomes, etterfulgt av fusjon med vakuolen for nedbrytning 8,9,10. Fosforyleringen av peksofagireseptorer, som Atg36p i Saccharomyces cerevisiae og Atg30p i Pichia pastoris, er avgjørende for reseptorene for å rekruttere kjerneautofagimaskiner og for å lette peroksisomal målretting mot autofagosomer 8,11.
I pattedyrceller kan pexophagy induseres av ubiquitinering. Merking av peroksisomale membranproteiner PMP34 eller PEX3 med ubiquitin på cytosolisk side induserer pexophagy12. Overekspresjon av PEX3 induserer peroksisom-ubiquitinering og peroksisomeliminasjon av lysosomer13. I tillegg svekker fusjonen av PEX5 med en C-terminal EGFP eksporten av monoubiquitinert PEX5 og resulterer i pexophagy14. På den annen side kan pexophagy også utløses av H 2 O2 behandling. Peroksisomer produserer reaktive oksygenarter (ROS); Spesielt produserer det peroksisomale enzymet Acox1, som katalyserer det første trinnet med beta-oksidasjon av svært langkjedede fettsyrer (> 22 karbon), ikke bare acetyl-CoA, men også peroksisomal ROS. Som svar på de økte ROS-nivåene under H 2 O2-behandling, aktiverer pattedyrceller pexophagy for å senke ROS-produksjonen og lindre stress. Det har blitt rapportert at H 2O2 -behandling driver rekruttering av ataksi-telangiektasi mutert (ATM) til peroksisomer. ATM fosforylerer deretter PEX5 for å fremme peroksisomal omsetning av pexophagy15.
Siden peroksisomer er ROS-genererende sentre, er de også utsatt for ROS-skade. ROS-fremkalte peroksisomale skader tvinger celler til å aktivere pexophagy for å initiere peroksisomkvalitetskontrollveier (fjerning av det skadede peroksisomet ved autofagi). Her skisserer vi en tilnærming for on-demand utløsing av ROS-fremkalt peroksisomal skade. Protokollen utnytter lysaktivert ROS-produksjon innenfor organeller 16,17,18,19,20 (figur 1). Fargemerkede peroksisomer belyses, noe som fører til ROS-produksjon i peroksisomale lumen, som spesifikt utløser peroksisomalskade. Ved hjelp av denne protokollen er det vist at ROS-stressede peroksisomer fjernes gjennom en ubiquitinavhengig nedbrytningsvei. ROS-stressede peroksisomer rekrutterer ubiquitin E3-ligasen Stub1 for å tillate deres oppslukt i autofagosomer for individuell fjerning av pexophagy16. Man kan bruke denne protokollen til å sammenligne skjebnen til skadde og friske peroksisomer i samme celle ved time-lapse-mikroskopi. Metoden kan også brukes til å skade alle peroksisomer (i alle celler) globalt på en kulturskål, noe som muliggjør den biokjemiske analysen av pexofagy-banen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Fremstilling av celler som uttrykker diKillerRed eller selvmerkende proteiner (SLP) i peroksisomlumen
- Frø de ønskede cellene på glassbunnede cellekulturretter. For eksperimentet her, frø 2 x 105 humane SHSY5Y-celler i 840 μL kulturmedium (DMEM / F-12 supplert med 10% føtal bovint serum og 1% penicillin / streptomycin) eller 6 x 104 mus NIH3T3 celler i 840 μL kulturmedium (DMEM supplert med 10% bovint serum og 1% penicillin / streptomycin) på en 35 mm kulturskål med en 20 mm diameter glass mikrobrønn.
MERK: Antall sådde celler bør justeres proporsjonalt i henhold til glassmikrobrønnområdet når du bruker glassbunnsfat av andre spesifikasjoner. - Dyrk cellene under 5 % CO2/37 °C i 24 timer.
- Transfekt cellene med ønskede plasmider ved hjelp av et transfeksjonsreagens.
- Bruk PMP34-TagBFP til å merke peroksisomer i levende celler. Bruk enten peroksisommålrettede diKillerRed-VKSKL eller SLP-VKSKL (+ fargemerkede SLP-ligander) for ROS-generering i peroksisomlumen (gjennom lysaktivert ROS-produksjon). I denne protokollen bruker vi det selvmerkende proteinet HaloTag-VKSKL21. For å overvåke translokasjonen av Stub1 / Hsp70, akkumuleringen av ubiquitinerte proteiner og dannelsen av autofagosomer på ROS-stressede peroksisomer, transfekt EGFP-Stub1, EGFP-Hsp70, EGFP-Ub eller EGFP-LC3B, henholdsvis. For å sjekke ROS-generering i peroksisomale lumen, co-transfekt diKillerRed-VKSKL med den peroksisomlokaliserte fluorescerende redokssonden roGFP2-VKSKL22.
- For SHSY5Y-celletransfeksjon, fortynn plasmider i 55 μL serumfri DMEM / F-12 og fortynn 1 μL transfeksjonsreagens i 55 μL serumfri DMEM / F12. Kombiner det fortynnede DNA med det fortynnede reagenset. Bland forsiktig, og rug i 30 min ved romtemperatur.
- Legg komplekset til 20 mm mikrobrønn tidligere belagt med 100 μL kulturmedium for SHSY5Y uten antibiotika (DMEM / F-12 med 10% føtal bovint serum). Rist fatet forsiktig frem og tilbake.
- For NIH3T3 celletransfeksjon, erstatt redusert serummedium for serumfri DMEM / F-12 for fortynning av plasmider og transfeksjonsreagens. Erstatt pletteringskulturmediet med SHSY5Y med kulturmedium for NIH3T3-celler uten antibiotika (DMEM med 10% bovint serum).
- Etter 2 timers transfeksjon, fjern transfeksjonsreagensholdig medium, og tilsett 1 ml friskt kulturmedium. Inkuber NIH3T3- eller SHSY5Y-cellene ved 37 ° C og 5% CO2 i 24 timer.
MERK: Andre cellelinjer kan også brukes til å studere Stub1-mediert pexophagy (f.eks. HeLa-celler).
2. Farging av peroksisomer med fargemerkede SLP-ligander (for lysaktivert ROS-produksjon)
- Ved 24 timer etter transfeksjon, fjern kulturmediet og tilsett 100 μL 200 nM HaloTag TMR-ligand eller 200 nM Janelia Fluor 646 HaloTag-ligand på 20 mm glassmikrobrønnen.
MERK: De fargemerkede SLP-ligandene skal fortynnes med det respektive kulturmediet for hver cellelinje. Å velge Janelia Fluor 646-merkede ligander vil frigjøre de blå, grønne og røde kanalene for nedstrøms fluorescensavbildning. - Overfør parabolen til en 37 ° C, 5% CO2 inkubator. Beis i 1 time. Etter 1 time, fjern fargemediet grundig, og tilsett 1 ml friskt kulturmedium.
3. ROS-stressing av peroksisomer på et laserskanning konfokalmikroskop
- Plasser en glassbunnet tallerken som inneholder de ønskede cellene på et laserskanning konfokalmikroskop utstyrt med en scene-topp inkubator.
- Klikk på Verktøyvindu, velg Ocular, og klikk på DIA-knappen (figur 2A) for å slå på det overførte lyset. Se parabolen gjennom mikroskopets okular, og bring cellene i fokus ved å vri fokusknappen.
- Velg LSM, og klikk på Velg-knappen Fargestoff og detektor (figur 2B). Dobbeltklikk på de ønskede fargestoffene i popup-vinduet for å velge passende laser- og filterinnstillinger for avbildning av cellene (figur 2C). Klikk på Livex4 i Live-panelet for å starte rask laserskanning for å starte screening for fluorescenssignalene til cellene (figur 2D).
- Flytt scenen rundt ved hjelp av joystickkontrolleren, og finn de mellomstore diKillerRed-VKSKL- eller SLP-VKSKL-uttrykkende cellene for å påføre ROS-stress (på peroksisomer). Skaff deg et bilde av ønsket celle.
- Klikk på Verktøyvindu, og velg LSM-stimulering (figur 2E). Klikk på ellipseknappen , og i live-bildevinduet bruker du musen til å tegne en sirkulær avkastning på 15 μm i diameter (figur 2F) som inneholder de ønskede peroksisomer oppnådd i trinn 3.4 som ROS-spenning vil bli påført (se figur 3 for et eksempel).
- For å påføre ROS-stress, bruk 561 nm for celler med diKillerRed-PTS1- eller TMR-merket SLP-ligand, og bruk 640 nm for celler farget med Janelia Fluor 646-merket SLP-ligand.
- Velg laserbølgelengden for påføring av ROS-spenningen. Angi ønsket laserprosent og varighet (figur 2G).
- Klikk på Hent, og klikk på Stimulering-knappen (Figur 2H) for å starte skanningen med 561/640 nm lys gjennom avkastningen i 30 s hver. Dette tilsvarer en ~ 5% lasereffektinnstilling for både 561 nm og 640 nm på konfokalmikroskopet som brukes her. Denne operasjonen vil føre til ROS-produksjon i peroksisomer.
MERK: Man kan velge avkastning av forskjellige størrelser. Man bør proporsjonalt justere belysningstiden for hver avkastning i henhold til området. - Etter 30 s laserbelysning vil peroksisomer innenfor avkastningen ha mistet diKillerRed-PTS1/TMR/Janelia Fluor 646-signalene. Dette signaltapet gjør det mulig å skille de opplyste fra de ikke-opplyste peroksisomer (skadet vs. sunt) i en celle.
4. Overvåking av pexophagy i levende celler ved time-lapse-avbildning
- Følg translokasjonen av EGFP-merket Stub1, Hsp70, Ub, p62 eller LC3B på de opplyste / ROS-stressede peroksisomer ved time-lapse-avbildning ved hjelp av 10 minutters intervaller mellom rammer (for eksempler, se figur 3-7).
MERK: EGFP-Stub1 eller EGFP-Hsp70 signaler begynner å vises 10-20 min etter belysning og holde på alle skadede peroksisomer til ~ 40 min etter belysning. EGFP-Ub-signalene vises 30 minutter etter belysning og varer i 2-3 timer. EGFP-p62-translokasjon vises 60 minutter etter belysning, og EGFP-LC3B-signaler blir synlige ~ 3 timer etter belysning. - Kvantifiser EGFP-signalene på de skadede peroksisomer (fra Stub1, Ub, p62 eller LC3B) ved hjelp av ImageJ. Utfør følgende trinn for å bruke ImageJ til å kvantifisere et trekanals bilde (PMP34-TagBFP/EGFP-LC3B/HaloTag-VKSKL).
- Åpne bildet, og bruk elliptiske markeringer eller frihåndsvalg for å omslutte regionen som inneholder alle de opplyste peroksisomer (PMP34-TagBFP-signal positivt og HaloTag-ligandsignal bleket; Figur 8A).
- Klikk på Dupliser for å velge PMP34-TagBFP-kanalen (figur 8A). Angi en terskel ved hjelp av rullegardinmenyen Bilde > Juster terskelen > for å markere peroksisomer (figur 8B).
- Velg Analyser > Analyser partikler for å bestemme de nøyaktige områdene av de opplyste peroksisomer. ImageJ registrerer disse interesseområdene (ROI) i ROI-behandleren (figur 8C).
- Klikk på Dupliser for å plukke ut EGFP-kanalen for å analysere fluorescenssignalet fra EGFP-konjugert Ub, p62 eller LC3B (figur 8D). Velg alle ROIene i ROI Manager (figur 8E).
- Bruk Mål i ROI Manager for å måle EGFP-signalene på peroksisomer (figur 8E). Finn verdien av arealet og integrert tetthet (summen av alle pikselintensitetene) for hver avkastning i resultattabellen (figur 8E).
- For å oppnå gjennomsnittlig EGFP-fluorescensintensitet på forskjellige tidspunkter etter belysning, del den integrerte EGFP-intensiteten med det totale arealet av opplyste peroksisomer (PMP34-TagBFP-signal positive og HaloTag-ligandsignalnegative områder). For å oppnå det akkumulerte signalet på peroksisomer, trekk den gjennomsnittlige intensiteten på et tidspunkt med gjennomsnittlig intensitet på tidspunkt = 0, og normaliser deretter med gjennomsnittlig intensitet på tidspunkt = 0.
5. Globalt skade alle peroksisomer (i hver celle) på en kultur parabolen
- Utfør trinn 1 (klargjøring av celler som uttrykker peroksisommålrettet diKillerRed [diKillerRed-VKSKL] eller SLP [SLP-VKSKL]) og trinn 2 (farging av peroksisomer med SLP-liganden [for lysaktivert ROS-produksjon]).
- Etter 1 time TMR-merket ligandfarging, fjern fargemediet og tilsett 1 ml dyrkningsmedium inneholdende 30 mM 3-AT (3-amino-1,2,4-triazol, en katalasehemmer).
MERK: Katalase er en ROS-scavenger uttrykt i peroksisomlumen, så 3-AT-behandling bidrar til å øke den lysfremkalte oksidative skaden på peroksisomer. - Plasser kulturfatet over en LED (555-570 nm). Belys alle cellene med en effekttetthet på 1,8 W / cm2 i 9 timer i en inkubator.
NOTAT: For å utføre dette trinnet utenfor en inkubator, plasser kulturfatet på en 37 ° C varmeplate. Tilsett 20 mM HEPES til det 3-AT-holdige mediet, og dekk kulturfatet med en gjennomsiktig film for å minimere gassutveksling. HEPES er et buffermiddel som opprettholder fysiologisk pH i cellekultur utenfor en CO2 -inkubator under LED-belysning. - Bekreft suksessen til LED-fremkalt skade ved å avbilde EGFP-Ub-, EGFP-p62- eller EGFP-LC3B-signalene på peroksisomer. Ved å bruke belysningsbetingelsen som er skissert ovenfor, viste 82% av SHSY5Y-celler som stabilt uttrykker HaloTag-VKSKL Stub1-mediert pexophagy.
- Høst cellene for nedstrøms biokjemisk analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Stub1-mediert pexophagy induksjonsskjema vist her utnytter fargeassistert ROS-generering innenfor peroksisomlumen. Denne operasjonen krever minimal lysintensitet. Peroksisomer som inneholder fluorescerende proteiner eller fargestoffer kan derfor belyses ved hjelp av standard laserskanning konfokale mikroskoper. Fokal belysning fører til øyeblikkelig og lokalisert ROS-produksjon innenfor individuelle peroksisomer, som indikert av den fluorescerende reporteren roGFP2-VKSKL (figur 9). Vi avbildet ikke diKillerRed-VKSKL i roGFP2-VKSKL-målingene for å unngå ytterligere ROS-generering under avbildning. Det nederste høyre diKillerRed-VKSKL-bildet i figur 9 ble tatt etter at alle roGFP2-VKSKL-målingene ble gjort for å tydelig indikere hvor de skadede peroksisomer var13. Dataene viser også at ubelyste peroksisomer ikke påvirkes, noe som indikerer metodikkens presisjon. ROS fører til oksidasjon av en liten brøkdel av peroksisomboende molekyler, noe som fører til peroksisomdysfunksjon. Denne akutte operasjonen gjør det mulig å undersøke de forskjellige peroksisomkvalitetskontrollveiene robust.
Vi kunne bruke denne metodikken til å overvåke Stub1-mediert pexophagy. I Stub1-mediert pexophagy rekrutterer Hsp70 Stub1 til ROS-stressede peroksisomer for å initiere peroksisomomsetning ved autofagi. Under denne prosessen vises Hsp70, Stub1, ubiquitinerte proteiner, autofagiadapter p62 og LC3B sekvensielt på ROS-stressede peroksisomer for å drive pexophagy (figur 3, figur 4, figur 5, figur 6 , figur 7) 13. Gjennom time-lapse-avbildning var det mulig å følge timing og rekkefølge for rekruttering av disse kritiske faktorene i pexophagy. Ved å bruke metodikken for å skade peroksisomer fokalt, kunne vi enkelt demonstrere at Hsp70 / Stub1-maskineriet spesifikt retter seg mot skadede peroksisomer (men ikke funksjonelle). Bortsett fra å fremkalle ROS-produksjon innenfor individuelle peroksisomer, var det mulig å bruke samme strategi for samtidig å skade alle peroksisomer på en dyrkningsskål for biokjemisk karakterisering av Stub1-mediert peksophagi (figur 10).
Figur 1: Skjematisk for lysaktivert ROS-produksjon i peroksisomer. (A) Skjematisk fremstilling av hvordan man utløser peroksisomal ROS generering av lys. Fargestoffer som KillerRed tandemdimerer eller fluorescerende SLP-ligander er målrettet mot peroksisomer ved bruk av peroksisommålrettingssekvenser (VKSKL). (B) 3-AT hemmer katalase og kan brukes sammen med skjemaet vist her for å øke ROS-nivåene i peroksisomale lumen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Bruk av konfokalmikroskop for å aktivere ROS-produksjon i peroksisomer. (A) Skjermbilde for trinn 3.2 i protokollen. (VG Nett) Skjermbilder for trinn 3.3 i protokollen. (VG Nett) Skjermbilder for trinn 3.5 i protokollen. (G) Skjermbilde for trinn 3.7 i protokollen. (H) Skjermbilde for trinn 3.8 i protokollen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Translokasjon av EGFP-Stub1 på ROS-stressede peroksisomer. SHSY5Y-celler ble transfektert med HaloTag-VKSKL, PMP34-TagBFP og EGFP-Stub1. En dag etter transfeksjon ble cellene farget med HaloTag TMR-liganden ved 37 °C (200 nM, 1 time). Her vises data fra en av cellene i dette utvalget. (A) Det hvite sirkulære området i denne cellen ble valgt for 561 nm belysning. (B) De opplyste peroksisomer i den hvite sirkulære regionen mistet umiddelbart sin TMR-fluorescens. (C) EGFP-Stub1 translokalisert på de opplyste peroksisomer ved t = 20 min. Øvre venstre innsats: forstørret visning av de hvite firkantede områdene . Alle skalastenger: 5 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Rekruttering av EGFP-Hsp70 ved ROS-stressede peroksisomer. Peroksisomer i SHSY5Y-cellene som uttrykker HaloTag-VKSKL, PMP34-TagBFP og EGFP-Hsp70 ble farget med 200 nM HaloTag TMR-ligand i 1 time. Her vises data fra en av cellene i dette utvalget. (A) Det hvite sirkulære området i cellen ble utsatt for 561 nm belysning. (B) De opplyste peroksisomer i dette opplyste området mistet umiddelbart sin TMR-fluorescens på grunn av fotobleking. (C) EGFP-Hsp70 translokalisert på de opplyste peroksisomer 20 minutter senere. Rammemarg nederst til høyre: forstørret visning av de hvite kvadratområdene. Alle skalastenger: 5 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Time-lapse-avbildning av ubiquitinert proteinakkumulering på ROS-stressede peroksisomer. (A) Etter 1 time med HaloTag TMR-ligandfarging ble peroksisomer i det hvite sirkulære området i en SHSY5Y-celle som uttrykker EGFP-Ub, PMP34-TagBFP og HaloTag-VKSKL opplyst med 561 nm. (B) TMR-fluorescensen i regionen ble bleket etter belysning. EGFP-Ub akkumuleres senere spesifikt på de opplyste peroksisomer (t = 40 min og 2 timer etter at 561 nm belysning er vist. Rammemarg nederst til høyre: forstørret visning av de hvite kvadratområdene i (C). Alle skalastenger: 5 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: Akkumulering av autofagiadapteren p62 på ROS-stressede peroksisomer . (A) Den hvite sirkulære regionen i en SHSY5Y-celle som uttrykker EGFP-p62, PMP34-TagBFP og HaloTag-VKSKL (farget med HaloTag TMR-liganden; 200 nM, 1 h) ble opplyst med 561 nm lys. (B) Belysningen forårsaket det umiddelbare tapet av TMR-signalene på de målrettede peroksisomer. (C) Ved 2,5 timer etter belysning rekrutterte peroksisomer EGFP-p62. Rammemarg øverst til høyre: forstørrede visninger av de hvite kvadratområdene i (C). Alle skalastenger: 5 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 7: Translokasjon av EGFP-LC3B på ROS-stressede peroksisomer. (A) Etter HaloTag TMR-ligandfarging (200 nM, 1 time) ble en SHSY5Y-celle som uttrykker EGFP-LC3B, PMP34-TagBFP og HaloTag-VKSKL opplyst med 561 nm innenfor det hvite sirkulære området. (B) Etter belysning ble TMR-signalet fra peroksisomer i det hvite sirkulære området bleket. (C) Ved 3,5 timer etter belysning translokeres EGFP-LC3B på de ROS-stressede peroksisomer. Rammemarg øverst til høyre: forstørrede visninger av de hvite kvadratområdene i (C). Alle skalastenger: 5 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 8: Kvantifisering av fluorescenssignalene på skadede peroksisomer ved bruk av ImageJ . (A) Skjermbilde for trinn 4.2.1 og trinn 4.2.2 i protokollen. (B) Skjermbilde for trinn 4.2.2 i protokollen. (C) Skjermbilde for trinn 4.2.3 i protokollen. (D) Skjermbilde for trinn 4.2.4 i protokollen. (E) Skjermbilde for trinn 4.2.4 og trinn 4.2.5 i protokollen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 9: Lysaktivert ROS-produksjon innenfor individuelle peroksisomer. Den peroksisomlokaliserte redokssonden roGFP2-VKSKL ble brukt til å validere den lysaktiverte ROS-produksjonen innenfor de målrettede peroksisomer. Peroksisomer innenfor den hvite sirkulære regionen av en NIH3T3-celle som uttrykker diKillerRed-VKSKL og roGFP2-VKSKL ble opplyst med 561 nm lys, og disse er vist (A) før 561 nm lysbelysning og (B) etter 561 nm lysbelysning. Venstre: roGFP2-VKSKL-utslipp med 405 nm eksitasjon (magenta); midten: roGFP2-VKSKL-utslipp med 488 nm eksitasjon (grønn). Forholdet mellom roGFP2-VKSKL-utslippssignalet opphisset av 405 nm (magenta) over utslippssignalet eksitert av 488 nm (grønn) sporer ROS-nivåene i peroksisomer. Den hvite sirkulære regionen i (B) viser det umiddelbare tapet av diKillerRed-VKSKL-utslipp etter 561 nm belysning. Alle skalastenger: 5 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 10: Globalt skadelig alle peroksisomer på en kulturskål. SHSY5Y-celler som uttrykker HaloTag-VKSKL, EGFP-Ub og PMP34-TagBFP ble farget med HaloTag TMR-ligand i 1 time. (A) Før LED-belysning var EGFP-Ub-fluorescens homogen i cytoplasma og samlokalisert ikke med peroksisomer (merket med HaloTag TMR-liganden og PMP34-TagBFP). (B) Etter 9 timer med LED-belysning akkumuleres EGFP-Ub-signalet på alle peroksisomer i cellene som vokser i en konfokal tallerken, som angitt i de to panelene i (B). Alle skalastenger: 5 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokollen beskriver hvordan man utløser Stub1-mediert pexophagy i cellekulturer ved å heve peroksisomale ROS-nivåer med lys. Siden protokollen er avhengig av fargeassistert ROS-generering, må man sikre tilstrekkelig uttrykk for diKillerRed-VKSKL eller fargemerket SLP-ligandfarging i cellene av interesse. Gitt at forskjellige celletyper eller celler med forskjellig genetisk bakgrunn kan ha peroksisomer med litt forskjellige egenskaper, må man kanskje justere de nøyaktige belysningsforholdene for å sikre induksjon av pexophagy. Et robust tiltak for å skjerme for aktivering av Stub1-mediert pexophagy er å overvåke om EGFP-Ub translokerer på de opplyste peroksisomer (1 time etter belysning)13. I friske celler er EGFP-Ub-signaler vanligvis jevnt fordelt i cytoplasma. Translokasjonen på opplyste peroksisomer er derfor lett å observere. For å optimalisere belysningstilstanden kan lysintensiteten eller belysningstiden endres. Det er også best å unngå overbelysning av fargestoffer når du prøver å skade peroksisomer, da noen kan gjennomgå fotokjemiske prosesser som kan forstyrre nedstrøms bildebehandling. For eksempel har det vist seg at overbelysningen av KillerRed kan føre til at den blir svakt grønn fluorescerende. Overbelysning genererer svake grønne signaler på de opplyste peroksisomer umiddelbart etter belysning23 (i motsetning til translokasjon av EGFP-baserte reportere, som kan ta titalls minutter til timer å skje).
Metoden tillater forskere å bruke standard laserskanning konfokale mikroskoper for å svekke en brøkdel av peroksisomer i en celle, noe som tillater direkte sammenligninger av forskjellen i skjebne mellom sunne og skadede peroksisomer. Sammenlignet med de eksisterende metodene, forårsaker protokollen her ROS-stress til bare en liten del av peroksisomer i stedet for alle peroksisomer eller andre organeller i cellene. Så det er mulig å studere effekten av de gjenværende sunne peroksisomer på pexophagy av ROS-stressede peroksisomer i samme celle.
Gjennom belysningen av en hel tallerken er det også mulig å målrette alle peroksisomer i en cellekultur, slik at den biokjemiske analysen av Stub1-mediert pexophagy. Hvordan Hsc70/Stub1 gjenkjenner skadede peroksisomer og hvilke peroksisomale substrater Stub1 ubiquitinater er alle spørsmål som kan utforskes ved hjelp av denne protokollen. Mer generelt kan protokollen for peroksisomsvekkelse også brukes til å undersøke andre peroksisomkvalitetskontrollveier. Gitt at peroksisomer er nært forbundet med mange forskjellige cellulære organeller i cellen, inkludert endoplasmatisk retikulum, mitokondriene og lipiddråpene, ville det også være interessant å undersøke hvordan celler systematisk modulerer oppførselen til alle cellulære strukturer som respons på peroksisomforringelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne oppgir ingen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble delvis støttet av et MOST 111-2311-B-001-019-MY3 forskningsstipend fra National Science and Technology Council i Taiwan.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 35 mm culture dish with a 20 mm diameter glass microwell | MatTek | P35G-1.5-20-C | 20 mm glass bottomed |
| 3-amino-1,2,4-triazole (3-AT) | Sigma Aldrich | A8056 | |
| bovine serum | ThermoFisher Scientific | 16170060 | |
| Cell culture incubator | Nuaire | NU-4750 | |
| diKillerRed-PTS1 | Academia Sinica | made by appending the KillerRed tandem dimer with PTS1(VKSKL) | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | ThermoFisher Scientific | 11965092 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F-12) | ThermoFisher Scientific | 11330032 | |
| EGFP-C1 | Clontech | pEGFP-C1 | The backbone of EGFP-C1 was used for cloning EGFP-Stub1, EGFP-Hsp70, EGFP-p62 |
| EGFP-Hsp70 | Academia Sinica | Hsp70 gene (HSPA1A) PCR amplified from HeLa cDNA and cloned into EGFP-C1 | |
| EGFP-LC3B | Addgene | 11546 | |
| EGFP-p62 | Academia Sinica | generated by inserting the human SQSTM1 gene (through PCR amplification of the HeLa cell cDNA) into EGFP-C1 | |
| EGFP-Stub1 | Academia Sinica | generated by inserting the mouse Stub1 gene (through PCR amplification of the total mouse kidney cDNA) into EGFP-C1 | |
| EGFP-Ub | Addgene | 11928 | |
| fetal bovine serum | ThermoFisher Scientific | 10437028 | |
| HaloTag TMR ligand | Promega | G8252 | |
| HaloTag-PTS1 | Academia Sinica | PTS1 appended and cloned into EGFP-C1 backbone | |
| HEPES | ThermoFisher Scientific | 15630080 | |
| Inverted Confocal Microscope | Olympus | FV3000RS | 405 nm Ex, 488 nm Ex, 561 nm Ex, microscope with a TOKAI HIT chamber incubator and the UNIV2-D35 dish attachment |
| Janelia Fluor 646 HaloTag Ligand | Promega | GA1120 | |
| LED | VitaStar | PAR64 | 80 W, 555-570 nm |
| lipofectamine 2000 | ThermoFisher Scientific | 11668 | transfection reagent |
| NIH3T3 cell | ATCC | CRL-1658 | adherent |
| Opti-MEM | ThermoFisher Scientific | 319850 | reduced serum media |
| penicillin/streptomycin | ThermoFisher Scientific | 15140 | |
| PMP34-TagBFP | Academia Sinica | PMP34 PCR amplified from HeLa cDNA and cloned intoTagBFP-C (Evrogen FP171) | |
| roGFP2-PTS1 | Academia Sinica | generated by appending eroGFP (taken from Addgene plasmid 20131) with the amino acid sequence VKSKL, and cloned into the EGFP-C1 | |
| SHSY5Y cell | ATCC | CRL-2266 | adherent |
References
- Wanders, R. J., Waterham, H. R., Ferdinandusse, S. Metabolic interplay between peroxisomes and other subcellular organelles including mitochondria and the endoplasmic reticulum. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 3, 83 (2016).
- He, A., et al. Acetyl-CoA derived from hepatic peroxisomal β-oxidation inhibits autophagy and promotes steatosis via mTORC1 activation. Molecular Cell. 79 (1), 30.e4-42.e4 (2020).
- Cipolla, C. M., Lodhi, I. J.
- Fransen, M., Nordgren, M., Wang, B., Apanasets, O., Veldhoven, P. P. V. Aging, age-related diseases and peroxisomes. Peroxisomes and their Key Role in Cellular Signaling and Metabolism. 69, Springer. Dordrecht, the Netherlands. 45-65 (2013).
- Puri, P., et al. The plasma lipidomic signature of nonalcoholic steatohepatitis. Hepatology. 50 (6), 1827-1838 (2009).
- Law, K. B., et al. The peroxisomal AAA ATPase complex prevents pexophagy and development of peroxisome biogenesis disorders. Autophagy. 13 (5), 868-884 (2017).
- Nazarko, T. Y. Pexophagy is responsible for 65% of cases of peroxisome biogenesis disorders. Autophagy. 13 (5), 991-994 (2017).
- Eberhart, T., Kovacs, W. J. Pexophagy in yeast and mammals: An update on mysteries. Histochemistry and Cell Biology. 150 (5), 473-488 (2018).
- Manjithaya, R., Nazarko, T. Y., Farré, J. -C., Subramani, S. Molecular mechanism and physiological role of pexophagy. FEBS Letters. 584 (7), 1367-1373 (2010).
- Till, A., Lakhani, R., Burnett, S. F., Subramani, S. Pexophagy: The selective degradation of peroxisomes. International Journal of Cell Biology. 2012, 512721 (2012).
- Germain, K., Kim, P. K. Pexophagy: A model for selective autophagy. International Journal of Molecular Sciences. 21 (2), 578 (2020).
- Kim, P. K., Hailey, D. W., Mullen, R. T., Lippincott-Schwartz, J. Ubiquitin signals autophagic degradation of cytosolic proteins and peroxisomes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (52), 20567-20574 (2008).
- Yamashita, S., Abe, K., Tatemichi, Y., Fujiki, Y. The membrane peroxin PEX3 induces peroxisome-ubiquitination-linked pexophagy. Autophagy. 10 (9), 1549-1564 (2014).
- Nordgren, M., et al. Export-deficient monoubiquitinated PEX5 triggers peroxisome removal in SV40 large T antigen-transformed mouse embryonic fibroblasts. Autophagy. 11 (8), 1326-1340 (2015).
- Zhang, J., et al. ATM functions at the peroxisome to induce pexophagy in response to ROS. Nature Cell Biology. 17 (10), 1259-1269 (2015).
- Chen, B. -H., Chang, Y. -J., Lin, S., Yang, W. Y. Hsc70/Stub1 promotes the removal of individual oxidatively stressed peroxisomes. Nature Communications. 11 (1), 5267 (2020).
- Hung, Y. H., Chen, L. M., Yang, J. Y., Yang, W. Y. Spatiotemporally controlled induction of autophagy-mediated lysosome turnover. Nature Communications. 4, 2111 (2013).
- Mageswaran, S. K., Yang, W. Y., Chakrabarty, Y., Oikonomou, C. M., Jensen, G. J. A cryo-electron tomography workflow reveals protrusion-mediated shedding on injured plasma membrane. Science Advances. 7 (13), eabc6345 (2021).
- Yang, J. Y., Yang, W. Y. Spatiotemporally controlled initiation of parkin-mediated mitophagy within single cells. Autophagy. 7 (10), 1230-1238 (2011).
- Yang, J. Y., Yang, W. Y. Bit-by-bit autophagic removal of parkin-labelled mitochondria. Nature Communications. 4, 2428 (2013).
- Los, G. V., et al. HaloTag: A novel protein labeling technology for cell imaging and protein analysis. ACS Chemical Biology. 3 (6), 373-382 (2008).
- Lismont, C., Walton, P. A., Fransen, M. Quantitative monitoring of subcellular redox dynamics in living mammalian cells using RoGFP2-based probes. Methods in Molecular Biology. 1595, 151-164 (2017).
- Nordgren, M., et al. Potential limitations in the use of KillerRed for fluorescence microscopy. Journal of Microscopy. 245 (3), 229-235 (2012).
