Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Мониторинг пексофагии, опосредованной Stub1

Published: May 12, 2023 doi: 10.3791/65010
Automatic Translation
1, 1,2
1Institute of Biological Chemistry, Academia Sinica, 2Institute of Biochemical Sciences, College of Life Sciences, National Taiwan University

Summary

Этот протокол содержит инструкции по запуску и мониторингу Stub1-опосредованной пексофагии в живых клетках.

Abstract

Клетки млекопитающих могут переворачивать пероксисомы через Stub1-опосредованную пексофагию. Этот путь потенциально позволяет клеточному контролю количества и качества пероксисом. Во время этого процесса белок 70 теплового шока и убиквитин-лигаза E3, Stub1, перемещаются на пероксисомы, чтобы перевернуться, чтобы инициировать пексофагию. Активность лигазы Stub1 позволяет накапливать убиквитин и другие модули, связанные с аутофагией, на целевых пероксисомах. Повышение уровня активных форм кислорода (АФК) в пероксисомальном просвете может активировать пексофагию, опосредованную Stub1. Таким образом, можно использовать генерацию АФК с помощью красителя для запуска и мониторинга этого пути. В этой статье описываются процедуры использования двух классов красителей, флуоресцентных белков и синтетических флуорофоров, для инициирования пексофагии в культурах клеток млекопитающих. Эти протоколы, основанные на генерации АФК с помощью красителей, могут не только использоваться для нацеливания на все пероксисомы в популяции клеток во всем мире, но также могут позволять манипулировать отдельными пероксисомами в отдельных клетках. Мы также описываем, как можно отслеживать пексофагию, опосредованную Stub1, с помощью микроскопии живых клеток.

Introduction

Пероксисомы представляют собой органеллы, связанные с одной мембраной, присутствующие в большинстве эукариотических клеток. Пероксисомы представляют собой метаболический компартмент, необходимый для осуществления бета-окисления очень длинноцепочечных жирных кислот, катаболизма пуринов и синтеза эфирфосфолипидов и желчных кислот1. Ацетил-КоА, полученный из пероксисом, контролирует гомеостаз липидов, регулируя центральную передачу сигналов в метаболизме2. Поэтому неудивительно, что нарушенные пероксисомальные функции подразумеваются при различных заболеваниях, включая нейродегенеративные расстройства, старение, рак, ожирение и диабет 3,4,5. Важным процессом в поддержании пероксисомальной работы является пексофагия. Пексофагия - это катаболический процесс селективного оборота пероксисом путем аутофагии. Клетки используют пексофагию, чтобы помочь контролировать количество и качество пероксисом, тем самым обеспечивая надлежащую функцию пероксисомы. Недавнее исследование показало, что потеря пероксисом, вызванная мутациями в факторах пероксисомального биогенеза PEX1 1 и 6, является результатом неконтролируемой пексофагии6. Примечательно, что 65% всех пациентов с нарушением биогенеза пероксисом (PBD) имеют дефицит пероксисомального комплекса ААА АТФазы, состоящего из PEX1, PEX6 и PEX26 в клетках млекопитающих7.

Для инициирования и изучения пексофагии может быть использован ряд методов. У дрожжей пексофагия запускается, когда поставляемые питательные вещества переключаются с пероксисом-зависимых источников углерода на пероксисомно-независимые источники углерода (для снижения количества клеточных пероксисом)8. Например, перенос выращенных в метаноле клеток Pichia pastoris из метанольной среды в среду глюкозы и этаноловую среду индуцирует микропексофагию и макропексофагию соответственно 8,9,10. Секвестраторы микропексофагии кластеризовали пероксисомы для деградации путем ремоделирования вакуоли с образованием чашеобразных вакуолярных секвестрирующих мембран и структуры, похожей на крышку, называемой микропексофагией-специфическим мембранным аппаратом (MIPA). При макропексофагии отдельные пероксисомы поглощаются двухмембранными структурами, известными как пексофагосомы, с последующим слиянием с вакуолью для деградации 8,9,10. Фосфорилирование рецепторов пексофагии, таких как Atg36p у Saccharomyces cerevisiae и Atg30p у Pichia pastoris, имеет решающее значение для рецепторов, чтобы рекрутировать основной механизм аутофагии и облегчать пероксисомальное нацеливание на аутофагосомы 8,11.

В клетках млекопитающих пексофагия может быть индуцирована убиквитинированием. Маркировка пероксисомальных мембранных белков PMP34 или PEX3 убиквитином на цитозольной стороне индуцирует пексофагию12. Сверхэкспрессия PEX3 индуцирует убиквитинирование пероксисом и элиминацию пероксисомлизосомами 13. Кроме того, слияние PEX5 с C-концевым EGFP ухудшает экспорт моноубиквитинированного PEX5 и приводит к пексофагии14. С другой стороны, пексофагия также может быть вызвана лечениемH2O2. Пероксисомы продуцируют активные формы кислорода (АФК); в частности, пероксисомальный фермент Acox1, который катализирует начальную стадию бета-окисления очень длинноцепочечных жирных кислот (> 22 углерода), продуцирует не только ацетил-КоА, но и пероксисомальные АФК. В ответ на повышенные уровни АФК при лечении H 2 O2клетки млекопитающих активируют пексофагию, чтобы снизить выработку АФК и облегчить стресс. Сообщалось, что лечение H 2 O2приводит к набору мутировавших атаксий-телеангиэктазий (ATM) в пероксисомы. Затем ATM фосфорилирует PEX5, способствуя пероксисомальному обороту за счет пексофагии15.

Поскольку пероксисомы являются центрами, генерирующими АФК, они также подвержены повреждению АФК. Пероксисомальные повреждения, вызванные АФК, заставляют клетки активировать пексофагию, чтобы инициировать пути контроля качества пероксисом (удаление поврежденной пероксисомы аутофагией). Здесь мы описываем подход к запуску по требованию пероксисомного повреждения, вызванного АФК. В протоколе используется активируемая светом продукция АФК в органеллах 16,17,18,19,20 (рис. 1). Пероксисомы, меченные красителем, подсвечиваются, что приводит к образованию АФК в просвете пероксисомы, что специфически вызывает пероксисомальное повреждение. С помощью этого протокола показано, что АФК-стрессовые пероксисомы удаляются по убиквитин-зависимому пути деградации. Пероксисомы, стрессированные АФК, рекрутируют убиквитин-E3-лигазу Stub1, чтобы позволить им проникнуть в аутофагосомы для индивидуального удаления с помощью пексофагии16. Этот протокол можно использовать для сравнения судьбы поврежденных и здоровых пероксисом в одной клетке с помощью покадровой микроскопии. Этот метод также может быть использован для глобального повреждения всех пероксисом (во всех клетках) на чашке для культивирования, что позволяет проводить биохимический анализ пути пексофагии.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Подготовка клеток, экспрессирующих diKillerRed или самомечеющиеся белки (SLP) в просвете пероксисом

  1. Высевают нужные клетки на чашки для клеточных культур со стеклянным дном. Для проведения эксперимента поместите 2 x 105 клеток SHSY5Y человека в 840 мкл питательной среды (DMEM/F-12 с добавлением 10% эмбриональной бычьей сыворотки и 1% пенициллина/стрептомицина) или 6 x 104 клеток NIH3T3 мыши в 840 мкл питательной среды (DMEM с добавлением 10% бычьей сыворотки и 1% пенициллина/стрептомицина) на культуральную чашку диаметром 35 мм со стеклянной микролункой диаметром 20 мм.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Количество засеянных ячеек должно быть пропорционально отрегулировано в соответствии с площадью стеклянной микролунки при использовании посуды со стеклянным дном других спецификаций.
  2. Выращивайте клетки при температуре ниже 5% CO2/37 °C в течение 24 часов.
  3. Трансфицируйте клетки желаемыми плазмидами с помощью реагента для трансфекции.
    1. Используйте PMP34-TagBFP для маркировки пероксисом в живых клетках. Используйте либо диKillerRed-VKSKL, нацеленный на пероксисомы, либо SLP-VKSKL (+ лиганды SLP, меченные красителем) для генерации АФК в просвете пероксисом (за счет производства АФК, активируемых светом). В этом протоколе мы используем самомаркирующийся белок HaloTag-VKSKL21. Для мониторинга транслокации Stub1/Hsp70, накопления убиквитинированных белков и образования аутофагосом на АФК-стрессовых пероксисомах трансфицируют EGFP-Stub1, EGFP-Hsp70, EGFP-Ub или EGFP-LC3B соответственно. Чтобы проверить генерацию АФК в пероксисомальном просвете, совместно трансфицируйте diKillerRed-VKSKL с локализованным пероксисомным флуоресцентным окислительно-восстановительным зондом roGFP2-VKSKL22.
    2. Для трансфекции клеток SHSY5Y разбавьте плазмиды в 55 мкл безсывороточного DMEM/F-12 и разбавьте 1 мкл реагента для трансфекции в 55 мкл DMEM/F12 без сыворотки. Соедините разбавленную ДНК с разбавленным реагентом. Аккуратно перемешайте и выдерживайте 30 минут при комнатной температуре.
    3. Добавьте комплекс в 20-миллиметровую микролунку, предварительно покрытую 100 мкл питательной среды для SHSY5Y без антибиотиков (DMEM/F-12 с 10% эмбриональной бычьей сывороткой). Аккуратно встряхните блюдо вперед и назад.
    4. Для трансфекции клеток NIH3T3 замените восстановленную сывороточную среду на безсывороточный DMEM/F-12 для разбавления плазмид и реагента для трансфекции. Замените гальваническую питательную среду SHSY5Y питательной средой для клеток NIH3T3 без антибиотиков (DMEM с 10% бычьей сывороткой).
  4. Через 2 ч после трансфекции удаляют среду, содержащую реагент для трансфекции, и добавляют 1 мл свежей питательной среды. Инкубируйте клетки NIH3T3 или SHSY5Y при 37 ° C и 5% CO2 в течение 24 часов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Другие клеточные линии также могут быть использованы для изучения пексофагии, опосредованной Stub1 (например, клетки HeLa).

2. Окрашивание пероксисом меченными красителем лигандами SLP (для получения светоактивируемых АФК)

  1. Через 24 часа после трансфекции удалите питательную среду и добавьте 100 мкл 200 нМ лиганда HaloTag TMR или 200 нМ лиганда Janelia Fluor 646 HaloTag на 20-миллиметровую стеклянную микролунку.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Меченные красителем лиганды SLP следует разбавлять соответствующей питательной средой для каждой клеточной линии. Выбор лигандов, меченных Janelia Fluor 646, освободит синий, зеленый и красный каналы для последующей флуоресцентной визуализации.
  2. Перенесите блюдо в инкубатор с температурой 37 ° C, 5% CO2 . Пятно на 1 ч. ч. Через 1 ч тщательно удалите окрашивающую среду и добавьте 1 мл свежей питательной среды.

3. АФК-стрессирование пероксисом на лазерно-сканирующем конфокальном микроскопе

  1. Поместите чашку со стеклянным дном, содержащую нужные клетки, на конфокальный микроскоп с лазерным сканированием, оснащенный настольным инкубатором.
  2. Нажмите « Окно инструментов», выберите «Окуляр» и нажмите кнопку DIA (рис. 2A), чтобы включить проходящий свет. Посмотрите на тарелку через окуляр микроскопа и сфокусируйте ячейки, повернув ручку фокусировки.
  3. Выберите LSM и нажмите кнопку « Выбор красителя и детектора » (рис. 2B). Дважды щелкните нужные красители во всплывающем окне, чтобы выбрать соответствующие настройки лазера и фильтра для визуализации клеток (рис. 2C). Нажмите на Livex4 на панели Live , чтобы начать быстрое лазерное сканирование, чтобы начать скрининг флуоресцентных сигналов клеток (рис. 2D).
  4. Перемещайте сцену с помощью джойстика и найдите средние клетки, экспрессирующие diKillerRed-VKSKL- или SLP-VKSKL, чтобы приложить АФК-стресс (к пероксисомам). Приобретите изображение нужной ячейки.
  5. Нажмите на Tool Window (Окно инструментов) и выберите LSM Stimulation (Стимуляция LSM ) (рис. 2E). Нажмите на кнопку эллипса и в окне живого изображения с помощью мыши нарисуйте круговой ROI диаметром 15 мкм (рис. 2F), содержащий желаемые пероксисомы, полученные на шаге 3.4, к которым будет приложено напряжение АФК (см. Рисунок 3 для примера).
  6. Чтобы применить стресс АФК, используйте 561 нм для клеток с лигандом SLP, меченным diKillerRed-PTS1 или TMR, и используйте 640 нм для клеток, окрашенных лигандом SLP, меченным Janelia Fluor 646.
  7. Выберите длину волны лазера для приложения напряжения АФК. Введите желаемый процент лазера и продолжительность (рис. 2G).
  8. Нажмите « Получить» и нажмите кнопку « Стимуляция » (рис. 2H), чтобы начать сканирование со светом 561/640 нм через ROI в течение 30 с каждый. Это соответствует настройке мощности лазера ~5% для 561 нм и 640 нм на используемом здесь конфокальном микроскопе. Эта операция приведет к образованию АФК в пероксисомах.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Можно выбрать ROI разных размеров. Следует пропорционально регулировать время освещения для каждого ROI в соответствии с его площадью.
  9. После 30 секунд лазерного освещения пероксисомы в ROI потеряют свои сигналы diKillerRed-PTS1/TMR/Janelia Fluor 646. Эта потеря сигнала позволяет отличить освещенные пероксисомы от неосвещенных (поврежденных и здоровых) внутри клетки.

4. Мониторинг пексофагии в живых клетках с помощью покадровой визуализации

  1. Проследите за транслокацией помеченных EGFP Stub1, Hsp70, Ub, p62 или LC3B на освещенные/напряженные АФК пероксисомы с помощью покадровой съемки с использованием 10-минутных интервалов между кадрами (например, см. Рисунки 3-7).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Сигналы EGFP-Stub1 или EGFP-Hsp70 начинают появляться через 10-20 минут после освещения и остаются на всех поврежденных пероксисомах до ~40 минут после освещения. Сигналы EGFP-Ub появляются через 30 минут после освещения и длятся 2-3 часа. Транслокация EGFP-p62 появляется через 60 минут после освещения, а сигналы EGFP-LC3B становятся видимыми через ~ 3 ч после освещения.
  2. Количественно оцените сигналы EGFP на поврежденных пероксисомах (из Stub1, Ub, p62 или LC3B) с помощью ImageJ. Выполните следующие действия для использования ImageJ для количественной оценки трехканального изображения (PMP34-TagBFP/EGFP-LC3B/HaloTag-VKSKL).
    1. Откройте изображение и примените эллиптический выбор или выбор от руки , чтобы заключить область, содержащую все освещенные пероксисомы (положительный сигнал PMP34-TagBFP и обесцвеченный сигнал лиганда HaloTag; Рисунок 8А).
    2. Нажмите « Дублировать », чтобы выбрать канал PMP34-TagBFP (рис. 8A). Установите порог с помощью выпадающего меню «Изображение» > «Настроить порог» > «Порог », чтобы отметить пероксисомы (рис. 8B).
    3. Выберите «Анализировать» > «Анализировать частицы», чтобы определить точные области освещенных пероксисом. ImageJ записывает эти области интереса (ROI) в менеджере ROI (рис. 8C).
    4. Нажмите « Дублировать », чтобы выбрать канал EGFP для анализа флуоресцентного сигнала из EGFP-сопряженного Ub, p62 или LC3B (рис. 8D). Выберите все ROI в ROI Manager (рис. 8E).
    5. Примените Measure в ROI Manager для измерения сигналов EGFP на пероксисомах (рис. 8E). Найдите значение площади и интегральной плотности (сумму всех интенсивностей пикселей) для каждого ROI в таблице результатов (рис. 8E).
    6. Чтобы получить среднюю интенсивность флуоресценции EGFP в разные моменты времени после освещения, разделите интегральную интенсивность EGFP на общую площадь освещенных пероксисом (положительные зоны сигнала PMP34-TagBFP и отрицательные зоны сигнала лиганда HaloTag). Чтобы получить накопленный сигнал на пероксисомах, вычтите усредненную интенсивность в момент времени на усредненную интенсивность в момент времени = 0, а затем нормализуйте на усредненную интенсивность в момент времени = 0.

5. Глобальное повреждение всех пероксисом (в каждой клетке) на культуральной чашке

  1. Выполните шаг 1 (подготовка клеток, экспрессирующих пероксисом-таргетированный diKillerRed [diKillerRed-VKSKL] или SLP [SLP-VKSKL]) и шаг 2 (окрашивание пероксисом лигандом SLP [для светоактивируемой продукции АФК]).
  2. После 1 ч окрашивания лиганда, меченного TMR, удаляют окрашивающую среду и добавляют 1 мл питательной среды, содержащей 30 мМ 3-АТ (3-амино-1,2,4-триазол; ингибитор каталазы).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Каталаза является поглотителем АФК, экспрессируемым в просвете пероксисом, поэтому лечение 3-AT помогает усилить окислительное повреждение пероксисом, вызванное светом.
  3. Поместите культуральную чашку над светодиодом (555-570 нм). Осветите все ячейки с плотностью мощности 1,8 Вт/см2 в течение 9 ч в инкубаторе.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы выполнить этот шаг вне инкубатора, поместите чашку с культурой на нагревательную пластину при температуре 37 ° C. Добавьте 20 мМ HEPES в среду, содержащую 3-AT, и накройте чашку для культивирования прозрачной пленкой, чтобы свести к минимуму газообмен. HEPES является буферным агентом, который поддерживает физиологический рН в клеточной культуре вне инкубатора CO2 во время светодиодного освещения.
  4. Подтвердите успешность повреждений, вызванных светодиодом, путем визуализации сигналов EGFP-Ub, EGFP-p62 или EGFP-LC3B на пероксисомах. Используя условия освещения, описанные выше, 82% клеток SHSY5Y, стабильно экспрессирующих HaloTag-VKSKL, проявляли пексофагию, опосредованную Stub1.
  5. Соберите клетки для последующего биохимического анализа.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Показанная здесь схема индукции пексофагии, опосредованная Stub1, использует преимущества генерации АФК с помощью красителя в просвете пероксисом. Эта операция требует минимальной интенсивности света. Таким образом, пероксисомы, содержащие флуоресцентные белки или красители, могут быть освещены с помощью стандартных конфокальных микроскопов с лазерным сканированием. Фокальное освещение приводит к мгновенному и локализованному образованию АФК в отдельных пероксисомах, на что указывает флуоресцентный репортер roGFP2-VKSKL (рис. 9). Мы не визуализировали diKillerRed-VKSKL в измерениях roGFP2-VKSKL, чтобы избежать дополнительной генерации АФК во время визуализации. Изображение diKillerRed-VKSKL в правом нижнем углу на рисунке 9 было сделано после того, как были проведены все измерения roGFP2-VKSKL, чтобы четко указать, где поврежденные пероксисомы были13. Данные также показывают, что неосвещенные пероксисомы не затронуты, что указывает на точность методологии. АФК приводит к окислению небольшой фракции резидентных молекул пероксисом, что приводит к дисфункции пероксисом. Эта острая операция позволяет надежно исследовать различные пути контроля качества пероксисом.

Мы смогли использовать эту методологию для мониторинга пексофагии, опосредованной Stub1. При пексофагии, опосредованной Stub1, Hsp70 рекрутирует Stub1 на АФК-стрессированные пероксисомы, чтобы инициировать оборот пероксисом путем аутофагии. Во время этого процесса Hsp70, Stub1, убиквитинированные белки, адаптер аутофагии p62 и LC3B последовательно появляются на АФК-стрессовых пероксисомах, управляя пексофагией (рис. 3, рис. 4, рис. 5, рис. 6, рис. 7)13. С помощью покадровой визуализации можно было проследить время и порядок привлечения этих критических факторов в пексофагии. Используя методологию для фокального повреждения пероксиом, мы могли бы легко продемонстрировать, что механизм Hsp70 / Stub1 специально нацелен на поврежденные пероксисомы (но не функциональные). Помимо выявления продукции АФК в отдельных пероксисомах, можно было использовать ту же стратегию для одновременного повреждения всех пероксисом на чашке для культивирования для биохимической характеристики пексофагии, опосредованной Stub1 (рис. 10).

Figure 1
Рисунок 1: Схема получения активированных светом АФК в пероксисомах . (A) Схема того, как запустить генерацию пероксисомальных АФК светом. Красители, такие как тандемные димеры KillerRed или флуоресцентные лиганды SLP, нацелены на пероксисомы с помощью последовательностей нацеливания на пероксисомы (VKSKL). (B) 3-AT ингибирует каталазу и может быть использован в сочетании со схемой, показанной здесь, для увеличения уровней АФК в пероксисомальном просвете. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: Использование конфокального микроскопа для активации продукции АФК в пероксисомах. (A) Снимок экрана для шага 3.2 протокола. (Б-Д) Скриншоты для шага 3.3 в протоколе. (Е-Ж) Скриншоты для шага 3.5 в протоколе. (G) Снимок экрана для шага 3.7 протокола. (H) Снимок экрана для шага 3.8 в протоколе. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3: Транслокация EGFP-Stub1 на пероксисомах, напряженных АФК. Клетки SHSY5Y трансфицировали препаратами HaloTag-VKSKL, PMP34-TagBFP и EGFP-Stub1. Через сутки после трансфекции клетки окрашивали лигандом HaloTag TMR при 37°C (200 нМ, 1 ч). Здесь показаны данные из одной из ячеек в этом образце. (A) Белая круглая область в этой ячейке была выбрана для освещения 561 нм. (B) Освещенные пероксисомы в белой круглой области немедленно потеряли свою флуоресценцию TMR. (C) EGFP-Stub1, перенесенный на освещенные пероксисомы при t = 20 мин. Вставки слева вверху: увеличенный вид областей белого квадрата. Все масштабные линейки: 5 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 4
Рисунок 4: Рекрутирование EGFP-Hsp70 АФК-стрессовыми пероксисомами. Пероксисомы в клетках SHSY5Y, экспрессирующих HaloTag-VKSKL, PMP34-TagBFP и EGFP-Hsp70, окрашивали лигандом HaloTag TMR 200 нМ в течение 1 ч. Здесь показаны данные из одной из ячеек в этом образце. (A) Белая круглая область в ячейке была подвергнута освещению 561 нм. (B) Освещенные пероксисомы в этой освещенной области немедленно потеряли свою флуоресценцию TMR из-за фотообесцвечивания. (C) EGFP-Hsp70 переносится на освещенные пероксисомы через 20 минут. Вставки в правом нижнем углу: увеличенный вид областей белого квадрата. Все масштабные линейки: 5 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 5
Рисунок 5: Покадровая визуализация накопления убиквитинированного белка на АФК-стрессовых пероксисомах. (A) Через 1 ч после окрашивания лиганда HaloTag TMR пероксисомы в белой кольцевой области в клетке SHSY5Y, экспрессирующей EGFP-Ub, PMP34-TagBFP и HaloTag-VKSKL, были освещены 561 нм. (B) Флуоресценция TMR в регионе была обесцвечена после освещения. Позже EGFP-Ub специфически накапливался на освещенных пероксисомах (показано t = 40 мин и 2 ч после освещения 561 нм). Вставки в правом нижнем углу: увеличенный вид областей белого квадрата в (C). Все масштабные линейки: 5 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 6
Рисунок 6: Накопление адаптера аутофагии p62 на АФК-стрессовых пероксисомах . (A) Белая круглая область в клетке SHSY5Y, экспрессирующей EGFP-p62, PMP34-TagBFP и HaloTag-VKSKL (окрашенная лигандом HaloTag TMR; 200 нМ, 1 ч), была освещена светом 561 нм. (B) Освещение вызвало немедленную потерю сигналов TMR на целевых пероксисомах. (C) Через 2,5 ч после освещения пероксисомы рекрутировали EGFP-p62. Вставки справа вверху: увеличенные виды областей белого квадрата в (C). Все масштабные линейки: 5 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 7
Рисунок 7: Транслокация EGFP-LC3B на пероксисомы с АФК-стрессом. (A) После окрашивания лиганда HaloTag TMR (200 нМ, 1 ч) клетка SHSY5Y, экспрессирующая EGFP-LC3B, PMP34-TagBFP и HaloTag-VKSKL, была освещена 561 нм в белой круглой области. (B) После освещения сигнал TMR пероксисом в белой круглой области был обесцвечен. (C) Через 3,5 ч после освещения EGFP-LC3B транслоцируется на пероксисомы, напряженные АФК. Вставки справа вверху: увеличенные виды областей белого квадрата в (C). Все масштабные линейки: 5 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 8
Рисунок 8: Количественная оценка сигналов флуоресценции на поврежденных пероксисомах с помощью ImageJ . (A) Снимок экрана для шага 4.2.1 и шага 4.2.2 в протоколе. (B) Снимок экрана для шага 4.2.2 протокола. (C) Снимок экрана для шага 4.2.3 протокола. (D) Снимок экрана для шага 4.2.4 в протоколе. (E) Снимок экрана для этапов 4.2.4 и 4.2.5 протокола. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 9
Рисунок 9: Активируемая светом продукция АФК в отдельных пероксисомах. Локализованный пероксисомами окислительно-восстановительный зонд roGFP2-VKSKL был использован для проверки продукции активируемых светом АФК в целевых пероксисомах. Пероксисомы в белой кольцевой области клетки NIH3T3, экспрессирующей diKillerRed-VKSKL и roGFP2-VKSKL, были освещены светом 561 нм, и они показаны (A) до освещения светом 561 нм и (B) после освещения светом 561 нм. Слева: излучение roGFP2-VKSKL с возбуждением 405 нм (пурпурный); посередине: излучение roGFP2-VKSKL с возбуждением 488 нм (зеленый). Отношение сигнала излучения roGFP2-VKSKL, возбужденного 405 нм (пурпурный), к сигналу излучения, возбужденному 488 нм (зеленый), отслеживает уровни АФК в пероксисомах. Белая круглая область в (B) показывает немедленную потерю излучения diKillerRed-VKSKL после освещения 561 нм. Все масштабные линейки: 5 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 10
Рисунок 10: Глобальное повреждение всех пероксисом на культуральной чашке. Клетки SHSY5Y, экспрессирующие HaloTag-VKSKL, EGFP-Ub и PMP34-TagBFP, окрашивали лигандом HaloTag TMR в течение 1 ч. (A) До светодиодного освещения флуоресценция EGFP-Ub была однородной в цитоплазме и не локализовалась с пероксисомами (отмеченными лигандом HaloTag TMR и PMP34-TagBFP). (B) После 9 часов светодиодного освещения сигнал EGFP-Ub накапливался на всех пероксисомах в клетках, выращенных в конфокальной чашке, как показано на двух панелях в (B). Все масштабные линейки: 5 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

В этом протоколе подробно описано, как запустить Stub1-опосредованную пексофагию в клеточных культурах путем повышения уровня пероксисомальных АФК с помощью света. Поскольку протокол основан на генерации АФК с помощью красителя, необходимо обеспечить достаточную экспрессию окрашивания лиганда diKillerRed-VKSKL или меченного красителем лиганда SLP в интересующих клетках. Учитывая, что разные типы клеток или клетки с разным генетическим фоном могут содержать пероксисомы с немного разными свойствами, может потребоваться настроить точные условия освещения, чтобы обеспечить индукцию пексофагии. Надежной мерой скрининга активации Stub1-опосредованной пексофагии является мониторинг того, перемещается ли EGFP-Ub на освещенные пероксисомы (через 1 ч после освещения)13. В здоровых клетках сигналы EGFP-Ub обычно равномерно распределены в цитоплазме. Поэтому его транслокацию на освещенные пероксисомы легко наблюдать. Чтобы оптимизировать условия освещения, интенсивность света или время освещения могут быть изменены. Также лучше избегать чрезмерного освещения красителей при попытке повредить пероксисомы, так как некоторые из них могут подвергаться фотохимическим процессам, которые могут мешать последующей визуализации. Например, было показано, что чрезмерное освещение KillerRed может привести к тому, что он станет слабо зеленым флуоресцентным. Чрезмерное освещение генерирует слабые зеленые сигналы на освещенных пероксисомах сразу после освещения23 (в отличие от транслокации репортеров на основе EGFP, которая может занять от десятков минут до нескольких часов).

Методология позволяет исследователям использовать стандартные конфокальные микроскопы с лазерным сканированием для разрушения фракции пероксисом в клетке, что позволяет проводить прямые сравнения разницы в судьбе между здоровыми и поврежденными пероксисомами. По сравнению с существующими методами, протокол здесь вызывает стресс АФК только для небольшой части пероксисом, а не для всех пероксисом или других органелл в клетках. Таким образом, можно изучить влияние оставшихся здоровых пероксисом на пексофагию АФК-стрессовых пероксисом в той же клетке.

Благодаря освещению всей чашки также можно воздействовать на все пероксисомы в клеточной культуре, что позволяет проводить биохимический анализ пексофагии, опосредованной Stub1. Как Hsc70/Stub1 распознает поврежденные пероксисомы и какие пероксисомальные субстраты убиквитинаты Stub1 — все это вопросы, которые можно изучить с помощью этого протокола. В более общем плане, протокол нарушения пероксисом также может быть использован для зондирования других путей контроля качества пероксисом. Учитывая, что пероксисомы тесно связаны со многими различными клеточными органеллами внутри клетки, включая эндоплазматический ретикулум, митохондрии и липидные капли, было бы также интересно исследовать, как клетки систематически модулируют поведение всех клеточных структур в ответ на повреждение пероксисом.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих финансовых интересов.

Acknowledgments

Эта работа была частично поддержана исследовательским грантом MOST 111-2311-B-001-019-MY3 от Национального совета по науке и технологиям Тайваня.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
35 mm culture dish with a 20 mm diameter glass microwell  MatTek P35G-1.5-20-C 20 mm glass bottomed
3-amino-1,2,4-triazole (3-AT) Sigma Aldrich A8056
bovine serum ThermoFisher Scientific 16170060
Cell culture incubator Nuaire NU-4750
diKillerRed-PTS1 Academia Sinica made by appending the KillerRed tandem dimer with PTS1(VKSKL)
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) ThermoFisher Scientific 11965092
Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F-12) ThermoFisher Scientific 11330032
EGFP-C1 Clontech pEGFP-C1 The backbone of EGFP-C1 was used for cloning EGFP-Stub1, EGFP-Hsp70, EGFP-p62
EGFP-Hsp70 Academia Sinica Hsp70 gene (HSPA1A) PCR amplified from HeLa cDNA and cloned into EGFP-C1
EGFP-LC3B Addgene 11546
EGFP-p62 Academia Sinica generated by inserting the human SQSTM1 gene (through PCR amplification of the HeLa cell cDNA) into EGFP-C1
EGFP-Stub1 Academia Sinica generated by inserting the mouse Stub1 gene (through PCR amplification of the total mouse kidney cDNA) into EGFP-C1
EGFP-Ub Addgene 11928
fetal bovine serum ThermoFisher Scientific 10437028
HaloTag TMR ligand  Promega G8252
HaloTag-PTS1 Academia Sinica PTS1 appended and cloned into EGFP-C1 backbone
HEPES ThermoFisher Scientific 15630080
Inverted Confocal Microscope  Olympus FV3000RS 405 nm Ex, 488 nm Ex, 561 nm Ex,  microscope with a TOKAI HIT chamber incubator and the UNIV2-D35 dish attachment
Janelia Fluor 646 HaloTag Ligand Promega GA1120
LED VitaStar PAR64 80 W, 555-570 nm
lipofectamine 2000  ThermoFisher Scientific 11668 transfection reagent
NIH3T3 cell ATCC CRL-1658 adherent
Opti-MEM ThermoFisher Scientific 319850 reduced serum media
penicillin/streptomycin ThermoFisher Scientific 15140
PMP34-TagBFP Academia Sinica PMP34 PCR amplified from HeLa cDNA and cloned intoTagBFP-C (Evrogen FP171)
roGFP2-PTS1 Academia Sinica generated by appending eroGFP (taken from Addgene plasmid 20131) with the amino acid sequence VKSKL, and cloned into the EGFP-C1
SHSY5Y cell ATCC CRL-2266 adherent

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wanders, R. J., Waterham, H. R., Ferdinandusse, S. Metabolic interplay between peroxisomes and other subcellular organelles including mitochondria and the endoplasmic reticulum. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 3, 83 (2016).
  2. He, A., et al. Acetyl-CoA derived from hepatic peroxisomal β-oxidation inhibits autophagy and promotes steatosis via mTORC1 activation. Molecular Cell. 79 (1), 30.e4-42.e4 (2020).
  3. Cipolla, C. M., Lodhi, I. J. Peroxisomal dysfunction in age-related diseases. Trends in Endocrinology & Metabolism. 28 (4), 297-308 (2017).
  4. Fransen, M., Nordgren, M., Wang, B., Apanasets, O., Veldhoven, P. P. V. Aging, age-related diseases and peroxisomes. Peroxisomes and their Key Role in Cellular Signaling and Metabolism. 69, Springer. Dordrecht, the Netherlands. 45-65 (2013).
  5. Puri, P., et al. The plasma lipidomic signature of nonalcoholic steatohepatitis. Hepatology. 50 (6), 1827-1838 (2009).
  6. Law, K. B., et al. The peroxisomal AAA ATPase complex prevents pexophagy and development of peroxisome biogenesis disorders. Autophagy. 13 (5), 868-884 (2017).
  7. Nazarko, T. Y. Pexophagy is responsible for 65% of cases of peroxisome biogenesis disorders. Autophagy. 13 (5), 991-994 (2017).
  8. Eberhart, T., Kovacs, W. J. Pexophagy in yeast and mammals: An update on mysteries. Histochemistry and Cell Biology. 150 (5), 473-488 (2018).
  9. Manjithaya, R., Nazarko, T. Y., Farré, J. -C., Subramani, S. Molecular mechanism and physiological role of pexophagy. FEBS Letters. 584 (7), 1367-1373 (2010).
  10. Till, A., Lakhani, R., Burnett, S. F., Subramani, S. Pexophagy: The selective degradation of peroxisomes. International Journal of Cell Biology. 2012, 512721 (2012).
  11. Germain, K., Kim, P. K. Pexophagy: A model for selective autophagy. International Journal of Molecular Sciences. 21 (2), 578 (2020).
  12. Kim, P. K., Hailey, D. W., Mullen, R. T., Lippincott-Schwartz, J. Ubiquitin signals autophagic degradation of cytosolic proteins and peroxisomes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (52), 20567-20574 (2008).
  13. Yamashita, S., Abe, K., Tatemichi, Y., Fujiki, Y. The membrane peroxin PEX3 induces peroxisome-ubiquitination-linked pexophagy. Autophagy. 10 (9), 1549-1564 (2014).
  14. Nordgren, M., et al. Export-deficient monoubiquitinated PEX5 triggers peroxisome removal in SV40 large T antigen-transformed mouse embryonic fibroblasts. Autophagy. 11 (8), 1326-1340 (2015).
  15. Zhang, J., et al. ATM functions at the peroxisome to induce pexophagy in response to ROS. Nature Cell Biology. 17 (10), 1259-1269 (2015).
  16. Chen, B. -H., Chang, Y. -J., Lin, S., Yang, W. Y. Hsc70/Stub1 promotes the removal of individual oxidatively stressed peroxisomes. Nature Communications. 11 (1), 5267 (2020).
  17. Hung, Y. H., Chen, L. M., Yang, J. Y., Yang, W. Y. Spatiotemporally controlled induction of autophagy-mediated lysosome turnover. Nature Communications. 4, 2111 (2013).
  18. Mageswaran, S. K., Yang, W. Y., Chakrabarty, Y., Oikonomou, C. M., Jensen, G. J. A cryo-electron tomography workflow reveals protrusion-mediated shedding on injured plasma membrane. Science Advances. 7 (13), eabc6345 (2021).
  19. Yang, J. Y., Yang, W. Y. Spatiotemporally controlled initiation of parkin-mediated mitophagy within single cells. Autophagy. 7 (10), 1230-1238 (2011).
  20. Yang, J. Y., Yang, W. Y. Bit-by-bit autophagic removal of parkin-labelled mitochondria. Nature Communications. 4, 2428 (2013).
  21. Los, G. V., et al. HaloTag: A novel protein labeling technology for cell imaging and protein analysis. ACS Chemical Biology. 3 (6), 373-382 (2008).
  22. Lismont, C., Walton, P. A., Fransen, M. Quantitative monitoring of subcellular redox dynamics in living mammalian cells using RoGFP2-based probes. Methods in Molecular Biology. 1595, 151-164 (2017).
  23. Nordgren, M., et al. Potential limitations in the use of KillerRed for fluorescence microscopy. Journal of Microscopy. 245 (3), 229-235 (2012).

Tags

Биология выпуск 195 Пексофагия пероксисомы Hsc70 Stub1 аутофагия АФК
Мониторинг пексофагии, опосредованной Stub1
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chen, B. H., Yang, W. Y. Monitoring… More

Chen, B. H., Yang, W. Y. Monitoring Stub1-Mediated Pexophagy. J. Vis. Exp. (195), e65010, doi:10.3791/65010 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter