Summary
أدى البروتوكول الحالي الذي يحاكي متلازمة الحبل المركزي (CCS) في الفئران إلى تحسين قابلية التكرار وتقليل أضرار التشغيل لحيوانات التجارب ، وتجنب تعطيل البنية التشريحية بشكل مفرط. الاستراتيجية في هذه الدراسة مفيدة لأنها تسمح بالبحث في آليات الإصابة من خلال تحقيق نتائج متسقة.
Abstract
يمكن أن تفيد النماذج الحيوانية لمتلازمة الحبل المركزي (CCS) بشكل كبير الأبحاث قبل السريرية. يمكن أن توفر المسارات التشريحية التي يمكن تحديدها مناهج تعرض طفيفة التوغل وتقليل الإصابات الإضافية لحيوانات التجارب أثناء التشغيل ، مما يتيح الحفاظ على مورفولوجيا تشريحية متسقة ومستقرة أثناء التجارب لتقليل الاختلافات السلوكية والنسيجية بين الأفراد لتحسين قابلية استنساخ التجارب. في هذه الدراسة ، تم الكشف عن الحبل الشوكي على مستوى C6 باستخدام منصة محورية لإصابة الحبل الشوكي (SCICP) ودمجها مع تقنية طفيفة التوغل. بمساعدة مثبت العمود الفقري ، قمنا بتثبيت الفقرات وضغط الحبال الشوكية للفئران C57BL / 6J بأوزان 5 جم / مم2 و 10 جم / مم2 باستخدام SCICP للحث على درجات مختلفة من إصابة الحبل الشوكي C6. تماشيا مع الوصف السابق ل CCS ، تكشف النتائج أن الآفة في هذا النموذج تتركز في المادة الرمادية حول الحبل المركزي ، مما يتيح إجراء مزيد من البحث في CCS. أخيرا ، يتم توفير النتائج النسيجية كمرجع للقراء.
Introduction
شهدت السنوات الأخيرة ارتفاعا مستمرا في حالات إصابة الحبل الشوكي (SCI) ، مع المزيد من الإصابات لدى كبار السن من tauma1 الأقل عنفا. هذه الإصابات في كثير من الأحيان تنطوي على العمود الفقري العنقي وغالبا ما تؤدي إلى خلل وظيفي عصبي غير مكتمل2.
وفي القرن الحادي والعشرين، يعد احتجاز الكربون وتخزينه أكثر أنواع اصابات النخاع الشوكي غير المكتملة انتشارا، حيث يمثل أكثر من نصف جميع اصابات النخاع الشوكي. بالمقارنة مع اصابات النخاع الشوكي التقليدية غير المكتملة ، يتميز CCS بضعف أكثر بشكل غير متناسب في الأطراف العلوية من الأطراف السفلية3. يتميز بضعف الأطراف العلوية في الغالب مع خلل وظيفي أقل أهمية في الحواس والمثانة. يعتقد أن CCS ناتج عن نزيف وذمة في المنطقة الوسطى بعد الصدمة أو ، كما اقترح مؤخرا ، بسبب تنكس Wallerian من ضغط الحبل الشوكي في تضيق القناة الشوكية. تفتقر إدارة CCS إلى أدلة عالية المستوى لتوجيهها ، الأمر الذي يتطلب فهما شاملا للفيزيولوجيا المرضية4. ومع ذلك ، لم يتم الإبلاغ عن نماذج CCS. النماذج الحيوانية المناسبة ضرورية لفهم الفيزيولوجيا المرضية ، والتي يمكن أن توفر قاعدة بحثية للدراسات السريرية وما قبل السريرية5،6،7،8،9،10.
في هذه الدراسة ، تم إنشاء نموذج CCS في الفئران مع منصة محورية لإصابة الحبل الشوكي (SCICP) وخطة تشغيل طفيفة التوغل ، مما يسمح بمزيد من البحث في CCS وفهمه. ثبت صحة النموذج في سياق عملية البحث عن طريق التصوير النسيجي والتصوير بالرنين المغناطيسي (MRI) وتحليل التألق المناعي.
Protocol
تمت الموافقة على التجارب من قبل لجنة أخلاقيات ورعاية المختبر بكلية تشيلو للطب بجامعة شاندونغ (رقم الموافقة: 22021). تم إجراؤها وفقا لدليل رعاية واستخدام المختبر الذي نشرته المعاهد الوطنية للصحة (منشورات المعاهد الوطنية للصحة رقم 85-23 ، المنقحة عام 1996). كانت جميع الفئران المستخدمة في هذه الدراسة من إناث الفئران C57BL / 6J البالغة من العمر 9-10 أسابيع والتي تم شراؤها من شركة Jinan Pengyue Experimental Animal Company (جينان ، الصين). تم اختيار ما مجموعه 9 فئران مشاركة في هذه الدراسة بشكل عشوائي بالتساوي مع المجموعات الضابطة والخفيفة والشديدة. في 7 و 28 و 70 يوما بعد الإصابة ، تم التضحية بفأر واحد من كل مجموعة.
1. C6 استئصال الصفيحة الفقرية والتعرض للحبل الشوكي
ملاحظة: تم إجراء التعرض تحت المجهر. يمكن تجنب النزيف من خلال الانتباه إلى جانبين: (ط) يجب تجنب جميع الأوعية الدموية. (ii) يجب فصل العضلات عند نقاط الأصل والنهاية للعضلة.
- إعداد الأدوات الجراحية و SCICP.
ملاحظة: تم الإبلاغ عن هيكل SCICP في الدراسة السابقة11. الفرق فيما يتعلق بالدراسة السابقة هو أن البروتوكول الحالي يحقق إصابة الحبل الشوكي عن طريق الضغط. يمكن أن ينتج وزنان مختلفان (10.4 جم و 20.8 جم) لهذه المنصة ضغطا قدره 5 جم / مم2 و 10 جم / مم2 ، على التوالي (الشكل 1). يوضح الشكل 2 خطوات تعرض الحبل الشوكي وانضغاطه. - إدارة إيزوفلوران للفأر عن طريق الاستنشاق باستخدام مخروط الأنف (الحث: 3٪ -5٪ ، الصيانة: 1.5٪ -2٪).
- بعد سريان مفعول التخدير ، استكشف انتفاخا صغيرا في خط الوسط خلف عنق الفئران ، وهي العملية الشائكة للفقرة الصدرية الثانية (T2).
- حلق الشعر حول هذا الانتفاخ. تطهير الجلد مع ثلاثة تطبيقات بالتناوب من محلول اليودوفور تليها مطهرات الجلد 75 ٪ الإيثانول.
- ضع الماوس عرضة على طاولة العمليات. تطبيق مرهم العين لحماية العينين.
- ضع وسادة بسمك 3-4 مم تحت الصدر للسماح بانحناء العمود الفقري العنقي المقوس ، مما يسهل التعرض للمساحة بين الصفيحة ومجرى الهواء دون عائق أثناء العملية. حقن البوبرينورفين على شكل تسكين قبل الجراحة (0.05-0.1 ملغ/كغ، SQ).
- قم بعمل شق طولي 1-1.5 سم بمشرط معقم يتمحور حول العملية الشائكةللفقرة الصدرية الثانية لكشف طبقة اللفافة (الشكل 2 أ).
- قم بإزالة جزء من الأنسجة الدهنية فوق T2 بمقص دقيق معقم للعثور على عملية T2 الشائكة.
- افصل العضلات شبه المنحرفة الثنائية والعضلات المعينية عن C5-T2 على طول خط الوسط بمقص دقيق (الشكل 2 ب).
- افصل العضلات الموجودة على صفيحة الفقرات C5-T2 بمقص دقيق ، واسحب طبقة العضلات إلى الجانبين باستخدام مبعدات دقيقة معقمة (الشكل 2C).
- قطع multifidus وعضلات العمود الفقري العنقي على سطح الفقرات.
- حدد موقع T2 وفقا لأعلى نقطة في العمليات الشائكة. دقق في العمليات الشائكة على التوالي نحو الطرف المنقاري من T2 لتحديد موقع C6 (الشكل 3).
- ارفع الصفيحة C6 بالملقط ، واقطع الصفيحة ، وانكشف الحبل الشوكي (الشكل 2 د).
2. إصابة انضغاط الحبل الشوكي العنقي
- قم بتثبيت مفاصل الوجه C6-7 باستخدام المثبت الفقري ، وقم بقفله (الشكل 2E).
- صوب طرف الوزن المعقم على الحبل الشوكي المكشوف ، وتأكد من وضع الجزء السفلي المسطح من الطرف بالتوازي مع السطح الظهري للحبل الشوكي (الشكل 2F).
- اضبط الكم لجعل الوزن يضغط على الحبل الشوكي. توقف عن الضبط عندما يحافظ الوزن على وضع نسبي ثابت مع الحبل الشوكي (الشكل 2G).
ملاحظة: لا تجعل هذه العملية عنيفة جدا أو سريعة في حالة ممارسة الوزن قوة كدمة على الحبل الشوكي. - قم بإزالة الوزن ومثبت العمود الفقري بعد ضغط لمدة 5 دقائق.
- لاحظ تغيرات لون الحبل الشوكي بعد الضغط تحت المجهر (الشكل 2H).
- شطف مع PBS معقمة واستخدام شفط لتنظيف موقع العملية.
- خياطة العضلات والجلد في طبقات باستخدام خياطة البولي بروبلين غير القابلة للامتصاص (الحجم: 6-0).
- تطهير المنطقة الجراحية ، ووضع الماوس على وسادة دافئة حتى يستعيد الماوس وعيه الكامل ، ثم أعد الماوس إلى قفص الفأر.
- حقن البوبرينورفين للتسكين (0.05-0.1 ملغ/كغ، SQ) كل 8-12 ساعة لمدة 3 أيام.
3. التحليل النسيجي
- تخدير الفأر عن طريق الحقن داخل الصفاق بنسبة 1.25٪ ثلاثي برومو إيثانول (0.02 مل / جم من وزن الجسم) في الأيام 7 أو 28 أو 70 بعد الإصابة. غرس الماوس عبر القلب مع 60 مل من محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) و 20 مل من 4٪ بارافورمالدهيد11.
- انقل الحبل الشوكي على بعد 0.5 سم من مركز الآفة من كلا الجانبين بمقص دقيق ، وحافظ على القسم الذي يبلغ طوله 1 سم.
- اغمر قسم الحبل الشوكي المحفوظ في 30٪ سكروز عند 4 درجات مئوية لمدة 48 ساعة.
- قم بتضمين الأنسجة باستخدام OCT ، وقم بتقطيع الأنسجة إلى أقسام بسمك 6 ميكرومتر باستخدام cryotome ، واجمع الأقسام على شريحة زجاجية.
- تلطيخ الهيماتوكسيلين ويوزين
- شطف أقسام 6 ميكرومتر مع 1x PBS لمدة 5 دقائق 3 مرات لإزالة OCT المتبقية.
- اغمر الأقسام في الهيماتوكسيلين لمدة 90 ثانية. اغسل الأقسام تحت الماء الجاري لمدة 3 دقائق.
- اغمر الأقسام في eosin لمدة 4 دقائق. نقع في 95 ٪ الكحول لمدة 30 ثانية لإزالة اليوزين الزائد.
- أخيرا ، قم بتجفيف الشرائح بالكحول (95٪ كحول و 100٪ كحول مرتين ، على التوالي) لمدة 30 ثانية وضع الشرائح في حمام زيلين للتطهير لمدة 2 دقيقة. ثم أغلق الأقسام بغطاء زجاجي وهلام راتنج.
- تلطيخ الأزرق البروسي
- اغمر الشرائح لمدة 20 دقيقة في خليط متساو من فيروسيانيد البوتاسيوم (10٪) وحمض الهيدروكلوريك (10٪).
- شطف 3 مرات بالماء المقطر ، و Counterstain لمدة 5 دقائق مع الأحمر السريع النووي.
- شطف ثلاث مرات بالماء المقطر ، تليها شطف واحد مع الكحول 95 ٪ وشطفين مع الكحول 100 ٪ لمدة 5 دقائق.
- نظف المقاطع في الزيلين مرتين لمدة 3 دقائق لكل منهما ثم أغلقها بجل راتنج12.
- تلطيخ المناعي
- احتضان الشرائح بالأجسام المضادة الأولية التالية لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية: جزيء محول ربط الكالسيوم المضاد للأأين 1 (Iba-1) (1: 500) ، والذي تم تنظيمه في الخلايا الدبقية الصغيرة بعد إصابة الأعصاب ؛ البروتين الحمضي الليفي المضاد للفأر (GFAP) (1: 300) ، والذي يتم التعبير عنه في الخلايا النجمية في الجهاز العصبي المركزي ؛ أرنب مضاد للخيوط العصبية 200 (NF-200) (1: 2000) ، والذي يتم التعبير عنه في خيوط عصبية.
- احتضان الأجسام المضادة الثانوية لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة (RT): Alexa Fluor488 الماعز المضاد للفأر و Alexa Fluor594 الماعز المضاد للأرانب (1: 1000).
- التقط الصور الفوتوغرافية وقم بتحليلها باستخدام مجهر مضان13.
4. التصوير بالرنين المغناطيسي
- تخدير الفأر في 7 أيام بعد الإصابة بتخدير إيزوفلوران (1٪ -2٪ إيزوفلوران ، 20٪ -30٪ O2) تدار من خلال قناع صغير.
- مسح الحبل الشوكي العنقي في الاتجاه السهمي. استخدم الإعدادات التالية لتصوير التصوير بالرنين المغناطيسي: تسلسل صدى الدوران (SE) بطريقة متعددة الشرائح ومتشابكة مع TR / TE = 2500/12 مللي ثانية ، مصفوفة الاستحواذ = مصفوفة 256 × 128 فوق مجال الرؤية (FOV) = 12 × 8 مم2 ، سمك الشريحة = 1 مم ، وعدد الإثارة (NEX) = 2.
ملاحظة: حافظ على معدل تنفس الماوس عند 10-15 / دقيقة أثناء المسح للتخلص من عيوب الصور المتعلقة بالتنفس14.
Representative Results
يشير قسم HE السهمي إلى أنه على الرغم من أن المنطقة المتضررة في المادة الرمادية كانت أوسع في المجموعة الشديدة ، إلا أن الاستمرارية على المادة البيضاء كانت موجودة. بالإضافة إلى ذلك ، فإن الاختلاف في منطقة المادة الرمادية التالفة بين المجموعات الشديدة والخفيفة يدعم معقولية إعداد المجموعة في البروتوكول (الشكل 4).
تظهر أقسام اعتلال الدماغ الكبدي الإكليلي أن الآفة موجودة بشكل أساسي في المادة الرمادية في كلا المجموعتين. في المجموعة الشديدة ، كان من المرجح أن تتأثر بنية المادة البيضاء المحيطة بالمادة الرمادية ، لكن مخطط المادة البيضاء كان لا يزال محفوظا (الشكل 5). يشير التألق المناعي NF-200 إلى أنه على الرغم من تأثر المادة البيضاء المحيطة بالمادة الرمادية في المجموعة الشديدة ، إلا أن المادة البيضاء كانت لا تزال سليمة نسبيا. تتوافق هذه النتائج مع الخصائص الموصوفة لاحتجاز الكربون وتخزينه في الدراسة السابقة4 (الشكل 6).
لم يتم العثور على خلايا الدم الحمراء في أقسام اعتلال الدماغ الكبدي السهمي بعد 7 أيام من الإصابة في المجموعة الخفيفة أو الشديدة. كشف التلوين الأزرق البروسي عن عدم وجود داء هيموسيديريدي في المجموعة الخفيفة ولكن في المجموعة الشديدة. تشير هذه النتائج إلى أن تحفيز النزف قد يتطلب درجة شديدة نسبيا من الضرر (الشكل 7).
كشف التألق المناعي عن مناطق ارتفاع تعبير GFAP و Iba-1 في كل من الإصابة الخفيفة والشديدة ، مما يشير إلى استجابة التهابية وتشكيل ندبة دبقية في الآفة. أيضا ، أظهرت المجموعة الشديدة مساحة آفة أكبر من المجموعة الخفيفة (الشكل 8).
التصوير بالرنين المغناطيسي هو وسيلة طفيفة التوغل نسبيا لمراقبة الحبل الشوكي. تشير النتائج إلى أنه في كل من المجموعات الخفيفة والشديدة ، هناك تغيير في إشارة نقص الشدة في الآفة مع مخطط إشارة مرتفع. أظهرت المجموعة الشديدة منطقة إشارة منخفضة الكثافة أكبر بكثير (الشكل 9). تشير إشارة انخفاض شدة الشدة إلى وجود راسب من الخلايا الشبكية المحللة في هذه المنطقة ، وتشير إشارة فرط التوتر المحيطة إلى استجابة التهابية. لقد أجرينا العديد من الاختبارات السلوكية في دراستنا السابقة. على سبيل المثال ، يكشف اختبار قوة القبضة في الأطراف الأمامية عن فرق كبير15.
الشكل 1: كم وأوزان SCICP. تم تصميم مساحة سطح الطرف لتكون 1.3 مم × 1.6 مم بناء على المنطقة المكشوفة من الحبل الشوكي التي تم قياسها بعد استئصال الصفيحة الفقرية C6. الوزن مطلي ب PTFE ، مما يقلل بشكل فعال من الاحتكاك بين الجدار الداخلي للكم والوزن. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: تعرض الحبل الشوكي وانضغاطه. (أ) شق طولي للجلد؛ (ب) فصل العضلات بشكل دائري عن العملية الشوكية T2 ؛ (ج) فصل العضلات فوق الصفيحة. (د) استئصال الصفيحة الفقرية C6. (ه) تثبيت الجسم الفقري؛ (و) تحديد موقع الانضغاط؛ (ز) ضغط الحبل الشوكي؛ (H) لا يوجد تلف كبير للمادة البيضاء فوق الحبل الشوكي بعد ضغط الحبل الشوكي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: تشريح الهيكل العظمي العنقي للفأر. الموقع المشار إليه بالسهم هو عملية T2 الشائكة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: الأجزاء الملطخة باعتلال الدماغ الكبدي السهمي. أ: الجزء السهمي للحبل الشوكي العنقي. (ب، ج) تعرضت المجموعة الشديدة لأضرار جسيمة أكثر من المجموعة الخفيفة ، لكن كلاهما ركز على المادة الرمادية حول الحبل المركزي. تشير الصور 7 و 28 و 70 نقطة في البوصة إلى عدم وجود فرق كبير في التعبير عن الإصابة في نفس مجموعة الإصابة في فترات مختلفة وأنه يتم الحفاظ على استمرارية المادة البيضاء في الحبل الشوكي العلوي والسفلي. شريط المقياس: 1 مم. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 5: إصابة الحبل الشوكي العنقي بالأجزاء الملطخة باعتلال الدماغ الكبدي. (أ-ج) تؤثر الإصابة بشكل أساسي على المادة الرمادية المحيطة بالحبل المركزي ، كما هو موضح في اللوحتين B و C. تعاني مجموعة الإصابات الشديدة من مجموعة واسعة من الأضرار أكثر من مجموعة الإصابات الخفيفة ، والتي من المرجح أن تؤثر على المادة البيضاء. شريط المقياس: 400 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 6: NF-200 المناعي الإكليلي بعد الإصابة. استجابة NF-200 مع عدم وجود فرق كبير في مخطط المادة البيضاء. شريط المقياس: 400 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 7: تلطيخ أزرق بروسي. (أ-ج) لوحظ داء هيموسيديريروس في المجموعة الشديدة ولكن ليس في المجموعة الخفيفة. شريط المقياس: 400 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 8: GFAP السهمي والتألق المناعي Iba-1 بعد الإصابة. (أ-ج) مع زيادة درجة الإصابة ، تزداد مساحة استجابة GFAP و Iba-1. شريط المقياس: 1 مم. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 9: التصوير بالرنين المغناطيسي السهمي بعد إصابة الحبل الشوكي العنقي (صور مرجحة T2). لوحظت منطقة الإصابة كإشارة منخفضة الشدة في مجموعات الإصابات الخفيفة والشديدة ، مع وجود مساحة أوسع بكثير من إشارة انخفاض الشدة في مجموعة الإصابة الشديدة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Discussion
من بين الأنواع العديدة لإصابات الحبل الشوكي ، يعد CCS أحد أكثر أنواع الإصابات التي يمكن علاجها 3,4. نظرا لعدم وجود نماذج البحوث المختبرية ، ركزت الأبحاث على CCS من خمسينيات القرن العشرين على الدراسات السريرية وتحقيقات تشريح الجثة3،16،17. تظهر الدراسة الحالية استخدام أدوات متوافقة وإجراءات طفيفة التوغل لإنشاء نموذج CCS للفئران. من منظور تقني ، تتمتع هذه المنصة بقابلية تشغيل قوية وقابلية استنساخ جيدة. بالنظر إلى أن نتائج التجربة تثبت صحتها ، فإن تقنيتنا لإنشاء النموذج الأقرب إلى المعيار الذي حددته الدراسات السابقة ل CCS4.
استخدمت الدراسات السابقة لإصابة الضغط بشكل أساسي مقاطع تمدد الأوعية الدموية والبالونات والملقط المعاير9،10،18. علاوة على ذلك ، حدثت معظم الإصابات على مستوى الحبل الشوكي الصدري18. تم اختيار الحبل الشوكي على مستوى C6 كجزء مصاب في هذه الدراسة للتحقيق في خصائص CCS. تجدر الإشارة إلى أن معدل البقاء على قيد الحياة لنموذج CCS هو أيضا عامل أساسي في ضمان الاتساق التجريبي. تشير الدراسة الحالية إلى حدوث إصابة انضغاطية ثنائية للحبل الشوكي العنقي للفأر ، في حين أن إصابة الحبل الشوكي عالية المستوى ، وخاصة الإصابة الثنائية ، يمكن أن تكون قاتلة لحيوانات التجربة إذا كانت خطيرة للغاية. وفقا للبوهي ، من المرجح أن يؤثر الحبل الشوكي C4 / 5 على الجهاز النخاعي البصلي الهابط والخلايا العصبية الحركية المرتبطة بالجهاز التنفسي ، مما يؤدي إلى إصابة التجربة بالاكتئاب التنفسي والموت18،19،20،21،22،23. في هذه الدراسة ، الفئران ذات درجات مختلفة من الضغط على الحبل الشوكي العنقي C6 لديها خصائص إصابة متباينة بشكل كبير اقترحها الاختبارات النسيجية. على الرغم من وجود اختلافات سلوكية ونسيجية كبيرة في نموذج تثبيت الحبل الشوكي العنقي للفأر الذي أبلغ عنه Forgione ، إلا أن تعطيل عنيق ، وعمليات مفصلية ، وصفيحة ، وحتى جذور الأعصاب كانت مطلوبة من أجل تثبيت الحبل الشوكي بالمشابك المعدلة ، والتي كان لها تأثير كبير على استقرار هياكل عنق الرحم24. أفادت دراسة أخرى لإصابات عنق الرحم باستخدام العملية المستعرضة كموقع تثبيت5. على الرغم من منع العمليات المفصلية من التلف ، إلا أن انهيار الأنسجة العضلية المفرطة يمكن أن يؤدي أيضا إلى تأثير على استقرار الحبل الشوكي. في الدراسة الحالية ، تم استئصال الصفيحةالعنقية 6 فقط للحفاظ على استقرار الحبل الشوكي العنقي ، مع الحفاظ على المفاصل المفصلية المجاورة وتجنب الضرر العضلي المفرط. في الوقت نفسه ، يمنع الضغط من أعلى الحبل الشوكي تلف جذور الأعصاب.
تشير نتائج HE إلى أن منطقة تلف الحبل الشوكي العنقي للفئران في كل مجموعة كانت بشكل رئيسي في المادة الرمادية بالقرب من الحبل المركزي ، والتي تميز CCS ، مع وجود اختلافات كبيرة في نطاق الإصابة بين المجموعات المختلفة. والجدير بالذكر أن الأقسام المرضية التي عرضناها قد خففت من مظاهر الإصابة لأن العينات تم جمعها في أيام قليلة بعد الإصابة. أظهر التألق المناعي (NF-200) ضررا أقل للمسالك العصبية في منطقة المادة البيضاء من الحبل الشوكي ، مما أكد أيضا أن الضرر في CCS كان يتركز بشكل أساسي حول الحبل المركزي. تضاعفت نتيجة التألق المناعي من خلال النتائج النسيجية السابقة لعلم الأمراض. أظهرت الدراسات السابقة أن CCS يؤدي إلى وذمة بالقرب من الحبل المركزي ، مما يؤدي إلى ورم دموي ، وفي النهاية ، خلل وظيفي في الجزء الإنسي من القناة القشرية الشوكيةالجانبية 3. تم الإبلاغ عن النزف كمكون نموذجي ل CCS ولكن نادرا ما يظهر في دراسات التصوير والتشريح اللاحقة17. في هذه الدراسة ، أشارت نتائج HE في 7 أيام بعد الإصابة إلى علامات وذمة الأنسجة في جميع المجموعات. ومع ذلك ، لم يتم العثور على خلايا الدم الحمراء المتبقية في منطقة الإصابة. لذلك ، تم استخدام اللون الأزرق البروسي لفحص منطقة الإصابة بحثا عن النزف ، وتوافقت النتائج مع داء هيموسيديريوس الذي لوحظ في منطقة الإصابة لمجموعة الإصابات الشديدة بعد 7 أيام من الإصابة ، في حين أن المجموعة الخفيفة لم تفعل ذلك. أظهرت صور التصوير بالرنين المغناطيسي T2 أن كلا من الإصابات الخفيفة والشديدة لها مناطق إشارة منخفضة في المنطقة المتضررة من الإصابة في 7 أيام بعد الإصابة ، تشير إلى ترسب الخلايا الشبكية المحللة هنا. توفر هذه النتائج دليلا ظرفيا على أن التناقض بين النتائج المبلغ عنها سابقا ربما يرجع إلى أن اختبار التصوير بالرنين المغناطيسي يحتمل أن يكون أكثر حساسية من الاختبار النسيجي14 ، بالإضافة إلى شدة الإصابة ، والتي قد تؤثر أيضا على مقدار النزيف في منطقة الإصابة. كما تم التعبير عن GFAP على نطاق واسع في المنطقة المتضررة. في الوقت نفسه ، شوهد تعبير Iba-1 أيضا في المناطق السليمة ، مما يشير إلى استمرار الاستجابة الالتهابية ، بما يتفق مع نتائج التصوير بالرنين المغناطيسي ، حيث تشير حلقة من إشارة فرط الشدة حول منطقة إشارة انخفاض الكثافة في الآفة إلى وجود استجابة التهابية. في النهاية ، بناء على نتائج الدراسة الحالية ، ركزت منطقة الإصابة في النموذج على المادة الرمادية حول الحبل المركزي ، والتي تتوافق بشكل عام مع الأوصاف التي تم الإبلاغ عنها سابقا13. لسوء الحظ ، لم نقم بإجراء التصوير بالرنين المغناطيسي بشكل متكرر في كل تجربة لإظهار كيف يتغير موقع الإصابة ديناميكيا مع مرور الوقت. يمكن للباحثين في المستقبل تضمين هذا في عملهم من أجل تحقيق أفضل في CCS. أيضا ، يمكن تضمين العلامات المناعية مع علامات الخلايا العصبية مثل NeuN ، والتي تحدد المادة الرمادية في الدراسة.
في الختام ، فإن خصائص النتائج المتعلقة بعلم الأمراض والتصوير بالرنين المغناطيسي لها أوجه تشابه وثيقة مع تلك الموصوفة ل CCS في الدراسات السابقة4. ويتيح البروتوكول الحالي الذي يصمم بشكل عملي احتجاز ثاني أكسيد الكربون وتخزينه إجراء مزيد من البحوث في مجال احتجاز ثاني أكسيد الكربون وتخزينه وفهمه.
Disclosures
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
تم دعم هذه الدراسة من قبل المشروع الوطني الرئيسي للبحث والتطوير للخلايا الجذعية وأبحاث التحول (2019YFA0112100) وبرنامج الدولة الرئيسي للعلوم الطبيعية الوطنية في الصين (81930070).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4% fixative solution | Solarbio | P1110 | 4% |
| Anti-Neurofilament heavy polypeptide antibody | Abcam | ab8135 | Dilution ratio (1:2000) |
| Eosin Staining Solution (water soluble) | Biosharp | BL727B | |
| Ethanol | Fuyu Reagent | ||
| Fluorescent microscope | KEYENCE | BZ-X800 | |
| Frozen Slicer | Leica | ||
| GFAP (GA5) Mouse mAb | Cell Signaling TECHNOLOGY | #3670 | Dilution ratio (1:600) |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 488 | ThermoFisher SCIENTIFIC | A32723TR | Dilution ratio (1:1000) |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 594 | ThermoFisher SCIENTIFIC | A32740 | Dilution ratio (1:1000) |
| Hematoxylin Staining Solution | Biosharp | BL702A | |
| Mice | Jinan Pengyue Experimental AnimalCompany | C57BL/6J | |
| Microsurgery apparatus | Shandong ULT Biotechnology Co., Ltd | All the surgey instruments are custom-made | Ophthalmic scissors, micro mosquito forceps, microsurgery forceps, micro scissors |
| Normal sheep serum for blocking (working solution) | Zhong Shan Jin Qiao | ZLI-9022 | working solution |
| O.C.T. Compound | SAKURA | 4583 | |
| Phosphate buffered solution (PBS) | Solarbio | P1020 | pH 7.2–7.4 |
| Prussian Blue Iron Stain Kit (With Eosin) | Solarbio | G1424 | |
| RWD Laboratory inhalation anesthetic station | RWD Life Science Co., Ltd | R550 | |
| Small animal in vivo microCT imaging system | PerkinElmer | Quantum GX2 | |
| Spinal cord injury coaxial platform | Shandong ULT Biotechnology Co., Ltd | Custom-made(Feng's standard) | https://shop43957633.m.youzan.com/wscgoods/detail/367x5ovgn69q18g?banner_id=f.81386274~goods.7~ 1~b0yRFKOq&alg_id= 0&slg=tagGoodList-default%2COpBottom%2Cuuid% 2CabTraceId&components_ style_layout =1&reft=1659409105184&spm= g.930111970_f.81386274&alias= 367x5ovgn69q18g&from_uuid= 1362cc46-ffe0-6886-2c65-01903 dbacbba&sf=qq_sm&is_share= 1&shopAutoEnter=1&share_cmpt =native_wechat&is_silence_auth=1 |
| Surgery microscope | Zumax Medical Co., Ltd. | zumax, OMS2355 | |
| Tris Buffered Saline+Tween (TBST) | Solarbio | T1082 | Dilution ratio (1:19) |
| Xylene | Fuyu Reagent |
References
- Liu, C., et al. Survival in 222 Patients With Severe CSCI: An 8-Year Epidemiologic Survey in Western China. Archives of Physical Medicine and Rehabilitation. 100 (10), 1872-1880 (2019).
- Qi, C., Xia, H., Miao, D., Wang, X., Li, Z. The influence of timing of surgery in the outcome of spinal cord injury without radiographic abnormality (SCIWORA). Journal of Orthopaedic Surgery and Research. 15 (1), 223 (2020).
- Brooks, N. P.
- Avila, M. J., Hurlbert, R. J.
- Forgione, N., Chamankhah, M., Fehlings, M. G. A mouse model of bilateral cervical contusion-compression spinal cord injury. Journal of Neurotrauma. 34 (6), 1227-1239 (2017).
- López-Dolado, E., Lucas-Osma, A. M., Collazos-Castro, J. E. Dynamic motor compensations with permanent, focal loss of forelimb force after cervical spinal cord injury. Journal of Neurotrauma. 30 (3), 191-210 (2013).
- Allen, L. L., et al. Phrenic motor neuron survival below cervical spinal cord hemisection. Experimental Neurology. 346, 113832 (2021).
- Reinhardt, D. R., Stehlik, K. E., Satkunendrarajah, K., Kroner, A. Bilateral cervical contusion spinal cord injury: A mouse model to evaluate sensorimotor function. Experimental Neurology. 331, 113381 (2020).
- Ropper, A. E., Ropper, A. H.
- Sun, G. D., et al. A progressive compression model of thoracic spinal cord injury in mice: function assessment and pathological changes in spinal cord. Neural Regeneration Research. 12 (8), 1365-1374 (2017).
- Elzat, E. Y., et al. Establishing a mouse contusion spinal cord injury model based on a minimally invasive technique. Journal of Visualized Experiments. (187), 64538 (2022).
- Lu, J., Xu, F., Lu, H. LncRNA PVT1 regulates ferroptosis through miR-214-mediated TFR1 and p53. Life Sciences. 260, 118305 (2020).
- Zeng, H., et al. Lentivirus-mediated downregulation of α-synuclein reduces neuroinflammation and promotes functional recovery in rats with spinal cord injury. Journal of Neuroinflammation. 16 (1), 283 (2019).
- Bilgen, M., Al-Hafez, B., Berman, N. E., Festoff, B. W. Magnetic resonance imaging of mouse spinal cord. Magnetic Resonance in Medicine. 54 (5), 1226-1231 (2005).
- Yilihamu, E. E., et al. A novel mouse model of central cord syndrome. Neural Regeneration Research. 18 (12), 2751-2756 (2023).
- Chikuda, H., et al. Effect of early vs delayed surgical treatment on motor recovery in incomplete cervical spinal cord injury with preexisting cervical stenosis: A randomized clinical trial. JAMA Network Open. 4 (11), e2133604 (2021).
- Jimenez, O., Marcillo, A., Levi, A. D. A histopathological analysis of the human cervical spinal cord in patients with acute traumatic central cord syndrome. Spinal Cord. 38 (9), 532-537 (2000).
- Menezes, K., et al. Human mesenchymal stromal/stem cells recruit resident pericytes and induce blood vessels maturation to repair experimental spinal cord injury in rats. Scientific Reports. 10 (1), 19604 (2020).
- Hutson, T. H., Di Giovanni, S. The translational landscape in spinal cord injury: focus on neuroplasticity and regeneration. Nature Reviews. Neurology. 15 (12), 732-745 (2019).
- El-Bohy, A. A., Schrimsher, G. W., Reier, P. J., Goshgarian, H. G. Quantitative assessment of respiratory function following contusion injury of the cervical spinal cord. Experimental Neurology. 150 (1), 143-152 (1998).
- El-Bohy, A. A., Goshgarian, H. G. The use of single phrenic axon recordings to assess diaphragm recovery after cervical spinal cord injury. Experimental Neurology. 156 (1), 172-179 (1999).
- Gonzalez-Rothi, E. J., Lee, K. Z. Intermittent hypoxia and respiratory recovery in preclinical rodent models of incomplete cervical spinal cord injury. Experimental Neurology. 342, 113751 (2021).
- Locke, K. C., Randelman, M. L., Hoh, D. J., Zholudeva, L. V., Lane, M. A. Respiratory plasticity following spinal cord injury: perspectives from mouse to man. Neural Regeneration Research. 17 (10), 2141-2148 (2022).
- Forgione, N., et al. Bilateral contusion-compression model of incomplete traumatic cervical spinal cord injury. Journal of Neurotrauma. 31 (21), 1776-1788 (2014).
