Summary
يصف هذا البروتوكول طريقة فعالة وغير مكلفة تستخدم الوسائط السائلة لتقييم آثار المواد السامة الكيميائية على صلاحية ذبابة الفاكهة الميلانية البالغة.
Abstract
تولد الصناعات البشرية مئات الآلاف من المواد الكيميائية ، وكثير منها لم يدرس بشكل كاف من أجل السلامة البيئية أو التأثيرات على صحة الإنسان. يتفاقم هذا النقص في معلومات السلامة الكيميائية بسبب طرق الاختبار الحالية في الثدييات باهظة الثمن وكثيفة العمالة وتستغرق وقتا طويلا. في الآونة الأخيرة ، يعمل العلماء والمنظمون على تطوير منهجيات نهج جديدة (NAMs) لاختبار السلامة الكيميائية تكون أرخص وأكثر سرعة وتقلل من معاناة الحيوانات. ومن أهم هذه الآليات التي ظهرت استخدام الكائنات اللافقارية كبدائل لنماذج الثدييات لتوضيح أنماط العمل الكيميائية المحفوظة عبر الأنواع ذات الصلة البعيدة، بما في ذلك البشر. لتعزيز هذه الجهود ، هنا ، نصف طريقة تستخدم ذبابة الفاكهة ، ذبابة الفاكهة ، لتقييم السلامة الكيميائية. يصف البروتوكول إجراء بسيطا وسريعا وغير مكلف لقياس صلاحية وسلوك تغذية الذباب البالغ المكشوف. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن تكييف البروتوكول بسهولة لتوليد عينات للنهج الجينومية والأيضية. بشكل عام ، يمثل البروتوكول خطوة مهمة إلى الأمام في إنشاء ذبابة الفاكهة كنموذج قياسي للاستخدام في علم السموم الدقيق.
Introduction
يتعرض البشر باستمرار للمواد الكيميائية من مجموعة متنوعة من المصادر ، بما في ذلك الهواء1 ، والغذاء2 ، والماء 3,4 ، والأدوية5 ، ومواد التنظيف6 ، ومنتجات العناية الشخصية 7 ، والمواد الكيميائية الصناعية 7 ، ومواد البناء 7. علاوة على ذلك ، يتم إدخال الآلاف من المواد الكيميائية الجديدة كلعام 8 ، وكثير منها لا يتم فحصه بشكل صحيح من أجل الصحة والسلامة البيئية. ينبع هذا النقص في اختبارات السلامة الكيميائية الكافية جزئيا من الاعتماد المفرط على نماذج الثدييات ، مثل الفئران والجرذان. في حين أن نماذج القوارض هذه غنية بالمعلومات ، فإن اختبار السلامة الكيميائية في هذه الأنظمة مكلف ويستغرق وقتا طويلا وغالبا ما يسبب مستويات غير مقبولة من المعاناة لحيوان الاختبار9.
تعد الأعباء المالية والأخلاقية المرتبطة باختبار السلامة الكيميائية للثدييات ، فضلا عن الطبيعة المستهلكة للوقت لدراسات الثدييات ، من العوامل الرئيسية المساهمة في ندرة البيانات المحيطة بالمواد الكيميائية الجديدة. لمعالجة هذه المشكلة ، تقوم وكالة حماية البيئة الأمريكية (EPA) ، والوكالة الأوروبية للمواد الكيميائية (ECHA) ، ووزارة الصحة الكندية ، ووكالات أخرى بتنفيذ تدابير تدمج منهجيات النهج الجديدة (NAMs) في الأطر التنظيمية10 ، وبالتالي وضع سياسة أمريكا الشمالية وأوروبا بما يتماشى مع الأهداف الدولية لاستبدال وتقليل وتحسين استخدام الحيوانات (3Rs principal)11 ، 12,13,14. وتشمل هذه الآليات مجموعة متنوعة من المقايسات التي تستند أساسا إلى النماذج المختبرية ونماذج السيليكو التي توفر فهما آليا للسمية الكيميائية بدلا من مراقبة الشدائد التي تلحق بأنواع اختبار الثدييات، مما يزيد من معدل توليد البيانات لتقييم المخاطر الكيميائية مع الاستمرار في إنتاج نواتج عالية الدقة15. ومع ذلك ، لم يثبت بعد أن هذه الطرق تحمي من السمية الجهازية ، بما في ذلك تعطيل العمليات البيولوجية الحيوية التي تنطوي على التواصل بين الأعضاء وإشارات الغدد الصماء. علاوة على ذلك ، لا يمكنهم تفسير التراكم البيولوجي للمواد الكيميائية داخل أنسجة معينة ، وقدرة المركبات الفردية على الامتصاص والإفراز ، والتفاعل بين السلوك والتعرض للمواد الكيميائية.
ونظرا للقيود المفروضة على النماذج المختبرية والحاسوبية، فإن الاستخدام الناجح لنماذج NAMs لتقليل أو استبدال نماذج الثدييات ينبغي أن يشمل أيضا نماذج اللافقاريات في الجسم الحي، مثل ذبابة الفاكهة، ذبابة الفاكهة الميلانوجاستر. أظهرت الدراسات السابقة التي أجريت على الذبابة أن هذا الكائن مناسب تماما لدراسة المسارات الجينية المحفوظة التي تحمي الخلايا الحيوانية من الجزيئات السامة16،17،18،19،20،21،22. علاوة على ذلك ، تظهر الذبابة تشابها وراثيا ملحوظا مع البشر ، بما في ذلك المتجانسات الوظيفية لأكثر من 65٪ من الأمراض البشرية 23،24،25 والحفاظ بشكل أكبر على المسارات الوظيفية المهمة 26. هذه الميزات ، جنبا إلى جنب مع دورة حياتها القصيرة نسبيا ، وتكلفة الصيانة المنخفضة ، والاستجابات السلوكية التي يمكن ملاحظتها بسهولة ، تجعل ذبابة الفاكهة مناسبة تماما للاستخدام كنموذج سمي27،28،29،30. علاوة على ذلك ، يتمتع الذباب بإنتاجية أعلى بكثير من نماذج القوارض ويلتقط التأثيرات على التمثيل الغذائي وعلم وظائف الأعضاء والإشارات الهرمونية التي لا يمكن اكتشافها بسهولة بواسطة NAMs غير العضوية الأخرى9.
يمثل البروتوكول الموصوف هنا إطارا لاختبار آثار التعرض للمواد الكيميائية على ذبابة الفاكهة لدى البالغين. تم تصميم الطريقة لتكون فعالة وغير مكلفة وقابلة للتكرار ، مع تقليل الوقت الذي يجب أن يكون فيه الباحثون على اتصال بمادة الاختبار الكيميائية واستيعاب جمع العينات لعلم الأيض ونهج omics الأخرى. تم تحسين البروتوكول لاختبار مادة كيميائية واحدة لكل تجربة ، ولكن يمكنه بسهولة استيعاب المعلمات التجريبية الأخرى ، مثل المذيبات المتنوعة أو مجموعات من المواد الكيميائية.
Protocol
ملاحظة: ارتداء قفازات النتريل لجميع الخطوات في هذا البروتوكول. ارتد معطفا مختبريا و / أو واقيا للعين و / أو أجهزة تنفس ، وفقا لأوراق بيانات السلامة لكل مادة كيميائية تم تقييمها.
1. إعداد قارورة وغرفة الرطوبة
ملاحظة: يمكن إكمال الخطوات 1.1-1.5 في أي وقت قبل بدء الأقسام التجريبية الأخرى. يجب ارتداء قفازات النتريل في جميع الأوقات أثناء تحضير القارورة لمنع التلوث.
- قم بتكديس أربع ورقات من ورق كروماتوغرافيا السليلوز من الدرجة 1 (انظر جدول المواد) وقطعها إلى 2 في شرائح عريضة. قم بإخراج حشوات ورق الترشيح على شكل زهرة باستخدام مثقاب ورق مقاس 1.5 بوصة يحتوي على قالب على شكل زهرة.
- استخدم وتد خشبي غير مصقول مقاس 22 مم × 220 مم لدفع ورق الترشيح إلى أسفل قارورة البولي بروبلين بقطر 28.5 مم. تأكد من أن كومة ورق الترشيح موجودة بإحكام في الجزء السفلي من القارورة.
- قم بتخزين القوارير المعدة في صواني بلاستيكية أو من الورق المقوى وضع الصواني في أكياس بلاستيكية كبيرة (~ 280 مم × 240 مم) حتى الاستخدام.
- قم ببناء غرفة رطوبة عن طريق قطع فتحة 120 مم × 280 مم في الغطاء البلاستيكي لحوض بلاستيكي 606.24 مم × 225.42 مم × 403.22 مم (انظر جدول المواد). شبكة الغراء فوق الفتحة للسماح بتدفق الهواء.
- قم بقص جزء من الشبكة البلاستيكية من ألواح إضاءة السقف ذات فتحات التهوية (في الأصل 610 مم × 1220 مم) لتناسب قاع الحوض البلاستيكي المستخدم في الخطوة 1.4.
ملاحظة: يمكن استخدام مجموعة متنوعة من الأحواض البلاستيكية المختلفة ومواد الشبكة البلاستيكية / المعدنية لبناء غرفة الرطوبة.
2. تربية الذباب
- ابدأ استزراع الذباب البالغ (بحد أدنى 30 بالغا) في زجاجات حليب زجاجية تحتوي على وسائط مركز بلومنجتون ذبابة الفاكهة (BDSC)القياسية 31. أغلق الزجاجات بسدادة من الحرير الصناعي ملفوفة في مسح المهام الدقيق. لا تزدحم الزجاجات.
ملاحظة: يعتمد عدد الزجاجات المطلوبة على عدد حالات التعرض للمواد الكيميائية التي يتم إجراؤها والنمط الجيني لسلالة الاختبار. عادة ، يمكن الحصول على عدة مئات من الذباب من زجاجة واحدة عند استخدام مخزون قوي وخصب. يستخدم الفحص القياسي ذباب Oregon-R البري (مخزون BDSC # 2057) ، ولكن يمكن استخدام أي نمط (أنماط) وراثية ذات أهمية مع هذا البروتوكول. تذكر أن الأنماط الجينية المعرضة للخطر ذات الخصوبة المنخفضة و / أو الصلاحية تتطلب زيادة مزارع الزجاجات. - احتضان صواني زجاجات الاستزراع عند 25 درجة مئوية مع رطوبة 60٪ تقريبا ودورة ضوئية مظلمة 12:12 ساعة حتى يتم ملاحظة مراحل اليرقات الثالثة أو مراحل العذراء المبكرة. يمكن التعرف على هذه المرحلة من خلال وجود يرقات تتجول على جوانب الزجاجة وظهور الشرانق على جدران الزجاجة.
ملاحظة: تعامل مع الذباب فقط خلال فترة إضاءة الضوء 12:12 ساعة: دورة الظلام. بالنسبة للمخزون القوي ، تصل الزجاجات إلى هذه المرحلة بعد 3-4 أيام في ظل الظروف الموصوفة.- إزالة الذباب الكبار وتحديد سيولة وسائل الإعلام. إذا كانت الوسائط تتدفق على طول جانب الزجاجة عند قلبها ، يكون الوسيط سائلا جدا. أدخل مسحة مهمة دقيقة أو كرة حرير صناعي في قاع الزجاجة لتصلب طعام الذبابة.
- عندما يبدأ الذباب في الإغلاق ، قم بإزالة جميع البالغين من الزجاجات واسمح للشرانق بالاستمرار في الإغلاق لمدة 48 ساعة. في هذه المرحلة ، يمكن إما نقل أي بالغين تم تطهيرهم من زجاجات الاستزراع إلى زجاجات جديدة لنشر المخزونات (انظر الخطوة 2.1) أو التخلص منها.
- نقل الذباب الذي يغلق في فترة 48 ساعة إلى زجاجات جديدة تحتوي على وسائط BDSC القياسية. العمر لمدة 3 أيام.
ملاحظة: البالغين في هذه الزجاجات تتراوح أعمارهم بين 3-5 أيام ويمكن استخدامها في تجارب الفتك والتغذية. تحتوي الزجاجات المستخدمة لعمر الذباب البالغ على البيض واليرقات. نتيجة لذلك ، يمكن استخدام هذه الزجاجات لنشر الجيل القادم من الذباب.
3. تحضير الذباب للتعرض الكيميائي
- تخدير الذباب البالغ من العمر 5-7 أيام باستخدام CO2. فرز الذباب المخدر حسب الجنس باستخدام أعضائه التناسلية. للمساعدة في تخدير الذباب وجنسه ، انظر المرجع28.
- ضع مجموعات من 20 ذكرا أو 20 ذبابة أنثى في قوارير تحتوي على وسائط BDSC القياسية. أغلق القارورة بسدادة من الحرير الصناعي وقم بتخزين قوارير الذكور والإناث بشكل منفصل. بمناسبة قوارير تحتوي على الذباب الإناث مع شريط. اترك القوارير مع ذكور الذباب بدون علامات لتجنب خلط الجنسين عن طريق الخطأ.
ملاحظة: عدد القوارير التي يجب تحضيرها في الخطوة 3.2 يحدده حجم تجارب التعرض. كما هو موضح في الخطوتين 5.3 و 5.6 ، تتطلب تجربة تحديد المدى النموذجية لمادة كيميائية اختبار واحدة ما لا يقل عن 40 قارورة من الذكور و 40 قارورة من الإناث. تتطلب تجربة منحنى الجرعة والاستجابة القياسية ، الموصوفة في الخطوتين 7.4 و 7.8 ، ما لا يقل عن 63 قارورة من الذكور و 63 قارورة من الإناث. - قم بتخزين القوارير لمدة 48 ساعة في حاضنة عند 25 درجة مئوية عند رطوبة 60٪ تقريبا وبدورة ضوئية مظلمة لمدة 12:12 ساعة. خلال هذا الوقت ، اسند صينية القوارير المصنفة بزاوية 60 درجة لمنع الذباب من التعلق في الطعام أثناء التعافي من التخدير.
ملاحظة: تسمح هذه الخطوة للذباب بالتعافي من تخدير CO2 . لا تخدير الذباب مرة أخرى خلال الفترة المتبقية من بروتوكول التعرض. - بعد فترة الاسترداد 48 ساعة ، أضف 0.75 مل من الماء النقي المعقم إلى القوارير المعدة في الخطوة 1.3. يجب أن يكون عدد القنينات المعدة في هذه الخطوة مطابقا لعدد القنينات المعدة في الخطوة 3.2.
- انقل الذباب المصنف والمطابق للجنس إلى قارورة الجوع عن طريق فتح القارورة الزجاجية التي تحتوي على الذباب من الخطوة 3.2 ، ووضعها في فم القارورة البلاستيكية المعدة ، ثم النقر على الجزء السفلي من القارورة البلاستيكية على سطح الطاولة. أغلق القارورة البلاستيكية بسدادة أسيتات السليلوز (المعروفة باسم flug).
- سجل أي ذباب مفقود في هذا النقل (نقل إلى سجلات عدد البداية من الذباب لكل قارورة في وقت لاحق).
- ضع علامة على قوارير الجوع التي تحتوي على ذباب أنثى بشريط. اترك القوارير مع ذكور الذباب بدون علامات لتجنب خلط الجنسين عن طريق الخطأ.
- تحضير غرفة الرطوبة للتعرض بين عشية وضحاها. انظر الخطوات 1.4-1.5 للحصول على وصف لكيفية بناء هذه الغرفة.
- ضع ستة مناشف ورقية قياسية في قاع غرفة الرطوبة. انقع المناشف الورقية مع 100 مل من الماء.
- ضع الشبكة البلاستيكية (الخطوة 1.5) فوق المناشف المبللة لضمان عدم ملامسة القوارير للمناشف الورقية المشبعة.
- ضع صواني قوارير الجوع في وضع أفقي داخل غرف الرطوبة. ضع غرف الرطوبة في حاضنة 25 درجة مئوية (عند رطوبة 60٪ تقريبا) طوال الليل.
ملاحظة: من الناحية المثالية ، تستمر فترة المجاعة بين عشية وضحاها حوالي 16 ساعة ؛ ومع ذلك ، يمكن تعديل التوقيت لجداول المختبر الفردية.
4. إعداد حلول الأسهم
ملاحظة: يتم تغذية الذباب بمواد كيميائية اختبارية في وسائط سائلة خميرة السكروز. يصف هذا القسم تحضير محاليل المخزون لوسائط التغذية المركزة والمواد الكيميائية للاختبار.
- قم بإعداد محلول 4x خميرة وسكروز يحتوي على 16٪ سكروز و 6٪ مستخلص خميرة (م / حجم) (انظر جدول المواد) مذاب في ماء نقي معقم. الأوتوكلاف الحل على دورة سائلة لوقت التعقيم المناسب (على سبيل المثال ، 40 دقيقة ل 1 لتر).
ملاحظة: يمكن صنع المحلول بكميات كبيرة وتخزينه في قسامات عند -20 درجة مئوية. قم بإذابة القسمة الفردية قبل 1 يوم من الاستخدام عن طريق وضعها في ثلاجة 4 درجات مئوية. - إعداد مخزون من اختبار الكيميائية. بالنسبة للتجربة الأولية ، يجب عمل محلول المخزون بأعلى تركيز بحيث يمكن إذابة المادة الكيميائية بالكامل في الماء.
ملاحظة: يمكن استخدام المذيبات بخلاف الماء لإذابة مادة الاختبار الكيميائية. انظر المناقشة المتعلقة بالمحاذير لاستخدام المذيبات البديلة. - قم بإعداد محلول مخزون صبغة زرقاء 100x عن طريق إذابة 1 جم من FD&C Blue رقم 1 (انظر جدول المواد) في 10 مل من الماء النقي المعقم.
ملاحظة: يمكن صنع محلول مخزون الصبغة الزرقاء بكميات كبيرة وتخزينه في قسامات عند 4 درجات مئوية.
5. إعداد قوارير التعرض: تجربة تحديد المدى
ملاحظة: تم تصميم الخطوتين 5 و 6 من البروتوكول لتحديد أقل جرعة من مادة الاختبار الكيميائية التي تحفز الفتك بنسبة 100٪ وأعلى جرعة تفشل في إحداث نمط ظاهري قاتل. إذا تم تحديد هذه التركيزات بالفعل من خلال التجارب السابقة ، فراجع الخطوتين 7 و 8 لحساب منحنى استجابة الجرعة. يجب تحضير وسائط التعرض مباشرة قبل إضافة الذباب إلى قوارير التعرض.
- قم بتسمية ثمانية أنابيب طرد مركزي سعة 15 مل على النحو التالي: (i) لا توجد مادة كيميائية ، (ii) أعلى تركيز ، (iii) 1: 2 ، 1:10 ، 1:20 ، 1: 100 ، 1: 200 ، و 1: 1,000.
- قم بإعداد وسائط التعرض في أنابيب الطرد المركزي الموسومة من الخطوة 5.1 عن طريق إضافة 2.5 مل أولا من محلول مخزون الخميرة / السكروز 4x إلى جميع الأنابيب الثمانية الملصقة.
- أضف 7.5 مل من الماء النقي المعقم إلى الأنبوب المسمى "بدون مادة كيميائية". هذا التخفيف هو السيطرة السلبية.
- أضف 7.4 مل من محلول المخزون الكيميائي الاختباري إلى الأنبوب المسمى "أعلى تركيز". أضف 100 ميكرولتر من الماء النقي المعقم إلى هذا الأنبوب ، وبالتالي فإن الحجم النهائي هو 10 مل. حساب وتسجيل مولارية المادة الكيميائية الاختبار في هذا الحل.
ملاحظة: تضمن إضافة 100 ميكرولتر من الماء النقي المعقم إلى الأنبوب أن التركيز الكيميائي في هذه الخطوة مطابق للتركيز المستخدم في الخطوة 5.5 ، حيث يتم إضافة محلول مخزون الصبغة الزرقاء إلى وسائط التعرض كطريقة لتقييم سلوك التغذية. - أضف الكمية المناسبة من محلول المخزون الكيميائي للاختبار والمياه النقية المعقمة إلى الأنابيب المتبقية. يجب أن يكون الحجم النهائي لكل أنبوب 10 مل. يجب أن يكون التركيز النهائي للمواد الكيميائية الاختبارية في هذه الأنابيب بالنسبة إلى أنبوب "أعلى تركيز" 1: 2 و 1:10 و 1:20 و 1: 100 و 1: 200 و 1: 1,000.
- قم بإعداد وتسمية ثماني قوارير تعرض لكل تركيز فردي لوسائط التعرض المتولدة في الخطوة 5.1. يجب أن يكون هناك ثماني مجموعات من القوارير (إجمالي 64 قارورة) تحتوي على الملصقات التالية: لا توجد مادة كيميائية ، أعلى تركيز ، 1: 2 ، 1:10 ، 1:20 ، 1: 100 ، 1: 200 ، و 1: 1000.
- ماصة 0.75 مل من وسائط التعرض المحضرة في الخطوة 5.2.3 في المجموعة المقابلة من قوارير التعرض.
- قم بتسمية ثمانية أنابيب فردية سعة 5 مل على النحو التالي: (i) لا توجد مادة كيميائية ، (ii) أعلى تركيز ، (iii) 1: 2 ، 1:10 ، 1:20 ، 1: 100 ، 1: 200 ، و 1: 1,000.
- قم بإعداد وسائط التعرض للصبغة الزرقاء عن طريق خلط 500 ميكرولتر أولا من محلول مخزون الخميرة / السكروز 4x و 20 ميكرولتر من محلول مخزون الصبغة الزرقاء في ثمانية أنابيب مصنفة سعة 5 مل.
- أضف 1.48 مل من الماء النقي المعقم إلى الأنبوب المسمى "بدون مادة كيميائية". هذا التخفيف هو السيطرة السلبية.
- أضف 1.48 مل من محلول المخزون الكيميائي للاختبار إلى الأنبوب المسمى "أعلى تركيز". لا يضاف الماء إلى هذا الأنبوب. حساب وتسجيل مولارية المادة الكيميائية الاختبار في هذا الحل.
- أضف الكمية المناسبة من محلول المخزون الكيميائي للاختبار والمياه النقية المعقمة إلى الأنابيب المتبقية. يجب أن يكون الحجم النهائي لكل أنبوب 2 مل. يجب أن يكون التركيز النهائي للمادة الكيميائية الاختبارية في هذه الأنابيب بالنسبة إلى أنبوب "أعلى تركيز" 1: 2 و 1:10 و 1:20 و 1: 100 و 1: 200 و 1: 1,000.
- قم بإعداد وتسمية قارورة تعرض مع كل تركيز فردي لوسائط التعرض الزرقاء. يجب أن يكون هناك ثماني مجموعات من القوارير (إجمالي 16 قارورة) تحتوي على الملصقات التالية: لا توجد مادة كيميائية ، أعلى تركيز ، 1: 2 ، 1:10 ، 1:20 ، 1: 100 ، 1: 200 ، و 1: 1000. يجب أيضا كتابة كلمة "أزرق" على هذه القوارير.
- ماصة 0.75 مل من وسائط التعرض الأزرق في المجموعة المقابلة من قوارير التعرض الزرقاء.
6. يطير التعرض للمواد الكيميائية: تجربة تحديد المدى
- قم بإعداد قوارير التعرض للمواد الكيميائية باستخدام قوارير الذباب الجائع بين عشية وضحاها من الخطوة 3.7 على النحو التالي:
- نقل أربع قوارير من إناث الذباب الجائعة (20 ذبابة لكل قارورة) إلى أربع قوارير تعرض لكل تركيز كيميائي. تسمية هذه القوارير "أنثى". استخدم نفس طريقة النقل الموضحة في الخطوة 3.5.
- نقل أربع قوارير من ذكور الذباب الجائعة (20 ذبابة لكل قارورة) إلى أربع قوارير تعرض لكل تركيز كيميائي. تسمية هذه القوارير "ذكر". استخدم نفس طريقة النقل الموضحة في الخطوة 3.5.
- قم بإعداد قوارير التعرض الكيميائي التي تحتوي على صبغة زرقاء باستخدام قوارير الذباب الجائع بين عشية وضحاها من الخطوة 3.7 على النحو التالي:
- نقل قارورة واحدة من إناث الذباب الجائعة (20 ذبابة لكل قارورة) إلى قنينة تعرض زرقاء واحدة لكل تركيز كيميائي. تسمية هذه القارورة "أنثى". استخدم نفس طريقة النقل الموضحة في الخطوة 3.5.
- نقل قارورة واحدة من ذكور الذباب الجائعة (20 ذبابة لكل قارورة) إلى قنينة تعرض زرقاء واحدة لكل تركيز كيميائي. تسمية هذه القارورة "ذكر". استخدم نفس طريقة النقل الموضحة في الخطوة 3.5.
- سجل عدد الذباب الموجود في كل قارورة بعد النقل ولاحظ العدد الذي مات أو هرب. عادة ، يجب أن تنجو جميع الذباب ال 20 من الجوع والنقل بين عشية وضحاها.
- ضع قوارير التعرض أفقيا في غرف الرطوبة المعدة حديثا (انظر الخطوة 3.6 لإعداد غرفة الرطوبة). ضع الغرف في حاضنة 25 درجة مئوية مع رطوبة 60٪ تقريبا ودورة 12:12 ساعة: مظلمة.
- افحص قوارير التعرض عند 24 و 48 ساعة بعد بدء التعرض للمواد الكيميائية. عد وسجل عدد الذباب الميت في كل قارورة في كل نقطة زمنية.
ملاحظة: يتم استخدام الموت كقراءة لهذا الفحص ، ولكن يمكن تكييف البروتوكول لفحص الأنماط الظاهرية الأخرى. عادة ما يتم جمع الذباب المكشوف في هذه النقاط الزمنية للدراسات النسخية والأيضية. - افحص قوارير التعرض الزرقاء عند 24 ساعة بعد بدء التعرض للمواد الكيميائية. استخدم التقنيات التالية لتحديد ما إذا كان الذباب المكشوف قد استهلك وسائط التعرض الزرقاء:
- افحص جدران القارورة بحثا عن مؤشرات على البراز الأزرق ، والتي تظهر كنقاط صغيرة على جانب قارورة التعرض وكذلك على التدفق.
- تخدير الذباب مع CO2 وفحص البطن لوجود صبغة زرقاء.
ملاحظة: عادة ، يتم تحليل قوارير التعرض الزرقاء بعد 24 ساعة. ومع ذلك ، يمكن تنفيذ هذه الخطوة في 48 ساعة ، بدلا من ذلك. الذباب الذي أكل عادة ما يكون له شريط أزرق من خلال البطن ، مما يشير إلى أن وسائط التعرض قد دخلت القناة الهضمية. - افحص الذباب بحثا عن سلوكيات التغذية غير الطبيعية ، مثل القلس ، وانتفاخ المحاصيل ، وانهيار وظيفة الحاجز المعوي (يشار إليه بظهور صبغة زرقاء في جميع أنحاء الكائن الحي بدلا من الاقتصار على الجهاز الهضمي ، والذي يشار إليه عادة باسم السنافر32،33).
- تخلص من جميع القوارير الملوثة ، وورق الترشيح ، والقذف ، والذباب في حاويات النفايات الكيميائية المناسبة. إذا بقي الذباب الحي في القوارير ، فقم بتجميد القوارير لقتل الذباب قبل التخلص منها في حاوية النفايات المناسبة.
ملاحظة: يتم التخلص من قوارير التعرض والذباب بواسطة المادة (المواد) الكيميائية التي يتم تحليلها في التجربة. اتبع دائما إجراءات السلامة الكيميائية الموضحة في ورقة بيانات السلامة الكيميائية. إذا كانت التركيزات المستخدمة في تجربة تحديد المدى تقتل الذباب بأقل جرعة ، كرر القسم 6 باستخدام سلسلة تخفيف ، بدءا من أقل تركيز قتل 100٪ من الحيوانات.
7. تحضير قوارير التعرض: توليد منحنى الاستجابة للجرعة
ملاحظة: تم تصميم البروتوكول الموضح في الخطوتين 5 و 6 لتحديد التركيز الكيميائي المطلوب لاستنباط النمط الظاهري على نطاق واسع. تستخدم الخطوتان 7 و 8 من البروتوكول لحساب منحنى دقيق للجرعة والاستجابة.
- احسب التركيزات الكيميائية للاختبار التي يجب تحليلها لإنشاء منحنى استجابة الجرعة باستخدام الطريقة التالية:
- أوجد أقل تركيز للمادة الكيميائية الاختبارية التي تقتل 100٪ من الذباب المكشوف عند 48 ساعة.
- تحديد أعلى تركيز للمادة الكيميائية الاختبارية التي ليس لها تأثير على الصلاحية عند 48 ساعة.
- احسب أربعة تركيزات إضافية موزعة بالتساوي بين التركيزات المحددة في الخطوتين 7-1-1 و7-1-2.
- ضع علامة على تسعة أنابيب طرد مركزي فردية سعة 15 مل مع مولارية التركيزات التالية: '1' لا توجد مادة كيميائية، '2' التركيز المحدد في الخطوة 7-1-1، '3' التركيز المحدد في الخطوة 7-1-2، '4' التركيزات المحددة في 7-1-3، '5' ضعف التركيز المحدد في الخطوة 7-1-1، '6' تخفيف التركيز بنسبة 1:2 المحدد في الخطوة 7-1-2.
ملاحظة: من المهم إدراج التركيزات التي تبلغ ضعف التركيز المحدد في 7-1-1 وتخفيف 1:2 من التركيز المحدد في الخطوة 7-1-2 لحساب منحنى الجرعة والاستجابة بدقة. - قم بإعداد وسائط التعرض عن طريق إضافة 2.5 مل أولا من محلول مخزون الخميرة / السكروز 4x إلى تسعة أنابيب طرد مركزي فردية سعة 15 مل محضرة في الخطوة 7.2.
- أضف 7.5 مل من الماء النقي المعقم إلى الأنبوب المسمى "بدون مادة كيميائية". هذا التخفيف هو السيطرة السلبية.
- أضف الكمية المناسبة من محلول المخزون الكيميائي للاختبار والمياه النقية المعقمة إلى الأنابيب المتبقية. يجب أن يكون الحجم النهائي لكل أنبوب 10 مل. يجب أن يكون التركيز النهائي للمادة الكيميائية داخل الأنبوب الفردي مساويا للتركيز المكتوب على السطح الخارجي للأنبوب.
- قم بإعداد وتسمية 12 قارورة تعرض لكل تركيز من وسائط التعرض المتولدة في الخطوة 7.2. يجب أن يكون هناك تسع مجموعات من القوارير (إجمالي 108 قارورة).
- ماصة 0.75 مل من وسائط التعرض في المجموعة المقابلة من قوارير التعرض.
ملاحظة: الخطوات من 7.6 إلى 7.8 اختيارية. إذا كان من المعروف أن التركيزات الكيميائية للاختبار المحضرة في الخطوة 7.2 لا تؤثر على سلوك التغذية ، فيمكن تخطي هذه الخطوات. - قم بإعداد وتسمية تسعة أنابيب مختلفة سعة 5 مل لوسائط التعرض الأزرق بنفس سلسلة التركيزات المستخدمة في الخطوة 7.2.
- قم بإعداد وسائط التعرض للصبغة الزرقاء عن طريق خلط 500 ميكرولتر أولا من محلول مخزون الخميرة / السكروز 4x و 20 ميكرولتر من محلول مخزون الصبغة الزرقاء.
- أضف 1.48 مل من الماء المعقم النقي إلى الأنبوب المسمى "بدون مادة كيميائية". هذا التخفيف هو السيطرة السلبية.
- أضف الكمية المناسبة من محلول المخزون الكيميائي للاختبار والماء المعقم النقي إلى الأنابيب المتبقية. يجب أن يكون الحجم النهائي لكل أنبوب 2 مل. يجب أن يكون التركيز النهائي للمادة الكيميائية داخل الأنبوب الفردي مساويا للتركيز المكتوب على السطح الخارجي للأنبوب.
- قم بإعداد وتسمية قارونينتين للتعرض لكل تركيز فردي لوسائط التعرض الزرقاء. يجب أن تكون هناك تسع مجموعات من القنينات (إجمالي 18 قارورة) ، مع تسمية كل مجموعة من القنينات بالتركيزات المدرجة في الخطوة 7.2. يجب أيضا كتابة كلمة "أزرق" على هذه القوارير.
- ماصة 0.75 مل من وسائط التعرض الأزرق في المجموعة المقابلة من قوارير التعرض الزرقاء.
8. التعرض للمواد الكيميائية للذبابة: توليد منحنى الاستجابة للجرعة
- قم بإعداد قوارير التعرض للمواد الكيميائية باستخدام قوارير الذباب الجائع بين عشية وضحاها من الخطوة 3.7 على النحو التالي:
- نقل ست قوارير من إناث الذباب الجائعة (20 ذبابة لكل قارورة) إلى ست قوارير تعرض لكل تركيز كيميائي. تسمية هذه القوارير "أنثى". استخدم نفس طريقة النقل الموضحة في الخطوة 3.5.
- نقل ست قوارير من ذكور الذباب الجائعة (20 ذبابة لكل قارورة) إلى ست قوارير تعرض لكل تركيز كيميائي. تسمية هذه القوارير "ذكر". استخدم نفس طريقة النقل الموضحة في الخطوة 3.5.
- قم بإعداد قوارير التعرض الكيميائي التي تحتوي على صبغة زرقاء باستخدام قوارير الذباب الجائع بين عشية وضحاها من الخطوة 3.7 على النحو التالي:
- نقل قارورة واحدة من إناث الذباب الجائعة (20 ذبابة لكل قارورة) إلى قنينة تعرض زرقاء واحدة لكل تركيز كيميائي. تسمية هذه القارورة "أنثى". استخدم نفس طريقة النقل الموضحة في الخطوة 3.5.
- نقل قارورة واحدة من ذكور الذباب الجائعة (عشرون ذبابة لكل قارورة) إلى قارورة تعرض زرقاء واحدة لكل تركيز كيميائي. تسمية هذه القارورة "ذكر". استخدم نفس طريقة النقل الموضحة في الخطوة 3.5.
- سجل عدد الذباب الموجود في كل قارورة بعد النقل. عادة ، يجب أن تنجو جميع الذباب ال 20 من الجوع والنقل بين عشية وضحاها ، ولكن تأكد من طرح أي ذباب مات أو هرب أثناء النقل من الإجمالي.
- ضع قوارير التعرض أفقيا في غرف الرطوبة المعدة حديثا (انظر الخطوة 3.6 لإعداد غرفة الرطوبة). ضع الغرف في حاضنة 25 درجة مئوية مع رطوبة 60٪ تقريبا ودورة 12:12 ساعة: مظلمة.
- افحص قوارير التعرض عند 24 و 48 ساعة بعد بدء التعرض للمواد الكيميائية. عد وسجل عدد الذباب الميت في كل قارورة في كل نقطة زمنية.
- افحص قوارير التعرض الزرقاء عند 24 ساعة بعد بدء التعرض للمواد الكيميائية. استخدم الطريقة الموضحة في الخطوة 6.6 لتقييم التغييرات في سلوك التغذية.
- تخلص من جميع القوارير الملوثة ، وورق الترشيح ، والقذف ، والذباب في حاويات النفايات الكيميائية المناسبة. إذا بقي الذباب الحي في القوارير ، فقم بتجميد القوارير لقتل الذباب قبل التخلص منه في حاوية النفايات المناسبة.
ملاحظة: يتم التخلص من قوارير التعرض والذباب بواسطة المادة (المواد) الكيميائية التي يتم تحليلها في التجربة. اتبع دائما إجراءات السلامة الكيميائية الموضحة في ورقة بيانات السلامة الكيميائية.
9. حساب منحنى الاستجابة للجرعة
- استخدم برنامج الجرعة المعيارية (BMDS ، الإصدار 3.2 ؛ انظر جدول المواد) أو برامج أخرى مماثلة لتحليل البيانات34. فيما يلي وصف لسير العمل باستخدام برنامج BMDS.
- انقر فوق علامة التبويب البيانات في BMDS وانقر فوق إدراج مجموعة بيانات جديدة. أدخل عدد العينات في مجموعة البيانات ، وانقر فوق التصنيف الثنائي ، ثم انقر فوق إنشاء مجموعة بيانات. أدخل كل نسخة متماثلة كصف فردي في مجموعة البيانات.
- أدخل الجرعة في العمود الأول من الجدول الذي تم إنشاؤه ، وعدد البداية للذباب باستثناء أي ذباب مات أو فقد قبل الخطوة 8.3) في العمود الثاني ، وعدد الذباب الذي مات من التعرض الكيميائي في العمود الثالث.
- انقر فوق علامة التبويب الرئيسية في BMDS.
- انقر فوق سهم القائمة المنسدلة لقائمة تحديد نوع النموذج وانقر فوق Dichotomous.
- انقر فوق تمكين لمجموعة البيانات من الخطوة 9.2 في جدول مجموعات البيانات.
- انقر فوق المربعات الخاصة بالنماذج المطلوبة للتحليل في جدول MLE والبدائل.
ملاحظة: تم استخدام نموذج التل ثنائي التفرع المقيد المتكرر بشكل أساسي. - انقر فوق تشغيل التحليل. سيقوم البرنامج بإنشاء ملف إخراج مع منحنى (منحنى) الفتك وتفاصيل إضافية حول النموذج (النماذج).
Representative Results
لطالما عملت الذبابة كنموذج في الدراسات لتحديد سمية زرنيخيت الصوديوم (NaAsO2)35،36،37،38. ولإثبات فعالية البروتوكول، تعرض ذكور وإناث الذباب ل NaAsO2، بهدف مقارنة هذه النتائج بالدراسات السابقة. باستخدام المنهجية الموضحة أعلاه، تعرض الذكور والإناث البالغين في ولاية أوريغون-آر (مخزون BDSC #2057) لمجموعة من تركيزات NaAsO 2 (0 و0.01 و0.02 و0.1 و0.2 و1 و2 مللي مول) وسجلوا مدى الفتك بعد 48 ساعة من بدء التعرض (الشكل 1A، B).
كان الغرض من هذا التحليل الأولي هو تحديد النطاق التقريبي للتركيزات التي من شأنها أن تسمح بتوصيف أكثر دقة لسمية NaAsO2. في التجارب اللاحقة، تم اختيار التركيزات (0 و0.2 و0.5 و1 و1.5 و2 و2.5 و3 و3.5 و5 مللي مول) التي حددت بدقة أكبر منحنى استجابة الجرعة NaAsO2 (الشكل 1C، D). لاحظ أن التحليل الناتج فحص العديد من التركيزات التي تسببت في الفتك بنسبة 100٪. تم تحليل البيانات باستخدام برنامج الجرعة المعيارية المتاح للجمهور التابع لوكالة حماية البيئة الإصدار 3.2.0.125. تم تصميم البيانات على أنها "ثنائية التفرع" وتم استخدام نموذج Dichotomous Hill للتحليلات اللاحقة. بناء على هذا النموذج ، كانت LD10 وLD 25 و LD 50 النهائية من ذكور الذباب التي تم تغذيتها NaAsO2 0.30 mM و0.50 mM و 0.65 mM على التوالي. بالنسبة لإناث الذباب ، كانت هذه القيم أعلى قليلا ، مع LD10 من 0.30 mM ، و LD25 من 0.65 mM ، وLD 50 من 0.90 mM. بشكل عام ، فإن القيم التي تم الحصول عليها باستخدام هذه الطريقة مماثلة لتلك التي تم الإبلاغ عنها سابقا لسمية الزرنيخ في ذبابة الفاكهة الميلانية35،36،37،38 ، وبالتالي التحقق من صحة المنهجية.
بالإضافة إلى النسخ المتماثلة الستة المستخدمة لحساب منحنى الاستجابة للجرعة، تم تغذية ذكور وإناث الذباب أيضا بمحاليل التعرض NaAsO2 التي تحتوي على 1٪ FD&C أزرق، والذي يمكن رؤيته بسهولة في الجهاز الهضمي باستخدام المجهر الضوئي. استنادا إلى وجود صبغة زرقاء داخل أمعاء الذباب الذي يتغذى على NaAsO 2، استمر كل من ذكور وإناث الذباب في التغذية بعد 24 ساعة من بداية التعرض للمواد الكيميائية، بغض النظر عن تركيز NaAsO 2 الموجود داخل الوسائط السائلة (الشكل 2). ومع ذلك ، لوحظ أن الطعام المبتلع يتم تقيؤه أحيانا بجرعات أعلى من 0.2 مليمتر للإناث و 0.5 ملليمتر للذكور (الشكل 2). تشير هذه النتائج إلى أن القلس يمكن أن يلعب دورا رئيسيا في استجابة ذبابة الفاكهة للتسمم بالزرنيخ.
الشكل 1: منحنيات الاستجابة للجرعة لذبابة الفاكهة الذكرية والأنثوية المعالجة ب NaAsO2 لمدة 48 ساعة. توضح جميع الرسوم البيانية النسب المقدرة للذباب الميت عند كل تركيز NaAsO2 تم اختباره بناء على نموذج التل ثنائي التفرع. (أ، ب) تم اختبار مجموعة واسعة من تركيزات NaAsO2 لتقريب الجرعة التي يبدأ عندها كل جنس من الذبابة في الموت. (أ) يوضح بيانات الذكور، و(ب) يوضح بيانات الإناث. N = 4 قوارير ، مع 20 ذبابة لكل قارورة. (ج، د) تم اختبار نطاق أضيق من تركيزات NaAsO2 لتحديد جرعات دقيقة مات عندها 10٪ و 25٪ و 50٪ من كل جنس من الذباب. يشار إلى هذه الجرعات على يمين كل رسم بياني. (ج) يوضح بيانات الذكور، و(د) يوضح بيانات الإناث. N = 6 قوارير ، مع 20 ذبابة لكل قارورة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: النتائج التمثيلية من مقايسة الصبغة الزرقاء لذبابة الفاكهة الذكرية والأنثوية المعالجة ب NaAsO2 لمدة 24 ساعة. تظهر الصور المجهرية أن الذباب يتغذى على تركيزات متزايدة من NaAsO2. يظهر الصف (A) ذكور الذباب، ويظهر الصف (B) إناث الذباب، مع زيادة تركيز NaAsO2 من اليسار إلى اليمين. يظهر البطن كمية صغيرة من اللون الأزرق بالقرب من الصدر بتركيزات منخفضة ، مما يشير إلى أن وسائط التعرض دخلت القناة الهضمية. عند التركيزات الأعلى ، تبدأ الصبغة الزرقاء في التراكم حول الفم ، مما يشير إلى أن وسائط التعرض يتم تقيؤها. شريط المقياس 1 مم. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
Discussion
تظهر ذبابة الفاكهة Drosophila melanogaster كنظام قوي ل NAMs16،18،19،21. من خلال الاستفادة من الموارد الجينية التي لا مثيل لها المتاحة لمجتمع الذباب، جنبا إلى جنب مع التطورات الحديثة في علم الجينوم والأيض، فإن دراسات السلامة الكيميائية باستخدام ذبابة الفاكهة قادرة على تحديد الآليات الجزيئية التي تتداخل من خلالها المركبات الفردية مع التمثيل الغذائي وعلم وظائف الأعضاء وإشارات الخلية بسرعة (على سبيل المثال، انظر39). تم تصميم هذا البروتوكول غير المكلف لتحديد منحنيات الاستجابة للجرعة بسرعة وبالتالي توليد عينات لتحليل RNA-seq والأيض. علاوة على ذلك ، يمكن تكييف هذا البروتوكول المرن للاستخدام مع أي نمط وراثي ويمكن أن يستوعب العديد من فئات المواد الكيميائية.
أحد الجوانب البارزة لهذا البروتوكول هو اختيار الطعام السائل المستخدم في التعرض الكيميائي ، والذي يعتمد على دراسة سابقة ، ولكنه يختلف عن الوسائط الصلبة المستخدمة في معظم الدراسات السمية لذبابة الفاكهة18،22. تم اختيار هذه الوسائط السائلة المحددة لتعكس المحتوى الغذائي لوسائط BDSC القياسية الصلبة التي يتم تغذية الذباب أيضا في هذا البروتوكول ، لضمان حصول الذباب على تغذية متسقة. تتميز بساطة وسائط التغذية السائلة بالعديد من المزايا. الوسائط السائلة أسهل في التعامل معها من الطعام الصلب ، الذي يحتاج إما إلى صهره وإعادة ترسيخه أو إعادة تشكيله من مسحوق. تزيد الوسائط السائلة أيضا من إنتاجية النظام ، وتضمن التوزيع الكيميائي المتساوي في جميع أنحاء وسائط التغذية ، وتقلل من الوقت المستغرق في العمل مع المركبات الخطرة. بالإضافة إلى ذلك ، لا تتطلب الوسائط تسخين المحاليل ، مما يسهل اختبار مركبات الاختبار المتطايرة. أخيرا ، بسبب المكونات القليلة نسبيا المدرجة في محلول الطعام ، يتم تقليل التفاعلات الجانبية غير المرغوب فيها بين مادة الاختبار الكيميائية والمكونات الغذائية الأخرى. الخميرة المستخدمة في الطعام غير نشطة أيضا ، مما يحد من تفاعل وسط التغذية. ومع ذلك ، يرجى ملاحظة أن الطريقة غير مناسبة لاختبار سمية النمو أو اليرقات.
يمكن استبدال بعض المواد المستخدمة في البروتوكول ، مثل استخدام قوارير الذباب الزجاجية بدلا من البولي بروبلين. ومع ذلك ، تم اختيار المواد المستخدمة لتكون خاملة ويمكن التخلص منها لتجنب التفاعلات الكيميائية غير المرغوب فيها بين الكواشف والتعرض الكيميائي الذي قد ينتج عن تنظيف الأواني الزجاجية.
يتطلب استخدام الطعام السائل وسيلة لتوصيل الطعام. تم اختيار ورق ترشيح خلات السليلوز لهذا الغرض بسبب مرونته وطبيعته الخاملة28. استخدم باحثون آخرون بروتوكولات مماثلة ولكن مع مركبات أخرى ، مثل مناديل المهام الدقيقة أو مرشح الألياف الزجاجية29,30. يناسب ورق ترشيح أسيتات السليلوز هذه الاحتياجات لأنه مركبة خاملة يمكن قطعها إلى الشكل المثالي لتناسبها في الجزء السفلي من قوارير الذباب دون وجود فجوات كبيرة بين الورق وجدار القارورة ، مما يمنع الموت بسبب تعلق الذباب في الوسائط أو السيارة نفسها.
أحد القيود المهمة لهذا النظام هو أن الحد الأقصى للتركيز القابل للاختبار للمادة الكيميائية مرتبط بقابلية ذوبان المادة الكيميائية. تتطلب المركبات غير القابلة للذوبان في الماء مذيب إضافي ، مما قد يؤدي إلى تأثيرات إضافية أو تآزرية مع المادة الكيميائية ذات الأهمية. يمكن أن يؤدي ذلك أيضا إلى حدوث مواقف لا يمكن فيها إعداد حلول مخزون مركزة بدرجة كافية لتحقيق نقطة النهاية المرغوبة في جميع الكائنات الحية ، وبالتالي الحد من تحليل البيانات الناتجة31. لمعالجة هذا ، يمكن اختبار المواد الكيميائية ذات القابلية المنخفضة للذوبان في الماء عن طريق إضافة ما يصل إلى 0.5٪ ثنائي ميثيل سلفوكسيد إلى محلول الطعام. يمكن استخدام مذيبات أخرى أيضا ، ولكن هناك حاجة إلى مزيد من البحث لكل مذيب مهم لتحديد أقصى تركيز مقبول للمذيب داخل المحلول لزيادة الذوبانية إلى أقصى حد مع تقليل تأثيرات المذيب على الكائن الحي.
وصف التوصيف المكثف للاستجابة الشمية في ذبابة الفاكهة كيف يتجنب الذباب استهلاك المركبات السامة40,41 ، مما يؤدي إلى انخفاض التغذية على الوسائط المعالجة. يعالج اختبار الصبغة الزرقاء هذه الظاهرة من خلال السماح للباحثين بفحص سلوكيات التغذية للذباب الذي يتغذى على كل تركيز من المواد الكيميائية التجريبية42،43،44 بكفاءة. يشير وجود أو عدم وجود اللون الأزرق في الجهاز الهضمي للذبابة إلى ما إذا كانت الذبابة تأكل الوسط المحتوي على المواد السامة. على الرغم من وجود طرق أكثر تطورا لتقييم سلوكيات تغذية الذباب ، مثل عداد تفاعل الطعام السائلالمتطاير 45 ، فإن هذه الطريقة النوعية مناسبة بشكل أفضل للفحص عالي الإنتاجية.
أحد الجوانب البارزة لهذا البروتوكول هو أنه تم تحسينه لفترة تعرض مدتها 48 ساعة دون الحاجة إلى نقل الذباب أو إضافة سائل إضافي إلى قارورة التعرض. أدى استخدام غرفة الرطوبة ووضع الغرف في حاضنة محفوظة في رطوبة عالية إلى منع ورق الترشيح الذي يحتوي على وسائط التغذية من الجفاف خلال هذا الإطار الزمني. يمكن تكييف البروتوكول لفترات تعرض أطول ، ولكن يجب تعديل الطريقة لضمان عدم جفاف ورق الترشيح والتسبب في تغييرات كبيرة في تركيز المحلول أو الفتك بسبب الجفاف.
أخيرا ، من الخصائص المهمة لهذا البروتوكول أنه يمكن أن يستوعب المتغيرات الجينية بسهولة ، مما يسمح للباحثين باستخدام مجموعة واسعة من الأدوات الجينية لذبابة الفاكهة لتوسيع هذه الدراسات الأولية على الكائنات الحية البرية لفهم آليات العمل الكيميائي في الجسم الحي بشكل أفضل. في هذا الصدد ، يمكن تعديل البروتوكول الموضح أعلاه بسهولة لاستكمال بروتوكول JoVE الموصوف سابقا من قبل Peterson and Long والذي يسمح بالتحليل السمي للذباب الذي يتم صيده في البرية18.
بسبب التنوع الكبير في الدراسات السابقة حول سمية زرنيخيت الصوديوم في ذبابة الفاكهة32،33،34،35،36 ، تمت معالجة ذباب Oregon-R بهذا المركب لإثبات فعالية نظامنا. أظهر ذكور الذباب LD 50 من 0.65 mM ، وأظهرت الإناثLD 50 من0.90 mM. وهذا يتماشى مع الدراسات السابقة لذبابة الفاكهة البالغة المعالجة بزرنيخيت الصوديوم. على سبيل المثال ، وجد Goldstein و Babich37 أن 50٪ من الذباب (الجنسين المختلطين) ماتوا بعد 7 أيام من التعرض ل 0.5 mM NaAsO2. على الرغم من أن هذه جرعة أقل قليلا مما لوحظ حاليا ، إلا أن الاختلافات بين أساليبهم وهذه الطريقة (بما في ذلك استخدام وسائط التعرض الصلبة ، ومقياس زمني أطول ، والجنسين المختلطين) من المحتمل أن تفسر هذا الاختلاف. الأهم من ذلك ، أدت كلتا الطريقتين إلى قيم LD50 متشابهة بشكل عام.
يمكن استخدام الملاحظات من التجارب باستخدام هذا البروتوكول للعثور على أهداف وراثية وجزيئية للدراسات السلوكية أو الميكانيكية اللاحقة. يمكن أيضا استخدام طريقة التعرض لعلاج ذبابة الفاكهة لأخذ عينات من الأيض والبروتينات ، مما يجعل هذا البروتوكول مناسبا تماما للمجال المتنامي لعلم السموم الدقيق (على غرار مجال الطب الدقيق46). في هذا الصدد ، يمكن جمع الذباب المكشوف بعد الخطوة 8 للتحليل الجينومي والأيضي اللاحق. يمكن بعد ذلك معالجة العينات التي تم جمعها في الخطوة 8 ، كما هو موضح بواسطة Li و Tennessen47 ، بدءا من الخطوة 3.
في نهاية المطاف ، فإن البيانات التي تم الحصول عليها من التجارب الموصوفة أعلاه ، بالإضافة إلى أي بيانات لاحقة عن الأيض والبروتينات ، ستستخدم بشكل مثالي في المقارنات بين الأنواع. كما لوحظ سابقا26 ، فإن مثل هذه الدراسات عبر الأنواع قوية وقادرة على تحديد كيفية تداخل المواد الكيميائية الفردية مع المسارات البيولوجية المحفوظة. وبالتالي ، يمكن استخدام البروتوكول الموصوف أعلاه للعثور على القواسم المشتركة التطورية استجابة للمواد السامة الفردية عبر الشعب والمساعدة في إبلاغ تنظيم السلامة الكيميائية.
Disclosures
لا يوجد تضارب في المصالح للإفصاح.
Acknowledgments
نشكر موظفينا على المساعدة في اختبار هذا البروتوكول وتحسينه: أميا بيلامكار ، مارلين كلارك ، ألكسندر فيت ، إيما روز جالانت ، إيثان جولديتش ، ماثيو لوي ، مورغان مارش ، كايل ماكلونج ، آندي بوجا ، دارسي روز ، كاميرون ستوكبريدج ، ونويل زولمان. كما نشكر زملائنا من مجموعة علم السموم الدقيق ، وخاصة نظرائنا في مجموعة التعرض ، للمساعدة في تحديد أهداف البروتوكول.
تلقى هذا المشروع تمويلا من برنامج البحث والابتكار Horizon 2020 التابع للاتحاد الأوروبي بموجب اتفاقية المنحة رقم 965406. تم تنفيذ العمل المقدم في هذا المنشور كجزء من مجموعة ASPIS. ولا يعكس هذا الناتج سوى آراء المؤلفين، ولا يمكن اعتبار الاتحاد الأوروبي مسؤولا عن أي استخدام للمعلومات الواردة فيه. أصبح هذا المنشور ممكنا أيضا بدعم من معهد إنديانا للعلوم السريرية والانتقالية ، والذي يتم تمويله جزئيا من خلال الجائزة رقم UL1TR002529 من المعاهد الوطنية للصحة ، والمركز الوطني لتطوير العلوم الانتقالية ، وجائزة العلوم السريرية والانتقالية. المحتوى هو مسؤولية المؤلفين وحدهم ولا يمثل بالضرورة الآراء الرسمية للمعاهد الوطنية للصحة. تم دعم أجزاء من هذا المشروع بأموال من جامعة إنديانا منحت ل JRS واتحاد PhyloTox. تم دعم JMH و EMP من قبل P40OD018537 جائزة المعاهد الوطنية للصحة لمركز بلومنجتون ذبابة الفاكهة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 inch flower lever action craft punch | Bira Craft | HCP-115-024 | |
| 15 mL Centrifuge Tubes | VWR | 89039-666 | High-Performance Centrifuge Tubes with Flat or Plug Caps, Polypropylene, 15 mL |
| 2 ml Tubes | VWR | 16466-044 | Micro Centrifuge Tube with Flat Screw-Cap, conical bottom |
| 5 ml Tubes | VWR | 60818-576 | Culture Tubes, Plastic, with Dual-Position Caps |
| 50 mL Centrifuge Tubes | Corning | 430290 | 50 mL polypropylene centrifuge tubes, conical bottom with plug seal cap |
| Benchmark Dose Software version 3.2 | U.S. Environmental Protection Agency | ||
| Cardboard trays | Genesee Scientific flystuff | 32-122 | trays and dividers for narrow vials |
| CO2 gas pads | Genesee Scientific flystuff | 59-114 | FlyStuff flypad, CO2 anesthetizing apparatus |
| Combitips advanced, 50 mL | Eppendorf | 0030089693 | Combitips advanced, Biopur, 50 mL, light gray, colorless tips |
| Cotton balls | Genesee Scientific flystuff | 51-101 | Cotton balls, large, fits narrow vials |
| Delicate task wipes | Kimtech | 34155 | Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipes, 1 Ply / 8.2" x 4.39" |
| Drosophila Vial Plugs, Cellulose Acetate (aka, Flugs) | VWR | 89168-888 | Wide |
| FD&C Blue No. 1 | Spectrum Chemical | FD110 | CAS number 3844-45-9 |
| Flies | BDSC | Stock #2057 | OregonR wildtype |
| Gloves (nitrile) | Kimtech | 55082/55081/55083 | Kimtech purple nitrile exam gloves, 5.9 mil, ambidextrous 9.5" |
| Grade 1 CHR cellulose chromatography paper | Cytvia | 3001-917 | Sheet, 46 x 57 cm |
| Mesh for humidity chamber | |||
| Multipette / Repeater (X) stream | Eppendorf | 022460811 | Repeater Xstream |
| Plastic grate | Plaskolite | 18469 (from lowes) | Plaskolite 24 in x 48 in 7.85 sq ft louvered ceiling light panels, cut down to fit in rubbermaid tubs |
| Plastic trays for glass vials | Genesee Scientific flystuff | 59-207 | Narrow fly vial reload tray |
| Polypropylene Drosophila Vial | VWR | 75813-156 | Wide (28.5 mm) |
| Rubbermaid tubs | Rubbermaid | 3769017 (from Lowes) | Rubbermaid Roughneck Tote 10 gallon 18" L x 12" W x 8 1/2" H |
| Sucrose ultra pure | MP Biomedicals, Inc. | 821721 | |
| Tube racks for wide-mouthed tubes | Thermo scientific | 5970-0230 | Nalgene Unwire Test tube racks, for 30 mm tubes |
| Water Purification System | Millipore Milli-Q | ZMQ560F01 | Millipore Milli-Q Biocel Water Purifier |
| Yeast extract | Acros Organics | 451120050 | CAS number 84604-16-0 |
References
- United States Occupational Safety and Health Administration. Construction industry: OSHA safety and health standards (29 CFR 1926/1910). United States Occupational Safety and Health Administration. , (2022).
- Chemical, Metals, Natural Toxins & Pesticides Guidance Documents & Regulations. United States Food & Drug Administration. , Available from: https://www.fda.gov/food/guidance-documents-regulatory-information-topic-food-and-dietary-supplements/chemical-metals-natural-toxins-pesticides-guidance-documents-regulations (2022).
- Drinking Water Contaminant Candidate List (CCL) and Regulatory Determination. United States Food & Drug Administration. , Available from: https://www.epa.gov/cci (2022).
- Administration Bottled Water/Carbonated Soft Drinks Guidance Documents & Regulatory Information. United States Food & Drug Administration. , Available from: https://www.fda.gov/food/guidance-documents-regulatory-information-topic-food-and-dietary-supplements/bottled-watercarbonated-soft-drinks-guidance-documents-regulatory-information (2022).
- United States Congress. Federal Food, Drug, and Cosmetic Act. United States Congress. 21, 301-392 (1934).
- Determining if a Cleaning Product is a Pesticide Under FIFRA. Environmental Protection Agency. , Available from: https://www.epa.gov/pesticide-registration/determining-if-cleaning-produt-pesticide-under-fifra (2022).
- United States Congress. Toxic Substances Control Act of 1976. H.R. 12440. Library of Congress, United States. , 1640-1707 (1976).
- Wang, Z., Walker, G. W., Muir, D. C. G., Nagatani-Yoshida, K. Toward a global understanding of chemical pollution: a first comprehensive analysis of national and regional chemical inventories. Environmental Science Technology. 54 (5), 2575-2584 (2020).
- Pandey, U. B., Nichols, C. D. Human disease models in Drosophila melanogaster and the role of the fly in therapeutic drug discovery. Pharmacological Reviews. 63 (2), 411-436 (2011).
- New Approach Methods Work Plan. United States Environmental Protection Agency. , Available from: https://www.epa.gov/system/files/documents/2021-11/nams-work-plan_11_15_21_508-tagged.pdf (2021).
- Hartung, T. From alternative methods to a new toxicology. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 77 (3), 338-349 (2011).
- Mahony, C. Building confidence in non-animal methods: Practical examples of collaboration between regulators, researchers and industry. Computational Toxicology. 10, 78-80 (2019).
- Kavlock, R. J., et al. Accelerating the pace of chemical risk assessment. Chemical Research in Toxicology. 31 (5), 287-290 (2018).
- European Chemicals Agency. New Approach Methodologies in Regulatory Science, Proceedings of the Scientific Workshop. European Chemicals Agency. , Helsinki, Finland, 19-20 April 2016 (2016).
- Wambaugh, J. F., et al. New approach methodologies for exposure science. Current Opinion in Toxicology. 15, 76-92 (2019).
- Rand, M. D. Drosophotoxicology: The growing potential for Drosophila in neurotoxicology. Neurotoxicology and Teratology. 32 (1), 74-83 (2010).
- Ong, C., Yung, L. Y. L., Cai, Y., Bay, B. H., Baeg, G. H. Drosophila melanogaster as a model organism to study nanotoxicity. Nanotoxicology. 9 (3), 396-403 (2015).
- Peterson, E. K., Long, H. E. Experimental protocol for using Drosophila as an invertebrate model system for toxicity testing in the laboratory. Journal of Visualized Experiments. (137), e57450 (2018).
- Rand, M. D., Montgomery, S. L., Prince, L., Vorojeikina, D. Developmental toxicity assays using the Drosophila model. Current Protocols in Toxicology. 59, 11-20 (2014).
- Misra, J. R., Horner, M. A., Lam, G., Thummel, C. S. Transcriptional regulation of xenobiotic detoxification in Drosophila. Genes & Development. 25 (17), 1796-1806 (2011).
- Rocha, J. B. T. Drosophila melanogaster as a promising model organism in toxicological studies. Archives of Basic and Applied Medicine. 1 (1), 33-38 (2013).
- Affleck, J. G., Walker, V. K. Drosophila as a model for developmental toxicology: using and extending the drosophotoxicology model. Methods in Molecular Biology. 1965, 139-153 (2019).
- Ugur, B., Chen, K., Bellen, H. J. Drosophila tools and assays for the study of human diseases. Disease Models & Mechanisms. 9 (3), 235-244 (2016).
- Chien, S., Reiter, L. T., Bier, E., Gribskov, M. Homophila: human disease gene cognates in Drosophila. Nucleic Acids Research. 30 (1), 149-151 (2002).
- Wangler, M. F., et al. Model organisms facilitate rare disease diagnosis and therapeutic research. Genetics. 207 (1), 9-27 (2017).
- Colbourne, J. K., et al. Toxicity by descent: A comparative approach for chemical hazard assessment. Environmental Advances. 9, 100287 (2022).
- Hales, K. G., Korey, C. A., Larracuente, A. M., Roberts, D. M. Genetics on the fly: a primer on the Drosophila model system. Genetics. 201 (3), 815-842 (2015).
- Markstein, M. Drosophila Workers Unite! A Laboratory Manual for Working with Drosophila. , Available from: http://marksteinlab.org/wp-content/uploads/2019/01/MicheleMarkstein-DrosophiliaWorkersUnite-PREPRINT-JAN2019.pdf (2018).
- Vang, L. L., Medvedev, A. V., Adler, J. Simple ways to measure behavioral responses of Drosophila to stimuli and use of these methods to characterize a novel mutant. PLoS One. 7 (5), 37495 (2012).
- Nichols, C. D., Becnel, J., Pandey, U. B., Byfield, F. Methods to assay Drosophila behavior. Journal of Visualized Experiments. (61), e3795 (2012).
- Bloomington Drosophilia Stock Center. BDSC Cornmeal Food. , Available from: https://bdsc.indiana.edu/information/recipes/bloomfood.html (2022).
- Martins, R. R., McCracken, A. W., Simons, M. J. P., Henriques, C. M., Rera, M. How to catch a Smurf? - ageing and beyond… in vivo assessment of intestinal permeability in multiple model organisms. Bio-Protocol. 8 (3), 2722 (2018).
- Rera, M., et al. Modulation of longevity and tissue homeostasis by the Drosophila PGC-1 homolog. Cell Metabolism. 14 (5), 623-634 (2011).
- Benchmark Dose Software (BMDS) (Build 3.3; Model Library Version 2022.10) [Computer Software]. United States Environmental Protection Agency. , Available from: https://www.epa.gov/bmds/download-bmds (2022).
- Ortiz, J. G., Opoka, R., Kane, D., Cartwright, I. L. Investigating arsenic susceptibility from a genetic perspective in Drosophila reveals a key role for glutathione synthetase. Toxicological Sciences. 107 (2), 416-426 (2009).
- Pickett, A. D., Patterson, N. A. Arsenates: effect on fecundity in some Diptera. Science. 140 (3566), 493-494 (1963).
- Goldstein, S. H., Babich, H. Differential effects of arsenite and arsenate to Drosophila melanogaster in a combined adult/developmental toxicity assay. Bulletin of Environmental Contamination and Toxicology. 42 (2), 276-282 (1989).
- Polak, M., Opoka, R., Cartwright, I. L. Response of fluctuating asymmetry to arsenic toxicity: support for the developmental selection hypothesis. Environmental Pollution. 118 (1), 1928 (1928).
- Zhou, S., et al. A Drosophila model for toxicogenomics: Genetic variation in susceptibility to heavy metal exposure. PLoS Genetics. 13 (7), 1006907 (2017).
- Anholt, R. R. H. Chemosensation and evolution of Drosophila host plant selection. iScience. 23 (1), 100799 (2020).
- Depetris-Chauvin, A., Galagovsky, D., Grosjean, Y. Chemicals and chemoreceptors: ecologically relevant signals driving behavior in Drosophila. Frontiers in Ecology and Evolution. 3, 41 (2015).
- Aryal, B., et al. Protocol for binary food choice assays using Drosophila melanogaster. STAR Protocols. 3 (2), 101410 (2022).
- Shimada, I., Nakao, M., Kawazoe, Y. Acute differential sensitivity and role of the central nervous system in the feeding behavior of Drosophila melanogaster. Chemical Senses. 12 (3), 481-490 (1987).
- Tanimura, T., Isono, K., Takamura, T., Shimada, I. Genetic dimorphism in the taste sensitivity to trehalose in Drosophila melanogaster. Journal of Comparative Physiology. 147 (4), 433-437 (1982).
- Ro, J., Harvanek, Z. M., Pletcher, S. D. FLIC: high-throughput, continuous analysis of feeding behaviors in Drosophila. PLoS One. 9 (6), 101107 (2014).
- National Research Council. Toward Precision Medicine: Building a Knowledge Network for Biomedical Research and a New Taxonomy of Disease. National Academy of Sciences. , National Academies Press. US. (2011).
- Li, H., Tennessen, J. M. Preparation of Drosophila larval samples for gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS)-based metabolomics. Journal of Visualized Experiments. (136), e57847 (2018).
