Summary
Denne protokol beskriver en effektiv og billig metode, der bruger flydende medier til at vurdere virkningerne af kemiske toksiske stoffer på levedygtigheden af voksen Drosophila melanogaster.
Abstract
Menneskelige industrier genererer hundredtusinder af kemikalier, hvoraf mange ikke er blevet tilstrækkeligt undersøgt for miljøsikkerhed eller virkninger på menneskers sundhed. Dette underskud af kemiske sikkerhedsoplysninger forværres af de nuværende testmetoder i pattedyr, der er dyre, arbejdskrævende og tidskrævende. For nylig har forskere og tilsynsmyndigheder arbejdet på at udvikle nye tilgangsmetoder (NAM'er) til kemisk sikkerhedstest, der er billigere, hurtigere og reducerer dyrs lidelse. En af de vigtigste NAM'er, der opstår, er brugen af hvirvelløse organismer som erstatning for pattedyrmodeller til belysning af konserverede kemiske virkningsmekanismer på tværs af fjernt beslægtede arter, herunder mennesker. For at fremme disse bestræbelser beskriver vi her en metode, der bruger bananfluen, Drosophila melanogaster, til at vurdere kemisk sikkerhed. Protokollen beskriver en enkel, hurtig og billig procedure til måling af levedygtighed og fodringsadfærd hos udsatte voksne fluer. Derudover kan protokollen let tilpasses til at generere prøver til genomiske og metabolomiske tilgange. Samlet set repræsenterer protokollen et vigtigt skridt fremad i etableringen af Drosophila som en standardmodel til brug i præcisionstoksikologi.
Introduction
Mennesker udsættes konstant for kemikalier fra en række forskellige kilder, herunder luft1, mad2, vand3,4, medicin5, rengøringsmidler6, produkter til personlig pleje 7, industrielle kemikalier 7 og byggematerialer 7. Desuden indføres der tusindvis af nye kemikalier hvert år8, hvoraf mange ikke er ordentligt undersøgt med hensyn til sundhed og miljøsikkerhed. Denne mangel på tilstrækkelige kemiske sikkerhedstest skyldes til dels en overdreven afhængighed af pattedyrsmodeller såsom mus og rotter. Mens sådanne gnavermodeller er informative, er kemisk sikkerhedstest i disse systemer dyre, tidskrævende og forårsager ofte uacceptable niveauer af lidelse for forsøgsdyret9.
De økonomiske og etiske byrder, der er forbundet med sikkerhedstest af pattedyrs kemikalier, samt den tidskrævende karakter af undersøgelser af pattedyr er væsentlige medvirkende faktorer til manglen på data vedrørende nye kemikalier. For at løse dette problem gennemfører U.S. Environmental Protection Agency (EPA), Det Europæiske Kemikalieagentur (ECHA), Health Canada og andre agenturer foranstaltninger, der inkorporerer nye tilgangsmetoder (NAMs) i lovgivningsmæssige rammer10, hvilket placerer nordamerikansk og europæisk politik i overensstemmelse med internationale mål om at erstatte, reducere og forfine brugen af dyr (3R-princippet)11, 12,13,14. NAM'er omfatter en række assays primært baseret på in vitro- og in silico-modeller, der giver en mekanistisk forståelse af kemisk toksicitet i stedet for at observere modgang påført pattedyrs testarter, hvorved datagenereringshastigheden til kemisk risikovurdering øges, samtidig med at der stadig produceres high fidelity-output15. Det er imidlertid endnu ikke bevist, at disse metoder beskytter mod systemisk toksicitet, herunder forstyrrelse af vitale biologiske processer, der involverer interorgankommunikation og endokrin signalering. Desuden kan de ikke redegøre for bioakkumulering af kemikalier i specifikke væv, individuelle forbindelsers evne til at blive absorberet og udskilt og samspillet mellem adfærd og kemisk eksponering.
På grund af begrænsningerne ved in vitro- og beregningsmodeller bør en vellykket anvendelse af NAM'er til at reducere eller erstatte pattedyrsmodeller også omfatte hvirvelløse in vivo-modeller, såsom bananfluen, Drosophila melanogaster. Tidligere undersøgelser i fluen har vist, at denne organisme er velegnet til at studere de bevarede genetiske veje, der beskytter dyreceller mod giftige molekyler 16,17,18,19,20,21,22. Desuden viser fluen bemærkelsesværdig genetisk lighed med mennesker, herunder funktionelle homologer til over 65% af menneskelige sygdomme 23,24,25 og en endnu større bevarelse af vigtige funktionelle veje 26. Disse funktioner kombineret med deres relativt korte livscyklus, lave vedligeholdelsesomkostninger og let observerbare adfærdsmæssige reaktioner gør Drosophila velegnet til brug som toksikologisk model27,28,29,30. Desuden har fluer meget højere gennemstrømning end gnavermodeller og fanger effekter på stofskifte, fysiologi og hormonsignalering, der ikke let kan påvises af andre ikke-organismerNAM'er 9.
Protokollen beskrevet her repræsenterer en ramme for test af virkningerne af kemisk eksponering på voksen Drosophila. Metoden er designet til at være effektiv, billig og reproducerbar, samtidig med at den minimerer den tid, forskere skal være i kontakt med testkemikaliet og imødekomme prøveindsamling til metabolomics og andre omics-tilgange. Protokollen er optimeret til test af et enkelt kemikalie pr. eksperiment, men kan let rumme andre eksperimentelle parametre, såsom forskellige opløsningsmidler eller kombinationer af kemikalier.
Protocol
BEMÆRK: Brug nitrilhandsker til alle trin i denne protokol. Brug laboratoriekitle, øjenbeskyttelse og/eller åndedrætsværn i henhold til sikkerhedsdatabladene for hvert evalueret kemikalie.
1. Forberedelse af hætteglas og fugtighedskammer
BEMÆRK: Trin 1.1-1.5 kan fuldføres når som helst, før de andre eksperimentelle afsnit påbegyndes. Nitrilhandsker skal altid bæres under tilberedning af hætteglasset for at forhindre kontaminering.
- Stak fire ark cellulosekromatografipapir af klasse 1 (se materialetabel) og skær dem i 2 i brede strimler. Stans blomsterformede filterpapirindsatser ud ved hjælp af en 1,5 tommer papirstans, der indeholder en blomsterformet matrice.
- Brug en 22 mm x 220 mm usminket trædyvel til at skubbe filterpapiret til bunden af et hætteglas med polypropylen med en diameter på 28,5 mm. Bekræft, at stakken af filterpapir er sikkert placeret i bunden af hætteglasset.
- Opbevar de tilberedte hætteglas i plast- eller papbakker, og læg bakkerne i store (~280 mm x 240 mm) plastposer indtil brug.
- Konstruer et fugtighedskammer ved at skære et hul på 120 mm x 280 mm i plastlåget på en 606,24 mm x 225,42 mm x 403,22 mm plastbøtte (se materialetabellen). Lim net over hullet for at tillade luftstrøm.
- Skær en del af plastgitteret af lamellerede loftslyspaneler (oprindeligt 610 mm x 1220 mm), så det passer i bunden af plastbøtten, der blev brugt i trin 1.4.
BEMÆRK: En række forskellige plastbøtter og plast / metalgittermaterialer kan bruges til at opbygge et fugtighedskammer.
2. Fluehold
- Start kulturer af voksne fluer (mindst 30 voksne) i glasmælkeflasker, der indeholder standard Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC) medier31. Luk flaskerne med en rayonprop indpakket i en delikat opgavetørring. Træng ikke flaskerne.
BEMÆRK: Antallet af krævede flasker afhænger af antallet af kemiske eksponeringer, der udføres, og genotypen af teststammen. Normalt kan flere hundrede fluer fås fra en enkelt flaske, når du bruger robuste og fecund lagre. Standardanalysen bruger Oregon-R vildtypefluer (BDSC-lager #2057), men enhver genotype (er) af interesse kan bruges med denne protokol. Husk, at kompromitterede genotyper med lav frugtbarhed og / eller levedygtighed kræver øget flaskekultur. - Beholderne med dyrkningsflasker inkuberes ved 25 °C med ca. 60 % fugtighed og en 12:12 timers lys:mørk cyklus, indtil den tredje larvestjerne eller tidlige puppestadier observeres. Denne fase kan identificeres ved tilstedeværelsen af larver, der vandrer op ad flaskens sider og udseendet af pupper på flaskevægge.
BEMÆRK: Håndter kun fluer i lystændingsperioden i 12:12 timers lys:mørk-cyklus. For robuste lagre når flasker dette stadium efter 3-4 dage under de beskrevne betingelser.- Fjern voksne fluer og bestem mediernes likviditet. Hvis mediet flyder langs siden af flasken, når det vendes, er mediet for flydende. Indsæt en delikat opgaveserviet eller en rayonkugle i bunden af flasken for at størkne fluemaden.
- Når fluerne begynder at lukke sig, skal du fjerne alle voksne fra flaskerne og lade pupperne fortsætte med at lukke i 48 timer. På dette tidspunkt kan voksne, der er ryddet fra kulturflaskerne, enten overføres til nye flasker for at formere lagrene (se trin 2.1) eller kasseres.
- Overfør fluer, der lukker i 48 timers perioden til nye flasker, der indeholder standard BDSC-medier. Alder i 3 dage.
BEMÆRK: De voksne i disse flasker er 3-5 dage gamle og kan bruges i dødeligheds- og fodringsforsøgene. De flasker, der bruges til at ælde voksne fluer, indeholder æg og larver. Som et resultat kan disse flasker bruges til at formere den næste generation af fluer.
3. Forberedelse af fluer til kemisk eksponering
- Bedøv 5-7 dage gamle fluer med CO2. Sorter de bedøvede fluer efter køn ved hjælp af deres kønsorganer. For hjælp til bedøvelse og sexing fluer, se reference28.
- Placer grupper på enten 20 han- eller 20 hunfluer i hætteglas, der indeholder standard BDSC-medier. Luk hætteglasset med en rayonprop og opbevar hætteglassene til hannen og hunnen separat. Marker hætteglassene, der indeholder hunfluer, med en stribe. Lad hætteglassene med hanfluer være umærkede for at undgå utilsigtet at blande køn.
BEMÆRK: Antallet af hætteglas, der skal klargøres i trin 3.2, afhænger af eksponeringsforsøgenes størrelse. Som beskrevet i trin 5.3 og 5.6 kræver et typisk forsøg med at finde intervaller for et enkelt testkemikalie mindst 40 hætteglas med hanner og 40 hætteglas med hunner. Et standard dosis-responskurve-eksperiment, beskrevet i trin 7.4 og 7.8, kræver mindst 63 hætteglas med hanner og 63 hætteglas med hunner. - Opbevar hætteglassene i 48 timer i en inkubator ved 25 °C ved ca. 60 % fugtighed og med en lys:mørke-cyklus på 12:12 timer. I løbet af denne tid skal du støtte bakken med sorterede hætteglas i en vinkel på 60 ° for at forhindre fluer i at sidde fast i maden, mens de kommer sig efter bedøvelsen.
BEMÆRK: Dette trin gør det muligt for fluer at komme sig efter CO2 -bedøvelsen. Du må ikke bedøve fluerne igen under resten af eksponeringsprotokollen. - Efter restitutionsperioden på 48 timer tilsættes 0,75 ml sterilt renset vand til hætteglassene, der er tilberedt i trin 1.3. Antallet af hætteglas, der tilberedes i dette trin, skal være identisk med antallet af hætteglas i trin 3.2.
- Overfør sorterede, kønsmatchede fluer til hætteglasset med sult ved at åbne hætteglasset med fluerne fra trin 3.2, putte det i munden på det tilberedte hætteglas af plast og derefter banke bunden af hætteglasset af plast mod en bordplade. Luk hætteglasset af plast med en celluloseacetatprop (almindeligvis kendt som en flug).
- Eventuelle fluer, der er gået tabt ved denne overførsel (overfør til optegnelser over startantallet af fluer for hvert hætteglas senere).
- Marker sulthætteglas indeholdende kvindelige fluer med en stribe. Lad hætteglassene med hanfluer være umærkede for at undgå utilsigtet at blande køn.
- Forbered fugtighedskammeret til eksponering natten over. Se trin 1.4-1.5 for en beskrivelse af, hvordan man bygger dette kammer.
- Placer seks standard papirhåndklæder i bunden af fugtighedskammeret. Blødgør køkkenrullerne med 100 ml vand.
- Sæt plastristen (trin 1.5) over de våde håndklæder for at sikre, at hætteglassene ikke kommer i kontakt med de mættede køkkenrulle.
- Placer bakkerne med hætteglas med sult i vandret position i fugtighedskamrene. Anbring fugtkamrene i en 25 °C inkubator (ved ca. 60% fugtighed) natten over.
BEMÆRK: Ideelt set varer sulteperioden natten over ca. 16 timer; Timingen kan dog justeres for individuelle laboratorieplaner.
4. Fremstilling af stamopløsninger
BEMÆRK: Fluer fodres med testkemikalier i et flydende gær-saccharose-medie. Dette afsnit beskriver fremstilling af stamopløsninger af koncentrerede fodermedier og testkemikalier.
- Der fremstilles en 4x gær-saccharoseopløsning indeholdende 16% saccharose og 6% gærekstrakt (m/v) (se materialetabel) opløst i sterilt renset vand. Autoklave opløsningen på et væskeprogram i den passende steriliseringstid (f.eks. 40 min for 1 liter).
BEMÆRK: Opløsningen kan fremstilles i løs vægt og opbevares i alikvoter ved -20 °C. De enkelte prøver optøs 1 dag før brug ved at anbringe dem i køleskab ved 4 °C. - Forbered et lager af testkemikaliet. Til det indledende forsøg skal stamopløsningen fremstilles i den højeste koncentration, således at kemikaliet kan opløses fuldstændigt i vand.
BEMÆRK: Andre opløsningsmidler end vand kan bruges til at opløse testkemikaliet. Se diskussionen om forbehold for brug af alternative opløsningsmidler. - Forbered en 100x blå farvestofopløsning ved at opløse 1 g FD&C Blue No. 1 (se materialetabel) i 10 ml sterilt renset vand.
BEMÆRK: Den blå farvestofopløsning kan fremstilles i løs vægt og opbevares i alikvoter ved 4 °C.
5. Fremstilling af hætteglas med eksponering: Forsøg med at finde rækkevidde
BEMÆRK: Trin 5 og 6 i protokollen er designet til at identificere den laveste dosis testkemikalie, der inducerer 100% dødelighed, og den højeste dosis, der ikke inducerer en dødelig fænotype. Hvis disse koncentrationer allerede er bestemt ved tidligere forsøg, se trin 7 og 8 for beregning af en dosis-responskurve. Eksponeringsmedier skal klargøres umiddelbart før fluer tilsættes til eksponeringshætteglassene.
- Mærk otte 15 ml centrifugeglas som følger: (i) ingen kemikalier, (ii) højeste koncentration, (iii) 1:2, 1:10, 1:20, 1:100, 1:200 og 1:1.000.
- Forbered eksponeringsmediet i de mærkede centrifugeglas fra trin 5.1 ved først at tilsætte 2,5 ml 4x gær/saccharosestamopløsning til alle otte mærkede rør.
- Tilsæt 7,5 ml sterilt renset vand til røret mærket "ingen kemisk". Denne fortynding er den negative kontrol.
- Der tilsættes 7,4 ml af testkemikaliestamopløsningen til glasset mærket "højeste koncentration". Tilsæt 100 μL sterilt renset vand til dette rør, så det endelige volumen er 10 ml. Testkemikaliets molaritet i denne opløsning beregnes og registreres.
BEMÆRK: Tilsætningen af 100 μL sterilt renset vand til røret sikrer, at den kemiske koncentration i dette trin er identisk med den, der anvendes i trin 5.5, hvor der tilsættes en blå farvestofopløsning til eksponeringsmediet som en metode til vurdering af fodringsadfærd. - Der tilsættes en passende mængde kemisk stamopløsning og sterilt renset vand til de resterende reagensglas. Det endelige volumen af hvert rør skal være 10 ml. Den endelige koncentration af testkemikalier i disse reagensglas i forhold til røret med "højeste koncentration" skal være 1:2, 1:10, 1:20, 1:100, 1:200 og 1:1.000.
- Klargør og mærk otte eksponeringshætteglas for hver enkelt koncentration af eksponeringsmedier, der genereres i trin 5.1. Der skal være otte sæt hætteglas (64 hætteglas i alt), der indeholder følgende etiketter: ingen kemisk, højeste koncentration, 1:2, 1:10, 1:20, 1:100, 1:200 og 1:1.000.
- 0,75 ml eksponeringsmedier fremstillet i trin 5.2.3 pipetteres ind i det tilsvarende sæt hætteglas med eksponering.
- Mærk otte 5 ml individuelle rør som følger: (i) ingen kemikalier, (ii) højeste koncentration, (iii) 1:2, 1:10, 1:20, 1:100, 1:200 og 1:1.000.
- Forbered eksponeringsmedier for blåt farvestof ved først at blande 500 μL 4x gær/saccharosestamopløsning og 20 μL blå farvestofopløsning i otte mærkede 5 ml rør.
- Tilsæt 1,48 ml sterilt renset vand til røret mærket "ingen kemisk". Denne fortynding er den negative kontrol.
- Der tilsættes 1,48 ml af testkemikaliestamopløsningen til glasset mærket "højeste koncentration". Der tilsættes ikke vand til dette rør. Testkemikaliets molaritet i denne opløsning beregnes og registreres.
- Der tilsættes en passende mængde kemisk stamopløsning og sterilt renset vand til de resterende reagensglas. Det endelige volumen af hvert rør skal være 2 ml. Den endelige koncentration af testkemikaliet i disse reagensglas i forhold til røret med "højeste koncentration" skal være 1:2, 1:10, 1:20, 1:100, 1:200 og 1:1.000.
- Klargør og mærk to eksponeringshætteglas med hver enkelt koncentration af blå eksponeringsmedier. Der skal være otte sæt hætteglas (16 hætteglas i alt), der indeholder følgende etiketter: ingen kemisk, højeste koncentration, 1:2, 1:10, 1:20, 1:100, 1:200 og 1:1.000. Ordet "blå" skal også skrives på disse hætteglas.
- Der pipetteres 0,75 ml blå eksponeringsmedier i det tilsvarende sæt hætteglas med blå eksponering.
6. Fluekemisk eksponering: Eksperiment med at finde rækkevidde
- Hætteglas med kemisk eksponering fremstilles ved hjælp af hætteglassene med udsultede fluer natten over fra trin 3.7 som følger:
- Overfør fire hætteglas med udsultede hunfluer (20 fluer pr. hætteglas) til fire eksponeringshætteglas med hver kemisk koncentration. Mærk disse hætteglas "hun". Brug den samme overførselsmetode, der er beskrevet i trin 3.5.
- Overfør fire hætteglas med udsultede hanfluer (20 fluer pr. hætteglas) til fire hætteglas med eksponering for hver kemisk koncentration. Mærk disse hætteglas "han". Brug den samme overførselsmetode, der er beskrevet i trin 3.5.
- Forbered hætteglas med kemisk eksponering, der indeholder blåt farvestof, ved hjælp af hætteglassene med udsultede fluer natten over fra trin 3.7 som følger:
- Overfør et hætteglas med udsultede hunfluer (20 fluer pr. hætteglas) til et hætteglas med blå eksponering for hver kemisk koncentration. Mærk hætteglasset "hun". Brug den samme overførselsmetode, der er beskrevet i trin 3.5.
- Overfør et hætteglas med udsultede hanfluer (20 fluer pr. hætteglas) til et hætteglas med blå eksponering for hver kemisk koncentration. Mærk dette hætteglas "han". Brug den samme overførselsmetode, der er beskrevet i trin 3.5.
- Registrer antallet af fluer, der er til stede i hvert hætteglas efter overførsel, og noter antallet, der døde eller undslap. Normalt skulle alle 20 fluer overleve natten over sult og overførsel.
- Anbring hætteglassene med eksponering vandret i frisklavede fugtkamre (se trin 3.6 for forberedelse af fugtighedskammeret). Kamrene anbringes i en 25 °C inkubator med ca. 60 % fugtighed og en 12:12 timers lys:mørk cyklus.
- Hætteglassene med eksponering undersøges 24 og 48 timer efter påbegyndelse af den kemiske eksponering. Tæl og registrer antallet af døde fluer i hvert hætteglas på hvert tidspunkt.
BEMÆRK: Døden bruges som aflæsning for dette assay, men protokollen kan tilpasses til at undersøge andre fænotyper. Eksponerede fluer indsamles almindeligvis på disse tidspunkter til transkriptomiske og metabolomiske undersøgelser. - De blå eksponeringshætteglas undersøges 24 timer efter påbegyndelse af den kemiske eksponering. Brug følgende teknikker til at bestemme, om eksponerede fluer indtog de blå eksponeringsmedier:
- Undersøg hætteglassets vægge for indikationer på blå afføring, der vises som små prikker på siden af eksponeringshætteglasset såvel som på flug.
- Bedøv fluerne med CO2 og undersøg maven for tilstedeværelsen af blåt farvestof.
BEMÆRK: Normalt analyseres hætteglas med blå eksponering efter 24 timer. Dette trin kunne dog udføres ved 48 timer i stedet. Fluer, der har spist, har normalt en blå stribe gennem maven, hvilket indikerer, at eksponeringsmediet er kommet ind i tarmen. - Undersøg fluerne for unormal fodringsadfærd, såsom regurgitation, afgrødeudspiling og nedbrydning af tarmbarrierefunktionen (indikeret ved udseendet af blåt farvestof i hele organismen snarere end blot begrænset til mave-tarmkanalen, almindeligvis omtalt som smølfing32,33).
- Kassér alle forurenede hætteglas, filterpapir, flugs og fluer i passende beholdere til kemisk affald. Hvis der forbliver levende fluer i hætteglassene, skal du fryse hætteglassene for at dræbe fluerne, inden du kasserer dem i den rigtige affaldsbeholder.
BEMÆRK: Bortskaffelse af hætteglas og fluer med eksponering dikteres af det eller de kemikalier, der analyseres i eksperimentet. Følg altid de kemikaliesikkerhedsprocedurer, der er beskrevet i kemikaliesikkerhedsdatabladet. Hvis koncentrationer, der anvendes i intervalundersøgelsesforsøget, dræber fluer ved den laveste dosis, gentages afsnit 6 ved hjælp af en fortyndingsserie, begyndende med den laveste koncentration, der dræbte 100 % af dyrene.
7. Fremstilling af hætteglas med eksponering: Generering af en dosis-responskurve
BEMÆRK: Protokollen skitseret i trin 5 og 6 er designet til bredt at bestemme den kemiske koncentration, der kræves for at fremkalde en fænotype. Trin 7 og 8 i protokollen bruges til at beregne en nøjagtig dosis-responskurve.
- De kemiske testkoncentrationer, der skal analyseres for at generere en dosis-responskurve, beregnes ved hjælp af følgende metode:
- Bestem den laveste koncentration af testkemikaliet, der dræber 100% af de eksponerede fluer ved 48 timer.
- Bestem den højeste koncentration af testkemikaliet, der ikke har nogen effekt på levedygtigheden ved 48 timer.
- Yderligere fire koncentrationer beregnes ligeligt fordelt mellem koncentrationerne bestemt i trin 7.1.1 og 7.1.2.
- Ni individuelle 15 ml centrifugeglas mærkes med molariteten af følgende koncentrationer: i) ingen kemikalier, ii) koncentration bestemt i trin 7.1.1, iii) koncentration bestemt i trin 7.1.2, iv) koncentrationer bestemt i 7.1.3, v) to gange den koncentration, der er bestemt i trin 7.1.1, vi) en 1:2 fortynding af koncentrationen bestemt i trin 7.1.2.
BEMÆRK: Det er vigtigt at medtage koncentrationer, der er to gange den koncentration, der er bestemt i punkt 7.1.1, og en 1:2-fortynding af den koncentration, der er bestemt i trin 7.1.2, for nøjagtig beregning af dosis-responskurven. - Eksponeringsmediet fremstilles ved først at tilsætte 2,5 ml 4x gær/saccharosestamopløsning til ni mærkede individuelle 15 ml centrifugeglas fremstillet i trin 7.2.
- Tilsæt 7,5 ml sterilt renset vand til røret mærket "ingen kemisk". Denne fortynding er den negative kontrol.
- Der tilsættes en passende mængde kemisk stamopløsning og sterilt renset vand til de resterende reagensglas. Det endelige volumen af hvert rør skal være 10 ml. Den endelige koncentration af kemikalier i et enkelt rør skal være lig med den, der er skrevet på ydersiden af røret.
- Klargør og mærk 12 eksponeringshætteglas for hver koncentration af eksponeringsmedier, der genereres i trin 7.2. Der skal være ni sæt hætteglas (108 hætteglas i alt).
- Der pipetteres 0,75 ml eksponeringsmedier ind i det tilsvarende sæt hætteglas med eksponering.
BEMÆRK: Trin 7.6 til 7.8 er valgfri. Hvis testkemikaliekoncentrationerne fremstillet i trin 7.2 vides ikke at påvirke fodringsadfærden, kan disse trin springes over. - Forbered og mærk ni forskellige 5 ml rør til blå eksponeringsmedier med samme serie koncentrationer, der blev brugt i trin 7.2.
- Forbered eksponeringsmedier for blåt farvestof ved først at blande 500 μL 4x gær/saccharosestamopløsning og 20 μL stamopløsning af blåt farvestof.
- Tilsæt 1,48 ml renset sterilt vand til røret mærket "ingen kemikalier". Denne fortynding er den negative kontrol.
- Der tilsættes en passende mængde kemisk stamopløsning og renset sterilt vand til de resterende reagensglas. Det endelige volumen af hvert rør skal være 2 ml. Den endelige koncentration af kemikalier i et enkelt rør skal være lig med den, der er skrevet på ydersiden af røret.
- Klargør og mærk to eksponeringshætteglas for hver enkelt koncentration af blå eksponeringsmedier. Der skal være ni sæt hætteglas (18 hætteglas i alt), hvor hvert sæt hætteglas er mærket med de koncentrationer, der er anført i trin 7.2. Ordet "blå" skal også skrives på disse hætteglas.
- Der pipetteres 0,75 ml blå eksponeringsmedier i det tilsvarende sæt hætteglas med blå eksponering.
8. Kemisk eksponering for fluer: Generering af en dosis-responskurve
- Hætteglas med kemisk eksponering fremstilles ved hjælp af hætteglassene med udsultede fluer natten over fra trin 3.7 som følger:
- Overfør seks hætteglas med udsultede hunfluer (20 fluer pr. hætteglas) til seks eksponeringshætteglas med hver kemisk koncentration. Mærk disse hætteglas "hun". Brug den samme overførselsmetode, der er beskrevet i trin 3.5.
- Overfør seks hætteglas med udsultede hanfluer (20 fluer pr. hætteglas) til seks eksponeringshætteglas med hver kemisk koncentration. Mærk disse hætteglas "han". Brug den samme overførselsmetode, der er beskrevet i trin 3.5.
- Forbered hætteglas med kemisk eksponering, der indeholder blåt farvestof, ved hjælp af hætteglassene med udsultede fluer natten over fra trin 3.7 som følger:
- Overfør et hætteglas med udsultede hunfluer (20 fluer pr. hætteglas) til et hætteglas med blå eksponering for hver kemisk koncentration. Mærk hætteglasset "hun". Brug den samme overførselsmetode, der er beskrevet i trin 3.5.
- Overfør et hætteglas med udsultede hanfluer (tyve fluer pr. hætteglas) til et hætteglas med blå eksponering for hver kemisk koncentration. Mærk dette hætteglas "han". Brug den samme overførselsmetode, der er beskrevet i trin 3.5.
- Registrer antallet af fluer i hvert hætteglas efter overførsel. Normalt skal alle 20 fluer overleve sulten natten over og overføre, men sørg for, at alle, der døde eller undslap under overførslen, trækkes fra det samlede antal.
- Anbring hætteglassene med eksponering vandret i frisklavede fugtkamre (se trin 3.6 for forberedelse af fugtighedskammeret). Kamrene anbringes i en 25 °C inkubator med ca. 60 % fugtighed og en 12:12 timers lys:mørk cyklus.
- Hætteglassene med eksponering undersøges 24 og 48 timer efter påbegyndelse af den kemiske eksponering. Tæl og registrer antallet af døde fluer i hvert hætteglas på hvert tidspunkt.
- De blå eksponeringshætteglas undersøges 24 timer efter påbegyndelse af den kemiske eksponering. Brug metoden beskrevet i trin 6.6 til at vurdere ændringer i fodringsadfærd.
- Kassér alle forurenede hætteglas, filterpapir, flugs og fluer i passende beholdere til kemisk affald. Hvis der forbliver levende fluer i hætteglassene, skal hætteglassene fryses for at dræbe fluerne, inden de kasseres i den korrekte affaldsbeholder.
BEMÆRK: Bortskaffelse af hætteglas og fluer med eksponering dikteres af det eller de kemikalier, der analyseres i eksperimentet. Følg altid de kemikaliesikkerhedsprocedurer, der er beskrevet i kemikaliesikkerhedsdatabladet.
9. Beregning af en dosis-responskurve
- Brug Benchmark Dose Software (BMDS, version 3.2; se Materialetabel) eller anden lignende software til at analysere dataene34. I det følgende beskrives arbejdsgangen ved hjælp af BMDS-softwaren.
- Klik på fanen Data i BMDS, og klik på indsæt nyt datasæt. Indtast antallet af prøver i datasættet, klik på dikotomt, og klik derefter på Opret datasæt. Angiv hver replikering som en individuel række i datasættet.
- Indtast dosis i første kolonne i den genererede tabel, startantallet af fluer eksklusive fluer, der døde eller gik tabt før trin 8.3) i anden kolonne, og antallet af fluer, der døde af kemisk eksponering i tredje kolonne.
- Klik på hovedfanen i BMDS.
- Klik på rullemenuen for menuen Vælg modeltype, og klik på Dichotomous.
- Klik på aktivér for datasættet fra trin 9.2 i tabellen Datasæt.
- Klik på boksene for de ønskede modeller til analyse i tabellen MLE og alternativer.
BEMÆRK: Frequentist Restricted Dichotomous Hill-modellen blev primært brugt. - Klik på Kør analyse. Programmet genererer en outputfil med dødelighedskurven (e) og yderligere detaljer om modellen (e).
Representative Results
Fluen har længe tjent som model i undersøgelser til bestemmelse af natriumarsenit (NaAsO2) toksicitet35,36,37,38. For at demonstrere protokollens effektivitet blev han- og hunfluer udsat for NaAsO2 med det formål at sammenligne disse resultater med tidligere undersøgelser. Ved hjælp af metoden beskrevet ovenfor blev voksne Oregon-R (BDSC-lager #2057) mænd og kvinder udsat for en række NaAsO2-koncentrationer (0, 0,01, 0,02, 0,1, 0,2, 1 og 2 mM) og scorede for dødelighed 48 timer efter eksponeringens start (figur 1A, B).
Formålet med denne indledende analyse var at identificere det omtrentlige koncentrationsområde, der ville muliggøre en mere præcis karakterisering afNaAsO2-toksicitet. I efterfølgende forsøg blev koncentrationer valgt (0, 0,2, 0,5, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5 og 5 mM), der mere præcist definerede NaAsO2 dosis-responskurven (figur 1C, D). Bemærk, at den resulterende analyse undersøgte flere koncentrationer, der inducerede 100% dødelighed. Data blev analyseret ved hjælp af Miljøstyrelsens offentligt tilgængelige Benchmark Dose Software version 3.2.0.125. Dataene blev modelleret som "dikotomiske", og Dichotomous Hill-modellen blev brugt til efterfølgende analyser. Baseret på denne model var de endelige LD10, LD25 og LD 50 af hanfluer fodret med NaAsO2 henholdsvis 0,30 mM,0,50 mM og 0,65 mM. For hunfluer var disse værdier lidt højere med en LD10 på 0,30 mM, en LD25 på 0,65 mM og en LD50 på 0,90 mM. Samlet set svarer værdierne opnået ved hjælp af denne metode til dem, der tidligere er rapporteret for arsentoksicitet i Drosophila melanogaster35,36,37,38, hvilket validerer metoden.
Ud over de seks replikater, der blev brugt til at beregne dosis-responskurven, blev han- og hunfluer også fodret med NaAsO2-eksponeringsopløsninger, der indeholdt 1% FD&C blå, hvilket er let synligt i fordøjelseskanalen ved hjælp af lysmikroskopi. Baseret på tilstedeværelsen af blåt farvestof i tarmen hos NaAsO 2-fodrede fluer fortsatte både han- og hunfluer med at fodre 24 timer efter begyndelsen af den kemiske eksponering, uanset NaAsO2-koncentrationen i det flydende medie (figur 2). Imidlertid blev det observeret, at den indtagne mad lejlighedsvis blev gylpet op ved doser over 0,2 mM for kvinder og 0,5 mM for mænd (figur 2). Disse resultater tyder på, at regurgitation kunne tjene en central rolle i Drosophila respons på arsenforgiftning.
Figur 1: Dosis-responskurver for Drosophila behandlet med NaAsO2 til mænd og kvinder i 48 timer. Alle grafer viser de estimerede andele af døde fluer ved hver NaAsO2 koncentration, der testes baseret på Dichotomous Hill-modellen. (A,B) En bred vifte af NaAsO2-koncentrationer blev testet for at tilnærme den dosis, hvor hvert fluekøn begynder at dø. (A) viser de mandlige data, og (B) viser de kvindelige data. N = 4 hætteglas med 20 fluer pr. hætteglas. (C,D) Et snævrere interval af NaAsO2-koncentrationer blev testet for at bestemme præcise doser, hvor 10%, 25% og 50% af hvert fluekøn døde. Disse doser er angivet til højre for hver graf. (C) viser de mandlige data, og (D) viser de kvindelige data. N = 6 hætteglas med 20 fluer pr. hætteglas. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Repræsentative resultater fra det blå farvestof assay af mandlige og kvindelige Drosophila behandlet med NaAsO2 i 24 timer. Mikrografier viser, at fluer fodres med stigende koncentrationer af NaAsO2. Række (A) viser hanfluer, og række (B) viser hunfluer, hvor koncentrationen af NaAsO2 stiger fra venstre mod højre. Underlivet viser en lille mængde blå nær brystkassen ved lave koncentrationer, hvilket indikerer, at eksponeringsmedier kom ind i tarmen. Ved højere koncentrationer begynder blåt farvestof at akkumulere omkring munden, hvilket tyder på, at eksponeringsmedier bliver regurgitated. Vægtbjælken er 1 mm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Discussion
Bananfluen Drosophila melanogaster fremstår som et kraftfuldt system til NAMs16,18,19,21. Ved at udnytte de uovertrufne genetiske ressourcer, der er tilgængelige for fluesamfundet, kombineret med de seneste fremskridt inden for genomik og metabolomics, er kemiske sikkerhedsundersøgelser ved hjælp af Drosophila i stand til hurtigt at identificere de molekylære mekanismer, hvormed individuelle forbindelser interfererer med metabolisme, fysiologi og cellesignalering (se for eksempel39). Denne billige protokol er designet til hurtigt at definere dosis-responskurver og efterfølgende generere prøver til RNA-seq og metabolomics-analyse. Desuden kan denne fleksible protokol tilpasses til brug med enhver genotype og kan rumme mange klasser af kemikalier.
Et bemærkelsesværdigt aspekt af denne protokol er valget af flydende fødevarer, der anvendes til kemisk eksponering, som er baseret på en tidligere undersøgelse, men adskiller sig fra de faste medier, der anvendes af de fleste toksikologiske undersøgelser af Drosophila18,22. Dette specifikke flydende medie blev valgt for at afspejle næringsindholdet i det standard, faste BDSC-medie, som fluerne også fodres med i denne protokol for at sikre, at fluerne får ensartet ernæring. Enkelheden af flydende fodringsmedier har mange fordele. Flydende medier er lettere at håndtere end fast mad, som enten skal smeltes og resolidificeres eller rekonstitueres fra pulver. Flydende medier øger også systemets gennemstrømning, sikrer jævn kemisk fordeling gennem fødemediet og reducerer den tid, der bruges på at arbejde med farlige forbindelser. Derudover kræver medierne ikke, at opløsninger opvarmes, hvilket letter testningen af flygtige testforbindelser. Endelig minimeres uønskede bivirkninger mellem testkemikaliet og andre kostkomponenter på grund af de relativt få komponenter, der indgår i fødevareopløsningen. Gæren, der anvendes i fødevaren, er også inaktiv, hvilket yderligere begrænser fodermediets reaktivitet. Bemærk dog, at metoden ikke er egnet til test af udviklings- eller larvetoksicitet.
Nogle af de materialer, der anvendes i protokollen, kan erstattes, såsom at bruge hætteglas med glasflue i stedet for polypropylen. De anvendte materialer blev imidlertid udvalgt til at være både inaktive og engangs for at undgå uønskede kemiske reaktioner mellem reagenser og kemiske eksponeringer, der kunne skyldes rengøring af glasvarer.
Brug af flydende fødevarer kræver et køretøj til levering af fødevarer. Celluloseacetatfiltrerpapir blev valgt til dette formål på grund af dets fleksibilitet og inaktive karakter28. Andre forskere brugte lignende protokoller, men med andre køretøjer, såsom sarte opgaveservietter eller glasfiberfilter29,30. Celluloseacetatfilterpapiret passede til disse behov, fordi det er et inaktivt køretøj, der kan skæres til den ideelle form, så det passer ind i bunden af hætteglassene uden store mellemrum mellem papiret og hætteglassets væg, hvilket forhindrer død som følge af, at fluer sidder fast i medierne eller selve køretøjet.
En vigtig begrænsning ved dette system er, at den maksimale testbare koncentration af et kemikalie er bundet til kemikaliets opløselighed. Ikke-vandopløselige forbindelser kræver et yderligere opløsningsmiddel, hvilket kan føre til yderligere eller synergistiske virkninger med kemikaliet af interesse. Dette kan også skabe situationer, hvor det ikke er muligt at fremstille stamopløsninger, der er koncentreret nok til at opnå det ønskede endepunkt i alle organismer, hvilket begrænser analysen af de resulterende data31. For at løse dette kan kemikalier med lav vandopløselighed testes ved at tilsætte op til 0,5% dimethylsulfoxid til fødevareopløsningen. Andre opløsningsmidler kan også anvendes, men yderligere forskning er nødvendig for hvert opløsningsmiddel af interesse for at bestemme den maksimalt acceptable opløsningsmiddelkoncentration i opløsningen for at maksimere opløseligheden og samtidig minimere opløsningsmiddelvirkninger på organismen.
Omfattende karakterisering af olfaktionsresponset i Drosophila har beskrevet, hvordan fluer undgår at indtage giftige forbindelser40,41, hvilket fører til reduceret fodring på behandlede medier. Det blå farvestofassay adresserer dette fænomen ved at give forskere mulighed for effektivt at screene fodringsadfærden hos fluerne, der fodres med hver koncentration af eksperimentelle kemiske42,43,44. Tilstedeværelsen eller fraværet af blå i fluens mave-tarmkanal indikerer, om fluen har spist det giftstofholdige medium. Selvom der findes mere sofistikerede metoder til vurdering af fluefodringsadfærd, såsom Fly Liquid-Food Interaction Counter45, er denne kvalitative metode bedre egnet til screening med højere gennemstrømning.
Et bemærkelsesværdigt aspekt ved denne protokol er, at den er optimeret til en eksponeringsperiode på 48 timer uden behov for at overføre fluer eller tilføje yderligere væske til eksponeringshætteglasset. Brug af et fugtighedskammer og placering af kamrene i en inkubator, der holdes ved høj luftfugtighed, forhindrede filterpapiret indeholdende fødemediet i at tørre ud i løbet af denne tidsramme. Protokollen kan tilpasses til længere eksponeringsvarighed, men metoden skal justeres for at sikre, at filterpapiret ikke bliver tørt og forårsager signifikante ændringer i opløsningskoncentration eller dødelighed på grund af udtørring.
Endelig er et vigtigt kendetegn ved denne protokol, at den let kan rumme genetiske varianter, hvilket gør det muligt for forskere at udnytte det store udvalg af genetiske værktøjer til Drosophila til at udvide disse foreløbige undersøgelser af vildtypeorganismer for bedre at forstå mekanismer for kemisk virkning in vivo. I denne henseende kunne protokollen skitseret ovenfor let ændres for at supplere en tidligere beskrevet JoVE-protokol af Peterson og Long, der giver mulighed for toksikologisk analyse af vildtfangede fluer18.
På grund af den brede vifte af tidligere undersøgelser af toksiciteten af natriumarsenit i Drosophila 32,33,34,35,36, Oregon-R fluer blev behandlet med denne forbindelse for at demonstrere effektiviteten af vores system. Hanfluer udviste en LD 50 på 0,65 mM, og hunner udviste en LD50 på 0,90 mM. Dette stemmer overens med tidligere undersøgelser af natriumarsenit-behandlede voksne Drosophila. For eksempel fandt Goldstein og Babich37, at 50% af fluerne (blandede køn) døde efter 7 dages eksponering for 0,5 mM NaAsO2. Selvom dette er en lidt lavere dosis end i øjeblikket blev observeret, forklarer forskellene mellem deres metoder og denne metode (herunder brugen af faste eksponeringsmedier, en længere tidsskala og blandede køn) sandsynligvis denne forskel. Det er vigtigt, at begge metoder resulterede i generelt lignende LD50-værdier.
Observationer fra eksperimenter ved hjælp af denne protokol kan bruges til at finde genetiske og molekylære mål for efterfølgende adfærdsmæssige eller mekanistiske undersøgelser. Eksponeringsmetoden kan også bruges til behandling af Drosophila til prøveudtagning for metabolomics og proteomics, hvilket gør denne protokol velegnet til det voksende felt inden for præcisionstoksikologi (modelleret fra præcisionsmedicinfeltet46). I denne henseende kan eksponerede fluer indsamles efter trin 8 til efterfølgende genomisk og metabolomisk analyse. Prøver indsamlet i trin 8 kan derefter behandles, som beskrevet af Li og Tennessen47, begyndende med trin 3.
I sidste ende vil de data, der er erhvervet fra de ovenfor beskrevne eksperimenter, såvel som eventuelle efterfølgende metabolomiske og proteomiske data, ideelt set blive brugt i sammenligninger på tværs af arter. Som tidligere nævnt26 er sådanne undersøgelser på tværs af arter kraftfulde og i stand til at bestemme, hvordan individuelle kemikalier interfererer med bevarede biologiske veje. Således kan protokollen beskrevet ovenfor bruges til at finde evolutionære fællestræk som reaktion på individuelle toksiske stoffer på tværs af phyla og hjælpe med at informere kemikaliesikkerhedsregulering.
Disclosures
Ingen interessekonflikter at oplyse.
Acknowledgments
Vi takker vores medarbejdere for hjælp med test og optimering af denne protokol: Ameya Belamkar, Marilyn Clark, Alexander Fitt, Emma Rose Gallant, Ethan Golditch, Matthew Lowe, Morgan Marsh, Kyle McClung, Andy Puga, Darcy Rose, Cameron Stockbridge og Noelle Zolman. Vi takker også vores kolleger fra Precision Toxicology Group, især vores Exposure Group-kolleger, for at hjælpe med at identificere målene i protokollen.
Dette projekt modtog finansiering fra EU's Horizon 2020 forsknings- og innovationsprogram under tilskudsaftale nr. 965406. Det arbejde, der præsenteres i denne publikation, blev udført som en del af ASPIS-klyngen. Denne produktion afspejler kun forfatternes synspunkter, og Den Europæiske Union kan ikke holdes ansvarlig for enhver brug, der måtte blive gjort af oplysningerne deri. Denne publikation blev også muliggjort med støtte fra Indiana Clinical and Translational Sciences Institute, som delvist finansieres af Award Number UL1TR002529 fra National Institutes of Health, National Center for Advancing Translational Sciences, Clinical and Translational Sciences Award. Indholdet er udelukkende forfatternes ansvar og repræsenterer ikke nødvendigvis de officielle synspunkter fra National Institutes of Health. Dele af dette projekt blev støttet af midler fra Indiana University tildelt JRS og PhyloTox-konsortiet. JMH og EMP blev støttet af NIH award P40OD018537 til Bloomington Drosophila Stock Center.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 inch flower lever action craft punch | Bira Craft | HCP-115-024 | |
| 15 mL Centrifuge Tubes | VWR | 89039-666 | High-Performance Centrifuge Tubes with Flat or Plug Caps, Polypropylene, 15 mL |
| 2 ml Tubes | VWR | 16466-044 | Micro Centrifuge Tube with Flat Screw-Cap, conical bottom |
| 5 ml Tubes | VWR | 60818-576 | Culture Tubes, Plastic, with Dual-Position Caps |
| 50 mL Centrifuge Tubes | Corning | 430290 | 50 mL polypropylene centrifuge tubes, conical bottom with plug seal cap |
| Benchmark Dose Software version 3.2 | U.S. Environmental Protection Agency | ||
| Cardboard trays | Genesee Scientific flystuff | 32-122 | trays and dividers for narrow vials |
| CO2 gas pads | Genesee Scientific flystuff | 59-114 | FlyStuff flypad, CO2 anesthetizing apparatus |
| Combitips advanced, 50 mL | Eppendorf | 0030089693 | Combitips advanced, Biopur, 50 mL, light gray, colorless tips |
| Cotton balls | Genesee Scientific flystuff | 51-101 | Cotton balls, large, fits narrow vials |
| Delicate task wipes | Kimtech | 34155 | Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipes, 1 Ply / 8.2" x 4.39" |
| Drosophila Vial Plugs, Cellulose Acetate (aka, Flugs) | VWR | 89168-888 | Wide |
| FD&C Blue No. 1 | Spectrum Chemical | FD110 | CAS number 3844-45-9 |
| Flies | BDSC | Stock #2057 | OregonR wildtype |
| Gloves (nitrile) | Kimtech | 55082/55081/55083 | Kimtech purple nitrile exam gloves, 5.9 mil, ambidextrous 9.5" |
| Grade 1 CHR cellulose chromatography paper | Cytvia | 3001-917 | Sheet, 46 x 57 cm |
| Mesh for humidity chamber | |||
| Multipette / Repeater (X) stream | Eppendorf | 022460811 | Repeater Xstream |
| Plastic grate | Plaskolite | 18469 (from lowes) | Plaskolite 24 in x 48 in 7.85 sq ft louvered ceiling light panels, cut down to fit in rubbermaid tubs |
| Plastic trays for glass vials | Genesee Scientific flystuff | 59-207 | Narrow fly vial reload tray |
| Polypropylene Drosophila Vial | VWR | 75813-156 | Wide (28.5 mm) |
| Rubbermaid tubs | Rubbermaid | 3769017 (from Lowes) | Rubbermaid Roughneck Tote 10 gallon 18" L x 12" W x 8 1/2" H |
| Sucrose ultra pure | MP Biomedicals, Inc. | 821721 | |
| Tube racks for wide-mouthed tubes | Thermo scientific | 5970-0230 | Nalgene Unwire Test tube racks, for 30 mm tubes |
| Water Purification System | Millipore Milli-Q | ZMQ560F01 | Millipore Milli-Q Biocel Water Purifier |
| Yeast extract | Acros Organics | 451120050 | CAS number 84604-16-0 |
References
- United States Occupational Safety and Health Administration. Construction industry: OSHA safety and health standards (29 CFR 1926/1910). United States Occupational Safety and Health Administration. , (2022).
- Chemical, Metals, Natural Toxins & Pesticides Guidance Documents & Regulations. United States Food & Drug Administration. , Available from: https://www.fda.gov/food/guidance-documents-regulatory-information-topic-food-and-dietary-supplements/chemical-metals-natural-toxins-pesticides-guidance-documents-regulations (2022).
- Drinking Water Contaminant Candidate List (CCL) and Regulatory Determination. United States Food & Drug Administration. , Available from: https://www.epa.gov/cci (2022).
- Administration Bottled Water/Carbonated Soft Drinks Guidance Documents & Regulatory Information. United States Food & Drug Administration. , Available from: https://www.fda.gov/food/guidance-documents-regulatory-information-topic-food-and-dietary-supplements/bottled-watercarbonated-soft-drinks-guidance-documents-regulatory-information (2022).
- United States Congress. Federal Food, Drug, and Cosmetic Act. United States Congress. 21, 301-392 (1934).
- Determining if a Cleaning Product is a Pesticide Under FIFRA. Environmental Protection Agency. , Available from: https://www.epa.gov/pesticide-registration/determining-if-cleaning-produt-pesticide-under-fifra (2022).
- United States Congress. Toxic Substances Control Act of 1976. H.R. 12440. Library of Congress, United States. , 1640-1707 (1976).
- Wang, Z., Walker, G. W., Muir, D. C. G., Nagatani-Yoshida, K. Toward a global understanding of chemical pollution: a first comprehensive analysis of national and regional chemical inventories. Environmental Science Technology. 54 (5), 2575-2584 (2020).
- Pandey, U. B., Nichols, C. D. Human disease models in Drosophila melanogaster and the role of the fly in therapeutic drug discovery. Pharmacological Reviews. 63 (2), 411-436 (2011).
- New Approach Methods Work Plan. United States Environmental Protection Agency. , Available from: https://www.epa.gov/system/files/documents/2021-11/nams-work-plan_11_15_21_508-tagged.pdf (2021).
- Hartung, T. From alternative methods to a new toxicology. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 77 (3), 338-349 (2011).
- Mahony, C. Building confidence in non-animal methods: Practical examples of collaboration between regulators, researchers and industry. Computational Toxicology. 10, 78-80 (2019).
- Kavlock, R. J., et al. Accelerating the pace of chemical risk assessment. Chemical Research in Toxicology. 31 (5), 287-290 (2018).
- European Chemicals Agency. New Approach Methodologies in Regulatory Science, Proceedings of the Scientific Workshop. European Chemicals Agency. , Helsinki, Finland, 19-20 April 2016 (2016).
- Wambaugh, J. F., et al. New approach methodologies for exposure science. Current Opinion in Toxicology. 15, 76-92 (2019).
- Rand, M. D. Drosophotoxicology: The growing potential for Drosophila in neurotoxicology. Neurotoxicology and Teratology. 32 (1), 74-83 (2010).
- Ong, C., Yung, L. Y. L., Cai, Y., Bay, B. H., Baeg, G. H. Drosophila melanogaster as a model organism to study nanotoxicity. Nanotoxicology. 9 (3), 396-403 (2015).
- Peterson, E. K., Long, H. E. Experimental protocol for using Drosophila as an invertebrate model system for toxicity testing in the laboratory. Journal of Visualized Experiments. (137), e57450 (2018).
- Rand, M. D., Montgomery, S. L., Prince, L., Vorojeikina, D. Developmental toxicity assays using the Drosophila model. Current Protocols in Toxicology. 59, 11-20 (2014).
- Misra, J. R., Horner, M. A., Lam, G., Thummel, C. S. Transcriptional regulation of xenobiotic detoxification in Drosophila. Genes & Development. 25 (17), 1796-1806 (2011).
- Rocha, J. B. T. Drosophila melanogaster as a promising model organism in toxicological studies. Archives of Basic and Applied Medicine. 1 (1), 33-38 (2013).
- Affleck, J. G., Walker, V. K. Drosophila as a model for developmental toxicology: using and extending the drosophotoxicology model. Methods in Molecular Biology. 1965, 139-153 (2019).
- Ugur, B., Chen, K., Bellen, H. J. Drosophila tools and assays for the study of human diseases. Disease Models & Mechanisms. 9 (3), 235-244 (2016).
- Chien, S., Reiter, L. T., Bier, E., Gribskov, M. Homophila: human disease gene cognates in Drosophila. Nucleic Acids Research. 30 (1), 149-151 (2002).
- Wangler, M. F., et al. Model organisms facilitate rare disease diagnosis and therapeutic research. Genetics. 207 (1), 9-27 (2017).
- Colbourne, J. K., et al. Toxicity by descent: A comparative approach for chemical hazard assessment. Environmental Advances. 9, 100287 (2022).
- Hales, K. G., Korey, C. A., Larracuente, A. M., Roberts, D. M. Genetics on the fly: a primer on the Drosophila model system. Genetics. 201 (3), 815-842 (2015).
- Markstein, M. Drosophila Workers Unite! A Laboratory Manual for Working with Drosophila. , Available from: http://marksteinlab.org/wp-content/uploads/2019/01/MicheleMarkstein-DrosophiliaWorkersUnite-PREPRINT-JAN2019.pdf (2018).
- Vang, L. L., Medvedev, A. V., Adler, J. Simple ways to measure behavioral responses of Drosophila to stimuli and use of these methods to characterize a novel mutant. PLoS One. 7 (5), 37495 (2012).
- Nichols, C. D., Becnel, J., Pandey, U. B., Byfield, F. Methods to assay Drosophila behavior. Journal of Visualized Experiments. (61), e3795 (2012).
- Bloomington Drosophilia Stock Center. BDSC Cornmeal Food. , Available from: https://bdsc.indiana.edu/information/recipes/bloomfood.html (2022).
- Martins, R. R., McCracken, A. W., Simons, M. J. P., Henriques, C. M., Rera, M. How to catch a Smurf? - ageing and beyond… in vivo assessment of intestinal permeability in multiple model organisms. Bio-Protocol. 8 (3), 2722 (2018).
- Rera, M., et al. Modulation of longevity and tissue homeostasis by the Drosophila PGC-1 homolog. Cell Metabolism. 14 (5), 623-634 (2011).
- Benchmark Dose Software (BMDS) (Build 3.3; Model Library Version 2022.10) [Computer Software]. United States Environmental Protection Agency. , Available from: https://www.epa.gov/bmds/download-bmds (2022).
- Ortiz, J. G., Opoka, R., Kane, D., Cartwright, I. L. Investigating arsenic susceptibility from a genetic perspective in Drosophila reveals a key role for glutathione synthetase. Toxicological Sciences. 107 (2), 416-426 (2009).
- Pickett, A. D., Patterson, N. A. Arsenates: effect on fecundity in some Diptera. Science. 140 (3566), 493-494 (1963).
- Goldstein, S. H., Babich, H. Differential effects of arsenite and arsenate to Drosophila melanogaster in a combined adult/developmental toxicity assay. Bulletin of Environmental Contamination and Toxicology. 42 (2), 276-282 (1989).
- Polak, M., Opoka, R., Cartwright, I. L. Response of fluctuating asymmetry to arsenic toxicity: support for the developmental selection hypothesis. Environmental Pollution. 118 (1), 1928 (1928).
- Zhou, S., et al. A Drosophila model for toxicogenomics: Genetic variation in susceptibility to heavy metal exposure. PLoS Genetics. 13 (7), 1006907 (2017).
- Anholt, R. R. H. Chemosensation and evolution of Drosophila host plant selection. iScience. 23 (1), 100799 (2020).
- Depetris-Chauvin, A., Galagovsky, D., Grosjean, Y. Chemicals and chemoreceptors: ecologically relevant signals driving behavior in Drosophila. Frontiers in Ecology and Evolution. 3, 41 (2015).
- Aryal, B., et al. Protocol for binary food choice assays using Drosophila melanogaster. STAR Protocols. 3 (2), 101410 (2022).
- Shimada, I., Nakao, M., Kawazoe, Y. Acute differential sensitivity and role of the central nervous system in the feeding behavior of Drosophila melanogaster. Chemical Senses. 12 (3), 481-490 (1987).
- Tanimura, T., Isono, K., Takamura, T., Shimada, I. Genetic dimorphism in the taste sensitivity to trehalose in Drosophila melanogaster. Journal of Comparative Physiology. 147 (4), 433-437 (1982).
- Ro, J., Harvanek, Z. M., Pletcher, S. D. FLIC: high-throughput, continuous analysis of feeding behaviors in Drosophila. PLoS One. 9 (6), 101107 (2014).
- National Research Council. Toward Precision Medicine: Building a Knowledge Network for Biomedical Research and a New Taxonomy of Disease. National Academy of Sciences. , National Academies Press. US. (2011).
- Li, H., Tennessen, J. M. Preparation of Drosophila larval samples for gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS)-based metabolomics. Journal of Visualized Experiments. (136), e57847 (2018).
