Summary
Dieses Protokoll beschreibt eine effiziente und kostengünstige Methode, bei der flüssige Medien verwendet werden, um die Auswirkungen chemischer Giftstoffe auf die Lebensfähigkeit von adulten Drosophila melanogaster zu bewerten.
Abstract
Die menschliche Industrie erzeugt Hunderttausende von Chemikalien, von denen viele nicht ausreichend auf Umweltverträglichkeit oder Auswirkungen auf die menschliche Gesundheit untersucht wurden. Dieses Defizit an Informationen zur Chemikaliensicherheit wird durch die derzeitigen Testmethoden bei Säugetieren noch verschärft, die teuer, arbeitsintensiv und zeitaufwändig sind. In jüngster Zeit haben Wissenschaftler und Aufsichtsbehörden daran gearbeitet, neue Ansatzmethoden (NAMs) für Chemikaliensicherheitstests zu entwickeln, die billiger und schneller sind und das Leiden der Tiere verringern. Eines der wichtigsten NAMs, das sich herauskristallisieren wird, ist die Verwendung von wirbellosen Organismen als Ersatz für Säugetiermodelle, um konservierte chemische Wirkmechanismen bei entfernt verwandten Arten, einschließlich des Menschen, aufzuklären. Um diese Bemühungen voranzutreiben, beschreiben wir hier eine Methode, die die Fruchtfliege Drosophila melanogaster verwendet, um die Chemikaliensicherheit zu bewerten. Das Protokoll beschreibt ein einfaches, schnelles und kostengünstiges Verfahren zur Messung der Lebensfähigkeit und des Fressverhaltens exponierter erwachsener Fliegen. Darüber hinaus kann das Protokoll leicht angepasst werden, um Proben für genomische und metabolomische Ansätze zu generieren. Insgesamt stellt das Protokoll einen wichtigen Schritt vorwärts dar, um Drosophila als Standardmodell für den Einsatz in der Präzisionstoxikologie zu etablieren.
Introduction
Der Mensch ist ständig Chemikalien aus einer Vielzahl von Quellen ausgesetzt, darunter Luft1, Lebensmittel2, Wasser3,4, Medikamente5, Reinigungsmittel6, Körperpflegeprodukte 7, Industriechemikalien 7 und Baumaterialien 7. Darüber hinaus werden jedes Jahr Tausende neuer Chemikalien eingeführt8, von denen viele nicht ordnungsgemäß auf Gesundheits- und Umweltsicherheit geprüft werden. Dieser Mangel an angemessenen Tests zur chemischen Sicherheit ist zum Teil darauf zurückzuführen, dass man sich zu sehr auf Säugetiermodelle wie Mäuse und Ratten verlässt. Solche Nagetiermodelle sind zwar aufschlussreich, aber die Prüfung der chemischen Sicherheit in diesen Systemen ist teuer, zeitaufwändig und verursacht oft ein inakzeptables Maß an Leid für das Versuchstier9.
Die finanziellen und ethischen Belastungen, die mit der chemischen Sicherheitsprüfung von Säugetieren verbunden sind, sowie der zeitaufwändige Charakter von Säugetierstudien sind wichtige Faktoren, die zum Mangel an Daten über neue Chemikalien beitragen. Um dieses Problem anzugehen, setzen die U.S. Environmental Protection Agency (EPA), die Europäische Chemikalienagentur (ECHA), Health Canada und andere Behörden Maßnahmen um, die neue Ansatzmethoden (NAMs) in den regulatorischen Rahmen einbeziehen10 und damit die nordamerikanische und europäische Politik mit den internationalen Zielen in Einklang bringen, die Verwendung von Tieren zu ersetzen, zu reduzieren und zu verfeinern (das 3R-Prinzip)11. 12,13,14. NAMs umfassen eine Vielzahl von Assays, die in erster Linie auf In-vitro- und In-silico-Modellen basieren, die ein mechanistisches Verständnis der chemischen Toxizität vermitteln, anstatt die Widrigkeiten zu beobachten, die Säugetiertestarten zugefügt werden, wodurch die Geschwindigkeit der Datengenerierung für die chemische Risikobewertung erhöht wird, während gleichzeitig hochgenaue Ergebnisse erzieltwerden 15 . Es ist jedoch noch nicht erwiesen, dass diese Methoden vor systemischer Toxizität schützen, einschließlich der Störung lebenswichtiger biologischer Prozesse, die die Kommunikation zwischen den Organen und die endokrine Signalübertragung betreffen. Darüber hinaus können sie die Bioakkumulation von Chemikalien in bestimmten Geweben, die Fähigkeit einzelner Verbindungen, absorbiert und abgesondert zu werden, und das Zusammenspiel zwischen Verhalten und chemischer Exposition nicht berücksichtigen.
Aufgrund der Einschränkungen von In-vitro- und Computermodellen sollte der erfolgreiche Einsatz von NAMs zur Reduzierung oder zum Ersatz von Säugetiermodellen auch wirbellose In-vivo-Modelle wie die Fruchtfliege Drosophila melanogaster umfassen. Frühere Studien an der Fliege haben gezeigt, dass dieser Organismus gut geeignet ist, um die konservierten genetischen Signalwege zu untersuchen, die tierische Zellen vor toxischen Molekülenschützen 16,17,18,19,20,21,22. Darüber hinaus weist die Fliege eine bemerkenswerte genetische Ähnlichkeit mit dem Menschen auf, einschließlich funktioneller Homologe zu über 65 % der menschlichen Krankheiten 23,24,25 und einer noch stärkeren Erhaltung wichtiger funktioneller Signalwege 26. Diese Merkmale, kombiniert mit ihrem relativ kurzen Lebenszyklus, den geringen Wartungskosten und den leicht beobachtbaren Verhaltensreaktionen, machen Drosophila gut geeignet für die Verwendung als toxikologisches Modell27,28,29,30. Darüber hinaus haben Fliegen einen viel höheren Durchsatz als Nagetiermodelle und erfassen Auswirkungen auf den Stoffwechsel, die Physiologie und die Hormonsignalisierung, die von anderen nicht-organismischen NAMs nicht ohne weiteres nachgewiesen werdenkönnen 9.
Das hier beschriebene Protokoll stellt einen Rahmen dar, um die Auswirkungen der Chemikalienexposition auf erwachsene Drosophila zu testen. Die Methode ist so konzipiert, dass sie effizient, kostengünstig und reproduzierbar ist und gleichzeitig die Zeit minimiert, die die Forscher mit der Testchemikalie in Kontakt bringen müssen, und die Probenentnahme für die Metabolomik und andere Omics-Ansätze ermöglicht. Das Protokoll ist für das Testen einer einzelnen Chemikalie pro Experiment optimiert, kann aber problemlos andere experimentelle Parameter berücksichtigen, wie z. B. verschiedene Lösungsmittel oder Kombinationen von Chemikalien.
Protocol
Anmerkungen: Tragen Sie für alle Schritte in diesem Protokoll Nitrilhandschuhe. Tragen Sie einen Laborkittel, Augenschutz und/oder Atemschutzmasken gemäß den Sicherheitsdatenblättern für jede bewertete Chemikalie.
1. Vorbereitung der Durchstechflasche und der Feuchtigkeitskammer
HINWEIS: Die Schritte 1.1-1.5 können jederzeit abgeschlossen werden, bevor mit den anderen experimentellen Abschnitten begonnen wird. Nitrilhandschuhe müssen während der Vorbereitung der Durchstechflasche immer getragen werden, um eine Kontamination zu vermeiden.
- Stapeln Sie vier Blätter Zellulosechromatographiepapier der Güteklasse 1 (siehe Materialtabelle) und schneiden Sie sie in 2 breite Streifen. Stanzen Sie blumenförmige Filterpapiereinsätze mit einem 1,5-Zoll-Papierlocher aus, der eine blumenförmige Stanze enthält.
- Verwenden Sie einen 22 mm x 220 mm großen, unlackierten Holzdübel, um das Filterpapier auf den Boden eines Polypropylen-Fläschchens mit einem Durchmesser von 28,5 mm zu schieben. Vergewissern Sie sich, dass sich der Stapel Filterpapier sicher am Boden der Durchstechflasche befindet.
- Bewahren Sie die vorbereiteten Fläschchen in Plastik- oder Pappschalen auf und legen Sie die Schalen bis zur Verwendung in große Plastiktüten (~280 mm x 240 mm).
- Konstruieren Sie eine Feuchtigkeitskammer, indem Sie ein 120 mm x 280 mm großes Loch in den Kunststoffdeckel einer 606,24 mm x 225,42 mm x 403,22 mm großen Kunststoffwanne schneiden (siehe Materialtabelle). Kleben Sie das Gitter über das Loch, um den Luftstrom zu ermöglichen.
- Schneiden Sie einen Abschnitt des Kunststoffgitters aus Lamellen-Deckenleuchtenplatten (ursprünglich 610 mm x 1220 mm) so zu, dass er in den Boden der in Schritt 1.4 verwendeten Kunststoffwanne passt.
Anmerkungen: Eine Vielzahl verschiedener Kunststoffwannen und Kunststoff-/Metallgittermaterialien kann verwendet werden, um eine Feuchtigkeitskammer zu bauen.
2. Fliegenhaltung
- Startkulturen von erwachsenen Fliegen (mindestens 30 erwachsene Fliegen) in Milchflaschen aus Glas, die Standardmedien des Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC) enthalten31. Verschließen Sie die Flaschen mit einem Viskosestopfen, der in ein empfindliches Arbeitstuch eingewickelt ist. Überfüllen Sie die Flaschen nicht.
HINWEIS: Die Anzahl der benötigten Flaschen hängt von der Anzahl der durchgeführten chemischen Expositionen und dem Genotyp des Teststamms ab. Normalerweise können aus einer einzigen Flasche mehrere hundert Fliegen gewonnen werden, wenn robuste und fruchtbare Bestände verwendet werden. Der Standardtest verwendet Oregon-R-Wildtyp-Fliegen (BDSC-Bestand #2057), aber jeder oder die Genotyp(s) von Interesse kann mit diesem Protokoll verwendet werden. Denken Sie daran, dass kompromittierte Genotypen mit geringer Fruchtbarkeit und/oder Lebensfähigkeit vermehrt Flaschenkulturen erfordern. - Inkubieren Sie die Schalen der Kulturflaschen bei 25 °C bei ca. 60 % Luftfeuchtigkeit und einem Hell-Dunkel-Zyklus von 12:12 h, bis das dritte Larvenstadium oder frühe Puppenstadien beobachtet werden. Dieses Stadium ist an der Anwesenheit von Larven zu erkennen, die an den Seiten der Flasche hochwandern, und am Auftreten von Puppen an den Flaschenwänden.
HINWEIS: Fliegen nur während der Einschaltphase des Hell-Dunkel-Zyklus um 12:12 Uhr anfassen. Bei robusten Beständen erreichen die Flaschen dieses Stadium nach 3-4 Tagen unter den beschriebenen Bedingungen.- Entfernen Sie erwachsene Fliegen und bestimmen Sie die Liquidität des Mediums. Fließt das Medium beim Umdrehen an der Seite der Flasche entlang, ist das Medium zu flüssig. Führen Sie ein empfindliches Arbeitstuch oder eine Viskosekugel in den Boden der Flasche ein, um das Fliegenfutter zu festigen.
- Wenn die Fliegen beginnen, sich zu schließen, entfernen Sie alle erwachsenen Tiere aus den Flaschen und lassen Sie die Puppen 48 Stunden lang weiterschließen. Zu diesem Zeitpunkt können alle erwachsenen Tiere, die aus den Kulturflaschen entfernt wurden, entweder in neue Flaschen umgefüllt werden, um die Bestände zu vermehren (siehe Schritt 2.1) oder verworfen werden.
- Übertragen Sie Fliegen, die sich innerhalb von 48 Stunden schließen, in neue Flaschen mit Standard-BDSC-Medien. Reifung für 3 Tage.
HINWEIS: Die erwachsenen Tiere in diesen Flaschen sind 3-5 Tage alt und können in den Letalitäts- und Fütterungsexperimenten verwendet werden. Die Flaschen, die zum Reifen erwachsener Fliegen verwendet werden, enthalten Eier und Larven. Dadurch können diese Flaschen zur Vermehrung der nächsten Generation von Fliegen verwendet werden.
3. Vorbereitung von Fliegen auf die chemische Exposition
- Betäuben Sie 5-7 Tage alte Fliegen mit CO2. Sortieren Sie die betäubten Fliegen nach Geschlecht anhand ihrer Genitalien. Unterstützung bei der Betäubung und Geschlechtsbestimmung von Fliegen finden Sie in Referenz28.
- Geben Sie Gruppen von entweder 20 männlichen oder 20 weiblichen Fliegen in Fläschchen mit Standard-BDSC-Medien. Verschließen Sie die Durchstechflasche mit einem Viskosestopfen und bewahren Sie die Durchstechflasche für Männer und Frauen getrennt auf. Markieren Sie die Fläschchen mit weiblichen Fliegen mit einem Streifen. Lassen Sie die Durchstechflaschen mit männlichen Fliegen unmarkiert, um eine versehentliche Vermischung der Geschlechter zu vermeiden.
HINWEIS: Die Anzahl der Durchstechflaschen, die in Schritt 3.2 vorbereitet werden müssen, hängt von der Größe der Expositionsexperimente ab. Wie in den Schritten 5.3 und 5.6 beschrieben, erfordert ein typischer Entfernungsfindungsversuch für eine einzelne Prüfchemikalie mindestens 40 Durchstechflaschen mit männlichen und 40 durchstechflaschen mit weiblichen Proben. Für ein Standard-Dosis-Wirkungs-Kurven-Experiment, das in den Schritten 7.4 und 7.8 beschrieben wird, sind mindestens 63 Durchstechflaschen männlicher und 63 weiblicher Durchstechflaschen erforderlich. - Lagern Sie die Durchstechflaschen 48 h in einem Inkubator bei 25 °C bei ca. 60 % Luftfeuchtigkeit und mit einem Hell-Dunkel-Zyklus von 12:12 h. Stellen Sie während dieser Zeit die Schale mit den sortierten Fläschchen in einem Winkel von 60° ab, um zu verhindern, dass Fliegen im Futter stecken bleiben, während Sie sich von der Narkose erholen.
HINWEIS: Dieser Schritt ermöglicht es den Fliegen, sich von der CO2 - Anästhesie zu erholen. Betäuben Sie die Fliegen während des restlichen Expositionsprotokolls nicht erneut. - Nach der 48-stündigen Erholungsphase werden 0,75 ml steriles, gereinigtes Wasser zu den in Schritt 1.3 hergestellten Durchstechflaschen gegeben. Die Anzahl der in diesem Schritt hergestellten Durchstechflaschen sollte mit der Anzahl der in Schritt 3.2 eingerichteten Durchstechflaschen identisch sein.
- Übertragen Sie sortierte, geschlechtsgleiche Fliegen in das Hungerfläschchen, indem Sie das Glasfläschchen mit den Fliegen aus Schritt 3.2 öffnen, es in den Mund des vorbereiteten Plastikfläschchens stecken und dann den Boden des Kunststofffläschchens gegen eine Tischplatte klopfen. Verschließen Sie die Durchstechflasche aus Kunststoff mit einem Stopfen aus Zelluloseacetat (allgemein bekannt als Flug).
- Notieren Sie alle Fliegen, die bei diesem Transfer verloren gegangen sind (übertragen Sie später die Startnummer der Fliegen für jede Durchstechflasche).
- Markieren Sie Hungerfläschchen mit weiblichen Fliegen mit einem Streifen. Lassen Sie die Durchstechflaschen mit männlichen Fliegen unmarkiert, um eine versehentliche Vermischung der Geschlechter zu vermeiden.
- Bereiten Sie die Feuchtigkeitskammer für die Belichtung über Nacht vor. In den Schritten 1.4-1.5 finden Sie eine Beschreibung, wie Sie diese Kammer bauen.
- Legen Sie sechs Standard-Papiertücher auf den Boden der Feuchtigkeitskammer. Tränken Sie die Papiertücher mit 100 ml Wasser.
- Legen Sie das Kunststoffgitter (Schritt 1.5) über die nassen Handtücher, um sicherzustellen, dass die Durchstechflaschen nicht mit den getränkten Papiertüchern in Berührung kommen.
- Stellen Sie die Schalen mit den Hungerfläschchen in horizontaler Position in die Feuchtigkeitskammern. Stellen Sie die Feuchtekammern über Nacht in einen 25 °C heißen Inkubator (bei ca. 60 % Luftfeuchtigkeit).
HINWEIS: Im Idealfall dauert die nächtliche Hungerzeit ca. 16 Stunden; Das Timing kann jedoch für individuelle Laborpläne angepasst werden.
4. Vorbereitung von Stammlösungen
HINWEIS: Fliegen werden mit Testchemikalien in einem Hefe-Saccharose-Flüssigmedium gefüttert. In diesem Abschnitt wird die Herstellung von Stammlösungen aus konzentrierten Einsatzmedien und Prüfchemikalien beschrieben.
- Bereiten Sie eine 4x Hefe-Saccharose-Lösung mit 16 % Saccharose und 6 % Hefeextrakt (m/v) (siehe Materialtabelle) in sterilem gereinigtem Wasser gelöst zu. Autoklavieren Sie die Lösung in einem Flüssigkeitszyklus für die entsprechende Sterilisationszeit (z. B. 40 Minuten für 1 l).
HINWEIS: Die Lösung kann in loser Schüttung hergestellt und in Aliquoten bei -20 °C gelagert werden. Tauen Sie einzelne Aliquots 1 Tag vor Gebrauch auf, indem Sie sie in einen 4 °C-Kühlschrank stellen. - Bereiten Sie einen Vorrat der Prüfchemikalie vor. Für den ersten Versuch sollte die Stammlösung in der höchsten Konzentration hergestellt werden, damit die Chemikalie vollständig in Wasser gelöst werden kann.
Anmerkungen: Zum Auflösen der Prüfchemikalie können andere Lösungsmittel als Wasser verwendet werden. Siehe die Diskussion zu Vorbehalten bei der Verwendung alternativer Lösungsmittel. - Bereiten Sie eine 100-fache blaue Farbstofflösung vor, indem Sie 1 g FD&C Blue No. 1 (siehe Materialtabelle) in 10 ml sterilem, gereinigtem Wasser auflösen.
HINWEIS: Die blaue Farbstofflösung kann in loser Schüttung hergestellt und in Aliquoten bei 4 °C gelagert werden.
5. Herstellung von Expositionsfläschchen: Experiment zur Entfernungsmessung
HINWEIS: Die Schritte 5 und 6 des Protokolls dienen dazu, die niedrigste Dosis der Prüfchemikalie zu identifizieren, die eine Letalität von 100 % induziert, und die höchste Dosis, die keinen letalen Phänotyp induziert. Wenn diese Konzentrationen bereits durch frühere Experimente bestimmt wurden, siehe Schritte 7 und 8 zur Berechnung einer Dosis-Wirkungs-Kurve. Expositionsmedien müssen unmittelbar vor der Zugabe von Fliegen in die Expositionsfläschchen vorbereitet werden.
- Beschriften Sie acht 15-ml-Zentrifugenröhrchen wie folgt: (i) keine Chemikalie, (ii) höchste Konzentration, (iii) 1:2, 1:10, 1:20, 1:100, 1:200 und 1:1.000.
- Bereiten Sie die Expositionsmedien in den markierten Zentrifugenröhrchen aus Schritt 5.1 vor, indem Sie zunächst 2,5 ml 4x Hefe-Saccharose-Stammlösung in alle acht markierten Röhrchen geben.
- Geben Sie 7,5 ml steriles, gereinigtes Wasser in das Röhrchen mit der Aufschrift "keine Chemikalie". Diese Verdünnung ist die Negativkontrolle.
- Geben Sie 7,4 ml der Stammlösung der Prüfchemikalie in das Röhrchen mit der Aufschrift "höchste Konzentration". Geben Sie 100 μl steriles, gereinigtes Wasser in dieses Röhrchen, so dass das Endvolumen 10 ml beträgt. Berechnen und notieren Sie die Molarität der Prüfchemikalie in dieser Lösung.
HINWEIS: Die Zugabe von 100 μl sterilem, gereinigtem Wasser in das Röhrchen stellt sicher, dass die chemische Konzentration in diesem Schritt identisch ist mit der in Schritt 5.5 verwendeten, bei der den Expositionsmedien eine blaue Farbstofflösung als Methode zur Beurteilung des Fütterungsverhaltens zugesetzt wird. - Geben Sie die entsprechende Menge der Testchemikalien-Stammlösung und steriles gereinigtes Wasser in die verbleibenden Röhrchen. Das Endvolumen jedes Röhrchens muss 10 ml betragen. Die Endkonzentration der Prüfchemikalien in diesen Röhrchen im Vergleich zum Röhrchen mit der höchsten Konzentration muss 1:2, 1:10, 1:20, 1:100, 1:200 und 1:1.000 betragen.
- Bereiten Sie acht Expositionsfläschchen für jede einzelne Konzentration des Expositionsmediums vor, die in Schritt 5.1 erzeugt wurde, und etikettieren Sie sie. Es sollten acht Sätze von Durchstechflaschen (insgesamt 64 Durchstechflaschen) mit den folgenden Etiketten vorhanden sein: keine Chemikalie, höchste Konzentration, 1:2, 1:10, 1:20, 1:100, 1:200 und 1:1.000.
- Pipettieren Sie 0,75 ml des in Schritt 5.2.3 hergestellten Expositionsmediums in den entsprechenden Satz von Expositionsfläschchen.
- Beschriften Sie acht 5-ml-Einzelröhrchen wie folgt: (i) keine Chemikalie, (ii) höchste Konzentration, (iii) 1:2, 1:10, 1:20, 1:100, 1:200 und 1:1.000.
- Bereiten Sie blaues Farbstoffbelichtungsmedium vor, indem Sie zuerst 500 μl 4x Hefe-/Saccharose-Stammlösung und 20 μl blaue Farbstoff-Stofflösung in acht markierten 5-ml-Röhrchen mischen.
- Geben Sie 1,48 ml steriles, gereinigtes Wasser in das Röhrchen mit der Aufschrift "keine Chemikalie". Diese Verdünnung ist die Negativkontrolle.
- Geben Sie 1,48 ml der Stammlösung der Prüfchemikalie in das Röhrchen mit der Aufschrift "höchste Konzentration". Diesem Schlauch wird kein Wasser zugesetzt. Berechnen und notieren Sie die Molarität der Prüfchemikalie in dieser Lösung.
- Geben Sie die entsprechende Menge der Testchemikalien-Stammlösung und steriles gereinigtes Wasser in die verbleibenden Röhrchen. Das Endvolumen jeder Tube sollte 2 ml betragen. Die Endkonzentration der Prüfchemikalie in diesen Röhrchen im Vergleich zum Röhrchen mit der "höchsten Konzentration" sollte 1:2, 1:10, 1:20, 1:100, 1:200 und 1:1.000 betragen.
- Bereiten Sie zwei Belichtungsfläschchen mit jeder einzelnen Konzentration blauer Belichtungsmedien vor und beschriften Sie sie. Es sollten acht Sätze von Durchstechflaschen (insgesamt 16 Durchstechflaschen) vorhanden sein, die die folgenden Etiketten enthalten: keine Chemikalie, höchste Konzentration, 1:2, 1:10, 1:20, 1:100, 1:200 und 1:1.000. Auch auf diesen Fläschchen sollte das Wort "blau" stehen.
- Pipettieren Sie 0,75 ml blaues Belichtungsmedium in den entsprechenden Satz blauer Belichtungsfläschchen.
6. Chemische Exposition gegenüber Fliegen: Experiment zur Entfernungsmessung
- Bereiten Sie Fläschchen mit chemischer Exposition vor, indem Sie die Durchstechflaschen mit über Nacht ausgehungerten Fliegen aus Schritt 3.7 wie folgt verwenden:
- Übertragen Sie vier Durchstechflaschen mit ausgehungerten weiblichen Fliegen (20 Fliegen pro Durchstechflasche) in vier Expositionsfläschchen mit jeder chemischen Konzentration. Beschriften Sie diese Fläschchen mit "weiblich". Verwenden Sie die gleiche Übertragungsmethode, die in Schritt 3.5 beschrieben ist.
- Übertragen Sie vier Durchstechflaschen mit ausgehungerten männlichen Fliegen (20 Fliegen pro Durchstechflasche) in vier Expositionsfläschchen mit jeder chemischen Konzentration. Beschriften Sie diese Fläschchen mit "männlich". Verwenden Sie die gleiche Übertragungsmethode, die in Schritt 3.5 beschrieben ist.
- Bereiten Sie Fläschchen mit blauem Farbstoff wie folgt vor, indem Sie die Durchstechflaschen mit über Nacht ausgehungerten Fliegen aus Schritt 3.7 verwenden:
- Übertragen Sie ein Fläschchen mit ausgehungerten weiblichen Fliegen (20 Fliegen pro Durchstechflasche) in ein blaues Expositionsfläschchen für jede chemische Konzentration. Beschriften Sie diese Durchstechflasche mit "weiblich". Verwenden Sie die gleiche Übertragungsmethode, die in Schritt 3.5 beschrieben ist.
- Übertragen Sie eine Durchstechflasche mit ausgehungerten männlichen Fliegen (20 Fliegen pro Durchstechflasche) in ein blaues Expositionsfläschchen für jede chemische Konzentration. Beschriften Sie diese Durchstechflasche mit "männlich". Verwenden Sie die gleiche Übertragungsmethode, die in Schritt 3.5 beschrieben ist.
- Notieren Sie die Anzahl der Fliegen, die sich nach dem Transfer in jeder Durchstechflasche befinden, und notieren Sie die Anzahl, die gestorben oder entkommen ist. Normalerweise sollten alle 20 Fliegen über Nacht verhungern und übertragen werden.
- Stellen Sie die Expositionsfläschchen waagerecht in frisch vorbereitete Feuchtekammern (siehe Schritt 3.6 zur Vorbereitung der Feuchtekammer). Stellen Sie die Kammern in einen 25 °C heißen Inkubator mit ca. 60 % Luftfeuchtigkeit und einem 12:12 h Hell-Dunkel-Zyklus.
- Untersuchen Sie die Expositionsfläschchen 24 und 48 h nach Beginn der Chemikalienexposition. Zählen und notieren Sie die Anzahl der toten Fliegen in jedem Fläschchen zu jedem Zeitpunkt.
HINWEIS: Der Tod wird als Messwert für diesen Test verwendet, aber das Protokoll kann angepasst werden, um andere Phänotypen zu untersuchen. Exponierte Fliegen werden üblicherweise zu diesen Zeitpunkten für transkriptomische und metabolomische Studien gesammelt. - Untersuchen Sie die blau belichteten Durchstechflaschen 24 Stunden nach Beginn der chemischen Exposition. Verwenden Sie die folgenden Techniken, um festzustellen, ob exponierte Fliegen die blauen Belichtungsmedien verbraucht haben:
- Untersuchen Sie die Wände der Durchstechflasche auf Anzeichen von blauem Kot, der als kleine Punkte an der Seite der Belichtungsdurchstechflasche sowie auf dem Flug erscheint.
- Betäuben Sie die Fliegen mit CO2 und untersuchen Sie den Bauch auf das Vorhandensein von blauem Farbstoff.
HINWEIS: Normalerweise werden Fläschchen mit blauer Exposition nach 24 Stunden analysiert. Dieser Schritt könnte jedoch stattdessen nach 48 Stunden durchgeführt werden. Fliegen, die gefressen haben, haben normalerweise einen blauen Streifen durch den Bauch, was darauf hinweist, dass die Expositionsmedien in den Darm eingedrungen sind. - Untersuchen Sie die Fliegen auf abnormales Fressverhalten wie Aufstoßen, Aufblähen der Ernte und Zusammenbruch der Darmbarrierefunktion (angezeigt durch das Auftreten von blauem Farbstoff im gesamten Organismus und nicht nur auf den Magen-Darm-Trakt beschränkt, allgemein als Schlumpfen bezeichnet32,33).
- Entsorgen Sie alle kontaminierten Durchstechflaschen, Filterpapiere, Flügel und Fliegen in geeigneten Behältern für chemische Abfälle. Wenn lebende Fliegen in den Fläschchen verbleiben, frieren Sie die Fläschchen ein, um die Fliegen abzutöten, bevor Sie sie in den richtigen Abfallbehälter werfen.
HINWEIS: Die Entsorgung von Expositionsfläschchen und Fliegen hängt von der/den Chemikalie(n) ab, die im Experiment analysiert werden. Befolgen Sie immer die auf dem Stoffsicherheitsdatenblatt beschriebenen Stoffsicherheitsverfahren. Wenn die im Entfernungsfindungsexperiment verwendeten Konzentrationen Fliegen mit der niedrigsten Dosis töten, wiederholen Sie Abschnitt 6 mit einer Verdünnungsreihe, beginnend mit der niedrigsten Konzentration, die 100 % der Tiere tötet.
7. Herstellung von Expositionsfläschchen: Erstellung einer Dosis-Wirkungs-Kurve
HINWEIS: Das in den Schritten 5 und 6 beschriebene Protokoll wurde entwickelt, um die chemische Konzentration, die erforderlich ist, um einen Phänotyp hervorzurufen, grob zu bestimmen. Die Schritte 7 und 8 des Protokolls werden verwendet, um eine genaue Dosis-Wirkungs-Kurve zu berechnen.
- Berechnen Sie die Konzentrationen der Prüfchemikalien, die analysiert werden müssen, um eine Dosis-Wirkungs-Kurve zu erstellen, mit der folgenden Methode:
- Bestimmen Sie die niedrigste Konzentration der Prüfchemikalie, die 100 % der exponierten Fliegen nach 48 Stunden abtötet.
- Bestimmen Sie die höchste Konzentration der Prüfchemikalie, die nach 48 Stunden keinen Einfluss auf die Lebensfähigkeit hat.
- Berechnen Sie weitere vier Konzentrationen, die gleichmäßig auf die in den Schritten 7.1.1 und 7.1.2 ermittelten Konzentrationen verteilt sind.
- Neun einzelne 15-ml-Zentrifugenröhrchen sind mit der Molarität der folgenden Konzentrationen zu kennzeichnen: (i) keine Chemikalie, (ii) Konzentration gemäß Schritt 7.1.1, (iii) Konzentration gemäß Schritt 7.1.2, (iv) Konzentrationen gemäß Schritt 7.1.3, (v) das Doppelte der in Schritt 7.1.1 ermittelten Konzentration, (vi) eine Verdünnung der in Schritt 7.1.2 ermittelten Konzentration von 1:2.
ANMERKUNG: Für die genaue Berechnung der Dosis-Wirkungs-Kurve ist die Einbeziehung der Konzentrationen, die doppelt so hoch sind wie die in 7.1.1 ermittelte Konzentration, und eine Verdünnung von 1:2 der in Schritt 7.1.2 ermittelten Konzentration wichtig. - Bereiten Sie das Expositionsmedium vor, indem Sie zunächst 2,5 ml 4x Hefe-Saccharose-Stammlösung in neun markierte einzelne 15-ml-Zentrifugenröhrchen geben, die in Schritt 7.2 hergestellt wurden.
- Geben Sie 7,5 ml steriles, gereinigtes Wasser in das Röhrchen mit der Aufschrift "keine Chemikalie". Diese Verdünnung ist die Negativkontrolle.
- Geben Sie die entsprechende Menge der Testchemikalien-Stammlösung und steriles gereinigtes Wasser in die verbleibenden Röhrchen. Das Endvolumen jedes Röhrchens muss 10 ml betragen. Die Endkonzentration der Chemikalie in einem einzelnen Röhrchen sollte der auf der Außenseite des Röhrchens angegebenen Konzentration entsprechen.
- Bereiten Sie 12 Expositionsfläschchen für jede in Schritt 7.2 erzeugte Konzentration des Expositionsmediums vor und etikettieren Sie sie. Es sollten neun Sätze von Durchstechflaschen vorhanden sein (insgesamt 108 Durchstechflaschen).
- Pipettieren Sie 0,75 ml des Belichtungsmediums in den entsprechenden Satz von Belichtungsfläschchen.
HINWEIS: Die Schritte 7.6 bis 7.8 sind optional. Wenn bekannt ist, dass die in Schritt 7.2 hergestellten chemischen Prüfchemikalienkonzentrationen das Fressverhalten nicht beeinflussen, können diese Schritte übersprungen werden. - Bereiten Sie neun verschiedene 5-ml-Röhrchen für blau belichtete Medien mit der gleichen Konzentrationsreihe vor, die in Schritt 7.2 verwendet wurde, und etikettieren Sie sie.
- Bereiten Sie blaues Farbstoffbelichtungsmedium vor, indem Sie zuerst 500 μl 4x Hefe-/Saccharose-Stammlösung und 20 μl blaue Farbstoffbrühlösung mischen.
- Geben Sie 1,48 ml gereinigtes steriles Wasser in das Röhrchen mit der Aufschrift "keine Chemikalie". Diese Verdünnung ist die Negativkontrolle.
- Geben Sie die entsprechende Menge der Testchemikalienstammlösung und gereinigtes steriles Wasser in die verbleibenden Röhrchen. Das Endvolumen jedes Röhrchens muss 2 ml betragen. Die Endkonzentration der Chemikalie in einem einzelnen Röhrchen sollte der auf der Außenseite des Röhrchens angegebenen Konzentration entsprechen.
- Bereiten Sie zwei Expositionsfläschchen für jede einzelne Konzentration des blauen Belichtungsmediums vor und beschriften Sie sie. Es sollten neun Durchstechflaschen (insgesamt 18 Durchstechflaschen) vorhanden sein, wobei jeder Satz Durchstechflaschen mit den in Schritt 7.2 aufgeführten Konzentrationen gekennzeichnet sein sollte. Auch auf diesen Fläschchen sollte das Wort "blau" stehen.
- Pipettieren Sie 0,75 ml blaues Belichtungsmedium in den entsprechenden Satz blauer Belichtungsfläschchen.
8. Chemische Exposition gegenüber Fliegen: Erstellung einer Dosis-Wirkungs-Kurve
- Bereiten Sie Fläschchen mit chemischer Exposition vor, indem Sie die Durchstechflaschen mit über Nacht ausgehungerten Fliegen aus Schritt 3.7 wie folgt verwenden:
- Übertragen Sie sechs Durchstechflaschen mit ausgehungerten weiblichen Fliegen (20 Fliegen pro Durchstechflasche) in sechs Expositionsfläschchen mit jeder chemischen Konzentration. Beschriften Sie diese Fläschchen mit "weiblich". Verwenden Sie die gleiche Übertragungsmethode, die in Schritt 3.5 beschrieben ist.
- Übertragen Sie sechs Durchstechflaschen mit ausgehungerten männlichen Fliegen (20 Fliegen pro Durchstechflasche) in sechs Expositionsfläschchen mit jeder chemischen Konzentration. Beschriften Sie diese Fläschchen mit "männlich". Verwenden Sie die gleiche Übertragungsmethode, die in Schritt 3.5 beschrieben ist.
- Bereiten Sie Fläschchen mit blauem Farbstoff wie folgt vor, indem Sie die Durchstechflaschen mit über Nacht ausgehungerten Fliegen aus Schritt 3.7 verwenden:
- Übertragen Sie ein Fläschchen mit ausgehungerten weiblichen Fliegen (20 Fliegen pro Durchstechflasche) in ein blaues Expositionsfläschchen für jede chemische Konzentration. Beschriften Sie diese Durchstechflasche mit "weiblich". Verwenden Sie die gleiche Übertragungsmethode, die in Schritt 3.5 beschrieben ist.
- Übertragen Sie eine Durchstechflasche mit ausgehungerten männlichen Fliegen (zwanzig Fliegen pro Durchstechflasche) für jede chemische Konzentration in eine Durchstechflasche mit blauer Belichtung. Beschriften Sie diese Durchstechflasche mit "männlich". Verwenden Sie die gleiche Übertragungsmethode, die in Schritt 3.5 beschrieben ist.
- Notieren Sie die Anzahl der Fliegen, die sich nach dem Transfer in jeder Durchstechflasche befinden. Normalerweise sollten alle 20 Fliegen den nächtlichen Hunger und die Übertragung überleben, aber stellen Sie sicher, dass alle, die während der Übertragung gestorben oder entkommen sind, von der Gesamtzahl abgezogen werden.
- Stellen Sie die Expositionsfläschchen waagerecht in frisch vorbereitete Feuchtekammern (siehe Schritt 3.6 zur Vorbereitung der Feuchtekammer). Stellen Sie die Kammern in einen 25 °C heißen Inkubator mit ca. 60 % Luftfeuchtigkeit und einem 12:12 h Hell-Dunkel-Zyklus.
- Untersuchen Sie die Expositionsfläschchen 24 und 48 h nach Beginn der Chemikalienexposition. Zählen und notieren Sie die Anzahl der toten Fliegen in jedem Fläschchen zu jedem Zeitpunkt.
- Untersuchen Sie die blau belichteten Durchstechflaschen 24 Stunden nach Beginn der chemischen Exposition. Verwenden Sie die in Schritt 6.6 beschriebene Methode, um Veränderungen im Fressverhalten zu beurteilen.
- Entsorgen Sie alle kontaminierten Durchstechflaschen, Filterpapiere, Flügel und Fliegen in geeigneten Behältern für chemische Abfälle. Wenn lebende Fliegen in den Fläschchen verbleiben, frieren Sie die Fläschchen ein, um die Fliegen abzutöten, bevor Sie sie in den richtigen Abfallbehälter werfen.
HINWEIS: Die Entsorgung von Expositionsfläschchen und Fliegen hängt von der/den Chemikalie(n) ab, die im Experiment analysiert werden. Befolgen Sie immer die auf dem Stoffsicherheitsdatenblatt beschriebenen Stoffsicherheitsverfahren.
9. Berechnung einer Dosis-Wirkungs-Kurve
- Verwenden Sie zur Analyse der Daten die Benchmark Dose Software (BMDS, Version 3.2; siehe Materialtabelle) oder eine ähnliche Software34. Im Folgenden wird der Workflow mit der BMDS-Software beschrieben.
- Klicken Sie auf den Reiter Daten von BMDS und klicken Sie auf Neuen Datensatz einfügen. Geben Sie die Anzahl der Stichproben im Datensatz ein, klicken Sie auf dichotom und dann auf Datensatz erstellen. Geben Sie jedes Replikat als einzelne Zeile in das Dataset ein.
- Geben Sie in der ersten Spalte der generierten Tabelle die Dosis ein, in der zweiten Spalte die Startzahl der Fliegen ohne diejenigen, die vor Schritt 8.3) gestorben sind oder verloren gegangen sind, und in der dritten Spalte die Anzahl der Fliegen, die durch chemische Exposition gestorben sind.
- Klicken Sie auf die Registerkarte Allgemein von BMDS.
- Klicken Sie auf den Dropdown-Pfeil für das Menü Modelltyp auswählen und klicken Sie auf Dichotom.
- Klicken Sie für den Datensatz aus Schritt 9.2 in der Tabelle Datensätze auf Aktivieren .
- Klicken Sie auf die Kästchen für die gewünschten Modelle für die Analyse in der Tabelle MLE und Alternativen.
HINWEIS: Es wurde hauptsächlich das Modell "Frequentist Restricted Dichotomous Hill" verwendet. - Klicken Sie auf Analyse ausführen. Das Programm generiert eine Ausgabedatei mit der/den Letalitätskurve(n) und zusätzlichen Details zu dem/den Modell(en).
Representative Results
Die Fliege dient seit langem als Modell in Studien zur Bestimmung der Toxizität von Natriumarsenit (NaAsO2)35,36,37,38. Um die Wirksamkeit des Protokolls zu demonstrieren, wurden männliche und weibliche Fliegen NaAsO2 ausgesetzt, mit dem Ziel, diese Ergebnisse mit früheren Studien zu vergleichen. Unter Anwendung der oben beschriebenen Methodik wurden erwachsene Oregon-R-Männer und -Frauen mit Oregon-R (BDSC-Bestand #2057) einer Reihe von NaAsO-2-Konzentrationen (0, 0,01, 0,02, 0,1, 0,2, 1 und 2 mM) ausgesetzt und 48 Stunden nach Beginn der Exposition für die Letalität bewertet (Abbildung 1A,B).
Ziel dieser ersten Analyse war es, den ungefähren Konzentrationsbereich zu ermitteln, der eine genauere Charakterisierung der Toxizität von NaAsO2 ermöglichen würde. In nachfolgenden Experimenten wurden Konzentrationen (0, 0,2, 0,5, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5 und 5 mM) ausgewählt, die die NaAsO2-Dosis-Wirkungs-Kurve genauer definierten (Abbildung 1C,D). Beachten Sie, dass die resultierende Analyse mehrere Konzentrationen untersuchte, die eine 100%ige Letalität induzierten. Die Daten wurden mit der öffentlich zugänglichen Benchmark Dose Software Version 3.2.0.125 der Environmental Protection Agency analysiert. Die Daten wurden als "dichotom" modelliert und das Dichotomous-Hill-Modell wurde für nachfolgende Analysen verwendet. Basierend auf diesem Modell betrugen die endgültigen LD10, LD25 und LD 50 von männlichen Fliegen, die mit NaAsO2 gefüttert wurden, 0,30 mM,0,50 mM bzw. 0,65 mM. Bei weiblichen Fliegen waren diese Werte mit einem LD10 von 0,30 mM, einem LD25 von 0,65 mM und einem LD von 50 von 0,90 mM etwas höher. Insgesamt ähneln die mit dieser Methode ermittelten Werte denen, die zuvor für die Arsentoxizität in Drosophila melanogaster35,36,37,38 berichtet wurden, was die Methodik bestätigt.
Zusätzlich zu den sechs Replikaten, die zur Berechnung der Dosis-Wirkungs-Kurve verwendet wurden, wurden männliche und weibliche Fliegen auch mit NaAsO 2-Expositionslösungen gefüttert, die 1 % FD&C-Blau enthielten, das im Verdauungstrakt mittels Lichtmikroskopie gut sichtbar ist. Basierend auf dem Vorhandensein von blauem Farbstoff im Darm von NaAsO 2-gefütterten Fliegen fraßen sowohl männliche als auch weibliche Fliegen 24 Stunden nach Beginn der chemischen Exposition weiter, unabhängig von der NaAsO2-Konzentration im flüssigen Medium (Abbildung 2). Es wurde jedoch beobachtet, dass die aufgenommene Nahrung gelegentlich in Dosen von mehr als 0,2 mM für Frauen und 0,5 mM für Männer ausgewürgt wurde (Abbildung 2). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass das Aufstoßen eine Schlüsselrolle bei der Reaktion von Drosophila auf eine Arsenvergiftung spielen könnte.
Abbildung 1: Dosis-Wirkungs-Kurven für männliche und weibliche Drosophila, die 48 h lang mit NaAsO2 behandelt wurden. Alle Diagramme zeigen die geschätzten Anteile toter Fliegen bei jeder NaAsO2-Konzentration, die auf der Grundlage des Dichotomous Hill-Modells getestet wurde. (A,B) Ein breites Spektrum an NaAsO2-Konzentrationen wurde getestet, um die Dosis anzunähern, bei der jedes Fliegengeschlecht zu sterben beginnt. (A) zeigt die männlichen Daten und (B) zeigt die weiblichen Daten. N = 4 Durchstechflaschen mit 20 Fliegen pro Durchstechflasche. (C,D) Ein engerer Bereich der NaAsO2-Konzentrationen wurde getestet, um genaue Dosen zu bestimmen, bei denen 10 %, 25 % und 50 % jedes Fliegengeschlechts starben. Diese Dosen sind rechts neben jedem Diagramm angegeben. (C) zeigt die männlichen Daten und (D) zeigt die weiblichen Daten. N = 6 Durchstechflaschen mit 20 Fliegen pro Durchstechflasche. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Repräsentative Ergebnisse des Blaufarbstoff-Assays von männlichen und weiblichen Drosophila, die 24 h lang mit NaAsO2 behandelt wurden. Mikroskopische Aufnahmen zeigen, dass Fliegen mit steigenden Konzentrationen von NaAsO2 gefüttert werden. Reihe (A) zeigt männliche Fliegen und Reihe (B) weibliche Fliegen, wobei die Konzentration von NaAsO2 von links nach rechts ansteigt. Das Abdomen zeigt bei niedrigen Konzentrationen eine kleine Menge Blau in der Nähe des Thorax, was darauf hindeutet, dass Expositionsmedien in den Darm eingedrungen sind. Bei höheren Konzentrationen beginnt sich blauer Farbstoff um den Mund herum anzusammeln, was darauf hindeutet, dass Expositionsmedien wiedergewürgt werden. Der Maßstabsbalken ist 1 mm groß. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Discussion
Die Fruchtfliege Drosophila melanogaster entwickelt sich zu einem leistungsfähigen System für die NAMs16,18,19,21. Durch die Nutzung der beispiellosen genetischen Ressourcen, die der Fliegengemeinschaft zur Verfügung stehen, in Kombination mit den jüngsten Fortschritten in der Genomik und Metabolomik sind chemische Sicherheitsstudien mit Drosophila in der Lage, die molekularen Mechanismen, durch die einzelne Verbindungen in den Stoffwechsel, die Physiologie und die Zellsignalübertragung eingreifen, schnell zu identifizieren (z. B.39). Dieses kostengünstige Protokoll wurde entwickelt, um schnell Dosis-Wirkungs-Kurven zu definieren und anschließend Proben für die RNA-Seq- und Metabolomics-Analyse zu generieren. Darüber hinaus kann dieses flexible Protokoll für die Verwendung mit jedem Genotyp angepasst werden und kann viele Klassen von Chemikalien aufnehmen.
Ein bemerkenswerter Aspekt dieses Protokolls ist die Wahl der flüssigen Nahrung, die bei der chemischen Exposition verwendet wird, die auf einer früheren Studie basiert, sich jedoch von den festen Medien unterscheidet, die in den meisten toxikologischen Studien zu Drosophila verwendet werden 18,22. Dieses spezielle flüssige Medium wurde ausgewählt, um den Nährstoffgehalt des standardmäßigen, festen BDSC-Mediums widerzuspiegeln, mit dem die Fliegen auch in diesem Protokoll gefüttert werden, um sicherzustellen, dass die Fliegen eine konsistente Ernährung erhalten. Die Einfachheit von flüssigen Nährmedien hat viele Vorteile. Flüssige Medien sind einfacher zu handhaben als feste Lebensmittel, die entweder geschmolzen und wieder verfestigt oder aus Pulver rekonstituiert werden müssen. Flüssige Medien erhöhen auch den Durchsatz des Systems, sorgen für eine gleichmäßige Chemikalienverteilung in den Zuführmedien und verringern den Zeitaufwand für die Arbeit mit gefährlichen Verbindungen. Darüber hinaus müssen die Medien nicht erhitzt werden, was die Prüfung flüchtiger Testverbindungen erleichtert. Schließlich werden aufgrund der relativ wenigen Komponenten, die in der Lebensmittellösung enthalten sind, unerwünschte Nebenreaktionen zwischen der Prüfchemikalie und anderen Nahrungsbestandteilen minimiert. Die im Futter verwendete Hefe ist ebenfalls inaktiv, was die Reaktivität des Nährmediums weiter einschränkt. Bitte beachten Sie jedoch, dass die Methode nicht geeignet ist, um die Entwicklungs- oder Larvatoxizität zu testen.
Einige der im Protokoll verwendeten Materialien können ersetzt werden, z. B. die Verwendung von Fliegenfläschchen aus Glas anstelle von Polypropylen. Die verwendeten Materialien wurden jedoch so ausgewählt, dass sie sowohl inert als auch wegwerfbar sind, um unerwünschte chemische Reaktionen zwischen Reagenzien und chemische Expositionen zu vermeiden, die sich aus der Reinigung von Glaswaren ergeben könnten.
Die Verwendung von flüssigen Lebensmitteln erfordert ein Fahrzeug für die Lieferung von Lebensmitteln. Filterpapier aus Celluloseacetat wurde aufgrund seiner Flexibilität und Inertheit für diesen Zweck ausgewählt28. Andere Forscher verwendeten ähnliche Protokolle, jedoch mit anderen Fahrzeugen, wie z. B. empfindlichen Tüchern oder Glasfaserfiltern29,30. Das Filterpapier aus Zelluloseacetat erfüllte diese Anforderungen, da es sich um ein inertes Vehikel handelt, das in die ideale Form geschnitten werden kann, um es ohne große Lücken zwischen dem Papier und der Fläschchenwand in den Boden der Fliegenfläschchen zu passen, wodurch der Tod durch Fliegen, die im Medium oder im Vehikel selbst stecken bleiben, verhindert wird.
Eine wichtige Einschränkung dieses Systems besteht darin, dass die maximal testbare Konzentration einer Chemikalie an die Löslichkeit der Chemikalie gebunden ist. Nicht wasserlösliche Verbindungen erfordern ein zusätzliches Lösungsmittel, was zu zusätzlichen oder synergistischen Effekten mit der zu untersuchenden Chemikalie führen kann. Dies kann auch zu Situationen führen, in denen es nicht möglich ist, Stammlösungen herzustellen, die konzentriert genug sind, um den gewünschten Endpunkt in allen Organismen zu erreichen, was die Analyse der resultierenden Daten einschränkt31. Um dieses Problem zu lösen, können Chemikalien mit geringer Wasserlöslichkeit getestet werden, indem der Lebensmittellösung bis zu 0,5 % Dimethylsulfoxid zugesetzt werden. Andere Lösungsmittel könnten ebenfalls verwendet werden, aber für jedes Lösungsmittel von Interesse sind weitere Untersuchungen erforderlich, um die maximal akzeptable Lösungsmittelkonzentration in der Lösung zu bestimmen, um die Löslichkeit zu maximieren und gleichzeitig die Auswirkungen des Lösungsmittels auf den Organismus zu minimieren.
Eine umfassende Charakterisierung der Geruchsreaktion in Drosophila hat beschrieben, wie Fliegen den Verzehr toxischer Verbindungen vermeiden40,41, was zu einer reduzierten Fütterung mit behandelten Medien führt. Der blaue Farbstoff-Assay adressiert dieses Phänomen, indem er es den Forschern ermöglicht, das Fressverhalten der Fliegen, die mit jeder Konzentration der experimentellen Chemikalie gefüttert wurden, effizient zu untersuchen42,43,44. Das Vorhandensein oder Fehlen von Blau im Magen-Darm-Trakt der Fliege zeigt an, ob die Fliege das giftige Medium gefressen hat. Obwohl es ausgefeiltere Methoden zur Beurteilung des Fressverhaltens von Fliegen gibt, wie z. B. den Fly Liquid-Food Interaction Counter45, ist diese qualitative Methode besser für das Screening mit höherem Durchsatz geeignet.
Ein bemerkenswerter Aspekt dieses Protokolls ist, dass es für eine Expositionsdauer von 48 Stunden optimiert wurde, ohne dass Fliegen übertragen oder zusätzliche Flüssigkeit in das Expositionsfläschchen gegeben werden müssen. Die Verwendung einer Feuchtekammer und die Unterbringung der Kammern in einem Inkubator bei hoher Luftfeuchtigkeit verhinderten, dass das Filterpapier mit den Zuführmedien während dieser Zeit austrocknete. Das Protokoll kann für längere Expositionsdauern angepasst werden, aber die Methode muss angepasst werden, um sicherzustellen, dass das Filterpapier nicht austrocknet und aufgrund der Austrocknung erhebliche Änderungen der Lösungskonzentration oder Letalität verursacht.
Schließlich ist ein wichtiges Merkmal dieses Protokolls, dass es problemlos genetische Varianten aufnehmen kann, was es den Forschern ermöglicht, die breite Palette genetischer Werkzeuge für Drosophila zu nutzen, um diese Vorstudien an Wildtyp-Organismen zu erweitern, um die Mechanismen der chemischen Wirkung in vivo besser zu verstehen. In dieser Hinsicht könnte das oben skizzierte Protokoll leicht modifiziert werden, um ein zuvor beschriebenes JoVE-Protokoll von Peterson und Long zu ergänzen, das eine toxikologische Analyse von wild gefangenen Fliegen ermöglicht18.
Aufgrund der Vielzahl früherer Studien zur Toxizität von Natriumarsenit in Drosophila 32,33,34,35,36 wurden Oregon-R-Fliegen mit dieser Verbindung behandelt, um die Wirksamkeit unseres Systems zu demonstrieren. Männliche Fliegen wiesen eine LD 50 von 0,65 mM und Weibchen eine LD50 von 0,90 mM auf. Dies deckt sich mit früheren Studien an mit Natriumarsenit behandelten adulten Drosophila. Goldstein und Babich37 fanden beispielsweise heraus, dass 50 % der Fliegen (gemischten Geschlechts) nach 7 Tagen Exposition gegenüber 0,5 mM NaAsO2 starben. Obwohl dies eine etwas niedrigere Dosis ist, als derzeit beobachtet wurde, sind die Unterschiede zwischen ihren Methoden und dieser Methode (einschließlich der Verwendung fester Expositionsmedien, einer längeren Zeitskala und gemischter Geschlechter) wahrscheinlich für diesen Unterschied verantwortlich. Wichtig ist, dass beide Methoden zu insgesamt ähnlichen LD50-Werten führten.
Beobachtungen aus Experimenten, die dieses Protokoll verwenden, können verwendet werden, um genetische und molekulare Ziele für nachfolgende Verhaltens- oder mechanistische Studien zu finden. Die Expositionsmethode kann auch zur Behandlung von Drosophila für die Probenahme für die Metabolomik und Proteomik verwendet werden, wodurch sich dieses Protokoll gut für das wachsende Gebiet der Präzisionstoxikologie eignet (modelliert aus dem Bereich der Präzisionsmedizin46). In diesem Zusammenhang können exponierte Fliegen nach Schritt 8 für die anschließende genomische und metabolomische Analyse gesammelt werden. Die in Schritt 8 entnommenen Proben können dann verarbeitet werden, wie von Li und Tennessen47 beschrieben, beginnend mit Schritt 3.
Letztendlich würden die aus den oben beschriebenen Experimenten gewonnenen Daten sowie alle nachfolgenden Metabolomik- und Proteomik-Daten idealerweise für artübergreifende Vergleiche verwendet werden. Wie bereits erwähnt26, sind solche speziesübergreifenden Studien aussagekräftig und in der Lage, zu bestimmen, wie einzelne Chemikalien in konservierte biologische Pfade eingreifen. Daher kann das oben beschriebene Protokoll verwendet werden, um evolutionäre Gemeinsamkeiten als Reaktion auf einzelne Giftstoffe in verschiedenen Stämmen zu finden und die Chemikaliensicherheitsvorschriften zu informieren.
Disclosures
Es müssen keine Interessenkonflikte offengelegt werden.
Acknowledgments
Wir danken unseren Mitarbeitern für die Hilfe beim Testen und Optimieren dieses Protokolls: Ameya Belamkar, Marilyn Clark, Alexander Fitt, Emma Rose Gallant, Ethan Golditch, Matthew Lowe, Morgan Marsh, Kyle McClung, Andy Puga, Darcy Rose, Cameron Stockbridge und Noelle Zolman. Wir danken auch unseren Kollegen von der Precision Toxicology Group, insbesondere unseren Kollegen in der Exposure Group, für ihre Hilfe bei der Identifizierung der Ziele des Protokolls.
Dieses Projekt wurde durch das Forschungs- und Innovationsprogramm Horizon 2020 der Europäischen Union im Rahmen der Finanzhilfevereinbarung Nr. 965406 gefördert. Die in dieser Publikation vorgestellten Arbeiten wurden im Rahmen des ASPIS-Clusters durchgeführt. Diese Ausgabe spiegelt nur die Ansichten der Autoren wider, und die Europäische Union kann nicht für die Verwendung der darin enthaltenen Informationen verantwortlich gemacht werden. Diese Publikation wurde auch durch die Unterstützung des Indiana Clinical and Translational Sciences Institute ermöglicht, das zum Teil durch den Preis Nummer UL1TR002529 der National Institutes of Health, National Center for Advancing Translational Sciences, Clinical and Translational Sciences Award finanziert wird. Der Inhalt liegt in der alleinigen Verantwortung der Autoren und spiegelt nicht unbedingt die offiziellen Ansichten der National Institutes of Health wider. Teile dieses Projekts wurden durch Mittel der Indiana University unterstützt, die JRS und dem PhyloTox-Konsortium zur Verfügung gestellt wurden. JMH und EMP wurden durch die NIH-Auszeichnung P40OD018537 an das Bloomington Drosophila Stock Center unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 inch flower lever action craft punch | Bira Craft | HCP-115-024 | |
| 15 mL Centrifuge Tubes | VWR | 89039-666 | High-Performance Centrifuge Tubes with Flat or Plug Caps, Polypropylene, 15 mL |
| 2 ml Tubes | VWR | 16466-044 | Micro Centrifuge Tube with Flat Screw-Cap, conical bottom |
| 5 ml Tubes | VWR | 60818-576 | Culture Tubes, Plastic, with Dual-Position Caps |
| 50 mL Centrifuge Tubes | Corning | 430290 | 50 mL polypropylene centrifuge tubes, conical bottom with plug seal cap |
| Benchmark Dose Software version 3.2 | U.S. Environmental Protection Agency | ||
| Cardboard trays | Genesee Scientific flystuff | 32-122 | trays and dividers for narrow vials |
| CO2 gas pads | Genesee Scientific flystuff | 59-114 | FlyStuff flypad, CO2 anesthetizing apparatus |
| Combitips advanced, 50 mL | Eppendorf | 0030089693 | Combitips advanced, Biopur, 50 mL, light gray, colorless tips |
| Cotton balls | Genesee Scientific flystuff | 51-101 | Cotton balls, large, fits narrow vials |
| Delicate task wipes | Kimtech | 34155 | Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipes, 1 Ply / 8.2" x 4.39" |
| Drosophila Vial Plugs, Cellulose Acetate (aka, Flugs) | VWR | 89168-888 | Wide |
| FD&C Blue No. 1 | Spectrum Chemical | FD110 | CAS number 3844-45-9 |
| Flies | BDSC | Stock #2057 | OregonR wildtype |
| Gloves (nitrile) | Kimtech | 55082/55081/55083 | Kimtech purple nitrile exam gloves, 5.9 mil, ambidextrous 9.5" |
| Grade 1 CHR cellulose chromatography paper | Cytvia | 3001-917 | Sheet, 46 x 57 cm |
| Mesh for humidity chamber | |||
| Multipette / Repeater (X) stream | Eppendorf | 022460811 | Repeater Xstream |
| Plastic grate | Plaskolite | 18469 (from lowes) | Plaskolite 24 in x 48 in 7.85 sq ft louvered ceiling light panels, cut down to fit in rubbermaid tubs |
| Plastic trays for glass vials | Genesee Scientific flystuff | 59-207 | Narrow fly vial reload tray |
| Polypropylene Drosophila Vial | VWR | 75813-156 | Wide (28.5 mm) |
| Rubbermaid tubs | Rubbermaid | 3769017 (from Lowes) | Rubbermaid Roughneck Tote 10 gallon 18" L x 12" W x 8 1/2" H |
| Sucrose ultra pure | MP Biomedicals, Inc. | 821721 | |
| Tube racks for wide-mouthed tubes | Thermo scientific | 5970-0230 | Nalgene Unwire Test tube racks, for 30 mm tubes |
| Water Purification System | Millipore Milli-Q | ZMQ560F01 | Millipore Milli-Q Biocel Water Purifier |
| Yeast extract | Acros Organics | 451120050 | CAS number 84604-16-0 |
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