Summary
이 프로토콜은 액체 배지를 사용하여 성인 Drosophila melanogaster의 생존 가능성에 대한 화학 독성 물질의 영향을 평가하는 효율적이고 저렴한 방법을 설명합니다.
Abstract
인간 산업은 수십만 개의 화학 물질을 생성하며, 그 중 다수는 환경 안전이나 인체 건강에 미치는 영향에 대해 적절하게 연구되지 않았습니다. 이러한 화학 물질 안전 정보의 부족은 비용이 많이 들고 노동 집약적이며 시간이 많이 소요되는 포유류의 현재 테스트 방법으로 인해 악화됩니다. 최근 과학자들과 규제 당국은 더 저렴하고 신속하며 동물의 고통을 줄이는 화학 물질 안전 테스트를 위한 새로운 접근 방법론(NAM)을 개발하기 위해 노력하고 있습니다. 등장할 주요 NAM 중 하나는 인간을 포함하여 멀리 떨어진 관련 종에 걸쳐 보존된 화학적 작용 방식을 설명하기 위해 포유류 모델의 대체품으로 무척추 동물 유기체를 사용하는 것입니다. 이러한 노력을 진전시키기 위해 여기에서는 초파리인 Drosophila melanogaster를 사용하여 화학적 안전성을 평가하는 방법을 설명합니다. 이 프로토콜은 노출된 성충의 생존력과 섭식 행동을 측정하기 위한 간단하고 신속하며 저렴한 절차를 설명합니다. 또한 이 프로토콜은 게놈 및 대사체학 접근법을 위한 샘플을 생성하도록 쉽게 조정할 수 있습니다. 전반적으로, 이 프로토콜은 초파리 를 정밀 독성학에 사용하기 위한 표준 모델로 확립하는 데 중요한 진전을 나타냅니다.
Introduction
인간은 공기1, 식품2, 물3,4, 약물5, 세척제6, 퍼스널 케어 제품7, 산업용 화학물질7, 건축 자재7 등 다양한 출처의 화학물질에 지속적으로 노출되어 있다. 더욱이 매년 수천 가지의 새로운 화학물질이 유입되고 있으며8 이들 중 상당수는 보건 및 환경 안전에 대한 적절한 검증을 받지 못하고 있다. 이러한 적절한 화학 안전성 테스트의 부족은 부분적으로 생쥐 및 쥐와 같은 포유류 모델에 대한 과도한 의존에서 비롯됩니다. 이러한 설치류 모델은 유익한 정보를 제공하지만, 이러한 시스템에서의 화학적 안전성 테스트는 비용이 많이 들고 시간이 많이 소요되며, 종종 실험 동물에게 허용할 수 없는 수준의 고통을 초래한다9.
포유류 화학 물질 안전성 테스트와 관련된 재정적, 윤리적 부담과 포유류 연구의 시간 소모적 특성은 새로운 화학 물질을 둘러싼 데이터 부족에 기여하는 주요 요인입니다. 이 문제를 해결하기 위해 미국 환경보호국(EPA), 유럽화학물질청(ECHA), 캐나다 보건부(Health Canada) 및 기타 기관들은 새로운 접근 방법론(NAM)을 규제 프레임워크10에 통합하는 조치를 시행하고 있으며, 이에 따라 북미 및 유럽 정책을 동물 사용을 대체, 감소 및 개선하려는 국제적 목표(3R 원칙)에 부합하도록 하고 있습니다.11. 12,13,14. NAM은 주로 시험관 내 및 인실리코 모델을 기반으로 하는 다양한 분석을 포함하며, 이는 포유류 테스트 종에 가해지는 역경을 관찰하는 대신 화학적 독성에 대한 기계론적 이해를 제공하여 화학적 위험 평가를 위한 데이터 생성 속도를 높이는 동시에 높은 충실도의 출력을 생성합니다15. 그러나 이러한 방법은 기관 간 통신 및 내분비 신호 전달과 관련된 중요한 생물학적 과정의 중단을 포함하여 전신 독성으로부터 보호하는 것으로 아직 입증되지 않았습니다. 또한 특정 조직 내 화학 물질의 생물 축적, 개별 화합물의 흡수 및 분비 능력, 행동과 화학 물질 노출 간의 상호 작용을 설명 할 수 없습니다.
시험관 내 및 전산 모델의 한계로 인해 포유류 모델을 줄이거나 대체하기 위한 NAM의 성공적인 사용에는 초파리, 초파리 멜라노가스터와 같은 무척추동물 생체 내 모델도 포함되어야 합니다. 파리에 대한 이전 연구는이 유기체가 독성 분자 16,17,18,19,20,21,22로부터 동물 세포를 보호하는 보존 된 유전 경로를 연구하는 데 매우 적합하다는 것을 입증했습니다. 또한, 파리는 인간 질병의 65% 이상에 대한 기능적 상동체(23,24,25)와 중요한 기능적 경로의 훨씬 더 큰 보존을 포함하여 인간과 현저한 유전적 유사성을 보여줍니다 26. 이러한 특징은 상대적으로 짧은 수명주기, 낮은 유지 보수 비용 및 쉽게 관찰 가능한 행동 반응과 결합되어 Drosophila를 독성 모델로 사용하기에 매우 적합합니다27,28,29,30. 또한, 파리는 설치류 모델보다 처리량이 훨씬 높으며, 다른 비유기체 NAM으로는 쉽게 검출할 수 없는 대사, 생리학 및 호르몬 신호 전달 효과를 포착한다9.
여기에 설명된 프로토콜은 성인 초파리에 대한 화학 물질 노출의 영향을 테스트하기 위한 프레임워크를 나타냅니다. 이 방법은 효율적이고 저렴하며 재현 가능하도록 설계되었으며, 연구자가 테스트 화학 물질과 접촉해야 하는 시간을 최소화하고 대사체학 및 기타 오믹스 접근법을 위한 샘플 수집을 수용합니다. 이 프로토콜은 실험당 단일 화학 물질을 테스트하는 데 최적화되어 있지만 다양한 용매 또는 화학 물질 조합과 같은 다른 실험 파라미터를 쉽게 수용할 수 있습니다.
Protocol
알림: 이 프로토콜의 모든 단계에서 니트릴 장갑을 착용하십시오. 평가된 각 화학 물질에 대한 안전 데이터 시트에 따라 실험실 코트, 보안경 및/또는 호흡기를 착용하십시오.
1. 바이알 및 습도 챔버 준비
알림: 1.1-1.5단계는 다른 실험 섹션을 시작하기 전에 언제든지 완료할 수 있습니다. 니트릴 장갑은 오염을 방지하기 위해 바이알을 준비하는 동안 항상 착용해야 합니다.
- 1등급 셀룰로오스 크로마토그래피 용지 4장( 재료 표 참조)을 쌓고 넓은 스트립으로 2개로 자릅니다. 꽃 모양의 다이가 들어 있는 1.5인치 종이 펀치를 사용하여 꽃 모양의 여과지 인서트를 펀칭합니다.
- 22mm x 220mm 광택이 나지 않은 목재 다웰을 사용하여 여과지를 직경 28.5mm 폴리프로필렌 바이알의 바닥으로 밀어 넣습니다. 여과지 더미가 바이알 바닥에 단단히 고정되어 있는지 확인합니다.
- 준비된 바이알을 플라스틱 또는 판지 트레이에 보관하고 사용할 때까지 트레이를 큰(~280mm x 240mm) 비닐 봉지에 넣습니다.
- 120mm x 280mm x 606.24mm 플라스틱 통의 플라스틱 뚜껑에 225.42mm x 403.22mm 구멍을 절단하여 습도 챔버를 구성합니다( 재료 표 참조). 공기 흐름을 허용하기 위해 구멍 위에 메쉬를 붙입니다.
- 루버 천장 조명 패널(원래 610mm x 1220mm)에서 플라스틱 그리드 부분을 잘라내어 1.4단계에서 사용한 플라스틱 욕조 바닥에 맞춥니다.
알림: 다양한 플라스틱 욕조와 플라스틱/금속 격자 재료를 사용하여 습도 챔버를 만들 수 있습니다.
2. 축산
- 표준 블루밍턴 초파리 스톡 센터(BDSC) 배지(31)를 함유하는 유리 우유병에서 성체 파리(최소 30마리의 성인)의 배양을 시작한다. 섬세한 작업 물티슈에 싸인 레이온 플러그로 병을 닫으십시오. 병을 붐비지 마십시오.
알림: 필요한 병의 수는 수행되는 화학 물질 노출 횟수와 테스트 균주의 유전자형에 따라 다릅니다. 일반적으로 견고하고 번식력이 풍부한 주식을 사용할 때 한 병에서 수백 마리의 파리를 얻을 수 있습니다. 표준 분석은 Oregon-R 야생형 파리(BDSC 스톡 #2057)를 사용하지만 관심 있는 모든 유전자형을 이 프로토콜과 함께 사용할 수 있습니다. 낮은 생산력 및/또는 생존력을 가진 손상된 유전자형은 증가된 병 배양을 필요로 한다는 것을 기억하십시오. - 배양 병의 트레이를 약 60% 습도와 12:12 시간의 빛:어둠 주기로 25°C에서 세 번째 유충 인스타 또는 초기 번데기 단계가 관찰될 때까지 배양합니다. 이 단계는 병의 측면을 방황하는 유충의 존재와 병 벽에 번데기의 출현으로 식별 할 수 있습니다.
알림: 12:12 시간 밝음:어둠 주기의 불이 켜진 기간 동안에만 파리를 처리하십시오. 견고한 재고의 경우, 병은 설명 된 조건 하에서 3-4 일 후에이 단계에 도달합니다.- 성인 파리를 제거하고 미디어의 유동성을 결정하십시오. 거꾸로 되었을 때 매체가 병의 측면을 따라 흐르면 매체가 너무 액체입니다. 섬세한 작업 물티슈 또는 레이온 볼을 병 바닥에 삽입하여 플라이 푸드를 굳히십시오.
- 파리가 닫히기 시작하면 병에서 모든 성인을 제거하고 번데기가 48 시간 동안 계속 닫히도록하십시오. 이 시점에서 배양 병에서 제거 된 성인은 새 병으로 옮겨 주식을 전파하거나 (2.1 단계 참조) 폐기 할 수 있습니다.
- 48 시간 동안 닫히는 파리를 표준 BDSC 배지가 들어있는 새 병으로 옮깁니다. 3 일 동안 숙성.
알림: 이 병에 담긴 성충은 생후 3-5일이며 치사율 및 수유 실험에 사용할 수 있습니다. 성충을 숙성시키는 데 사용되는 병에는 알과 유충이 들어 있습니다. 결과적으로 이 병은 차세대 파리를 번식시키는 데 사용할 수 있습니다.
3. 화학 물질 노출을위한 파리의 준비
- 5-7 일 된 파리를 CO2로 마취하십시오. 마취 된 파리를 생식기를 사용하여 성별로 분류하십시오. 파리를 마취 및 섹스하는 데 도움이 필요하면 참고 문헌28을 참조하십시오.
- 수컷 파리 20마리 또는 암컷 파리 20마리로 구성된 그룹을 표준 BDSC 배지가 들어 있는 바이알에 넣습니다. 레이온 플러그로 바이알을 닫고 암수 바이알을 별도로 보관하십시오. 암컷 파리가 들어있는 약병에 줄무늬를 표시하십시오. 실수로 성별이 섞이는 것을 방지하기 위해 수컷 파리가 있는 유리병에 표시를 하지 않은 상태로 두십시오.
참고: 3.2단계에서 준비해야 하는 바이알의 수는 노출 실험의 크기에 따라 결정됩니다. 5.3 단계와 5.6 단계에서 설명한 바와 같이, 단일 테스트 화학 물질에 대한 일반적인 범위 찾기 실험에는 최소 40 바이알의 수컷과 40 개의 암컷 바이알이 필요합니다. 7.4 단계와 7.8 단계에서 설명한 표준 용량-반응 곡선 실험에는 최소 63 개의 남성 바이알과 63 개의 여성 바이알이 필요합니다. - 바이알을 약 60% 습도에서 25°C의 인큐베이터에서 12:12 시간 동안 밝음:어둠 주기로 48시간 동안 보관합니다. 이 시간 동안 마취에서 회복하는 동안 파리가 음식에 끼는 것을 방지하기 위해 분류된 바이알의 트레이를 60° 각도로 받치십시오.
알림: 이 단계를 통해 파리는 CO2 마취에서 회복할 수 있습니다. 노출 프로토콜의 나머지 기간 동안 파리를 다시 마취하지 마십시오. - 48시간의 회수 기간 후, 1.3단계에서 제조된 바이알에 멸균 정제수 0.75mL를 넣는다. 이 단계에서 준비된 바이알의 수는 3.2단계에서 설정한 바이알의 수와 동일해야 합니다.
- 3.2 단계의 파리가 들어있는 유리 바이알을 열고 준비된 플라스틱 바이알의 입에 넣은 다음 플라스틱 바이알의 바닥을 벤치 탑에 두드려 분류되고 성별이 일치하는 파리를 기아 바이알로 옮깁니다. 아세트산 셀룰로오스 플러그(일반적으로 플루그로 알려짐)로 플라스틱 바이알을 닫습니다.
- 이 전송에서 손실된 파리를 기록하십시오(나중에 각 바이알에 대한 시작 파리 수 기록으로 전송).
- 줄무늬가있는 암컷 파리가 들어있는 기아 병을 표시하십시오. 실수로 성별이 섞이는 것을 방지하기 위해 수컷 파리가 있는 유리병에 표시를 하지 않은 상태로 두십시오.
- 밤새 노출되도록 습도 챔버를 준비하십시오. 이 챔버를 만드는 방법에 대한 설명은 1.4-1.5단계를 참조하십시오.
- 습도 챔버 바닥에 6개의 표준 종이 타월을 놓습니다. 종이 타월에 물 100mL를 담그십시오.
- 바이알이 포화된 종이 타월과 접촉하지 않도록 젖은 수건 위에 플라스틱 격자(1.5단계)를 놓습니다.
- 기아 바이알 트레이를 습도 챔버 내의 수평 위치에 놓습니다. 습도 챔버를 25°C 인큐베이터(약 60% 습도)에 밤새 놓습니다.
알림: 이상적으로는 하룻밤 기아 기간이 약 16시간 지속됩니다. 그러나 타이밍은 개별 실험실 일정에 맞게 조정할 수 있습니다.
4. 원액 준비
알림: 파리는 효모-자당 액체 배지에 테스트 화학 물질을 공급합니다. 이 섹션에서는 농축 공급 매체 및 테스트 화학 물질의 저장 용액을 준비하는 방법에 대해 설명합니다.
- 멸균 정제수에 용해된 4% 자당과 16% 효모 추출물(m/v)을 포함하는 6x 효모-자당 용액( 재료 표 참조)을 준비합니다. 적절한 멸균 시간(예: 1L의 경우 40분) 동안 액체 사이클에서 용액을 오토클레이브합니다.
참고: 용액은 대량으로 만들 수 있으며 -20°C에서 분취량으로 보관할 수 있습니다. 개별 분취량을 사용 1일 전에 4°C 냉장고에 넣어 해동합니다. - 테스트 화학 물질의 재고를 준비합니다. 초기 실험의 경우 화학 물질이 물에 완전히 용해될 수 있도록 원액을 최고 농도로 만들어야 합니다.
알림: 물 이외의 용매를 사용하여 테스트 화학 물질을 용해할 수 있습니다. 대체 용매 사용에 대한 주의 사항에 대한 논의를 참조하십시오. - FD&C Blue No. 1 1 g( 재료 표 참조) 1g을 멸균 정제수 10mL에 용해시켜 100x 청색 염료 원액을 준비합니다.
참고: 청색 염료 원액은 대량으로 만들어 4°C에서 분취량으로 보관할 수 있습니다.
5. 노광바이알의 준비: 거리탐지 실험
알림: 프로토콜의 5단계와 6단계는 100% 치사율을 유도하는 가장 낮은 용량의 테스트 화학 물질과 치명적인 표현형을 유도하지 못하는 가장 높은 용량을 식별하도록 설계되었습니다. 이들 농도가 이전 실험에 의해 이미 결정된 경우, 용량-반응 곡선을 계산하기 위한 단계 7 및 8을 참조한다. 노출 바이알에 파리를 추가하기 직전에 노출 매체를 준비해야 합니다.
- 8개의 15mL 원심분리기 튜브에 (i) 화학 물질 없음, (ii) 최고 농도, (iii) 1:2, 1:10, 1:20, 1:100, 1:200 및 1:1,000으로 레이블을 지정합니다.
- 먼저 8개의 라벨이 붙은 튜브 모두에 5.1mL의 4x 효모/자당 원액을 추가하여 5.1단계의 라벨이 붙은 원심분리기 튜브에 노출 매체를 준비합니다.
- 멸균 정제수 7.5mL를 "화학 물질 없음"이라고 표시된 튜브에 추가합니다. 이 희석은 음성 대조군입니다.
- 7.4mL의 테스트 화학 약품 저장 용액을 "최고 농도"라고 표시된 튜브에 추가합니다. 이 튜브에 멸균 정제수 100μL를 추가하면 최종 부피가 10mL가 됩니다. 이 용액에서 테스트 화학 물질의 몰 농도를 계산하고 기록합니다.
알림: 튜브에 멸균 정제수 100μL를 추가하면 이 단계의 화학 물질 농도가 5.5단계에서 사용된 것과 동일하며, 여기서 공급 거동을 평가하기 위한 방법으로 파란색 염료 원액을 노출 매체에 추가합니다. - 나머지 튜브에 적절한 양의 테스트 화학 원액과 멸균 정제수를 추가합니다. 각 튜브의 최종 부피는 10mL여야 합니다. "최고 농도" 튜브와 관련된 이 튜브의 테스트 화학 물질의 최종 농도는 1:2, 1:10, 1:20, 1:100, 1:200 및 1:1,000이어야 합니다.
- 5.1단계에서 생성된 노출 매체의 각 개별 농도에 대해 8개의 노출 바이알을 준비하고 라벨을 붙입니다. 화학 물질 없음, 최고 농도, 1:2, 1:10, 1:20, 1:100, 1:200 및 1:1,000 라벨이 포함된 8세트의 바이알(총 64개 바이알)이 있어야 합니다.
- 5.2.3단계에서 제조된 0.75mL의 노출 배지를 해당 노출 바이알 세트에 피펫팅합니다.
- 8개의 5mL 개별 튜브에 (i) 화학 물질 없음, (ii) 최고 농도, (iii) 1:2, 1:10, 1:20, 1:100, 1:200 및 1:1,000으로 레이블을 지정합니다.
- 먼저 500 μL의 4x 효모/자당 원액과 20 μL의 청색 염료 원액을 8개의 표지된 5 mL 튜브에 혼합하여 청색 염료 노출 배지를 준비합니다.
- 멸균 정제수 1.48mL를 "화학 물질 없음"이라고 표시된 튜브에 추가합니다. 이 희석은 음성 대조군입니다.
- 1.48mL의 테스트 화학 약품 저장 용액을 "최고 농도"라고 표시된 튜브에 추가합니다. 이 튜브에는 물이 첨가되지 않습니다. 이 용액에서 테스트 화학 물질의 몰 농도를 계산하고 기록합니다.
- 나머지 튜브에 적절한 양의 테스트 화학 원액과 멸균 정제수를 추가합니다. 각 튜브의 최종 부피는 2ml이어야합니다. "최고 농도" 튜브와 관련된 이 튜브의 테스트 화학 물질의 최종 농도는 1:2, 1:10, 1:20, 1:100, 1:200 및 1:1,000이어야 합니다.
- 청색 노출 매체의 각 개별 농도로 두 개의 노출 바이알을 준비하고 라벨을 붙입니다. 8개의 바이알 세트(총 16개 바이알)에는 화학 물질 없음, 최고 농도, 1:2, 1:10, 1:20, 1:100, 1:200 및 1:1,000 라벨이 포함되어야 합니다. 이 바이알에는 "파란색"이라는 단어도 적어야 합니다.
- 0.75mL의 청색 노출 배지를 해당 청색 노출 바이알 세트에 피펫팅합니다.
6. 비행 화학 물질 노출: 거리 찾기 실험
- 다음과 같이 3.7단계에서 하룻밤 굶주린 파리의 바이알을 사용하여 화학 물질 노출 바이알을 준비합니다.
- 굶주린 암컷 파리 4 개 바이알 (바이알 당 파리 20 개)을 각 화학 물질 농도의 노출 바이알 4 개에 옮깁니다. 이 바이알에 "여성"이라는 라벨을 붙입니다. 3.5단계에서 설명한 것과 동일한 전송 방법을 사용합니다.
- 굶주린 수컷 파리 4 개 바이알 (바이알 당 파리 20 개)을 각 화학 물질 농도의 노출 바이알 4 개에 옮깁니다. 이 바이알에 "남성"이라는 라벨을 붙입니다. 3.5단계에서 설명한 것과 동일한 전송 방법을 사용합니다.
- 다음과 같이 3.7 단계에서 밤새 굶어 죽은 파리의 바이알을 사용하여 파란색 염료가 들어있는 화학 물질 노출 바이알을 준비합니다.
- 굶주린 암컷 파리 한 바이알(바이알당 파리 20마리)을 각 화학 물질 농도에 대해 하나의 파란색 노출 바이알에 옮깁니다. 이 바이알에 "여성"이라는 라벨을 붙입니다. 3.5단계에서 설명한 것과 동일한 전송 방법을 사용합니다.
- 굶주린 수컷 파리 한 바이알(바이알당 파리 20마리)을 각 화학 물질 농도에 대해 하나의 파란색 노출 바이알에 옮깁니다. 이 바이알에 "남성"이라는 라벨을 붙입니다. 3.5단계에서 설명한 것과 동일한 전송 방법을 사용합니다.
- 이송 후 각 바이알에 존재하는 파리의 수를 기록하고 죽거나 탈출한 파리의 수를 기록하십시오. 일반적으로 20 마리의 파리는 모두 하룻밤 사이에 굶주림과 이동에서 살아남아야합니다.
- 새로 준비된 습도 챔버에 노출 바이알을 수평으로 놓습니다(습도 챔버 준비는 3.6단계 참조). 챔버를 약 60%의 습도와 12:12시간의 밝음:어둠 주기로 25°C 인큐베이터에 놓습니다.
- 화학 물질 노출 시작 후 24시간 및 48시간에 노출 바이알을 검사합니다. 각 시점에서 각 바이알에 죽은 파리의 수를 세고 기록합니다.
참고: 사망은 이 분석의 판독값으로 사용되지만 프로토콜은 다른 표현형을 검사하도록 조정할 수 있습니다. 노출된 파리는 일반적으로 전사체 및 대사체 연구를 위해 이러한 시점에서 수집됩니다. - 화학 물질 노출 시작 후 24시간에 파란색 노출 바이알을 검사합니다. 다음 기법을 사용하여 노출된 파리가 파란색 노출 매체를 소비했는지 확인합니다.
- 바이알 벽에서 파란색 대변의 징후가 있는지 검사하며, 이는 노출 바이알의 측면과 플루그에 작은 점으로 나타납니다.
- 파리를 CO2 로 마취시키고 복부에 청색 염료가 있는지 검사하십시오.
참고: 일반적으로 파란색 노출 바이알은 24시간 후에 분석됩니다. 그러나 이 단계는 대신 48시간에 수행할 수 있습니다. 정상적으로 먹은 파리는 복부에 파란색 줄무늬가 있어 노출 매체가 장에 들어갔음을 나타냅니다. - 역류, 작물 팽창 및 장 장벽 기능의 파괴와 같은 비정상적인 섭식 행동에 대해 파리를 검사합니다(일반적으로 스머핑이라고 함, 위장관에만 국한되지 않고 유기체 전체에 파란색 염료가 나타나는 것으로 나타남32,33).
- 오염된 모든 바이알, 여과지, 플루그 및 파리를 적절한 화학 폐기물 용기에 버리십시오. 살아있는 파리가 바이알에 남아 있으면 적절한 폐기물 용기에 버리기 전에 바이알을 얼려 파리를 죽입니다.
알림: 노출 바이알과 파리의 폐기는 실험에서 분석되는 화학 물질에 따라 결정됩니다. 항상 화학 안전 데이터 시트에 설명된 화학 안전 절차를 따르십시오. 범위 찾기 실험에 사용된 농도가 가장 낮은 용량으로 파리를 죽이는 경우 동물의 6%를 죽인 가장 낮은 농도부터 시작하여 희석 시리즈를 사용하여 섹션 100을 반복합니다.
7. 노출 바이알의 준비: 용량-반응 곡선 생성
참고: 5단계와 6단계에 요약된 프로토콜은 표현형을 유도하는 데 필요한 화학 물질 농도를 광범위하게 결정하도록 설계되었습니다. 프로토콜의 단계 7 및 8은 정확한 용량-반응 곡선을 계산하는 데 사용됩니다.
- 다음 방법을 사용하여 용량-반응 곡선을 생성하기 위해 분석해야 하는 테스트 화학 물질 농도를 계산합니다.
- 48 시간에 노출 된 파리의 100 %를 죽이는 테스트 화학 물질의 최저 농도를 결정합니다.
- 48시간에서 생존력에 영향을 미치지 않는 최고 농도의 테스트 화학 물질을 결정합니다.
- 단계 7.1.1 및 7.1.2에서 결정된 농도 사이에 균등하게 분포된 추가 4개의 농도를 계산하십시오.
- (i) 화학 물질 없음, (ii) 7.1.1 단계에서 결정된 농도, (iii) 7.1.2 단계에서 결정된 농도, (iv) 7.1.3에서 결정된 농도, (v) 7.1.1 단계에서 결정된 농도의 두 배, (vi) 7.1.2 단계에서 결정된 농도의 1:2 희석.
참고: 7.1.1에서 결정된 농도의 두 배인 농도와 7.1.2단계에서 결정된 농도의 1:2 희석을 포함하는 것은 용량-반응 곡선을 정확하게 계산하는 데 중요합니다. - 먼저 2.5단계에서 준비된 9개의 표지된 개별 15mL 원심분리기 튜브에 4x 효모/자당 원액 7.2mL를 추가하여 노출 배지를 준비합니다.
- 멸균 정제수 7.5mL를 "화학 물질 없음"이라고 표시된 튜브에 추가합니다. 이 희석은 음성 대조군입니다.
- 나머지 튜브에 적절한 양의 테스트 화학 원액과 멸균 정제수를 추가합니다. 각 튜브의 최종 부피는 10mL여야 합니다. 개별 튜브 내의 화학 물질의 최종 농도는 튜브 외부에 기록된 농도와 같아야 합니다.
- 12단계에서 생성된 노출 매체의 각 농도에 대해 7.2개의 노출 바이알을 준비하고 라벨을 붙입니다. 9 세트의 바이알 (총 108 개의 바이알)이 있어야합니다.
- 0.75mL의 노출 배지를 해당 노출 바이알 세트에 피펫팅합니다.
참고: 7.6-7.8단계는 선택 사항입니다. 7.2단계에서 준비한 테스트 화학 물질 농도가 섭식 거동에 영향을 미치지 않는 것으로 알려진 경우 이 단계를 건너뛸 수 있습니다. - 7.2단계에서 사용된 것과 동일한 일련의 농도로 청색 노출 매체에 대해 9개의 서로 다른 5mL 튜브를 준비하고 라벨을 붙입니다.
- 먼저 500μL의 4x 효모/자당 원액과 20μL의 청색 염료 원액을 혼합하여 청색 염료 노출 배지를 준비합니다.
- 정제된 멸균수 1.48mL를 "화학 물질 없음"이라고 표시된 튜브에 추가합니다. 이 희석은 음성 대조군입니다.
- 나머지 튜브에 적절한 양의 테스트 화학 약품 원액과 정제된 멸균수를 추가합니다. 각 튜브의 최종 부피는 2mL여야 합니다. 개별 튜브 내의 화학 물질의 최종 농도는 튜브 외부에 기록된 농도와 같아야 합니다.
- 청색 노출 매체의 각 개별 농도에 대해 두 개의 노출 바이알을 준비하고 라벨을 붙입니다. 9 개의 바이알 세트 (총 18 개의 바이알)가 있어야하며, 각 바이알 세트에는 7.2 단계에 나열된 농도로 표시되어 있어야합니다. 이 바이알에는 "파란색"이라는 단어도 적어야 합니다.
- 0.75mL의 청색 노출 배지를 해당 청색 노출 바이알 세트에 피펫팅합니다.
8. 플라이 화학 물질 노출: 용량-반응 곡선 생성
- 다음과 같이 3.7단계에서 하룻밤 굶주린 파리의 바이알을 사용하여 화학 물질 노출 바이알을 준비합니다.
- 굶주린 암컷 파리 6 개 바이알 (바이알 당 파리 20 개)을 각 화학 물질 농도의 노출 바이알 6 개에 옮깁니다. 이 바이알에 "여성"이라는 라벨을 붙입니다. 3.5단계에서 설명한 것과 동일한 전송 방법을 사용합니다.
- 굶주린 수컷 파리 6개 바이알(바이알당 파리 20마리)을 각 화학 농도의 노출 바이알 6개에 옮깁니다. 이 바이알에 "남성"이라는 라벨을 붙입니다. 3.5단계에서 설명한 것과 동일한 전송 방법을 사용합니다.
- 다음과 같이 3.7 단계에서 밤새 굶어 죽은 파리의 바이알을 사용하여 파란색 염료가 들어있는 화학 물질 노출 바이알을 준비합니다.
- 굶주린 암컷 파리 한 바이알(바이알당 파리 20마리)을 각 화학 물질 농도에 대해 하나의 파란색 노출 바이알에 옮깁니다. 이 바이알에 "여성"이라는 라벨을 붙입니다. 3.5단계에서 설명한 것과 동일한 전송 방법을 사용합니다.
- 굶주린 수컷 파리 한 바이알(바이알당 파리 20마리)을 각 화학 물질 농도에 대해 하나의 파란색 노출 바이알에 옮깁니다. 이 바이알에 "남성"이라는 라벨을 붙입니다. 3.5단계에서 설명한 것과 동일한 전송 방법을 사용합니다.
- 이송 후 각 바이알에 존재하는 파리의 수를 기록하십시오. 일반적으로 20마리의 파리는 모두 하룻밤 사이에 굶주림과 이송에서 살아남아야 하지만, 이송 중에 죽거나 탈출한 파리는 총계에서 빼야 합니다.
- 새로 준비된 습도 챔버에 노출 바이알을 수평으로 놓습니다(습도 챔버 준비는 3.6단계 참조). 챔버를 약 60%의 습도와 12:12시간의 밝음:어둠 주기로 25°C 인큐베이터에 놓습니다.
- 화학 물질 노출 시작 후 24시간 및 48시간에 노출 바이알을 검사합니다. 각 시점에서 각 바이알에 죽은 파리의 수를 세고 기록합니다.
- 화학 물질 노출 시작 후 24시간에 파란색 노출 바이알을 검사합니다. 6.6 단계에 설명 된 방법을 사용하여 섭식 행동의 변화를 평가하십시오.
- 오염된 모든 바이알, 여과지, 플루그 및 파리를 적절한 화학 폐기물 용기에 버리십시오. 살아있는 파리가 바이알에 남아 있으면 적절한 폐기물 용기에 버리기 전에 바이알을 얼려 파리를 죽입니다.
알림: 노출 바이알과 파리의 폐기는 실험에서 분석되는 화학 물질에 따라 결정됩니다. 항상 화학 안전 데이터 시트에 설명된 화학 안전 절차를 따르십시오.
9. 용량-반응 곡선 계산
- Benchmark Dose Software(BMDS, 버전 3.2; 재료 표 참조) 또는 다른 유사한 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석한다(34). 다음은 BMDS 소프트웨어를 사용하는 워크플로우에 대한 설명입니다.
- BMDS의 데이터 탭을 클릭하고 새 데이터 세트 삽입을 클릭합니다. 데이터 세트의 샘플 수를 입력하고 dichotomous를 클릭한 다음 데이터 세트 만들기를 클릭합니다. 각 복제를 데이터 세트의 개별 행으로 입력합니다.
- 생성된 표의 첫 번째 열에 선량을 입력하고, 두 번째 열에 8.3) 단계 이전에 사망했거나 손실된 파리를 제외한 파리의 시작 수를 입력하고, 세 번째 열에 화학 물질 노출로 사망한 파리의 수를 입력합니다.
- BMDS의 기본 탭을 클릭합니다.
- Select Model Type 메뉴의 드롭다운 화살표 를 클릭하고 Dichotomous를 클릭합니다.
- 데이터 세트 테이블에서 9.2단계의 데이터 세트에 대해 사용을 클릭합니다.
- MLE 및 대안 테이블에서 분석할 원하는 모델의 상자를 클릭합니다.
참고: Frequentist Restricted Dichotomous Hill 모델이 주로 사용되었습니다. - 분석 실행을 클릭합니다. 프로그램은 치사율 곡선과 모델에 대한 추가 세부 정보가 포함된 출력 파일을 생성합니다.
Representative Results
파리는 오랫동안 나트륨 비소 (NaAsO2) 독성을 결정하는 연구에서 모델로 사용되었습니다35,36,37,38. 프로토콜의 효능을 입증하기 위해 수컷과 암컷 파리를 NaAsO2에 노출시켰고, 이러한 결과를 이전 연구와 비교하기 위한 목적으로 했습니다. 위에서 설명한 방법론을 사용하여 성인 Oregon-R(BDSC 스톡 #2057) 수컷과 암컷을 다양한 NaAsO 2 농도(0, 0.01, 0.02, 0.1,0.2, 1 및 2mM)에 노출시키고 노출 시작 후 48시간 후에 치사율에 대해 점수를 매겼습니다(그림 1A, B).
이 초기 분석의 목적은 NaAsO2 독성을보다 정확하게 특성화 할 수있는 대략적인 농도 범위를 확인하는 것이 었습니다. 후속 실험에서 NaAsO 2 용량-반응 곡선을 보다 정확하게 정의한 농도(0, 0.2, 0.5, 1, 1.5, 2,2.5, 3, 3.5 및 5mM)를 선택했습니다(그림 1C,D). 결과 분석에서는 100% 치사율을 유발하는 여러 농도를 조사했습니다. 데이터는 미국 환경보호국(EPA)의 공개된 벤치마크 도즈 소프트웨어 버전 3.2.0.125를 사용하여 분석되었다. 데이터는 "이분법적"으로 모델링되었고 이분법 언덕 모델은 후속 분석에 사용되었습니다. 이 모델에 기초하여,NaAsO2를 먹인 수컷 파리의 최종LD10,LD25 및LD50은 각각 0.30 mM, 0.50 mM, 및 0.65 mM이었다. 암컷 파리의 경우, 이 값은 0.30mM의 LD10, 0.65mM의 LD25 및 0.90mM의 LD50으로 약간 더 높았다. 전반적으로, 이 방법을 사용하여 얻은 값은 Drosophila melanogaster35,36,37,38의 비소 독성에 대해 이전에 보고된 값과 유사하여 방법론을 검증합니다.
용량-반응 곡선을 계산하는 데 사용 된 6 회 반복 이외에, 수컷과 암컷 파리는 광학 현미경을 사용하여 소화관에서 쉽게 볼 수있는 1 % FD & C 청색을 함유 한 NaAsO2 노출 용액을 먹였습니다. NaAsO 2 먹이를 먹인 파리의 장 내 청색 염료의 존재에 기초하여, 수컷과 암컷 파리는 액체 배지 내에 존재하는 NaAsO 2 농도에 관계없이 화학 물질 노출이 시작된 후 24 시간 동안 계속 먹이를 먹었습니다 (그림 2). 그러나 섭취한 음식은 여성의 경우 0.2mM, 남성의 경우 0.5mM 이상의 용량에서 때때로 역류하는 것으로 관찰되었습니다(그림 2). 이러한 발견은 역류가 비소 중독에 대한 초파리 반응에 핵심적인 역할을 할 수 있음을 시사합니다.
그림 1: 48시간 동안 NaAsO2로 처리된 수컷 및 암컷 초파리에 대한 용량-반응 곡선. 모든 그래프는 이분법 언덕 모델에 기초하여 시험된 각각의 NaAsO2 농도에서 죽은 파리의 추정된 비율을 보여준다. (ᄀ,ᄂ) 광범위한 NaAsO2 농도를 시험하여 파리의 각 성별이 죽기 시작하는 선량을 근사화하였다. (A)는 남성 데이터를, (B)는 여성 데이터를 나타냅니다. N = 4 바이알, 바이알 당 20 파리. (씨, 디) 더 좁은 범위의 NaAsO2 농도를 시험하여 파리의 각 성별의 10%, 25% 및 50%가 사망한 정확한 투여량을 결정하였다. 이 복용량은 각 그래프의 오른쪽에 표시됩니다. (C)는 남성 데이터를, (D)는 여성 데이터를 나타냅니다. N = 6 바이알, 바이알 당 20 파리. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 24시간 동안 NaAsO2로 처리된 수컷 및 암컷 초파리의 청색 염료 분석의 대표적인 결과. 현미경 사진은 NaAsO2 의 농도가 증가하는 파리를 보여줍니다. 행 (A)는 수컷 파리를 나타내고 행 (B)은 암컷 파리를 나타내며 NaAsO2 의 농도는 왼쪽에서 오른쪽으로 증가합니다. 복부는 낮은 농도에서 흉부 근처에 소량의 파란색을 보여 노출 매체가 장에 들어갔음을 나타냅니다. 더 높은 농도에서는 청색 염료가 입 주위에 축적되기 시작하여 노출 매체가 역류하고 있음을 시사합니다. 스케일 바는 1mm입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
초파리 Drosophila melanogaster는 NAM16,18,19,21의 강력한 시스템으로 부상하고 있습니다. 유전체학 및 대사체학의 최근 발전과 결합된 파리 군집이 이용할 수 있는 비할 데 없는 유전 자원을 활용함으로써 초파리를 사용한 화학적 안전성 연구는 개별 화합물이 대사, 생리학 및 세포 신호 전달을 방해하는 분자 메커니즘을 신속하게 식별할 수 있습니다(예:39). 이 저렴한 프로토콜은 용량-반응 곡선을 신속하게 정의하고 이후에 RNA-seq 및 대사체학 분석을 위한 샘플을 생성하도록 설계되었습니다. 또한, 이 유연한 프로토콜은 모든 유전자형에 사용할 수 있으며 다양한 종류의 화학 물질을 수용할 수 있습니다.
이 프로토콜의 주목할만한 측면은 화학 물질 노출에 사용되는 액체 식품의 선택이며, 이는 이전 연구를 기반으로 하지만 Drosophila18,22에 대한 대부분의 독성학적 연구에서 사용되는 고체 배지와 다릅니다. 이 특정 액체 배지는 파리가 일관된 영양을 받을 수 있도록 하기 위해 파리도 이 프로토콜에서 먹이는 표준 고체 BDSC 배지의 영양 성분을 반영하도록 선택되었습니다. 액체 공급 매체의 단순성에는 많은 장점이 있습니다. 액체 매체는 용융 및 재응고 또는 분말로 재구성해야 하는 고체 식품보다 취급이 더 쉽습니다. 액체 매체는 또한 시스템의 처리량을 증가시키고, 공급 매체 전체에 균일한 화학 물질 분배를 보장하며, 유해 화합물 작업에 소요되는 시간을 줄입니다. 또한 매체는 용액을 가열할 필요가 없어 휘발성 테스트 화합물의 테스트를 용이하게 합니다. 마지막으로, 식품 용액에 포함된 성분이 상대적으로 적기 때문에 시험 화학 물질과 다른 식이 성분 사이에 바람직하지 않은 부반응이 최소화됩니다. 식품에 사용되는 효모도 비활성이어서 공급 매체의 반응성을 더욱 제한합니다. 그러나 이 방법은 발달 또는 유충 독성을 테스트하는 데 적합하지 않습니다.
프로토콜에 사용되는 재료 중 일부는 폴리프로필렌 대신 유리 플라이 바이알을 사용하는 것과 같이 대체될 수 있습니다. 그러나 사용된 재료는 유리 제품 세척으로 인해 발생할 수 있는 시약과 화학 물질 노출 사이의 원치 않는 화학 반응을 피하기 위해 불활성 및 일회용으로 선택되었습니다.
액체 식품을 사용하려면 음식 배달 차량이 필요합니다. 셀룰로오스 아세테이트 여과지는 유연성 및 불활성 성질 때문에 이러한 목적을 위해 선택되었다28. 다른 연구자들은 유사한 프로토콜을 사용했지만 섬세한 작업 물티슈 또는 유리 섬유 필터29,30과 같은 다른 차량과 함께 사용했습니다. 셀룰로오스 아세테이트 여과지는 종이와 바이알 벽 사이에 큰 간격 없이 플라이 바이알의 바닥에 맞도록 이상적인 모양으로 절단할 수 있는 불활성 비히클이기 때문에 이러한 요구에 적합하여 파리가 매체 또는 차량 자체에 끼어 사망하는 것을 방지합니다.
이 시스템의 중요한 한계는 화학 물질의 최대 테스트 가능한 농도가 화학 물질의 용해도와 관련이 있다는 것입니다. 비수용성 화합물은 추가 용매를 필요로 하며, 이는 관심 화학 물질과 추가 또는 시너지 효과를 유발할 수 있습니다. 이것은 또한 모든 유기체에서 원하는 종말점을 달성하기에 충분히 농축된 스톡 용액을 제조하는 것이 불가능한 상황을 생성할 수 있고, 따라서 결과 데이터(31)의 분석을 제한할 수 있다. 이를 해결하기 위해 수용성이 낮은 화학 물질은 식품 용액에 최대 0.5 %의 디메틸 설폭 사이드를 첨가하여 테스트 할 수 있습니다. 다른 용매도 사용할 수 있지만 유기체에 대한 용매 영향을 최소화하면서 용해도를 최대화하기 위해 용액 내 최대 허용 용매 농도를 결정하기 위해 관심 있는 각 용매에 대한 추가 연구가 필요합니다.
초파리(Drosophila)의 후각 반응에 대한 광범위한 특성화는 파리가 독성 화합물40,41을 섭취하는 것을 피하여 처리된 배지의 먹이를 줄이는 방법을 설명했습니다. 청색 염료 분석은 연구자들이 실험 화학 물질42,43,44의 각 농도를 먹인 파리의 섭식 행동을 효율적으로 스크리닝할 수 있도록 함으로써 이러한 현상을 해결합니다. 파리의 위장관에 파란색이 있는지 여부는 파리가 독성 물질 함유 배지를 먹었는지 여부를 나타냅니다. 플라이 리퀴드-푸드 상호작용 계수기(Fly Liquid-Food Interaction Counter45)와 같이 플라이 섭식 거동을 평가하는 보다 정교한 방법이 존재하지만, 이 정성적 방법은 고처리량 스크리닝에 더 적합합니다.
이 프로토콜의 주목할만한 측면은 파리를 옮기거나 노출 바이알에 추가 액체를 추가할 필요 없이 48시간 노출 기간 동안 최적화되었다는 것입니다. 습도 챔버를 사용하고 챔버를 높은 습도로 유지된 인큐베이터에 배치하면 이 기간 동안 공급 매체가 포함된 여과지가 건조되는 것을 방지할 수 있습니다. 이 프로토콜은 더 긴 노출 기간 동안 조정할 수 있지만 여과지가 건조해지지 않고 건조로 인해 용액 농도 또는 치사율에 상당한 변화를 일으키지 않도록 방법을 조정해야 합니다.
마지막으로, 이 프로토콜의 중요한 특징은 유전적 변이를 쉽게 수용할 수 있다는 것인데, 이를 통해 연구자들은 초파리 를 위한 방대한 유전 도구를 활용하여 야생형 유기체에 대한 이러한 예비 연구를 확장하여 생체 내 화학 작용 메커니즘을 더 잘 이해할 수 있습니다. 이와 관련하여, 위에서 설명한 프로토콜은 야생에서 잡은 파리의 독성학적 분석을 가능하게 하는 Peterson and Long에 의해 이전에 기술된 JoVE 프로토콜을 보완하기 위해 쉽게 수정될 수 있다18.
초파리 32,33,34,35,36에서 나트륨 비소의 독성에 대한 다양한 이전 연구로 인해 Oregon-R 파리는 우리 시스템의 효능을 입증하기 위해 이 화합물로 처리되었습니다. 수컷 파리는 0.65 mM의 LD50을 나타내었고, 암컷은 0.90 mM의LD50을 나타내었다. 이것은 나트륨 비소 처리 성인 초파리에 대한 이전 연구와 일치합니다. 예를 들어, Goldstein과 Babich37은 0.5mM NaAsO2에 7 일 동안 노출 된 후 파리 (혼합 성별)의 50 %가 사망 한 것을 발견했습니다. 이것은 현재 관찰된 것보다 약간 낮은 용량이지만, 그들의 방법과 이 방법의 차이(고체 노출 매체의 사용, 더 긴 시간 척도 및 혼합 성별 포함)가 이러한 차이를 설명할 가능성이 높습니다. 중요하게도, 두 방법 모두 전체적으로 유사한LD50 값을 초래하였다.
이 프로토콜을 사용한 실험의 관찰은 후속 행동 또는 기계론적 연구를 위한 유전 및 분자 표적을 찾는 데 사용할 수 있습니다. 노출 방법은 또한 대사체학 및 단백질체학을 위한 샘플링을 위해 초파리 를 처리하는 데 사용할 수 있으며, 이 프로토콜은 성장하는 정밀 독성학 분야(정밀 의학 분야46에서 모델링됨)에 매우 적합합니다. 이와 관련하여, 노출된 파리는 후속 게놈 및 대사체학 분석을 위해 단계 8 후에 수집될 수 있다. 8 단계에서 수집 된 샘플은 3 단계부터 시작하여 Li 및 Tennessen47에 의해 설명 된대로 처리 될 수 있습니다.
궁극적으로, 위에서 설명한 실험에서 얻은 데이터와 후속 대사체학 및 단백질체학 데이터는 종 간 비교에 이상적으로 사용될 것입니다. 앞서 언급한바와 같이26, 이러한 종간 연구는 강력하며 개별 화학 물질이 보존된 생물학적 경로를 어떻게 방해하는지 결정할 수 있습니다. 따라서 위에서 설명한 프로토콜은 문에 걸쳐 개별 독성 물질에 대한 반응으로 진화적 공통점을 찾고 화학 물질 안전 규정을 알리는 데 사용할 수 있습니다.
Disclosures
공개할 이해 상충이 없습니다.
Acknowledgments
이 프로토콜의 테스트 및 최적화에 도움을 주신 Ameya Belamkar, Marilyn Clark, Alexander Fitt, Emma Rose Gallant, Ethan Golditch, Matthew Lowe, Morgan Marsh, Kyle McClung, Andy Puga, Darcy Rose, Cameron Stockbridge 및 Noelle Zolman에게 감사드립니다. 또한 프로토콜의 목표를 식별하는 데 도움을 준 Precision Toxicology Group의 동료, 특히 Exposure Group의 동료들에게도 감사드립니다.
이 프로젝트는 보조금 계약 번호 965406에 따라 유럽 연합의 Horizon 2020 연구 및 혁신 프로그램으로부터 자금을 받았습니다. 이 간행물에 제시된 작업은 ASPIS 클러스터의 일부로 수행되었습니다. 이 출력물은 저자의 견해만을 반영하며 유럽 연합은 여기에 포함된 정보의 사용에 대해 책임을 지지 않습니다. 이 출판물은 또한 National Institutes of Health, National Center for Advancing Translational Sciences, Clinical and Translational Sciences Award의 Award Number UL1TR002529에 의해 부분적으로 자금을 지원받는 Indiana Clinical and Translational Sciences Institute의 지원으로 가능했습니다. 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 국립 보건원의 공식 견해를 나타내는 것은 아닙니다. 이 프로젝트의 일부는 JRS와 PhyloTox 컨소시엄에 수여 된 인디애나 대학의 기금으로 지원되었습니다. JMH와 EMP는 블루밍턴 초파리 스톡 센터(Bloomington Drosophila Stock Center)에 P40OD018537 NIH 어워드의 지원을 받았습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 inch flower lever action craft punch | Bira Craft | HCP-115-024 | |
| 15 mL Centrifuge Tubes | VWR | 89039-666 | High-Performance Centrifuge Tubes with Flat or Plug Caps, Polypropylene, 15 mL |
| 2 ml Tubes | VWR | 16466-044 | Micro Centrifuge Tube with Flat Screw-Cap, conical bottom |
| 5 ml Tubes | VWR | 60818-576 | Culture Tubes, Plastic, with Dual-Position Caps |
| 50 mL Centrifuge Tubes | Corning | 430290 | 50 mL polypropylene centrifuge tubes, conical bottom with plug seal cap |
| Benchmark Dose Software version 3.2 | U.S. Environmental Protection Agency | ||
| Cardboard trays | Genesee Scientific flystuff | 32-122 | trays and dividers for narrow vials |
| CO2 gas pads | Genesee Scientific flystuff | 59-114 | FlyStuff flypad, CO2 anesthetizing apparatus |
| Combitips advanced, 50 mL | Eppendorf | 0030089693 | Combitips advanced, Biopur, 50 mL, light gray, colorless tips |
| Cotton balls | Genesee Scientific flystuff | 51-101 | Cotton balls, large, fits narrow vials |
| Delicate task wipes | Kimtech | 34155 | Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipes, 1 Ply / 8.2" x 4.39" |
| Drosophila Vial Plugs, Cellulose Acetate (aka, Flugs) | VWR | 89168-888 | Wide |
| FD&C Blue No. 1 | Spectrum Chemical | FD110 | CAS number 3844-45-9 |
| Flies | BDSC | Stock #2057 | OregonR wildtype |
| Gloves (nitrile) | Kimtech | 55082/55081/55083 | Kimtech purple nitrile exam gloves, 5.9 mil, ambidextrous 9.5" |
| Grade 1 CHR cellulose chromatography paper | Cytvia | 3001-917 | Sheet, 46 x 57 cm |
| Mesh for humidity chamber | |||
| Multipette / Repeater (X) stream | Eppendorf | 022460811 | Repeater Xstream |
| Plastic grate | Plaskolite | 18469 (from lowes) | Plaskolite 24 in x 48 in 7.85 sq ft louvered ceiling light panels, cut down to fit in rubbermaid tubs |
| Plastic trays for glass vials | Genesee Scientific flystuff | 59-207 | Narrow fly vial reload tray |
| Polypropylene Drosophila Vial | VWR | 75813-156 | Wide (28.5 mm) |
| Rubbermaid tubs | Rubbermaid | 3769017 (from Lowes) | Rubbermaid Roughneck Tote 10 gallon 18" L x 12" W x 8 1/2" H |
| Sucrose ultra pure | MP Biomedicals, Inc. | 821721 | |
| Tube racks for wide-mouthed tubes | Thermo scientific | 5970-0230 | Nalgene Unwire Test tube racks, for 30 mm tubes |
| Water Purification System | Millipore Milli-Q | ZMQ560F01 | Millipore Milli-Q Biocel Water Purifier |
| Yeast extract | Acros Organics | 451120050 | CAS number 84604-16-0 |
References
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