Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Vurdering av kjemisk toksisitet hos voksne Drosophila melanogaster

Published: March 24, 2023 doi: 10.3791/65029
Automatic Translation
*1,2, *1, 1,2, 3, 4, 5, 1, 1
1Department of Biology, Indiana University, 2Bloomington Drosophila Stock Center, Department of Biology, Indiana University, 3School of Biosciences, University of Birmingham, 4O'Neill School of Public and Environmental Affairs, Indiana University, 5Section of Developmental Genomics, Laboratory of Biochemistry and Genetics, National Institute of Diabetes and Kidney and Digestive Diseases, National Institutes of Health
* These authors contributed equally

Summary

Denne protokollen beskriver en effektiv og rimelig metode som bruker flytende medier for å vurdere effekten av kjemiske toksiske stoffer på levedyktigheten til voksen Drosophila melanogaster.

Abstract

Menneskelige næringer genererer hundretusenvis av kjemikalier, hvorav mange ikke har blitt tilstrekkelig studert for miljøsikkerhet eller effekter på menneskers helse. Dette underskuddet av kjemisk sikkerhetsinformasjon forverres av dagens testmetoder hos pattedyr som er dyre, arbeidskrevende og tidkrevende. Nylig har forskere og regulatorer jobbet for å utvikle nye tilnærmingsmetoder (NAM) for kjemisk sikkerhetstesting som er billigere, raskere og reduserer dyrs lidelse. En av de viktigste NAM-ene som dukker opp er bruken av virvelløse organismer som erstatning for pattedyrmodeller for å belyse konserverte kjemiske virkemåter på tvers av fjernt beslektede arter, inkludert mennesker. For å fremme dette arbeidet, beskriver vi her en metode som bruker bananfluen, Drosophila melanogaster, for å vurdere kjemisk sikkerhet. Protokollen beskriver en enkel, rask og billig prosedyre for å måle levedyktigheten og fôringsatferden til eksponerte voksne fluer. I tillegg kan protokollen enkelt tilpasses for å generere prøver for genomiske og metabolomiske tilnærminger. Samlet sett representerer protokollen et viktig skritt fremover for å etablere Drosophila som en standardmodell for bruk i presisjonstoksikologi.

Introduction

Mennesker blir stadig utsatt for kjemikalier fra en rekke kilder, inkludert luft1, mat2, vann3,4, medisiner5, rengjøringsmidler6, personlig pleieprodukter 7, industrielle kjemikalier 7 og byggematerialer 7. Videre blir tusenvis av nye kjemikalier introdusert hvert år8, hvorav mange ikke er skikkelig undersøkt for helse- og miljøsikkerhet. Denne mangelen på tilstrekkelig kjemisk sikkerhetstesting stammer delvis fra en overdreven avhengighet av pattedyrmodeller, som mus og rotter. Selv om slike gnagermodeller er informative, er kjemisk sikkerhetstesting i disse systemene dyrt, tidkrevende og forårsaker ofte uakseptable nivåer av lidelse for testdyret9.

De økonomiske og etiske byrdene knyttet til pattedyrs kjemiske sikkerhetstesting, samt den tidkrevende naturen til pattedyrstudier, er viktige medvirkende faktorer til mangelen på data rundt nye kjemikalier. For å løse dette problemet implementerer US Environmental Protection Agency (EPA), European Chemicals Agency (ECHA), Health Canada og andre byråer tiltak som innlemmer nye tilnærmingsmetoder (NAM) i regelverk10, og plasserer dermed nordamerikansk og europeisk politikk i tråd med internasjonale mål om å erstatte, redusere og avgrense bruken av dyr (3Rs-rektoren)11, 12,13,14. NAM omfatter en rekke analyser primært basert på in vitro og i silikomodeller som gir en mekanistisk forståelse av kjemisk toksisitet i stedet for å observere motgang påført pattedyrs testarter, og dermed øke datagenereringshastigheten for kjemisk risikovurdering samtidig som de produserer høy troskap utganger15. Imidlertid er disse metodene ennå ikke bevist å beskytte mot systemisk toksisitet, inkludert forstyrrelse av vitale biologiske prosesser som involverer interorgankommunikasjon og endokrin signalering. Videre kan de ikke redegjøre for bioakkumulering av kjemikalier i bestemte vev, evnen til individuelle forbindelser til å bli absorbert og utskilt, og samspillet mellom atferd og kjemisk eksponering.

På grunn av begrensningene i in vitro- og beregningsmodeller, bør vellykket bruk av NAM for å redusere eller erstatte pattedyrmodeller også inkludere virvelløse in vivo-modeller, for eksempel bananfluen, Drosophila melanogaster. Tidligere studier i flua har vist at denne organismen er godt egnet til å studere de konserverte genetiske veiene som beskytter dyreceller mot giftige molekyler 16,17,18,19,20,21,22. Videre viser flua bemerkelsesverdig genetisk likhet med mennesker, inkludert funksjonelle homologer til over 65% av menneskelige sykdommer 23,24,25 og en enda større bevaring av viktige funksjonelle veier 26. Disse funksjonene, kombinert med deres relativt korte livssyklus, lave vedlikeholdskostnader og lett observerbare atferdsresponser, gjør Drosophila velegnet til bruk som en toksikologisk modell27,28,29,30. Videre har fluer mye høyere gjennomstrømning enn gnagermodeller og fanger opp effekter på metabolisme, fysiologi og hormonsignalering som ikke lett kan påvises av andre ikke-organismale NAMer9.

Protokollen beskrevet her representerer et rammeverk for å teste effekten av kjemisk eksponering på voksen Drosophila. Metoden er designet for å være effektiv, billig og reproduserbar, samtidig som den minimerer tiden forskere må være i kontakt med testkjemikaliet og imøtekommende prøveinnsamling for metabolomics og andre omics-tilnærminger. Protokollen er optimalisert for å teste et enkelt kjemikalie per eksperiment, men kan enkelt imøtekomme andre eksperimentelle parametere, for eksempel varierte løsningsmidler eller kombinasjoner av kjemikalier.

Protocol

MERK: Bruk nitrilhansker for alle trinnene i denne protokollen. Bruk laboratoriefrakk, øyevern og/eller åndedrettsvern, i henhold til sikkerhetsdatabladene for hvert evaluerte kjemikalie.

1. Forberedelse av hetteglass og fuktighetskammer

MERK: Trinn 1.1-1.5 kan fullføres når som helst før du begynner på de andre eksperimentelle seksjonene. Nitrilhansker må alltid brukes under tilberedning av hetteglasset for å forhindre kontaminering.

  1. Stable fire ark med klasse 1 cellulosekromatografipapir (se materialfortegnelse) og kutt dem i 2 i brede strimler. Punch ut blomsterformede filterpapirinnsatser ved hjelp av en 1,5 i papirstans som inneholder en blomsterformet dyse.
  2. Bruk en 22 mm x 220 mm ubehandlet treplugg til å skyve filterpapiret til bunnen av et hetteglass med diameter på 28,5 mm i polypropylen. Bekreft at bunken med filterpapir er forsvarlig plassert i bunnen av hetteglasset.
  3. Oppbevar de klargjorte hetteglassene i plast- eller pappbrett og plasser brettene i store (~280 mm x 240 mm) plastposer til bruk.
  4. Konstruer et fuktighetskammer ved å kutte et 120 mm x 280 mm hull i plastlokket på et 606,24 mm x 225,42 mm x 403,22 mm plastkar (se materialfortegnelse). Lim netting over hullet for å tillate luftstrøm.
  5. Klipp en del av plastgitteret fra taklampepaneler (opprinnelig 610 mm x 1220 mm) for å passe i bunnen av plastbeholderen som ble brukt i trinn 1.4.
    MERK: En rekke forskjellige plastkar og plast / metallgitter materialer kan brukes til å bygge et fuktighetskammer.

2. Fluehold

  1. Start kulturer av voksne fluer (minimum 30 voksne) i glassmelkeflasker som inneholder standard Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC) media31. Lukk flaskene med en rayonplugg pakket inn i en delikat arbeidsserviett. Ikke fyll flaskene.
    MERK: Antall nødvendige flasker avhenger av antall kjemiske eksponeringer som utføres og genotypen til teststammen. Normalt kan flere hundre fluer fås fra en enkelt flaske ved bruk av robuste og fruktbare bestander. Standardanalysen bruker Oregon-R villtypefluer (BDSC stock #2057), men alle genotyper av interesse kan brukes med denne protokollen. Husk at kompromitterte genotyper med lav fruktbarhet og / eller levedyktighet krever økte flaskekulturer.
  2. Inkuber brettene med kulturflasker ved 25 °C med ca. 60 % fuktighet og en lys:mørk syklus på 12:12 timer til tredje larvestjerne eller tidlige puppestadier observeres. Dette stadiet er identifiserbart ved tilstedeværelse av larver som vandrer opp på sidene av flasken og utseendet av pupper på flaskevegger.
    MERK: Håndter bare fluer i lys-på-perioden i 12:12 h lys:mørk syklus. For robuste lagre når flasker dette stadiet etter 3-4 dager under de beskrevne forholdene.
    1. Fjern voksne fluer og bestem likviditeten til media. Hvis mediet strømmer langs siden av flasken når det er omvendt, er mediet for flytende. Sett inn en delikat arbeidsserviett eller en rayonkule i bunnen av flasken for å stivne fluematen.
  3. Når fluene begynner å lukke, fjern alle voksne fra flaskene og la puppene fortsette å lukke i 48 timer. På dette tidspunktet kan alle voksne som fjernes fra kulturflaskene enten overføres til nye flasker for å forplante lagrene (se trinn 2.1) eller kastes.
  4. Overføringsfluer som stenger i 48 timers perioden til nye flasker som inneholder standard BDSC-medier. Alder i 3 dager.
    MERK: De voksne i disse flaskene er 3-5 dager gamle og kan brukes i dødelighet og fôringseksperimenter. Flaskene som brukes til å aldre voksne fluer vil inneholde egg og larver. Som et resultat kan disse flaskene brukes til å forplante neste generasjon fluer.

3. Forberedelse av fluer for kjemisk eksponering

  1. Bedøve 5-7 dager gamle fluer med CO2. Sorter de bedøvede fluene etter kjønn ved hjelp av kjønnsorganene deres. For hjelp med bedøvelse og sexing av fluer, se referanse28.
  2. Plasser grupper på enten 20 hannfluer eller 20 hunnfluer i hetteglass som inneholder standard BDSC-medier. Lukk hetteglasset med en rayonplugg og oppbevar hetteglassene for hanner og kvinner separat. Merk hetteglassene som inneholder kvinnelige fluer med en stripe. La hetteglassene med hannfluer være umerket for å unngå å blande kjønn ved et uhell.
    MERK: Antall hetteglass som må klargjøres i trinn 3.2 er diktert av størrelsen på eksponeringseksperimentene. Som beskrevet i trinn 5.3 og 5.6 krever et typisk eksperiment for å finne områder for et enkelt testkjemikalie minst 40 hetteglass med hanner og 40 hetteglass med hunner. Et standard dose-respons-kurveeksperiment, beskrevet i trinn 7.4 og 7.8, krever minst 63 hetteglass med hanner og 63 hetteglass med kvinner.
  3. Oppbevar hetteglassene i 48 timer i en inkubator ved 25 °C ved ca. 60 % fuktighet og med en 12:12 timers lys:mørk syklus. I løpet av denne tiden, støtt brettet med sorterte hetteglass i en 60 ° vinkel for å forhindre at fluer setter seg fast i maten mens de gjenoppretter fra anestesien.
    MERK: Dette trinnet gjør det mulig for fluer å komme seg fra CO2 -anestesien. Ikke bedøv fluene igjen under resten av eksponeringsprotokollen.
  4. Etter 48 timers restitusjonsperiode, tilsett 0,75 ml sterilt renset vann til hetteglassene tilberedt i trinn 1,3. Antall hetteglass tilberedt i dette trinnet skal være identisk med antall hetteglass som er satt opp i trinn 3.2.
  5. Overfør sorterte, kjønnsmatchede fluer til sulteglasset ved å åpne glassflasken med fluene fra trinn 3.2, putte det inn i munnen på det klargjorte plasthetteglasset og deretter banke bunnen av plasthetteglasset mot en benkeplate. Lukk hetteglasset av plast med en celluloseacetatplugg (vanligvis kjent som en flug).
    1. Registrer eventuelle fluer tapt i denne overføringen (overfør til registreringer av startantall fluer for hvert hetteglass senere).
    2. Merk sulteflasker som inneholder kvinnelige fluer med en stripe. La hetteglassene med hannfluer være umerket for å unngå å blande kjønn ved et uhell.
  6. Forbered fuktighetskammeret for eksponering over natten. Se trinn 1.4-1.5 for en beskrivelse av hvordan du bygger dette kammeret.
    1. Plasser seks standard papirhåndklær i bunnen av fuktighetskammeret. Bløtlegg tørkepapiret med 100 ml vann.
    2. Sett plastgitteret (trinn 1.5) over de våte håndklærne for å sikre at hetteglassene ikke kommer i kontakt med mettede papirhåndklær.
  7. Plasser brettene med sulteflasker i horisontal stilling i fuktighetskamrene. Plasser fuktighetskamrene i en 25 °C inkubator (ved ca. 60 % fuktighet) over natten.
    MERK: Ideelt sett varer sulteperioden over natten ca 16 timer; Tidspunktet kan imidlertid justeres for individuelle laboratorieplaner.

4. Klargjøring av lagerløsninger

MERK: Fluer blir matet testkjemikalier i et gjær-sukrose flytende medium. Denne delen beskriver tilberedning av stamløsninger av konsentrerte fôringsmedier og testkjemikalier.

  1. Forbered en 4x gjær-sukroseløsning som inneholder 16% sukrose og 6% gjærekstrakt (m / v) (se materialtabell) oppløst i sterilt renset vann. Autoklav oppløsningen i en væskesyklus for riktig steriliseringstid (f.eks. 40 minutter i 1 l).
    MERK: Oppløsningen kan lages i bulk og oppbevares i alikoter ved -20 °C. Tine de enkelte alikotene 1 dag før bruk ved å legge dem i kjøleskap på 4 °C.
  2. Forbered et lager av testkjemikaliet. For det første forsøket bør stamløsningen fremstilles i høyeste konsentrasjon slik at kjemikaliet kan oppløses fullstendig i vann.
    MERK: Andre løsemidler enn vann kan brukes til å løse opp testkjemikaliet. Se diskusjon om forbehold for bruk av alternative løsemidler.
  3. Forbered en 100x blå fargestoffoppløsning ved å oppløse 1 g FD&C Blue No. 1 (se materialfortegnelse) i 10 ml sterilt renset vann.
    MERK: Den blå fargestoffløsningen kan lages i bulk og lagres i alikoter ved 4 °C.

5. Klargjøring av eksponeringshetteglass: Eksperiment med avstandssøk

MERK: Trinn 5 og 6 i protokollen er utformet for å identifisere den laveste dosen av testkjemikalie som induserer 100% dødelighet og den høyeste dosen som ikke induserer en dødelig fenotype. Hvis disse konsentrasjonene allerede er bestemt av tidligere eksperimenter, se trinn 7 og 8 for beregning av en dose-responskurve. Eksponeringsmedier må klargjøres umiddelbart før fluer tilsettes i eksponeringshetteglassene.

  1. Merk åtte 15 ml sentrifugerør som følger: (i) ingen kjemisk, (ii) høyeste konsentrasjon, (iii) 1:2, 1:10, 1:20, 1:100, 1:200, 1:200 og 1:1,000.
  2. Forbered eksponeringsmediet i de merkede sentrifugerørene fra trinn 5.1 ved først å tilsette 2,5 ml 4x gjær-/sukroseoppløsning til alle de åtte merkede rørene.
    1. Tilsett 7,5 ml sterilt renset vann til røret merket "ingen kjemikalier". Denne fortynningen er den negative kontrollen.
    2. Tilsett 7,4 ml av testens kjemiske stamløsning til røret merket "høyeste konsentrasjon". Tilsett 100 μL sterilt renset vann til dette røret, så det endelige volumet er 10 ml. Beregn og registrer molariteten til testkjemikaliet i denne løsningen.
      MERK: Tilsetningen av 100 μL sterilt renset vann til røret sikrer at den kjemiske konsentrasjonen i dette trinnet er identisk med den som ble brukt i trinn 5.5, der en blå fargestoffoppløsning tilsettes eksponeringsmediet som en metode for å vurdere fôringsadferd.
    3. Tilsett riktig mengde test kjemisk stamløsning og sterilt renset vann til de resterende rørene. Det endelige volumet av hvert rør må være 10 ml. Den endelige konsentrasjonen av testkjemikalier i disse rørene i forhold til røret "høyeste konsentrasjon" må være 1: 2, 1: 10, 1: 20, 1: 100, 1: 200 og 1: 1,000.
  3. Klargjør og merk åtte hetteglass med eksponering for hver enkelt konsentrasjon av eksponeringsmedier generert i trinn 5.1. Det skal være åtte sett hetteglass (totalt 64 hetteglass) som inneholder følgende etiketter: ingen kjemisk, høyeste konsentrasjon, 1:2, 1:10, 1:20, 1:100, 1:200 og 1:1000.
    1. Pipette 0,75 ml eksponeringsmedier tilberedt i trinn 5.2.3 i det tilsvarende settet med eksponeringshetteglass.
  4. Merk åtte 5 ml individuelle rør som følger: (i) ingen kjemisk, (ii) høyeste konsentrasjon, (iii) 1:2, 1:10, 1:20, 1:100, 1:200 og 1:1,000.
  5. Forbered eksponeringsmedier for blått fargestoff ved først å blande 500 μL 4x gjær / sukrose stamløsning og 20 μL blå fargestoffoppløsning i åtte merkede 5 ml rør.
    1. Tilsett 1,48 ml sterilt renset vann til røret merket "ingen kjemikalier". Denne fortynningen er den negative kontrollen.
    2. Tilsett 1,48 ml av testens kjemiske stamløsning til røret merket "høyeste konsentrasjon". Ingen vann tilsettes dette røret. Beregn og registrer molariteten til testkjemikaliet i denne løsningen.
    3. Tilsett riktig mengde test kjemisk stamløsning og sterilt renset vann til de resterende rørene. Det endelige volumet av hvert rør skal være 2 ml. Den endelige konsentrasjonen av testkjemikaliet i disse rørene i forhold til "høyeste konsentrasjon" -røret skal være 1: 2, 1: 10, 1: 20, 1: 100, 1: 200 og 1: 1,000.
  6. Klargjør og merk to hetteglass med eksponering med hver enkelt konsentrasjon av blå eksponeringsmedier. Det skal være åtte sett hetteglass (totalt 16 hetteglass) som inneholder følgende etiketter: ingen kjemisk, høyeste konsentrasjon, 1:2, 1:10, 1:20, 1:100, 1:200 og 1:1000. Ordet "blå" skal også skrives på disse hetteglassene.
    1. Pipette 0,75 ml blått eksponeringsmedium inn i det tilsvarende settet med hetteglass med blå eksponering.

6. Fly kjemisk eksponering: Range finding eksperiment

  1. Klargjør hetteglass med kjemisk eksponering ved bruk av hetteglassene med sultne fluer over natten fra trinn 3.7 som følger:
    1. Overfør fire hetteglass med utsultede hunnfluer (20 fluer per hetteglass) til fire hetteglass med hver kjemiske konsentrasjon. Merk disse hetteglassene som "kvinnelige". Bruk samme overføringsmetode som beskrevet i trinn 3.5.
    2. Overfør fire hetteglass med utsultede hannfluer (20 fluer per hetteglass) til fire hetteglass med hver kjemiske konsentrasjon. Merk disse hetteglassene som "mannlige". Bruk samme overføringsmetode som beskrevet i trinn 3.5.
  2. Tilbered hetteglass med kjemisk eksponering som inneholder blått fargestoff ved bruk av hetteglassene med sultne fluer over natten fra trinn 3.7 som følger:
    1. Overfør ett hetteglass med utsultede hunnfluer (20 fluer per hetteglass) til ett hetteglass med blå eksponering for hver kjemiske konsentrasjon. Merk hetteglasset med "kvinnelig". Bruk samme overføringsmetode som beskrevet i trinn 3.5.
    2. Overfør ett hetteglass med utsultede hannfluer (20 fluer per hetteglass) til ett hetteglass med blå eksponering for hver kjemiske konsentrasjon. Merk dette hetteglasset "mannlig". Bruk samme overføringsmetode som beskrevet i trinn 3.5.
  3. Registrer antall fluer som er tilstede i hvert hetteglass etter overføring, og noter antallet som døde eller rømte. Normalt skal alle de 20 fluene overleve sult og overføring over natten.
  4. Plasser eksponeringshetteglassene horisontalt i nytilberedte fuktighetskamre (se trinn 3.6 for klargjøring av fuktighetskammeret). Plasser kamrene i en 25 °C kuvøse med ca. 60 % luftfuktighet og en 12:12 h lys:mørk syklus.
  5. Undersøk eksponeringshetteglassene ved 24 og 48 timer etter starten av den kjemiske eksponeringen. Tell og registrer antall døde fluer i hvert hetteglass på hvert tidspunkt.
    MERK: Døden brukes som avlesning for denne analysen, men protokollen kan tilpasses for å undersøke andre fenotyper. Eksponerte fluer samles vanligvis på disse tidspunktene for transkriptomiske og metabolomiske studier.
  6. Undersøk hetteglassene med blå eksponering 24 timer etter starten av den kjemiske eksponeringen. Bruk følgende teknikker for å avgjøre om eksponerte fluer konsumerer det blå eksponeringsmediet:
    1. Undersøk hetteglassveggene for indikasjoner på blå avføring, som vises som små prikker på siden av eksponeringshetteglasset, så vel som på flugen.
    2. Bedøv fluene med CO2 og undersøk magen for tilstedeværelse av blått fargestoff.
      MERK: Normalt analyseres hetteglass med blå eksponering etter 24 timer. Dette trinnet kan imidlertid utføres ved 48 timer i stedet. Fluer som har spist har normalt en blå stripe gjennom magen, noe som indikerer at eksponeringsmediet har kommet inn i tarmen.
    3. Undersøk fluene for unormal fôringsadferd, som oppblåsthet, avlingdistensjon og nedbrytning av tarmbarrierefunksjonen (indikert ved utseendet av blått fargestoff i hele organismen i stedet for bare begrenset til GI-kanalen, ofte referert til som smurfing32,33).
  7. Kast alle kontaminerte hetteglass, filterpapir, flugs og fluer i passende beholdere for kjemisk avfall. Hvis levende fluer forblir i hetteglassene, frys hetteglassene for å drepe fluene før du kaster dem i riktig avfallsbeholder.
    MERK: Avhending av eksponeringshetteglass og fluer dikteres av kjemikaliet (e) som analyseres i forsøket. Følg alltid prosedyrene for kjemisk sikkerhet som er beskrevet på kjemikaliesikkerhetsdatabladet. Hvis konsentrasjoner brukt i områdefinningsforsøket dreper fluer ved laveste dose, gjenta avsnitt 6 ved hjelp av en fortynningsserie, som begynner med den laveste konsentrasjonen som drepte 100 % av dyrene.

7. Tilberedning av eksponeringshetteglass: Generering av en dose-responskurve

MERK: Protokollen som er beskrevet i trinn 5 og 6, er utformet for å bestemme den kjemiske konsentrasjonen som kreves for å fremkalle en fenotype. Trinn 7 og 8 i protokollen brukes til å beregne en nøyaktig dose-responskurve.

  1. Beregn de kjemiske testkonsentrasjonene som må analyseres for å generere en dose-responskurve ved hjelp av følgende metode:
    1. Bestem den laveste konsentrasjonen av testkjemikaliet som dreper 100% av eksponerte fluer ved 48 timer.
    2. Bestem den høyeste konsentrasjonen av testkjemikalie som ikke har noen effekt på levedyktigheten ved 48 timer.
    3. Beregn ytterligere fire konsentrasjoner som er likt fordelt mellom konsentrasjonene som er fastsatt i trinn 7.1.1 og 7.1.2.
  2. Merk ni individuelle 15 ml sentrifugerør med molariteten til følgende konsentrasjoner: (i) ingen kjemisk, (ii) konsentrasjon bestemt i trinn 7.1.1, (iii) konsentrasjon bestemt i trinn 7.1.2, (iv) konsentrasjoner bestemt i 7.1.3, (v) to ganger konsentrasjonen bestemt i trinn 7.1.1, (vi) en 1:2 fortynning av konsentrasjonen bestemt i trinn 7.1.2.
    MERK: Å inkludere konsentrasjonene som er to ganger konsentrasjonen bestemt i 7.1.1 og en 1:2-fortynning av den som ble bestemt i trinn 7.1.2, er viktig for nøyaktig beregning av dose-responskurven.
  3. Klargjør eksponeringsmediet ved først å tilsette 2,5 ml 4x gjær-/sukroseoppløsning til ni merkede individuelle 15 ml sentrifugerør fremstilt i trinn 7.2.
    1. Tilsett 7,5 ml sterilt renset vann til røret merket "ingen kjemikalier". Denne fortynningen er den negative kontrollen.
    2. Tilsett riktig mengde test kjemisk stamløsning og sterilt renset vann til de resterende rørene. Det endelige volumet av hvert rør må være 10 ml. Den endelige konsentrasjonen av kjemikalier i et enkelt rør skal være lik det som er skrevet på utsiden av røret.
  4. Klargjør og merk 12 hetteglass med eksponering for hver konsentrasjon av eksponeringsmedier generert i trinn 7.2. Det skal være ni sett hetteglass (108 hetteglass totalt).
  5. Pipette 0,75 ml eksponeringsmedier inn i det tilsvarende settet med eksponeringshetteglass.
    MERK: Trinn 7.6 til 7.8 er valgfrie. Hvis de kjemiske testkonsentrasjonene utarbeidet i trinn 7.2 er kjent for ikke å påvirke fôringsatferden, kan disse trinnene hoppes over.
  6. Klargjør og merk ni forskjellige 5 ml rør for blå eksponeringsmedier med samme serie konsentrasjoner som ble brukt i trinn 7.2.
  7. Forbered eksponeringsmedier for blått fargestoff ved først å blande 500 μL 4x gjær / sukroseoppløsning og 20 μL blå fargestoffløsning.
    1. Tilsett 1,48 ml renset sterilt vann til røret merket "ingen kjemikalier". Denne fortynningen er den negative kontrollen.
    2. Tilsett riktig mengde kjemisk stamløsning og renset sterilt vann til de resterende rørene. Det endelige volumet av hvert rør må være 2 ml. Den endelige konsentrasjonen av kjemikalier i et enkelt rør skal være lik det som er skrevet på utsiden av røret.
  8. Klargjør og merk to eksponeringshetteglass for hver enkelt konsentrasjon av blå eksponeringsmedier. Det skal være ni sett hetteglass (totalt 18 hetteglass), der hvert sett hetteglass er merket med konsentrasjonene listet opp i trinn 7.2. Ordet "blå" skal også skrives på disse hetteglassene.
    1. Pipette 0,75 ml blått eksponeringsmedium inn i det tilsvarende settet med hetteglass med blå eksponering.

8. Fly kjemisk eksponering: Generere en dose-responskurve

  1. Klargjør hetteglass med kjemisk eksponering ved bruk av hetteglassene med sultne fluer over natten fra trinn 3.7 som følger:
    1. Overfør seks hetteglass med utsultede hunnfluer (20 fluer per hetteglass) til seks hetteglass med hver kjemiske konsentrasjon. Merk disse hetteglassene som "kvinnelige". Bruk samme overføringsmetode som beskrevet i trinn 3.5.
    2. Overfør seks hetteglass med utsultede hannfluer (20 fluer per hetteglass) til seks hetteglass med hver kjemiske konsentrasjon. Merk disse hetteglassene som "mannlige". Bruk samme overføringsmetode som beskrevet i trinn 3.5.
  2. Tilbered hetteglass med kjemisk eksponering som inneholder blått fargestoff ved bruk av hetteglassene med sultne fluer over natten fra trinn 3.7 som følger:
    1. Overfør ett hetteglass med utsultede hunnfluer (20 fluer per hetteglass) til ett hetteglass med blå eksponering for hver kjemiske konsentrasjon. Merk hetteglasset med "kvinnelig". Bruk samme overføringsmetode som beskrevet i trinn 3.5.
    2. Overfør ett hetteglass med utsultede hannfluer (tjue fluer per hetteglass) til ett hetteglass med blå eksponering for hver kjemiske konsentrasjon. Merk dette hetteglasset "mannlig". Bruk samme overføringsmetode som beskrevet i trinn 3.5.
  3. Registrer antall fluer i hvert hetteglass etter overføring. Normalt skal alle de 20 fluene overleve sult og overføring over natten, men sørge for at alle som døde eller rømte under overføringen trekkes fra totalen.
  4. Plasser eksponeringshetteglassene horisontalt i nytilberedte fuktighetskamre (se trinn 3.6 for klargjøring av fuktighetskammeret). Plasser kamrene i en 25 °C kuvøse med ca. 60 % luftfuktighet og en 12:12 h lys:mørk syklus.
  5. Undersøk eksponeringshetteglassene ved 24 og 48 timer etter starten av den kjemiske eksponeringen. Tell og registrer antall døde fluer i hvert hetteglass på hvert tidspunkt.
  6. Undersøk hetteglassene med blå eksponering 24 timer etter starten av den kjemiske eksponeringen. Bruk metoden som er beskrevet i trinn 6.6 for å vurdere endringer i fôringsatferd.
  7. Kast alle kontaminerte hetteglass, filterpapir, flugs og fluer i passende beholdere for kjemisk avfall. Hvis levende fluer forblir i hetteglassene, frys hetteglassene for å drepe fluene før de kastes i riktig avfallsbeholder.
    MERK: Avhending av eksponeringshetteglass og fluer dikteres av kjemikaliet (e) som analyseres i forsøket. Følg alltid prosedyrene for kjemisk sikkerhet som er beskrevet på kjemikaliesikkerhetsdatabladet.

9. Beregning av en dose-responskurve

  1. Bruk Benchmark Dose-programvaren (BMDS, versjon 3.2; se Materialfortegnelse) eller annen lignende programvare for å analysere dataene34. Nedenfor beskrives arbeidsflyten ved hjelp av BMDS-programvaren.
  2. Klikk på Data-fanen i BMDS og klikk på sett inn nytt datasett. Skriv inn antall prøver i datasettet, klikk på dikotom, og klikk deretter på opprett datasett. Angi hver replikering som en individuell rad i datasettet.
  3. Skriv inn dosen i den første kolonnen i den genererte tabellen, startantall fluer ekskludert alle som døde eller gikk tapt før trinn 8.3) i den andre kolonnen, og antall fluer som døde av kjemisk eksponering i den tredje kolonnen.
  4. Klikk på hovedfanen til BMDS.
  5. Klikk på rullegardinpilen for Velg modelltype-menyen og klikk på Dikotom.
  6. Klikk på aktiver for datasettet fra trinn 9.2 i Datasett-tabellen.
  7. Klikk på boksene for de ønskede modellene for analyse i tabellen MLE og alternativer.
    MERK: Frequentist Restricted Dichotomous Hill-modellen ble primært brukt.
  8. Klikk på Kjør analyse. Programmet vil generere en utdatafil med dødelighetskurven (e) og ytterligere detaljer om modellen (e).

Representative Results

Flua har lenge fungert som modell i studier for å bestemme natriumarsenitt (NaAsO2) toksisitet35,36,37,38. For å demonstrere effekten av protokollen ble hann- og hunnfluer eksponert for NaAsO2, med mål om å sammenligne disse resultatene med tidligere studier. Ved hjelp av metodikken beskrevet ovenfor ble voksne Oregon-R (BDSC stock #2057) menn og kvinner utsatt for en rekke NaAsO 2-konsentrasjoner (0, 0,01, 0,02, 0,1, 0,2, 1 og2 mM) og scoret for dødelighet 48 timer etter starten av eksponeringen (figur 1A,B).

Formålet med denne innledende analysen var å identifisere det omtrentlige konsentrasjonsområdet som ville tillate en mer presis karakterisering av NaAsO 2-toksisitet. I påfølgende eksperimenter ble konsentrasjoner valgt (0, 0,2, 0,5, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5 og 5 mM) som mer presist definerte NaAsO2 dose-responskurven (figur 1C,D). Merk at den resulterende analysen undersøkte flere konsentrasjoner som induserte 100% dødelighet. Data ble analysert ved hjelp av Environmental Protection Agencys offentlig tilgjengelige Benchmark Dose Software versjon 3.2.0.125. Dataene ble modellert som "dikotome" og Dichotomous Hill-modellen ble brukt til senere analyser. Basert på denne modellen var den endelige LD10, LD 25 og LD 50 av hannfluer som fikk NaAsO2 henholdsvis 0,30 mM,0,50 mM og0,65 mM. For hunnfluer var disse verdiene litt høyere, med en LD10 på 0,30 mM, en LD25 på 0,65 mM og en LD50 på 0,90 mM. Samlet sett er verdiene oppnådd ved hjelp av denne metoden lik de som tidligere er rapportert for arsentoksisitet i Drosophila melanogaster35,36,37,38, og validerer dermed metodikken.

I tillegg til de seks replikatene som ble brukt til å beregne dose-responskurven, ble hann- og hunnfluer også fôret med NaAsO 2-eksponeringsløsninger som inneholdt 1 % FD&C-blått, som er lett synlig i fordøyelseskanalen ved hjelp av lysmikroskopi. Basert på tilstedeværelsen av blått fargestoff i tarmen til NaAsO 2-fôrede fluer, fortsatte både hann- og hunnfluer å spise 24 timer etter begynnelsen av den kjemiske eksponeringen, uavhengig av NaAsO 2-konsentrasjonen som var tilstede i væskemediet (figur 2). Imidlertid ble inntatt mat av og til regurgitert ved doser over 0,2 mM for kvinner og 0,5 mM for menn (figur 2). Disse funnene tyder på at oppstøt kan tjene en nøkkelrolle i Drosophila-responsen på arsenforgiftning.

Figure 1
Figur 1: Dose-responskurver for mannlig og kvinnelig Drosophila behandlet med NaAsO2 i 48 timer. Alle grafer viser estimerte andeler av døde fluer ved hver NaAsO2-konsentrasjon testet basert på Dichotomous Hill-modellen. (A,B) Et bredt spekter av NaAsO2-konsentrasjoner ble testet for å tilnærme dosen der hvert kjønn av fly begynner å dø. (A) viser de mannlige dataene, og (B) viser de kvinnelige dataene. N = 4 hetteglass, med 20 fluer per hetteglass. (C,D) Et smalere utvalg av NaAsO2-konsentrasjoner ble testet for å bestemme nøyaktige doser der 10%, 25% og 50% av hvert kjønn av fluer døde. Disse dosene er angitt til høyre for hver graf. (C) viser de mannlige dataene, og (D) viser de kvinnelige dataene. N = 6 hetteglass, med 20 fluer per hetteglass. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Representative resultater fra blåfargeanalysen av mannlig og kvinnelig Drosophila behandlet med NaAsO2 i 24 timer. Mikrografer viser fluer som får økende konsentrasjoner av NaAsO2. Rad (A) viser hannfluer, og rad (B) viser hunnfluer, med konsentrasjonen av NaAsO2 økende fra venstre mot høyre. Abdomen viser en liten mengde blått nær thorax ved lave konsentrasjoner, noe som indikerer at eksponeringsmedier kom inn i tarmen. Ved høyere konsentrasjoner begynner blått fargestoff å samle seg rundt munnen, noe som tyder på at eksponeringsmedier blir oppblåst. Skalastangen er 1 mm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Discussion

Bananfluen Drosophila melanogaster fremstår som et kraftig system for NAMs16,18,19,21. Ved å utnytte de enestående genetiske ressursene som er tilgjengelige for fluesamfunnet, kombinert med nylige fremskritt innen genomikk og metabolomikk, er kjemiske sikkerhetsstudier ved bruk av Drosophila i stand til raskt å identifisere molekylære mekanismer som individuelle forbindelser forstyrrer metabolisme, fysiologi og cellesignalering (for eksempel, se39). Denne rimelige protokollen er designet for raskt å definere dose-responskurver og deretter generere prøver for RNA-seq og metabolomikkanalyse. Videre kan denne fleksible protokollen tilpasses for bruk med alle genotyper og kan romme mange klasser av kjemikalier.

Et bemerkelsesverdig aspekt ved denne protokollen er valget av flytende mat som brukes i kjemisk eksponering, som er basert på en tidligere studie, men skiller seg fra de faste mediene som brukes av de fleste toksikologiske studier av Drosophila18,22. Dette spesifikke flytende mediet ble valgt for å gjenspeile næringsinnholdet i det standard, faste BDSC-mediet som fluene også fôres med i denne protokollen, for å sikre at fluene får konsistent ernæring. Enkelheten til flytende fôringsmedier har mange fordeler. Flytende medier er lettere å håndtere enn fast føde, som enten må smeltes og størknes eller rekonstitueres fra pulver. Flytende medier øker også systemets gjennomstrømning, sikrer jevn kjemisk fordeling gjennom fôringsmediet og reduserer tiden som brukes på å arbeide med farlige forbindelser. I tillegg krever media ikke at løsninger skal varmes opp, noe som letter testingen av flyktige testforbindelser. Til slutt, på grunn av de relativt få komponentene som er inkludert i matløsningen, minimeres uønskede sidereaksjoner mellom testkjemikaliet og andre diettkomponenter. Gjæren som brukes i maten er også inaktiv, noe som ytterligere begrenser reaktiviteten til fôringsmediet. Vær imidlertid oppmerksom på at metoden ikke er egnet for testing av utviklings- eller larvestoksisitet.

Noen av materialene som brukes i protokollen kan erstattes, for eksempel å bruke glassflueflasker i stedet for polypropylen. Imidlertid ble materialene som ble brukt valgt for å være både inerte og engangsbruk for å unngå uønskede kjemiske reaksjoner mellom reagenser og kjemiske eksponeringer som kunne skyldes rengjøring av glassvarer.

Bruk av flytende mat nødvendiggjør et kjøretøy for matlevering. Celluloseacetatfilterpapir ble valgt til dette formålet på grunn av sin fleksibilitet og inerte natur28. Andre forskere brukte lignende protokoller, men med andre kjøretøy, for eksempel delikate arbeidsservietter eller glassfiberfilter 29,30. Celluloseacetatfilterpapiret passet disse behovene fordi det er et inert kjøretøy som kan kuttes til ideell form for å passe det inn i bunnen av flueglassene uten store mellomrom mellom papiret og hetteglassveggen, og forhindrer død på grunn av fluer som sitter fast i media eller selve kjøretøyet.

En viktig begrensning ved dette systemet er at den maksimale testbare konsentrasjonen av et kjemikalie er knyttet til kjemikaliets løselighet. Ikke-vannløselige forbindelser krever et ekstra løsningsmiddel, noe som kan føre til ytterligere eller synergistiske effekter med kjemikaliet av interesse. Dette kan også skape situasjoner der det ikke er mulig å fremstille stamløsninger som er konsentrerte nok til å oppnå ønsket endepunkt i alle organismer, og dermed begrense analysen av de resulterende dataene31. For å løse dette kan kjemikalier med lav vannløselighet testes ved å tilsette opptil 0,5% dimetylsulfoksid til matoppløsningen. Andre løsningsmidler kan også brukes, men ytterligere forskning er nødvendig for hvert løsningsmiddel av interesse for å bestemme maksimal akseptabel løsningsmiddelkonsentrasjon i løsningen for å maksimere løseligheten samtidig som løsningsmiddeleffekter på organismen minimeres.

Omfattende karakterisering av olfactionresponsen i Drosophila har beskrevet hvordan fluer unngår å konsumere giftige forbindelser40,41, noe som fører til redusert fôring på behandlede medier. Den blå fargestoffanalysen adresserer dette fenomenet ved å la forskere effektivt skjerme fôringsadferdene til fluene som mates hver konsentrasjon av eksperimentell kjemisk 42,43,44. Tilstedeværelsen eller fraværet av blått i fluens mage-tarmkanal indikerer om flua har spist det giftstoffholdige mediet. Selv om det finnes mer sofistikerte metoder for å vurdere fluefôringsatferd, for eksempel Fly Liquid-Food Interaction Counter45, er denne kvalitative metoden bedre egnet for screening med høyere gjennomstrømning.

Et bemerkelsesverdig aspekt ved denne protokollen er at den har blitt optimalisert for en 48 timers eksponeringsperiode uten behov for å overføre fluer eller legge til ekstra væske til eksponeringshetteglasset. Ved å bruke et fuktighetskammer og plassere kamrene i en inkubator som ble holdt ved høy luftfuktighet, forhindret filterpapiret som inneholder matemediet å tørke ut i løpet av denne tidsrammen. Protokollen kan tilpasses for lengre eksponeringsvarighet, men metoden må justeres for å sikre at filterpapiret ikke blir tørt og forårsaker betydelige endringer i løsningskonsentrasjon eller dødelighet på grunn av uttørking.

Endelig er en viktig egenskap ved denne protokollen at den lett kan imøtekomme genetiske varianter, noe som gjør det mulig for forskere å utnytte det store utvalget av genetiske verktøy for Drosophila for å utvide disse foreløpige studiene på villtypeorganismer for bedre å forstå mekanismer for kjemisk virkning in vivo. I denne forbindelse kan protokollen som er skissert ovenfor enkelt modifiseres for å utfylle en tidligere beskrevet JoVE-protokoll av Peterson og Long som muliggjør toksikologisk analyse av villfangede fluer18.

På grunn av det store utvalget av tidligere studier på toksisiteten av natriumarsenitt i Drosophila 32,33,34,35,36, ble Oregon-R-fluer behandlet med denne forbindelsen for å demonstrere effekten av systemet vårt. Mannlige fluer viste en LD 50 på 0,65 mM, og kvinner viste en LD50 på 0,90 mM. Dette stemmer overens med tidligere studier av natriumarsenittbehandlet voksen Drosophila. For eksempel fant Goldstein og Babich37 at 50% av fluene (blandede kjønn) døde etter 7 dagers eksponering for 0,5 mM NaAsO2. Selv om dette er en litt lavere dose enn det som ble observert i dag, utgjør forskjellene mellom metodene deres og denne metoden (inkludert bruk av faste eksponeringsmedier, en lengre tidsskala og blandede kjønn) sannsynligvis denne forskjellen. Det er viktig at begge metodene resulterte i generelt like LD50-verdier.

Observasjoner fra eksperimenter ved hjelp av denne protokollen kan brukes til å finne genetiske og molekylære mål for påfølgende atferdsmessige eller mekanistiske studier. Eksponeringsmetoden kan også brukes til å behandle Drosophila for prøvetaking for metabolomikk og proteomikk, noe som gjør denne protokollen godt egnet til det voksende feltet presisjonstoksikologi (modellert fra presisjonsmedisinfeltet46). I denne forbindelse kan eksponerte fluer samles etter trinn 8 for påfølgende genomisk og metabolomisk analyse. Prøver samlet inn i trinn 8 kan deretter behandles, som beskrevet av Li og Tennessen47, med utgangspunkt i trinn 3.

Til syvende og sist vil dataene som er oppnådd fra forsøkene beskrevet ovenfor, samt eventuelle påfølgende metabolomikk- og proteomikkdata, ideelt sett bli brukt i sammenligninger på tvers av arter. Som tidligere nevnt26, er slike studier på tvers av arter kraftige og i stand til å bestemme hvordan individuelle kjemikalier forstyrrer konserverte biologiske veier. Dermed kan protokollen beskrevet ovenfor brukes til å finne evolusjonære fellestrekk som respons på individuelle toksiske stoffer på tvers av phyla og bidra til å informere kjemisk sikkerhetsregulering.

Disclosures

Ingen interessekonflikter å opplyse.

Acknowledgments

Vi takker våre ansatte for hjelp med testing og optimalisering av denne protokollen: Ameya Belamkar, Marilyn Clark, Alexander Fitt, Emma Rose Gallant, Ethan Golditch, Matthew Lowe, Morgan Marsh, Kyle McClung, Andy Puga, Darcy Rose, Cameron Stockbridge og Noelle Zolman. Vi takker også våre kolleger fra Precision Toxicology Group, spesielt våre kolleger i Exposure Group, for å hjelpe til med å identifisere målene for protokollen.

Dette prosjektet mottok finansiering fra EUs Horizon 2020 Research and Innovation-program under Grant Agreement No. 965406. Arbeidet som presenteres i denne publikasjonen ble utført som en del av ASPIS-klyngen. Dette resultatet gjenspeiler bare forfatternes synspunkter, og EU kan ikke holdes ansvarlig for eventuell bruk av informasjonen som finnes der. Denne publikasjonen ble også gjort mulig med støtte fra Indiana Clinical and Translational Sciences Institute, som delvis finansieres av Award Number UL1TR002529 fra National Institutes of Health, National Center for Advancing Translational Sciences, Clinical and Translational Sciences Award. Innholdet er utelukkende forfatternes ansvar og representerer ikke nødvendigvis de offisielle synspunktene til National Institutes of Health. Deler av dette prosjektet ble støttet av midler fra Indiana University tildelt JRS og PhyloTox-konsortiet. JMH og EMP ble støttet av NIH-prisen P40OD018537 til Bloomington Drosophila Stock Center.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 inch flower lever action craft punch Bira Craft HCP-115-024
15 mL Centrifuge Tubes  VWR 89039-666 High-Performance Centrifuge Tubes with Flat or Plug Caps, Polypropylene, 15 mL
2 ml Tubes  VWR 16466-044 Micro Centrifuge Tube with Flat Screw-Cap, conical bottom
5 ml Tubes  VWR  60818-576 Culture Tubes, Plastic, with Dual-Position Caps
50 mL Centrifuge Tubes  Corning  430290 50 mL polypropylene centrifuge tubes, conical bottom with plug seal cap
Benchmark Dose Software version 3.2 U.S. Environmental Protection Agency
Cardboard trays Genesee Scientific flystuff 32-122 trays and dividers for narrow vials 
CO2 gas pads Genesee Scientific flystuff 59-114 FlyStuff flypad, CO2 anesthetizing apparatus 
Combitips advanced, 50 mL Eppendorf  0030089693 Combitips advanced, Biopur, 50 mL, light gray, colorless tips
Cotton balls Genesee Scientific flystuff 51-101 Cotton balls, large, fits narrow vials 
Delicate task wipes Kimtech 34155 Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipes, 1 Ply / 8.2" x 4.39"
Drosophila Vial Plugs, Cellulose Acetate (aka, Flugs) VWR 89168-888 Wide
FD&C Blue No. 1 Spectrum Chemical FD110 CAS number 3844-45-9
Flies  BDSC Stock #2057  OregonR wildtype 
Gloves (nitrile) Kimtech 55082/55081/55083 Kimtech purple nitrile exam gloves, 5.9 mil, ambidextrous 9.5" 
Grade 1 CHR cellulose chromatography paper Cytvia 3001-917 Sheet, 46 x 57 cm
Mesh for humidity chamber
Multipette / Repeater (X) stream  Eppendorf  022460811 Repeater Xstream 
Plastic grate Plaskolite 18469 (from lowes) Plaskolite 24 in x 48 in 7.85 sq ft louvered ceiling light panels, cut down to fit in rubbermaid tubs
Plastic trays for glass vials Genesee Scientific flystuff 59-207 Narrow fly vial reload tray 
Polypropylene Drosophila Vial VWR 75813-156 Wide (28.5 mm)
Rubbermaid tubs Rubbermaid 3769017 (from Lowes) Rubbermaid Roughneck Tote 10 gallon 18" L x 12" W x 8 1/2" H
Sucrose ultra pure MP Biomedicals, Inc. 821721
Tube racks for wide-mouthed tubes Thermo scientific  5970-0230 Nalgene Unwire Test tube racks, for 30 mm tubes 
Water Purification System Millipore Milli-Q ZMQ560F01 Millipore Milli-Q Biocel Water Purifier 
Yeast extract Acros Organics 451120050 CAS number 84604-16-0

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. United States Occupational Safety and Health Administration. Construction industry: OSHA safety and health standards (29 CFR 1926/1910). United States Occupational Safety and Health Administration. , (2022).
  2. Chemical, Metals, Natural Toxins & Pesticides Guidance Documents & Regulations. United States Food & Drug Administration. , Available from: https://www.fda.gov/food/guidance-documents-regulatory-information-topic-food-and-dietary-supplements/chemical-metals-natural-toxins-pesticides-guidance-documents-regulations (2022).
  3. Drinking Water Contaminant Candidate List (CCL) and Regulatory Determination. United States Food & Drug Administration. , Available from: https://www.epa.gov/cci (2022).
  4. Administration Bottled Water/Carbonated Soft Drinks Guidance Documents & Regulatory Information. United States Food & Drug Administration. , Available from: https://www.fda.gov/food/guidance-documents-regulatory-information-topic-food-and-dietary-supplements/bottled-watercarbonated-soft-drinks-guidance-documents-regulatory-information (2022).
  5. United States Congress. Federal Food, Drug, and Cosmetic Act. United States Congress. 21, 301-392 (1934).
  6. Determining if a Cleaning Product is a Pesticide Under FIFRA. Environmental Protection Agency. , Available from: https://www.epa.gov/pesticide-registration/determining-if-cleaning-produt-pesticide-under-fifra (2022).
  7. United States Congress. Toxic Substances Control Act of 1976. H.R. 12440. Library of Congress, United States. , 1640-1707 (1976).
  8. Wang, Z., Walker, G. W., Muir, D. C. G., Nagatani-Yoshida, K. Toward a global understanding of chemical pollution: a first comprehensive analysis of national and regional chemical inventories. Environmental Science Technology. 54 (5), 2575-2584 (2020).
  9. Pandey, U. B., Nichols, C. D. Human disease models in Drosophila melanogaster and the role of the fly in therapeutic drug discovery. Pharmacological Reviews. 63 (2), 411-436 (2011).
  10. New Approach Methods Work Plan. United States Environmental Protection Agency. , Available from: https://www.epa.gov/system/files/documents/2021-11/nams-work-plan_11_15_21_508-tagged.pdf (2021).
  11. Hartung, T. From alternative methods to a new toxicology. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 77 (3), 338-349 (2011).
  12. Mahony, C. Building confidence in non-animal methods: Practical examples of collaboration between regulators, researchers and industry. Computational Toxicology. 10, 78-80 (2019).
  13. Kavlock, R. J., et al. Accelerating the pace of chemical risk assessment. Chemical Research in Toxicology. 31 (5), 287-290 (2018).
  14. European Chemicals Agency. New Approach Methodologies in Regulatory Science, Proceedings of the Scientific Workshop. European Chemicals Agency. , Helsinki, Finland, 19-20 April 2016 (2016).
  15. Wambaugh, J. F., et al. New approach methodologies for exposure science. Current Opinion in Toxicology. 15, 76-92 (2019).
  16. Rand, M. D. Drosophotoxicology: The growing potential for Drosophila in neurotoxicology. Neurotoxicology and Teratology. 32 (1), 74-83 (2010).
  17. Ong, C., Yung, L. Y. L., Cai, Y., Bay, B. H., Baeg, G. H. Drosophila melanogaster as a model organism to study nanotoxicity. Nanotoxicology. 9 (3), 396-403 (2015).
  18. Peterson, E. K., Long, H. E. Experimental protocol for using Drosophila as an invertebrate model system for toxicity testing in the laboratory. Journal of Visualized Experiments. (137), e57450 (2018).
  19. Rand, M. D., Montgomery, S. L., Prince, L., Vorojeikina, D. Developmental toxicity assays using the Drosophila model. Current Protocols in Toxicology. 59, 11-20 (2014).
  20. Misra, J. R., Horner, M. A., Lam, G., Thummel, C. S. Transcriptional regulation of xenobiotic detoxification in Drosophila. Genes & Development. 25 (17), 1796-1806 (2011).
  21. Rocha, J. B. T. Drosophila melanogaster as a promising model organism in toxicological studies. Archives of Basic and Applied Medicine. 1 (1), 33-38 (2013).
  22. Affleck, J. G., Walker, V. K. Drosophila as a model for developmental toxicology: using and extending the drosophotoxicology model. Methods in Molecular Biology. 1965, 139-153 (2019).
  23. Ugur, B., Chen, K., Bellen, H. J. Drosophila tools and assays for the study of human diseases. Disease Models & Mechanisms. 9 (3), 235-244 (2016).
  24. Chien, S., Reiter, L. T., Bier, E., Gribskov, M. Homophila: human disease gene cognates in Drosophila. Nucleic Acids Research. 30 (1), 149-151 (2002).
  25. Wangler, M. F., et al. Model organisms facilitate rare disease diagnosis and therapeutic research. Genetics. 207 (1), 9-27 (2017).
  26. Colbourne, J. K., et al. Toxicity by descent: A comparative approach for chemical hazard assessment. Environmental Advances. 9, 100287 (2022).
  27. Hales, K. G., Korey, C. A., Larracuente, A. M., Roberts, D. M. Genetics on the fly: a primer on the Drosophila model system. Genetics. 201 (3), 815-842 (2015).
  28. Markstein, M. Drosophila Workers Unite! A Laboratory Manual for Working with Drosophila. , Available from: http://marksteinlab.org/wp-content/uploads/2019/01/MicheleMarkstein-DrosophiliaWorkersUnite-PREPRINT-JAN2019.pdf (2018).
  29. Vang, L. L., Medvedev, A. V., Adler, J. Simple ways to measure behavioral responses of Drosophila to stimuli and use of these methods to characterize a novel mutant. PLoS One. 7 (5), 37495 (2012).
  30. Nichols, C. D., Becnel, J., Pandey, U. B., Byfield, F. Methods to assay Drosophila behavior. Journal of Visualized Experiments. (61), e3795 (2012).
  31. Bloomington Drosophilia Stock Center. BDSC Cornmeal Food. , Available from: https://bdsc.indiana.edu/information/recipes/bloomfood.html (2022).
  32. Martins, R. R., McCracken, A. W., Simons, M. J. P., Henriques, C. M., Rera, M. How to catch a Smurf? - ageing and beyond… in vivo assessment of intestinal permeability in multiple model organisms. Bio-Protocol. 8 (3), 2722 (2018).
  33. Rera, M., et al. Modulation of longevity and tissue homeostasis by the Drosophila PGC-1 homolog. Cell Metabolism. 14 (5), 623-634 (2011).
  34. Benchmark Dose Software (BMDS) (Build 3.3; Model Library Version 2022.10) [Computer Software]. United States Environmental Protection Agency. , Available from: https://www.epa.gov/bmds/download-bmds (2022).
  35. Ortiz, J. G., Opoka, R., Kane, D., Cartwright, I. L. Investigating arsenic susceptibility from a genetic perspective in Drosophila reveals a key role for glutathione synthetase. Toxicological Sciences. 107 (2), 416-426 (2009).
  36. Pickett, A. D., Patterson, N. A. Arsenates: effect on fecundity in some Diptera. Science. 140 (3566), 493-494 (1963).
  37. Goldstein, S. H., Babich, H. Differential effects of arsenite and arsenate to Drosophila melanogaster in a combined adult/developmental toxicity assay. Bulletin of Environmental Contamination and Toxicology. 42 (2), 276-282 (1989).
  38. Polak, M., Opoka, R., Cartwright, I. L. Response of fluctuating asymmetry to arsenic toxicity: support for the developmental selection hypothesis. Environmental Pollution. 118 (1), 1928 (1928).
  39. Zhou, S., et al. A Drosophila model for toxicogenomics: Genetic variation in susceptibility to heavy metal exposure. PLoS Genetics. 13 (7), 1006907 (2017).
  40. Anholt, R. R. H. Chemosensation and evolution of Drosophila host plant selection. iScience. 23 (1), 100799 (2020).
  41. Depetris-Chauvin, A., Galagovsky, D., Grosjean, Y. Chemicals and chemoreceptors: ecologically relevant signals driving behavior in Drosophila. Frontiers in Ecology and Evolution. 3, 41 (2015).
  42. Aryal, B., et al. Protocol for binary food choice assays using Drosophila melanogaster. STAR Protocols. 3 (2), 101410 (2022).
  43. Shimada, I., Nakao, M., Kawazoe, Y. Acute differential sensitivity and role of the central nervous system in the feeding behavior of Drosophila melanogaster. Chemical Senses. 12 (3), 481-490 (1987).
  44. Tanimura, T., Isono, K., Takamura, T., Shimada, I. Genetic dimorphism in the taste sensitivity to trehalose in Drosophila melanogaster. Journal of Comparative Physiology. 147 (4), 433-437 (1982).
  45. Ro, J., Harvanek, Z. M., Pletcher, S. D. FLIC: high-throughput, continuous analysis of feeding behaviors in Drosophila. PLoS One. 9 (6), 101107 (2014).
  46. National Research Council. Toward Precision Medicine: Building a Knowledge Network for Biomedical Research and a New Taxonomy of Disease. National Academy of Sciences. , National Academies Press. US. (2011).
  47. Li, H., Tennessen, J. M. Preparation of Drosophila larval samples for gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS)-based metabolomics. Journal of Visualized Experiments. (136), e57847 (2018).

Tags

Biologi utgave 193
Vurdering av kjemisk toksisitet hos voksne <em>Drosophila melanogaster</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Holsopple, J. M., Smoot, S. R.,… More

Holsopple, J. M., Smoot, S. R., Popodi, E. M., Colbourne, J. K., Shaw, J. R., Oliver, B., Kaufman, T. C., Tennessen, J. M. Assessment of Chemical Toxicity in Adult Drosophila Melanogaster. J. Vis. Exp. (193), e65029, doi:10.3791/65029 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter