Summary
本研究提出了一种半自动数字图像分析程序，用于基于口内荧光相机获取的图像对所披露的牙菌斑进行平面定量。该方法可以在研究环境中快速可靠地定量牙菌斑。
Abstract
牙菌斑积累使用临床指数或其他平面牙菌斑指数（PPI）进行量化，该指数测量被牙菌斑沉积物覆盖的牙齿的相对面积。与临床指标相比，PPI具有更高的辨别能力，但传统的平面测量是一种耗时的分析，因为必须使用图像处理软件手动确定每个图像的牙菌斑覆盖和清洁牙齿区域。在这里，我们提出了一种对牙菌斑进行半自动平面定量的方法，该方法可以同时快速处理多达1，000张图像。该方法利用了用口腔内摄像头获取的荧光图像中公开的牙菌斑、健全的牙齿表面和软组织之间的增强对比度。仔细执行临床程序和准确的图像采集是成功半自动识别斑块覆盖区域的关键步骤。该方法适用于健全的面部和口腔牙齿表面、大多数复合树脂修复体和带正畸托槽的牙齿的平面测量，但不适用于金属修复体。与传统的PPI记录相比，半自动平面测量大大减少了分析所花费的时间以及主观的人工输入，从而提高了平面测量的可重复性。
Introduction
研究环境中牙菌斑的定量要么使用临床指数进行，要么通过记录平面学牙菌斑指数（PPI）1进行。临床指标，如Turesky修饰的Quigley-Hein斑块指数，依赖于操作员对斑块覆盖率的目视评估以及随后在序数量表2上分配分数。虽然评分很快，但临床指标的使用需要费力的检查员间和检查者内部校准，并且评分总是受到一定程度的主观性的影响3，4，5。此外，由于评分数量有限，临床指标可能无法检测到斑块覆盖率的相关差异6。
对于平面记录，牙菌斑覆盖的范围是通过将牙菌斑覆盖面积除以牙齿表面的总面积7来确定的。使用连续量表可提高准确性，并在统计分析中表现出很高的判别力8，9，10。此外，有人可能会争辩说，平面测量不那么主观，因为指数是由考官计算而不是估计的11。传统上，通过使用图像处理软件7，12在每个图像中绘制感兴趣的区域，手动确定PPI记录的牙菌斑覆盖面积和总牙齿区域。因此，平面分析以前非常耗时，这降低了其在大型临床研究中的适用性6。
在传统的白光图像上，牙菌斑覆盖的区域、干净的牙齿区域和周围组织之间的对比度很微弱，因此，通常依赖于基于强度的物体检测的自动图像处理受到严重阻碍13，14。用荧光相机采集的图像显示，公开的牙菌斑、在绿色光谱中强烈发出强烈自发荧光的清洁牙齿和非荧光软组织之间的对比度显着增强1。
在这里，我们提出了一种半自动平面测量方法，与传统的PPI记录相比，该方法大大减少了图像分析所花费的时间。该方法采用标准公开程序、市售荧光相机和图像分析免费软件。讨论了对图像采集和图像分析很重要的参数，以及该方法的典型错误和局限性。
Protocol
该研究得到了中日德兰地区伦理委员会（1-10-72-259-21）的批准，并按照《赫尔辛基宣言》及其修正案进行。
1. 定制垫片的制造（可选）
注意：在图像采集过程中可以使用定制的3D打印垫片来标准化相机头的定位。记录荧光图像时不需要垫片。
- 垫片的设计
- 设计适合口内荧光相机摄像头的间隔物。为此，请使用数字扫描仪对相机头进行扫描。将扫描导入专用软件。
- 设计垫片，使相机头具有所需的形态和与相机头的定位距离（即 4 毫米）。导出为 STL 文件（设计示例作为 补充文件 S1 附加）。
- 间隔条的增材制造
- 打开与打印机关联的增材制造软件，然后选择基本设置。点击 打印机 |选择可用的 3D 打印机 | 下一页 |形状： 透明 |下一页 |打印模式： 50 微米 |下一页 |构建风格： 标准 |接下来。
- 通过单击“ 文件”|“ 导入 STL 文件进口 |选择 STL 文件 | 打开。
- 定义垫片在打印平台上的位置;单击 变换，然后将垫片拖动到平台的一角，尽可能靠近平台表面。
- 要打印其他垫片，请单击 “复制 |线性图案。调整计数和距离以使其他对象适合打印平台，然后单击 “设置”。
- 要设计对象的支撑，请单击 “智能支撑 |风格： 一般 | 生成 |类型： 闸门 | 创建支持。
- 将打印作业发送到 3D 打印机。单击添加到 队列。该软件会自动执行 STL 文件的质量检查，以识别添加到队列时的错误。然后，单击添加到 队列 |职位名称 |F4X |添加到队列。
- 在3D打印机上安装干净的打印平台，并添加适当的树脂。单击 开始作业，然后扫描树脂的二维码。确认打印平台是空的和干净的，树脂托盘已满，并且在添加之前树脂已经搅拌过。单击“ 启动作业”。
- 打印作业完成后，从打印平台上移除垫片。
- 用异丙醇在超声波浴中清洁垫片3分钟。使用新鲜的异丙醇重复清洁。风干垫片。
- 通过在后固化炉中聚合间隔物10分钟来确保材料的总聚合。
- 取下支撑材料，并染色垫片以防止光线穿透材料。
2. 斑块披露和图像采集
- 将定制的垫片安装在荧光相机上（可选）。将口腔内窥镜连接到计算机，然后打开摄像头软件。
- 点击 患者 |新 患者以在系统中创建患者。填写患者信息。点击 患者 | 保存以保存患者数据。点击 视频。口内摄像头现已准备就绪，可供使用。
- 调暗房间的灯光。
- 在感兴趣的牙齿表面上涂上红色披露染料（即5%赤藓氨酸）和棉丸以显示牙菌斑。
- 指导患者用水冲洗10秒以去除多余的染料。使用棉丸去除任何牙龈污渍。风干每颗牙齿3秒。
- 将口腔内窥镜水平放置在感兴趣的牙齿前面，垫片接触牙龈/相邻牙齿。通过按下相机按钮获取荧光图像。
注意：确保感兴趣的整个牙齿表面都在焦点中并在图像中捕获，不包括拮抗剂或对侧牙齿表面。 - 对所有感兴趣的牙齿重复步骤2.4-2.6。
- 在相机软件中标记所有图像。点击 保存 图像/视频 在菜单中。
注意：确保图像以“斑块”模式保存，而不是以“龋齿”模式保存。菜单中的 符号 P/C 表示当前模式。 - 要导出图像，请转到查看器。选择要导出的图像。点击 “文件”|”导出（另存为...） | 要导出患者的所有图像 。在导出窗口中，选择以下设置： 模式：标准 |导出路径： 选择所需的文件夹 | 图像类型选择： 选中左侧框 | 图像状态：原始数据。展开导出窗口以显示更多选项。选择以下选项： 文件名包含：卡号或用户输入或患者姓名 |格式：TIF。单击 “确定” 导出图像。
- 或者，在映像之前设置自动文件导出。点击 选项 |显示配置 |模块 |查看器 |导出/电子邮件 |导出选项 |模式：自动导出|导出路径： 选择所需的文件夹 | 图像状态：原始数据。选择以下选项： 文件名包含：卡号或用户输入或患者姓名 |格式：TIF。单击 “确定 ”以设置默认导出设置。设置自动文件导出后，图像将在保存时自动导出（步骤2.8）。
3. 数字图像分析
注意：数字图像分析可以在图像采集后的任何时间进行。可以并行处理多达 1，000 张荧光图像的批次。如果大图像批次的分析超出了计算能力，则在分析之前可能会减小图像大小。
- 总牙齿面积的量化
- 使用连续索引号（即Planimetry_001、Planimetry_002,...）重命名所有图像。通过单击“文件”|”导入图片 |导入为颜色。
- 通过单击 “分段 |自动细分 |自定义阈值。将“低”阈值设置为高于口腔软组织的强度（即 80）。将“高”阈值保留为 255。因此，只有牙齿（清洁和牙菌斑覆盖的区域）在软件中被识别为对象。点击 申请 |确定 |段！以启动分段。
- 通过双击图像系列的名称打开可视化工具。输入对象编辑器 （OBJ）。对分割的图像执行视觉质量控制，并通过拒绝和删除此类对象来删除伪影。
- 合并所有图像中的其余对象（在所有图像中 |合并选定对象）。现在，每个图像有一个对象。量化每个图像中的牙齿总面积（分析 |测量对象 |全部清除 |像素）。导出数据。
- 斑块覆盖区域的量化
- 将荧光图像系列再次导入软件，这次使用拆分的红色，绿色和蓝色通道（文件|导入图片 |以灰色导入）。关闭蓝色通道图像。将对象层从 RGB 图像传输到红色通道图像（段 |传递对象层）。
- 使用对象编辑器删除红色通道图像中的非对象像素（在所有图像中 |删除非对象像素（体素））。软组织现在已从图像中删除。
- 为了增强牙菌斑覆盖和清洁牙齿区域之间的对比度，请将红色通道图像系列乘以 2 倍 （编辑 |图像计算器 |乘法 |参数：因子 2.00 | 申请 | 好的）。
- 要从图像中删除干净的牙齿区域，请从增强的红色通道图像系列中减去绿色通道图像系列 （编辑 |图像计算器 |第二个操作数图像：Planimetry_green |减法 |申请 |好的）。
- 要识别牙齿上被牙菌斑覆盖的区域，请对生成的图像系列（分段 |自动细分 |自定义阈值）。将“低”阈值设置为高于清洁牙齿区域的强度（即 80）。将“高”阈值保留为 255。只有斑块覆盖的区域才会被识别为软件中的对象。点击 申请 |确定 |段！以启动分段。
- 在对象编辑器中对分割的图像执行视觉质量控制，并通过拒绝和删除此类对象来删除工件。合并所有图像中的其余对象（在所有图像中 |合并选定对象）。量化每个图像中的斑块覆盖区域（分析 |测量对象 |全部清除 |像素）。导出数据。
- 在专用软件中打开导出的数据表。根据公式（1）计算PPI：
等式 （1）
Representative Results
所提出的方法允许对牙齿上的牙菌斑覆盖区域进行快速，半自动的平面定量（图1）。斑块沉积物由赤藓氨酸可视化，而干净的牙齿区域以及获得的薄膜未染色16 （图2A）。当使用荧光相机采集图像时，清洁牙齿区域，牙菌斑覆盖区域和周围软组织之间的对比度显着增强（图2B，C）。荧光相机有两个检测窗口，一个在绿色光谱中，一个在红色光谱中。与干净的牙齿区域相比，牙菌斑覆盖的区域在红色通道中显得略亮（图2D，E）。在绿色通道中，牙齿的自发荧光在牙菌斑覆盖的区域被大大掩盖（图2F）。在图像分析过程中，当从红色通道图像中减去绿色通道图像时，利用了这种掩蔽效应（图2G）。所得图像中干净区域和斑块覆盖区域之间的强烈对比（图2H）允许基于强度阈值的半自动确定PPI。可同时处理多达 1，000 张荧光图像。
定制的3D打印垫片可用于改善相机头在与感兴趣牙齿相同距离处的标准化定位。垫片还可以保护牙齿免受环境光的影响，从而增强采集图像中公开的牙菌斑、清洁牙齿区域和周围软组织之间的对比度。垫片在三个固定元件的帮助下安装在摄像头上（图3）。
所述方法可用于面部和口腔牙齿表面龈上斑块和结石的平面测量记录（图4A-D）。根据牙弓的曲率，可能很难将垫片定位在与牙龈紧密接触的位置，从而在摄像头和牙齿之间保持相同的距离。由于牙菌斑区域的覆盖率是相对于总牙齿面积确定的，因此这种差异不太可能影响PPI记录。不同的牙齿颜色材料在绿色光谱中发出不同强度的荧光17，18，19。因此，PPI通常可以用标准图像分析算法来确定玻璃离聚物水泥和复合树脂修复体的牙齿（图4E-H）。相比之下，汞合金和石膏修复体通常在红色和绿色通道中微弱地发出，因此无法确定此类表面上的斑块覆盖率（图4I，J）。金属正畸托槽也是如此，但由于托槽表面通常被排除在PPI记录之外，因此半自动平面测量适用于正畸患者（图4K，L）。
荧光图像上斑块覆盖区域的成功半自动识别高度依赖于临床程序所有步骤的仔细执行。如果过多的环境光进入图像，红色通道中背景的亮度会增加，这使得牙齿和软组织之间的区分变得困难（图5A，B）。因此，在图像捕获过程中需要调暗房间的灯光。如果患者在图像采集过程中没有充分张开嘴巴，则拮抗剂牙齿可能会与感兴趣的牙齿一起成像并阻碍半自动处理（图5C）。对前磨牙或臼齿进行平面测量时，相机的正确角度对于避免对咬合面的部分进行成像非常重要（图5D，E）。一旦斑块沉积物被披露，操作员应立即进行图像采集。否则，赤藓氨酸可能会被洗掉，牙菌斑覆盖和干净的牙齿区域之间的对比度可能会变得太微弱。然而，在某些情况下，公开的溶液可能会强烈染色牙龈，并且在随后的漂洗过程中可能不会去除污渍（图5F）。为避免高估斑块覆盖的区域，可以通过额外的冲洗或用棉丸轻轻擦拭牙龈来减少污渍。
图 1：半自动定量牙齿表面牙菌斑覆盖率的工作流程。 缩写：PPI = 平面学斑块指数。 请点击此处查看此图的大图。
图2：数字图像分析程序。 （A）公开牙菌斑的白光图像（牙齿26，面部方面）。（B）使用荧光相机（红-绿-蓝[RGB]模式）获取的相应图像。请注意，牙菌斑覆盖和干净的牙齿区域之间的对比度增强。（C）由橙色轮廓标记的总牙齿面积通过基于强度阈值的分割来识别。（D）将RGB图像中的对象层转移到红色通道图像（橙色轮廓），并删除非对象像素（背景，软组织）。（E） 红色通道图像的亮度提高了两倍。（F） 绿色通道图像。注意斑块覆盖区域的自发荧光减少。（G）从修改后的红色通道图像（E）中减去绿色通道图像（F）后，牙菌斑覆盖区域与清洁牙齿区域之间的对比度很明显。（H）基于强度阈值的分割后，将斑块覆盖的区域识别为物体（橙色轮廓），并计算平面斑块指数（PPI）（PPI = 81.6%）。请点击此处查看此图的大图。
图 3：定制垫片。 从 （A） 正面、（B） 侧和 （C） 背面查看的定制垫片。（D） 带有安装垫片的荧光相机（橙色轮廓）。 请点击此处查看此图的大图。
图4：半自动平面测量的应用和局限性。 （A）面部牙齿表面的荧光图像。（B）显示斑块覆盖区域的相应处理图像（橙色轮廓;平面学斑块指数[PPI] = 51.9%）。（C）口腔牙齿表面的荧光图像。（D）相应的处理图像，显示斑块覆盖的区域（橙色轮廓;PPI = 14.5%）。（E-H）带有复合树脂修复体的牙齿图像。E中的修复体在绿色光谱中发出强烈的荧光，而G中的修复体似乎比周围干净的牙齿区域略微弱。在这两个图像中，PPI都可以使用标准图像分析算法确定。（F，H）显示斑块覆盖区域的处理图像（橙色轮廓;PPI = 分别为 20.3% 和 20.2%）。（一，一）具有汞合金修复体（I）的牙齿和具有金属陶瓷冠的牙齿（J，蓝色轮廓，手动添加）的荧光图像。两种修复体都是无荧光的，斑块沉积物不能通过半自动平面法定量。（K）带有金属正畸托槽的牙齿的荧光图像。由于括号被排除在分析之外，因此可以使用标准图像分析算法（L，橙色轮廓，PPI = 31.5%）确定PPI。请点击此处查看此图的大图。
图5：临床程序对图像质量和半自动平面测定结果的影响 。 （A）用昏暗的室内灯光采集的荧光图像。在基于阈值的图像分割（橙色轮廓）后，正确确定总牙齿面积。（B）在打开房间灯的情况下获得的相同牙齿的荧光图像。由于红色光谱中背景发射增加，基于阈值的分割无法准确区分牙齿表面和周围的软组织（橙色轮廓）。（C）张口不足的情况下采集的荧光图像。未公开的拮抗剂牙齿在图像中可见，因此包含在总牙齿区域（橙色轮廓）中。为了获得正确的平面斑块索引，必须在图像分析过程中手动去除它们。（D）使用相机头的最佳定位获取的荧光图像。总牙齿面积（橙色轮廓）仅限于面部方面。（E） 在相机 头角度欠佳的情况下获得的 D 中牙齿的荧光图像。咬合面的一部分被捕获，导致牙齿总面积增加（橙色轮廓）。（F）牙龈染色明显的暴露斑块的白光图像。红色光谱中的高发射可能导致高估斑块覆盖的区域。 请点击此处查看此图的大图。
补充文件S1：请点击此处下载此文件。
Discussion
与传统平面测量法20相比，所提出的基于荧光图像的半自动平面测量方法在研究环境中改善了健全牙齿表面的牙菌斑定量。半自动平面测量允许使用预先确定的后处理算法同时测定多达 1，000 张图像中的 PPI。因此，该方法比传统的平面测量法更具时间效率，在传统的平面测量中，总牙齿面积和牙菌斑覆盖区域是通过在图像处理软件7，12中绘制感兴趣的区域手动确定的。此外，图像分析中的人为判断范围减少到图像分割的亮度阈值的选择。因此，对所有图像一视同仁，审查员主观性的影响大大降低11.
协议中的关键步骤主要与临床程序有关，临床程序需要以高度标准化的方式执行以获得最佳图像质量。必须轻柔均匀地涂抹公开溶液，并且应在冲洗和风干后立即获取图像，以避免染料被冲刷，从而损失图像对比度。此外，需要避免牙龈出血，因为血红蛋白可能会增强红色通道19中记录的荧光。图像捕获应在房间灯光调暗的情况下进行，以减少环境光的干扰，并且患者需要充分张开嘴巴，以使图像中不会出现拮抗剂牙齿。摄像头必须垂直于齿轴放置，以避免捕获部分咬合面和对侧牙齿。
在大多数情况下，在图像分析过程中可以消除由次优图像采集产生的伪影，但代价是处理时间大大增加。在分割过程中被识别为对象的一些工件可以通过在对象编辑器中进行简单的删除来清除。如果工件与识别为斑块的区域汇合，则在删除之前，必须在对象编辑器中拆分生成的对象。在极端情况下，操作员可能不得不通过在软件中绘制感兴趣的区域来手动确定干净的牙齿和牙菌斑覆盖的区域。如果所有临床程序都准确执行，则操作员在图像分析期间的唯一主观输入包括确定基于阈值的分割的截止值。通常，图像中明确定义了牙菌斑覆盖和清洁的牙齿区域，但需要提及的是，所选阈值的微小差异确实会影响计算的PPI值，尽管程度相对较低。由于为特定研究获取的所有图像都可以使用相同的阈值进行分割，因此临界值的主观选择不会影响治疗或患者组之间的差异。
就像手动平面测量一样，由于使用披露溶液，半自动平面测定法不适合斑块积聚的纵向记录。赤藓红氨酸可能通过抗菌活性干扰生物膜生长21，22，23，但最重要的是，突出的污渍需要在患者被送回家之前去除专业的斑块。然而，所述方法可用于临床中习惯性斑块水平的定期定量。半自动平面测量的另一个限制是由于单个牙齿之间的尺寸差异而出现的。尽管相机与牙齿表面之间的距离以及视野的大小可以标准化，但获取的图像可能包括相邻牙齿的部分。这些不能通过批处理操作删除，而只能通过在分析过程中手动裁剪图像来删除。虽然半自动平面测量适用于定量健全牙齿表面上的牙龈上斑块和结石24，但未来的工作必须确定所述方法如何受到发育缺陷25，空化和非空化龋齿病变以及严重染色的影响。
总之，半自动平面测量是一种可以使用荧光相机快速可靠地量化斑块区域覆盖率的方法。它可以用于评估不同患者群体中 新发 斑块形成或不同治疗方案对斑块去除的影响的临床试验。
Disclosures
该研究由 Novozymes A/S 和丹麦创新基金（批准号 9065-00244B）资助。资助者在数据的收集、分析和解释或报告撰写方面没有任何作用。
Acknowledgments
作者感谢Dirk Leonhardt在定制间隔条的增材制造方面的出色帮助。Lene Grønkjær，Javier E. Garcia，Charlotte K. Vindbjerg和Sussi B. Eriksen在研究期间的技术支持得到了认可。作者还要感谢Matthias Beck在荧光相机使用方面的技术支持，并感谢Mette R. Jørgensen富有成效的讨论。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3D Sprint Basic | 3D systems | Additive manufacturing software | |
| 5% erythrosine; Top Dent Rondell Röd | Top Dent Lifco Dental AB | 6327 | Disclosing solution |
| D1000 lab scanner | 3 Shape | Lab scanner used to scan the camera head | |
| DBSWIN 5.17.0 | Dürr Dental | Software for VistaCam | |
| Digital image analysis in microbial ecology (Daime), version 2.2.2 | Freeware for image analysis | ||
| LC-3D Print Box | NextDent | Polymerization unit | |
| Meshmixer 3.5 | Autodesk | Freeware for designing custom-made spacer | |
| NextDent 5100 | 3D systems | 3D-printer | |
| NextDent Ortho IBT | 3D systems | Material for spacer | |
| Ultrasound bath T660/H | Elma Schmidbauer GmbH | ||
| VistaCam iX HD Smart intraoral camera | Dürr Dental | Coupled with a fluorescence camera head |
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