Summary
Vi etablerede en musemodel for kronisk leverfibrose, som giver en passende dyremodel til det virusinducerede leverfibrose mekanistiske studie af galdeatresi (BA) og en platform for fremtidige BA-behandlinger.
Abstract
Biliær atresi (BA) er en dødelig sygdom, der involverer obstruktiv gulsot, og det er den mest almindelige indikation for levertransplantation hos børn. På grund af den komplekse ætiologi og ukendte patogenese er der stadig ingen effektive lægemiddelbehandlinger. På nuværende tidspunkt er den klassiske BA-musemodel induceret af rhesusrotavirus (RRV) den mest almindeligt anvendte model til undersøgelse af patogenesen af BA. Denne model er kendetegnet ved vækstretardering, gulsot i hud og slimhinde, lerafføring og mørk gul urin. Histopatologien viser alvorlig leverbetændelse og obstruktion af de intrahepatiske og ekstrahepatiske galdekanaler, som ligner symptomerne på human BA. Imidlertid mangler leveren hos mus i slutstadiet i denne model fibrose og kan ikke fuldt ud simulere egenskaberne ved leverfibrose i klinisk BA. Den præsenterede undersøgelse udviklede en ny BA-musemodel af kronisk leverfibrose ved at injicere 5-10 μg anti-Ly6G-antistof fire gange med mellemrum på 2 dage efter hver injektion. Resultaterne viste, at nogle af musene med succes dannede kronisk BA med typisk fibrose efter tidsforløbet, hvilket betyder, at disse mus repræsenterer en passende dyremodel til den virusinducerede leverfibrose mekanistiske undersøgelse af BA og en platform til udvikling af fremtidige BA-behandlinger.
Introduction
Biliær atresi (BA) er en alvorlig hepatobiliær sygdom, der ofte forekommer hos spædbørn og småbørn; Specifikt præsenterer den som en udslettende cholangiopati med neonatal gulsot og bleg afføring1. Dens kliniske egenskaber er inflammatorisk ødelæggelse af de intrahepatiske og ekstrahepatiske galdekanaler og progressiv fibrose, som til sidst udvikler sig til leversvigt2. Ifølge statistikker er forekomsten af BA i asiatiske lande højere end i europæiske og amerikanske lande, og forekomsten af BA i asiatiske lande er 1/8.000. Ætiologien af BA omfatter virusinfektion, unormal galdegang udvikling, immunsygdomme, og genetiske variationer3. Kasai kirurgi er den mest almindeligt anvendte metode til at forbedre kolestase hos børn med BA, men i sidste ende kan dette ikke forhindre progression af fibrose4. Den nuværende behandling for BA er hovedsageligt afhængig af levertransplantation, som er begrænset af manglen på leverkilder. En grundig undersøgelse af patogenesen af BA er det mest direkte middel til at løse udfordringerne ved denne sygdom. Undersøgelser af patogenesen af BA er imidlertid hovedsageligt afhængige af BA-dyremodeller, og det er afgørende at vælge en passende dyremodel.
De fleste histopatologiske undersøgelser af BA har vist, at galdegangshyperplasi (BDP), galdetrombose og portalvenefibrose er de vigtigste patologiske træk ved BA, og andre patologiske træk af forskellige kvaliteter findes på samme tid, såsom portalinflammatorisk celleinfiltration og hepatocythævelse 5,6. På nuværende tidspunkt er der en række musemodeller, der efterligner BA, såsom den kroniske 3,5-die-thoxycarbonyl-1,4-dihydrocollidin (DDC) -fodrede musemodel med segmental galdegangsobstruktion og pericholangitis, der involverer de ekstrahepatiske galdekanaler7 og musemodellen af leverfibrose med en intraperitoneal injektion af carbontetrachlorid8. Galdekanalligeringsmodellen (BDL) er kendetegnet ved gulsot og hurtig portalvenefibrose9. Den alfa-naphthylisothiocyanat (ANIT) -fodrede musemodel præsenterer med cholangitis begrænset til den intrahepatiske galdegang og hepatocytskade10. En musemodel med langvarig gulsot induceres af forsinket rhesusrotavirus (RRV) podning11. Selvom der er en række dyremodeller, især musemodeller, har hver model sine egne begrænsninger. De kan kun simulere en del af sygdomsegenskaberne ved BA, såsom akut betændelse eller leverfibrose i processen med galde atresi, og der er ingen model, der er meget i overensstemmelse med sygdomsprocessen og patologiske træk ved BA.
Den klassiske BA-musemodel induceres af RRV, og denne model er den mest lignende model til BA hos mennesker. Mens RRV-inducerede BA-modelmus imidlertid viser lignende kliniske symptomer og patologiske egenskaber som nogle af dem ved ekstrahepatisk galdeatresi, mangler denne model leverfibrose, hvilket i høj grad begrænser den dybtgående undersøgelse af BA-mekanismerne og udviklingen af nye behandlinger12. Derfor udviklede denne undersøgelse en ny BA-musemodel af kronisk leverfibrose. Anti-Ly6G-antistof blev intraperitonealt injiceret før RRV-podning på fødselsdagen. Derefter blev 5-10 μg anti-Ly6G-antistof injiceret fire gange med mellemrum på 2 dage mellem hver injektion. BA-symptomerne hos mus blev forbedret, overlevelsestiden blev forlænget, og musene kom ind i kronisk fibrose-stadiet. Denne model simulerer ikke kun BA's akutte faserespons, men efterligner også leverprocesserne og progressiv fibrose. Det er således en mere velegnet dyremodel til mekanistisk undersøgelse af BA, og det kan give et teoretisk grundlag for at udvikle fremtidige behandlinger for BA.
Gr-1-molekylet er en myeloidafledt celleoverflademarkør, der oprindeligt viste sig at være udtrykt i neutrofiler13. Udtømningen af anti-Ly6G-antistoffer reducerer cirkulerende neutrofiler med mere end 90% og ændrer responsen aktiveret af andre immunceller. Funktionerne af Gr-1+ cellepopulationer er blevet rapporteret i forskellige undersøgelser ved anvendelse af specifikke skylleantistoffer med varierende virkninger identificeret på cytokiner og medieret immunbeskyttelse14. Vi har undersøgt funktionen af Gr-1+ celler i RRV-inokulerede BA-musemodeller. Da Gr-1-molekylet imidlertid ikke har vist sig at blive udtrykt hos mennesker, er et lignende molekyle, CD177, blevet undersøgt hos BA-patienter15. Vores data beviser betydningen af Gr-1+ cellepopulationer, især i sygdommens kroniske fibrotiske fase, og giver en passende dyremodel til at undersøge potentielle BA-behandlinger.
Protocol
Denne undersøgelse blev godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee of Guangzhou Yongnuo Biomedical Animal Center (IACUC-AEWC-F2208020), hvor alle dyreforsøg blev udført.
1. Etablering af den kroniske fibrotiske BA-musemodel
BEMÆRK: Alle dyrene blev holdt i et specifikt patogenfrit (SPF) miljø i samme rum, og forsøgene blev udført i et konventionelt miljø. BALB/c-mus på drægtighedsdag 12,5 (alder: 10-12 uger; vægt 35-40 g) blev holdt i et rum uden specifikke patogener ved 25 °C under en 12 timers mørk/lys cyklus og fik fri adgang til autoklaveret mad og vand. Nyfødte mus inden for 24 timer efter fødslen (gennemsnitlig kropsvægt: 1,5-1,6 g) blev valgt til musens BA-model.
- Forbered RRV som tidligere rapporteret16.
BEMÆRK: På grund af modelmusenes dårlige overlevelsesstatus skal de adskilles, når de er 21 dage gamle for at undgå, at de bliver bidt eller endda dræbt af andre mus i samme bur. - Opdel neonatale mus i tre grupper: kontrolgruppen, RRV-gruppen og RRV + anti-Ly6G-gruppen. Intraperitonealt injiceres de neonatale mus med 20 μL RRV (titer: 1,5 x 106 PFU/ml) (RRV-gruppe) eller saltvand (kontrolgruppe) inden for 24 timer efter fødslen. For at nedbryde Gr-1+ celler skal du forbehandle hver mus med en intraperitoneal injektion af 5 μg anti-Ly6G-antistof 4 timer før RRV-injektionen.
BEMÆRK: Anti-Ly6G-antistofopløsningen opbevares ved 2-8 °C og må ikke fryses. Tag antistoffet ud før brug og sæt det ved stuetemperatur i 30 minutter for at varme op. - Injicer 10 μg anti-Ly6G-antistof i musens underliv hver 3. dag indtil dag 12 efter RRV-injektionen (figur 1A).
- Kontroller og registrer udseendet, vægten og overlevelsen af alle musene dagligt.
2. Intraperitoneal injektion af musene
- Fjern nyfødte mus fra buret. Brug en 1 ml insulinsprøjte til at injicere 20 μL RRV-opløsning eller 50 μL anti-Ly6G-antistofopløsning. Klem halshuden på den unge mus med pegefingeren og tommelfingeren på den ene hånd, og hold forsigtigt musens bagben med ringfingeren og halefingeren for at udsætte maven.
- Løft nålen i en opadgående hældning. Stik nålen ind i midten af låret på musens højre bagben i en vinkel på 15° med huden. Efter at have bevæget sig langs den subkutane sti, indtil nålen når musens højre kystkant, skal nålen ledes nedad i bukhulen. Injicer derefter væsken under musens lever.
BEMÆRK: Nyfødte mus har deres mave og milt i venstre mave. Hvis en nål indsættes på venstre side, er det let at gennembore maven eller forårsage miltblødning. - Træk kanylen ud umiddelbart efter injektionen, og hold øje med blødning eller lækage på injektionsstedet. Hvis der er nogen, skal du tørre det af med en autoklaveret bomuld. Sæt musen tilbage i sin mors bur.
BEMÆRK: For at reducere indflydelsen af væskelækage under injektion på forsøgsresultaterne skal du sikre dig, at injektionsvirkningen er skånsom, langsomt fjerne nålen og trykke på injektionsstedet med en vatpind i 30 sekunder.
3. Udtagning af prøvevæv
- På dag 12 bedøves musene med 4% isofluranindånding og dissekeres under et mikroskop. Indsæt en 1 ml insulinsprøjte i hjertets venstre ventrikel for at opsamle blod. Efter blodindsamling aflives musene ved inhalation af 4% isofluran i 10 min. Centrifuger blodet ved 400 × g i 5 minutter ved stuetemperatur, og serumet adskilles til måling af leverfunktionen.
BEMÆRK: Blodindsamling skal udføres, mens musene er i live. Hvis musene dør, vil blodet blive tilbageholdt i blodkarrene og kan ikke opsamles. - Fotografer det generelle udseende af leveren og galdegangen. Derefter dissekeres museleveren og milten fra det omgivende væv med saks og pincet.
BEMÆRK: Leveren og andet væv opsamles og reserveres ved -80 ° C til RNA- og proteinekstraktion eller gennemblødes i 10% formalin til fremstilling af histologiske prøver.
4. Fluorescein angiografi af den ekstrahepatiske galdegang
- Efter aflivning af musen skal du helt udsætte leveren, galdeblæren og ekstrahepatiske galdekanaler med saks og vatpinde.
- Overhold under et kropsholdningsmikroskop, injicer 5-10 μL af det fluorescerende farvestof rhodamin 123 (20 mg / ml) i galdeblæren med en 1 ml insulinsprøjte og tag billeder. Denne proces er den samme som den, der blev rapporteret i en tidligere16.
BEMÆRK: Forskellige mus i samme gruppe anvendes til prøvevævsopsamling og fluorescensangiografi.
5. H&E-farvning
- Dyp frisk muselevervæv i 10% formalin i 24 timer.
- Efter indlejring af vævet i paraffin, brug en paraffinmikrotomt til at skære paraffinblokken i sektioner med en tykkelse på 4 μm og placere to på hinanden følgende sektioner på samme dias. Erfarent personale er forpligtet til at standardisere operationen for at undgå fingersnit17.
- Læg skiverne i en skiverist, afvoks dem i xylen, hydrat dem successivt i absolut ethanol, 95% ethanol, 80% ethanol, 70% ethanol og destilleret vand og blød i hver i 5 minutter.
- Plet sektionerne med hæmatoxylinopløsning i 5 minutter, og blød dem i 1% saltsyre og 75% alkohol i 5 s. Skyl sektionerne med rent vand, og pletter med eosinopløsning i 1 min.
6. CK19 og F4/80 immunhistokemisk farvning
- De første tre trin er de samme som trinnene til vævsindlejring, sektionering og afvoksning i H&E-farvningsafsnittet.
- Udfør antigenreparation med Tris-EDTA-buffer (10 mmol / L Tris base, 1 mmol / L EDTA-opløsning, pH 9,0), opvarm sektionerne i en mikrobølgeovn ved 95 ° C i 10 minutter, og fjern og afkøl dem derefter naturligt til stuetemperatur.
- Anbring vævssektionerne i 3% hydrogenperoxidopløsning i 10 minutter for at fjerne endogen peroxidase.
- Behandl skiverne med 5% gedeserum for at blokere uspecifik binding.
- Der tilsættes primært antimusecytokeratin 19 hos rotter eller monoklonalt antistof mod mus F4/80 på rotter til sektionerne, og der inkuberes natten over ved 4 °C.
- Inkuber sektionerne med passende sekundære antistoffer i 30 minutter ved stuetemperatur.
- Der anvendes 3,3'-diaminobenzidin (DAB) som kromogent middel til at observere kromogenreaktionen under mikroskop.
- Overhold skiverne under et 40x mikroskop for at få billeder, og analyser dem efter behov.
7. Sirius rød farvning
- Udfør de første tre trin med vævsindlejring, sektionering og afvoksning som beskrevet i afsnittet H&E-farvning.
- Når vævssektionerne er modfarvet med hæmatoxylin, dækkes hvert væv med 50 μL Sirius Red dye-opløsning ved stuetemperatur i 1 time.
- Tør diasene naturligt ved stuetemperatur i 4 timer, tilsæt en dråbe neutralt tyggegummi til hvert dias, og brug et dæksel til langsomt at dække vævet for at undgå bobler. Lad diasene stå ved stuetemperatur i 24 timer for at størkne det neutrale tyggegummi.
- Brug en polariseret kontrastlysmikroskopi til at observere detaljerne i kollagenaflejring; Vælg et klart og passende synsfelt, og juster lysstyrken og hvidbalancen i mikroskopets synsfelt. Få billeder, og analyser dem efter behov under et 40x mikroskop.
Representative Results
Musene blev intraperitonealt injiceret med 5 μg anti-Ly6G-antistof inden for 24 timer efter fødslen og derefter intraperitonealt injiceret med 20 μL RRV 4 timer senere. Derefter blev 10 μg anti-Ly6G-antistof injiceret hver 3. dag indtil dag 12 (figur 1A). Den mediane overlevelsestid i RRV-gruppen var 13 dage. Tværtimod udviklede de fleste af de mus, der blev behandlet med antistoffet, mild gulsot, og der blev ikke observeret vægttab (figur 1C). Omkring 20% -30% af musene havde BA-syndrom med langvarig gulsot og lav kropsvægt, men overlevede i mere end 42 dage. Efter anti-Ly6G-antistofbehandling faldt antallet af Gr-1+ cellermed 15, og musene gik ind i stadiet med kronisk fibrose, kaldet kronisk BA. Prøver blev indsamlet på dag 12 og dag 42, og vævsskiver farvet med Sirius Red viste en gradvis stigning i leverfibrose. De kroniske BA-mus, der overlevede i 42 dage, blev brugt til detaljerede analyser. Ud over den lille størrelse viste ørerne, fødderne og halehuden markeret gulsot (blå pile i figur 1E). På dag 6 efter RRV-injektionen blev musenes afføringsfarve lysere, og urinfarven blev mørkere; dette blev signifikant forskelligt fra kontrolgruppen på dag 12, da RRV-gruppens mus viste hvid afføring og mørkegul urin. På dag 42 viste urin og afføring fra de kroniske BA-mus også tydelige træk ved gulsot (figur 1D, E). Leveren fra BA-musene blev fjernet og sammenlignet med kontrollernes. Leveren var mindre (figur 2B), nekrotiske læsioner var synlige for det blotte øje (figur 2A, sort trekant), og et segment af galdegangataresi blev også observeret ekstrahepatisk (figur 2A, hvide stjerner).
Levervævssektionsanalyse viste, at lavdosis anti-Ly6G-terapi reducerede portalvenebetændelse. Imidlertid blev inflammatorisk celleakkumulering stadig observeret i levervævsskiverne på dag 42 (figur 3A). Sirius Rød farvning viste en lille stigning i aflejringen af kollagen i portalområdet på dag 12 efter RRV-injektionen. Desuden blev der ikke observeret signifikante ændringer i kollagenekspression efter behandling med anti-Ly6g-antistoffet, men kollagenekspressionen i BA-vævsprøver på dag 42 var signifikant øget (figur 3B). Når det blev undersøgt under et polariseret lysmikroskop, blev det observeret, at kollagenfibre var akkumuleret i det tilstødende levervæv. En betydelig aflejring af kollagen, overvejende grøn, blev set i BA-vævsprøverne på dag 42 (figur 3C), og kollagenaflejringen steg yderligere hos mus, der overlevede i 42 dage uden vægtøgning. Med reduktionen af portalinflammation blev CK19+ galdegangsceller observeret på dag 12. På dag 42 var modne galdegange imidlertid næppe påviselige, selvom der blev set en stigning i CK19+ galdegangsceller (figur 4A, røde pile angiver galdegangepitelceller). I tilfælde af ekstrahepatiske galdekanaler hos mus med kronisk BA afslørede seriel dissektion af portalregionen hos mus, at de ekstrahepatiske galdekanaler var blokeret og havde inflammatoriske infiltrater af makrofager (figur 4B, sorte pile angiver makrofager).
Sammenlignet med RRV alene nedsatte behandling med en lav dosis anti-Ly6G-antistof leverskade med hensyn til leverenzymniveauer på dag 12 efter RRV-podning. Alaninaminotransferase- og alkalisk fosfataseniveauerne i leveren var højere i den kroniske BA-gruppe end i den normale kontrolgruppe. De mest udtalte ændringer blev fundet i bilirubinniveauerne, hvor RRV + anti-Ly6G-mus viste reducerede TBIL-, DBIL- og IBIL-niveauer i akut BA i modsætning til RRV alene. Hos mus med kronisk BA blev niveauerne af TBIL, DBIL og IBIL øget (figur 5), hvilket indikerer, at leverfunktionen var signifikant reduceret i BA's kroniske fibrosestadium.
Figur 1: Virkningerne af anti-Ly6G-antistofbehandling i en musemodel af galdeatresi inficeret med RRV. (A) Skematisk illustration af lave doser antistoffer til inducering af akut og kronisk fase BA hos mus med pile, der angiver tidspunktet for injektion af antistoffet og RRV. (B) Overlevelseskurver for musene i den normale kontrolgruppe (Cont.), rhesusrotavirus (RRV) gruppen og RRV + anti-Ly6G antistofgruppen. (C) Kropsvægtkurver for musene i hver gruppe. (D) Repræsentative billeder af musene og deres afføring og urin i hver gruppe på dag 12. (E) Repræsentative billeder af musene og deres afføring og urin i hver gruppe på dag 42. De blå pile angiver de gule ører og hale. Denne figur er genoptrykt med tilladelse fra Zhang et al.15. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Virkningerne af anti-Ly6G-antistofbehandling på leveren i en musemodel af galdeatresi inficeret med RRV . (A) Sammenligning af leveranatomi og ekstrahepatisk galdegangsfluorescensangiografi mellem kroniske BA-mus (højre) og normale mus på dag 42. (B) Sammenligning af leverstørrelsen mellem kroniske BA-mus og normale mus. Den sorte trekant indikerer levernekrose hos mus med kronisk BA. Den hvide stjerne angiver ekstrahepatisk galde atresi. Denne figur er genoptrykt med tilladelse fra Zhang et al.15. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Levervævsskiver af musene i den normale kontrolgruppe (Cont.), rhesusrotavirus (RRV) gruppen og RRV + anti-Ly6G antistofgruppen på dag 12 og dag 42. (A) Billeder af levervævssektioner farvet med hæmatoxylin og eosin (H&E). (B) Sirius Rød farvning viste kollagenaflejring (PSR). (C) Yderligere observation af skiverne ved hjælp af polariseret lysmikroskopi (Pol. Light). Forkortelse: PV = portalvene. Skalabjælke = 50 μm. Dette tal er blevet ændret fra Zhang et al.15. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Immunohistokemisk farvning af levervævsskiver fra den normale kontrolgruppe (fortsat), rhesusrotavirus (RRV) gruppe og RRV + anti-Ly6G antistofgruppe på dag 12 og dag 42 . (A) Ekspression af galdegangsepitelcellemarkør (CK19) i forskellige behandlingsgrupper. (B) Inflammatorisk celleinfiltration af makrofager blev påvist i forskellige behandlingsgrupper. Forkortelse: PV = portalvene. Den røde pil angiver galdekanalepitelceller. Den sorte pil angiver makrofager. Skalabjælke = 50 μm. Dette tal er blevet ændret fra Zhang et al.15. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Sammenligning af leverfunktion hos mus i forskellige behandlingsgrupper. Musblod blev indsamlet efter eksperimentet og testet i laboratorieafdelingen på hospitalet. Hver gruppe indeholdt tre til fem mus. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001. Forkortelser: ALT = alaninaminotransferase; ASAT = aspartataminotransferase; ALP = alkalisk fosfatase; TBIL = total bilirubin; DBIL = direkte bilirubin; IBIL = indirekte bilirubin. Dette tal er blevet ændret fra Zhang et al.15. Klik her for at se en større version af denne figur.
Discussion
I vores undersøgelse brugte vi anti-Ly6G-antistof til at eliminere eller mindske Gr-1+ celler i en musemodel af galdeatresi inficeret med RRV for at forbedre akut BA-syndrom, forlænge overlevelsesraten og gøre det muligt for BA-mus at komme ind i den kroniske fase. Reduktion af antistofdosis kan føre til kronisk BA med leverfibrose, hvilket indikerer, at antallet af Gr-1+ celler ændrer resultatet af BA i de akutte og kroniske faser. I vores tidligere undersøgelse blev Gr-1+ celler reduceret efter administration af anti-Ly6G antistof, og den samlede overlevelsesstatus for BA-musene blev forbedret15. Samtidig er det blevet rapporteret, at Gr-1 + makrofager19, Gr-1 + neutrofiler 20, Gr-1 + myeloide celler21 og Gr-1 + granulocytter kan forbedre fibrose i nogle dyremodeller 22. I denne undersøgelse blev Gr-1 + celler hos mus imidlertid delvist udtømt med lave doser anti-Ly6G-antistof, og kollagenaflejringer forblev. Som følge heraf kan der være behov for mere tid til at behandle sygdommen mere grundigt.
Anvendelsen af anti-Ly6G-antistoffet nedsatte inflammation, bevarede delvist galdegangene og forhindrede akut BA-induceret død hos mus. Imidlertid kom kun 20% til 30% af musene ind i den kroniske fase af BA; Dette kan være relateret til tidspunktet og antallet af injektioner af anti-Ly6G-antistof. Vi er nødt til at undersøge dette nøglepunkt yderligere for at forbedre succesraten. Derudover mener vi, at ikke kun Gr-1+ celler, men også andre immunceller kan spille vigtige roller, såsom NK-celler, T-celler, B-celler og makrofager.
Hvad angår protokollen, skal nogle detaljer noteres. (i) For at undgå lækage af injicerede lægemidler bruger vi en 1 ml insulinsprøjte med en nål med en diameter på 0,33 mm, fordi nålediameteren er lille, og nålehullet i sprøjten er lille, hvilket bidrager til at reducere muligheden for lægemiddellækage. (ii) Før injektionen skal musen fastgøres for at forhindre den i at bevæge sig, undgå lægemiddellækage og dermed yderligere sikre den eksperimentelle effekt. (iii) Under lægemiddelinjektion injicerede vi lægemidlet så vidt muligt i overfladen eller den nedre margen af museleveren, så lægemidlet kom ind i maven og kontaktede leveren fuldt ud for at træde i kraft. (iv) Injektionen foretages normalt fra musens øverste højre lår, fordi den nyfødte mus' mave og milt er i venstre del af maven, og maven er fuld af mælk. Hvis nålen indsættes fra venstre side, kan den let punktere maven, hvilket får mælk til at strømme ind i maven eller punktere milten og forårsage blødning.
CD177 er en homolog af Ly6G, og ekspressionen af CD177 hos BA-patienter er blevet undersøgt. CD177 kan bruges som markør for tidlig diagnose af BA hos børn, hvilket indikerer, at CD177+ celler spiller en væsentlig rolle i løbet af BA23. Ved at analysere RNA-sekventeringsdataene fandt vores team, at CD177-celler var den dominerende population af Gr-1 + celler; i mellemtiden viste Cd177−/− BALB/c-mus vaccineret med RRV en forsinket debut af BA og reduceret sygelighed og dødelighed18. Således har vores kroniske BA-musemodel åbenlyse fordele ved at studere patogenesen og sygdomsprogressionen af BA; det giver også en passende dyremodel til at studere potentielle behandlinger for BA.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter at oplyse.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af tilskud fra National Natural Science Foundation of China (81974056) til R.Z. og fra National Nature Youth Foundation of China (82101808) og Science and Technology Planning Project of Guangzhou (nr. 202102020196) til Z.L.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Balb/c mouse | Guangdong Skarjingda Biotechnology Co., LTD | 20221000112 | |
| rat anti-mouse Ly6G | Bio X Cell | clone 1A8 | West Lebanon, NH |
| rat anti-mouse cytokeratin 19 | Developmental Studies Hybridoma Bank | clone TROMA III | Iowa City, IA |
| rat anti-mouse F4/80 | R&D Systems | MAB5580 | Minneapolis, MN |
| RRV strain | ATCC | MMU 18006 | Manassas, VA |
| Fluorescent stereomicroscope | Olympus | SZX7 | |
| Leica light microscopy | Leica Microsystems | Leica DMI8+DFC7000T | Wetzlar, Germany |
| Hitachi Pre-Analytical Process Automation System | Hitachi | 7600 Clinical Analyzer | Tokyo, Japan |
| Isoflurane anesthetic | RWD | R510-22-10 | |
| Rhodamine 123 | Sigma-Aldrich | 83702 | |
| sirius red dye | Leagene | DC0041 | |
| paraffin microtome | Leica Microsystems | RM2235 | |
| neutral gum | Solarbio | G8590 |
References
- Lakshminarayanan, B., Davenport, M. Biliary atresia: A comprehensive review. Journal of Autoimmunity. 73, 1-9 (2016).
- Bassett, M. D., Murray, K. F.
- Bezerra, J. A., et al. Biliary atresia: Clinical and research challenges for the twenty-first century. Hepatology. 68 (3), 1163-1173 (2018).
- Hartley, J. L., Davenport, M., Kelly, D. A.
- Lee, W. S., Looi, L. M. Usefulness of a scoring system in the interpretation of histology in neonatal cholestasis. World Journal of Gastroenterology. 15 (42), 5326-5333 (2009).
- Russo, P., et al. Key histopathologic features of liver biopsies that distinguish biliary atresia from other causes of infantile cholestasis and their correlation with outcome: A multicenter study. The American Journal of Surgical Pathology. 40 (12), 1601-1615 (2016).
- Fickert, P., et al. Characterization of animal models for primary sclerosing cholangitis (PSC). Journal of Hepatology. 60 (6), 1290-1303 (2014).
- Sonoda, S., et al. Biliary atresia-specific deciduous pulp stem cells feature biliary deficiency. Stem Cell Research and Therapy. 12 (1), 582 (2021).
- Xiao, Y., et al. Long noncoding RNA H19 contributes to cholangiocyte proliferation and cholestatic liver fibrosis in biliary atresia. Hepatology. 70 (5), 1658-1673 (2019).
- Desmet, V. J., Krstulović, B., Van Damme, B. Histochemical study of rat liver in alpha-naphthyl isothiocyanate (ANIT) induced cholestasis. The American Journal of Pathology. 52 (2), 401-421 (1968).
- Luo, Z., Shivakumar, P., Mourya, R., Gutta, S., Bezerra, J. A. Gene expression signatures associated with survival times of pediatric patients with biliary atresia identify potential therapeutic agents. Gastroenterology. 157 (4), 1138-1152 (2019).
- Mariotti, V., Strazzabosco, M., Fabris, L., Calvisi, D. F. Animal models of biliary injury and altered bile acid metabolism. Biochimica et Biophysica Acta. Molecular Basis of Disease. 1864, 1254-1261 (2018).
- Egan, C. E., Sukhumavasi, W., Bierly, A. L., Denkers, E. Y. Understanding the multiple functions of Gr-1(+) cell subpopulations during microbial infection. Immunologic Research. 40 (1), 35-48 (2008).
- McDermott, A. J., et al. The role of Gr-1(+) cells and tumour necrosis factor-α signalling during Clostridium difficile colitis in mice. Immunology. 144 (4), 704-716 (2015).
- Zhang, R., et al. The role of neonatal Gr-1(+) myeloid cells in a murine model of rhesus-rotavirus-induced biliary atresia. The American Journal of Pathology. 188 (11), 2617-2628 (2018).
- Fu, M., et al. A silver nanoparticle method for ameliorating biliary atresia syndrome in mice. Journal of Visualized Experiments. (140), e58158 (2018).
- Sy, J., Ang, L. C. Microtomy: Cutting formalin-fixed, paraffin-embedded sections. Methods in Molecular Biology. 1897, 269-278 (2019).
- Zhang, R., et al. CD177(+) cells produce neutrophil extracellular traps that promote biliary atresia. Journal of Hepatology. 77 (5), 1299-1310 (2022).
- Engel, D. R., et al. CX3CR1 reduces kidney fibrosis by inhibiting local proliferation of profibrotic macrophages. Journal of Immunology. 194 (4), 1628-1638 (2015).
- Liang, M., et al. A modified murine model of systemic sclerosis: Bleomycin given by pump infusion induced skin and pulmonary inflammation and fibrosis. Laboratory Investigation. 95 (3), 342-350 (2015).
- Chen, Y., et al. Differential effects of sorafenib on liver versus tumor fibrosis mediated by stromal-derived factor 1 alpha/C-X-C receptor type 4 axis and myeloid differentiation antigen-positive myeloid cell infiltration in mice. Hepatology. 59 (4), 1435-1447 (2014).
- Tomasson, M. H., et al. Fatal myeloproliferation, induced in mice by TEL/PDGFbetaR expression, depends on PDGFbetaR tyrosines 579/581. Journal of Clinical Investigation. 105 (4), 423-432 (2000).
- Zhang, R., Huang, J., Shan, J., Chen, Y., Xia, H. Peripheral blood CD177(+) cells as an early diagnostic marker for biliary atresia: A prospective multicentre study in pediatric patients with cholestasis. Journal of Hepatology. 77 (6), 1714-1716 (2022).
