क्रायो-एसटीईएम टोमोग्राफी द्वारा सीटू में ऑर्गेनेल का विज़ुअलाइज़ेशन

Summary

क्रायो-एसटीईएम टोमोग्राफी एम्बेडिंग, सेक्शनिंग या अन्य आक्रामक तैयारी के बिना बरकरार कोशिकाओं के ऑर्गेनेल की कल्पना करने का एक साधन प्रदान करता है। प्राप्त 3 डी रिज़ॉल्यूशन वर्तमान में कुछ नैनोमीटर की सीमा में है, जिसमें कई माइक्रोमीटर का क्षेत्र और 1 μm के क्रम में एक सुलभ मोटाई है।

Abstract

क्रायोजेनिक इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (क्रायो-ईएम) उनके मूल जलीय माध्यम में एम्बेडेड जैविक या कार्बनिक नमूनों की इमेजिंग पर निर्भर करता है; क्रिस्टलीकरण के बिना पानी को एक गिलास (यानी, विट्रीफाइड) में ठोस किया जाता है। क्रायो-ईएम विधि का व्यापक रूप से जैविक मैक्रोमोलेक्यूल्स की संरचना को निर्धारित करने के लिए उपयोग किया जाता है, हाल ही में निकट-परमाणु संकल्प पर। दृष्टिकोण को टोमोग्राफी का उपयोग करके ऑर्गेनेल और कोशिकाओं के अध्ययन के लिए विस्तारित किया गया है, लेकिन वाइड-फील्ड ट्रांसमिशन ईएम इमेजिंग का पारंपरिक मोड नमूना मोटाई में एक गंभीर सीमा से ग्रस्त है। इससे एक केंद्रित आयन बीम का उपयोग करके पतली लैमेला मिलिंग का अभ्यास किया गया है; पुनर्निर्माण से औसत सबटोमोग्राम द्वारा उच्च रिज़ॉल्यूशन प्राप्त किया जाता है, लेकिन शेष परत के बाहर त्रि-आयामी संबंध खो जाते हैं। स्कैनिंग ईएम या कॉन्फोकल लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोप के समान स्कैन की गई जांच इमेजिंग द्वारा मोटाई सीमा को दरकिनार किया जा सकता है। जबकि सामग्री विज्ञान में स्कैनिंग ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (एसटीईएम) एकल छवियों में परमाणु संकल्प प्रदान करता है, इलेक्ट्रॉन विकिरण के लिए क्रायोजेनिक जैविक नमूनों की संवेदनशीलता के लिए विशेष विचार की आवश्यकता होती है। यह प्रोटोकॉल एसटीईएम का उपयोग करके क्रायो-टोमोग्राफी के लिए एक सेटअप प्रस्तुत करता है। माइक्रोस्कोप के मूल सामयिक विन्यास को दो और तीन-कंडेनसर सिस्टम दोनों के लिए वर्णित किया गया है, जबकि स्वचालन गैर-वाणिज्यिक सीरियलईएम सॉफ्टवेयर द्वारा प्रदान किया जाता है। बैच अधिग्रहण और पहले से अधिग्रहित प्रतिदीप्ति मानचित्रों के सापेक्ष संरेखण के लिए वृद्धि भी वर्णित है। एक उदाहरण के रूप में, हम एक माइटोकॉन्ड्रियन के पुनर्निर्माण को दिखाते हैं, आंतरिक और बाहरी झिल्ली और कैल्शियम फॉस्फेट कणिकाओं, साथ ही आसपास के सूक्ष्मनलिकाएं, एक्टिन फिलामेंट्स और राइबोसोम को इंगित करते हैं। क्रायो-एसटीईएम टोमोग्राफी साइटोप्लाज्म में ऑर्गेनेल के थिएटर को प्रकट करने में उत्कृष्टता प्राप्त करती है और, कुछ मामलों में, यहां तक कि संस्कृति में अनुयायी कोशिकाओं की परमाणु परिधि भी।

Introduction

ऑर्गेनेल का त्रि-आयामी (3 डी) विज़ुअलाइज़ेशन आधुनिक सेल जीव विज्ञान में एक सर्वोपरि कार्य है। इसमें शामिल तराजू को देखते हुए, स्रावी पुटिकाओं के लिए दसियों नैनोमीटर से लेकर सेल नाभिक के लिए कई माइक्रोन तक, सभी अनुप्रयोगों को फिट करने के लिए एक माइक्रोस्कोपी तकनीक खोजना चुनौतीपूर्ण है। जबकि आधुनिक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी रिज़ॉल्यूशन के मामले में सीमा का अधिकांश विस्तार कर सकती है, केवल लेबल किए गए अणु दिखाई देते हैं। सेलुलर थिएटर इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी का क्षेत्र बना हुआ है। रासायनिक निर्धारण, प्लास्टिक एम्बेडिंग, और भारी धातुओं के साथ धुंधला करने के पारंपरिक तरीके दृढ़ता से आक्रामक हैं, इसलिए परिणाम नमूना तैयारी के विवरण पर निर्भर हो सकते हैं। दूसरी ओर, क्रायो-ईएम, जलीय माध्यम को विट्रीफाई करने की आवश्यकता से बाधित है; बर्फ के क्रिस्टल जो इलेक्ट्रॉन रोशनी को अलग करते हैं, जिससे कार्बनिक पदार्थ की तुलना में उच्च कंट्रास्ट की विपरीत कलाकृतियां होती हैं।

पिछले दशक में सेलुलर अध्ययन के लिए विकसित या अनुकूलित ईएम इमेजिंग तकनीकों का प्रसार देखा गया^है। स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप (यानी, एफआईबी-एसईएम) का उपयोग करके पुनरावृत्ति केंद्रित आयन बीम (एफआईबी) मिलिंग और सीरियल सरफेस इमेजिंग के साथ संयुक्त उच्च दबाव ठंड वर्तमान में बड़े नमूनों के लिए पसंद की विधि^है। क्रायोजेनिक सॉफ्ट एक्स-रे टोमोग्राफी (क्रायो-एसएक्सटी) आकार में कई माइक्रोन के नमूनों के लिए उपयुक्त है, जो पानी में नरम एक्स-रे की विशिष्ट अवशोषण लंबाई ^3,4,5 द्वारा सीमित है। इस पैमाने में कई बरकरार सेल प्रकार शामिल हैं, और एक्स-रे अवशोषण कंट्रास्ट की मात्रात्मक प्रकृति एकाग्रता माप⁶ या स्पेक्ट्रोस्कोपी⁷ का एक पहलू जोड़ती है। जब सबटोमोग्राम औसत के साथ जोड़ा जाता है, तो क्रायो-ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन टोमोग्राफी (क्रायो-ईटी), चरण कंट्रास्ट ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (टीईएम) के आधार पर, मैक्रोमोलेक्यूल्स या कॉम्प्लेक्स ^8,9,10 के लिए उच्चतम रिज़ॉल्यूशन प्रदान करता है। हालांकि, यह दुर्लभ है कि बरकरार ऑर्गेनेल इतने नियमित हैं कि उन्हें पूरे औसत किया जा सकता है। इसके अलावा, वाइड-फील्ड टीईएम का पारंपरिक मोड नमूना में इनलेस्टिक स्कैटरिंग (ऊर्जा हानि को शामिल करते हुए) और चुंबकीय उद्देश्य लेंस^11,12 में क्रोमैटिक विपथन के संयोजन से नमूना मोटाई के लिए कुछ सौ नैनोमीटर तक सीमित है। बड़ी ऊर्जा प्रसार परिणामी आउट-ऑफ-फोकस धुंध को हटाने के लिए एक ऊर्जा फिल्टर के उपयोग को निर्देशित करता है, लेकिन संवेदनशील नमूना अभी भी विकिरण क्षति का सामना करता है जबकि छवि संकेत बढ़ती मोटाई के साथ तेजी से कमजोर हो जाता है।

वैकल्पिक इमेजिंग मोड, स्कैनिंग ट्रांसमिशन ईएम (एसटीईएम), ऊर्जा फ़िल्टरिंग की आवश्यकता को दरकिनार करता है और छवि निर्माण के लिए असंगत रूप से बिखरे हुए इलेक्ट्रॉनों को बरकरार रखता है, हालांकि वर्तमान में टीईएम टोमोग्राफी (चित्रा 1) की तुलना में कम रिज़ॉल्यूशन पर। वास्तव में, कोई वास्तविक छवि नहीं बनती है। इसके बजाय, स्कैनिंग ईएम के रूप में, माप बिंदु-दर-बिंदु किए जाते हैं, और छवि को कंप्यूटर द्वारा इकट्ठा किया जाता है। आवर्धन केवल लेंस धाराओं को बदलने के बिना स्कैन चरणों के आकार से निर्धारित होता है। जब ठीक से कॉन्फ़िगर किया जाता है, तो क्रायो-एसटीईएम टोमोग्राफी (सीएसटीईटी) के लिए नमूना मोटाई की उपयोगी सीमा 1.5 या 2 μm तक पहुंच सकती है, हालांकि आराम क्षेत्र, जहां उपयोगी सिग्नल तीव्रता रोशनी का एक महत्वपूर्ण अंश बनी हुई है, लगभग 600-900 एनएम^11,13 है। यह साइटोप्लाज्म के एक बड़े अंश को देखने के लिए पर्याप्त है, और कभी-कभी सेल नाभिक का एक किनारा होता है। व्यवहार में, हम पाते हैं कि क्रायोजेनिक द्रव में गिरने की मानक विधि द्वारा विट्रीफिकेशन एसटीईएम इमेजिंग की तुलना में मोटाई पर अधिक गंभीर बाधा डालता है। इस वीडियो लेख का लक्ष्य अनुसंधान प्रयोगशालाओं और माइक्रोस्कोपी सुविधाओं में सेल और ऑर्गेनेल इमेजिंग के लिए टूल चेस्ट में सीएसटीईटी को शामिल करने की सुविधा प्रदान करना है।

पहली चुनौती यह है कि सीएसटीईटी में माइक्रोस्कोप संचालन अभी तक जीवन विज्ञान अनुप्रयोगों के लिए मानकीकृत नहीं हैं जिस तरह से वे क्रायो-टीईएम टोमोग्राफी के लिए रहे हैं। एसटीईएम हार्डवेयर को क्रायो-ईएम बाजार में शायद ही कभी (यदि कभी) लक्षित किया गया है। हालांकि, यह माइक्रोस्कोप की नवीनतम पीढ़ी के साथ बदल रहा है, और कई मौजूदा उपकरणों को रेट्रोफिट किया जा सकता है। एक तकनीक के रूप में एसटीईएम ने आगे बढ़ लिया है और बड़े पैमाने पर सामग्री विज्ञान में कब्जा कर लिया है, जहां क्रायोजेनिक और कम खुराक^{के तरीकों में} भी रुचि बढ़ रही ^है। सामग्री विज्ञान साहित्य बीएफ-एसटीईएम, एडीएफ-एसटीईएम, एचएडीएफ-एसटीईएम, 4 डी-एसटीईएम, डीपीसी-एसटीईएम, आदि के संक्षिप्त नामों से भरा हुआ है, जो भ्रम को बढ़ाते हैं। हम यहां एक अनुशंसित प्रारंभिक बिंदु प्रदान करते हैं, जो वीज़मैन इंस्टीट्यूट ऑफ साइंस में हमारे सामूहिक अनुभव में, उज्ज्वल क्षेत्र (बीएफ) एसटीईएम इमेजिंग¹⁶ के आधार पर उपयोगी परिणामों के लिए सबसे सामान्य प्रोटोकॉल प्रदान करता है। किसी भी तरह से यह संभावनाओं की सीमा को समाप्त या यहां तक कि तलाशता नहीं है, लेकिन यह आगे की वृद्धि के लिए एक आधार के रूप में काम करेगा। जबकि हम क्रायो-एसटीईएम पर जोर देते हैं, अधिकांश प्रोटोकॉल प्लास्टिक-एम्बेडेड वर्गों के कमरे के तापमान एसटीईएम टोमोग्राफी के लिए समान रूप से प्रासंगिक है।

एसटीईएम का सार एक केंद्रित इलेक्ट्रॉन जांच (चित्रा 1), रोशनी शंकु के साथ नमूने को स्कैन करना है, और ट्रांसमिशन में विवर्तन (प्रकीर्णन) विमान से संकेतों को रिकॉर्ड करना है, पिक्सेल द्वारा पिक्सेल, 2 डी छवियों^17,18 का उत्पादन करने के लिए। अधिकांश सेलुलर सामग्रियों सहित अनाकार नमूने, संचरण में एक फैलाव प्रकीर्णन पैटर्न का उत्पादन करेंगे। सबसे सरल व्यावहारिक एसटीईएम कॉन्फ़िगरेशन केंद्रीय डिस्क को रिकॉर्ड करने के लिए एक परिपत्र डिटेक्टर रखना है (यानी, जांच रोशनी जो नमूने के बिना प्रेषित की जाएगी)। नमूना इस रोशनी शंकु से इलेक्ट्रॉनों को इस हद तक दूर बिखेरता है कि सिग्नल कम हो जाता है। यह एक बीएफ छवि पैदा करता है-नमूना एक उज्ज्वल पृष्ठभूमि पर अंधेरा दिखाई देता है। एक वलयाकार डिटेक्टर का उपयोग (या इसके बजाय) रोशनी शंकु के बाहर नमूने से प्रकीर्णन का पता लगाने के लिए भी किया जा सकता है। नमूना हटाए जाने के साथ, कोई संकेत नहीं है। जब एक नमूना जगह में होता है, तो ऑब्जेक्ट अंधेरे क्षेत्र (डीएफ) छवि में एक अंधेरे पृष्ठभूमि पर उज्ज्वल दिखाई देते हैं। एसटीईएम (बीएफ, वलयाकार डार्क फील्ड [एडीएफ], उच्च-कोण वलयाकार डार्क फील्ड [एचएडीएफ], आदि) के लिए नामकरण मुख्य रूप से डिटेक्टरों के लिए संग्रह कोणों की श्रेणियों को संदर्भित करता है।

रोशनी का अभिसरण कोण सेलुलर टोमोग्राफी के लिए एसटीईएम के एक आवश्यक अनुकूलन का प्रतिनिधित्व करता है। जब शीर्ष प्राथमिकता उच्च रिज़ॉल्यूशन होती है, तो अभिसरण कोण जितना संभव हो उतना बड़ा होना चाहिए। (यह कॉन्फोकल लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी के समान है; रिज़ॉल्यूशन जांच व्यास द्वारा निर्धारित किया जाता है, जो संख्यात्मक एपर्चर द्वारा विभाजित तरंग दैर्ध्य के रूप में स्केल करता है। ध्यान दें कि हम ईएम के लिए अर्ध-कोण या अर्ध-अभिसरण कोण का उल्लेख करते हैं। जब प्राथमिकता क्षेत्र की गहराई होती है, तो दूसरी ओर, रिज़ॉल्यूशन में समझौता एक बड़ा लाभ देता है, क्योंकि केंद्रित बीम अर्ध-कोण वर्ग द्वारा विभाजित तरंग दैर्ध्य के दोगुने के बराबर दूरी के लिए लगभग समानांतर रहता है। आदर्श रूप से, पूरे सेल वॉल्यूम फोकस¹⁹ में रहता है। उदाहरण के लिए, 300 केवी पर, इलेक्ट्रॉन डीब्रोगली तरंग दैर्ध्य 0.002 एनएम है, इसलिए 1 मराड के अभिसरण से 2 एनएम का रिज़ॉल्यूशन और 4 माइक्रोन के क्षेत्र की गहराई उत्पन्न होती है। इन शर्तों के तहत, टोमोग्राफी को डेटा संग्रह प्रक्रिया के दौरान ध्यान केंद्रित किए बिना भी किया जा सकता है, लेकिन अधिग्रहण की शुरुआत में केवल एक बार। एक पारंपरिक टोमोग्राफी-सक्षम एसटीईएम 7 या 8 मैराड के अर्ध-अभिसरण कोण तक पहुंच सकता है; इसलिए, सिद्धांत रूप में, हम 0.25 एनएम के क्रम में एक संकल्प तक पहुंच सकते हैं, लेकिन फिर केवल 62 एनएम की फोकल गहराई के साथ। यह सेलुलर इमेजिंग के लिए स्पष्ट रूप से बहुत पतला है। तीन कंडेनसर लेंस के साथ अधिक उन्नत माइक्रोस्कोप काफी सीमा पर अर्ध-अभिसरण कोण के निरंतर समायोजन की पेशकश करते हैं। अधिक पारंपरिक दो-कंडेनसर कॉन्फ़िगरेशन के साथ, अभिसरण कंडेनसर (सी 2) एपर्चर द्वारा असतत रूप से तय किया जाता है।

मजबूत, प्लास्टिक-एम्बेडेड नमूनों के लिए, कोई प्रत्येक झुकाव पर एक फोकल श्रृंखला रिकॉर्ड कर सकता है और उन्हें उच्च रिज़ॉल्यूशन²⁰ के लिए जोड़ सकता है, लेकिन क्रायोजेनिक नमूनों के लिए, विकिरण बजट बहुत गंभीर रूप से बाधित है। अंत में, मोटे नमूनों के लिए, बीएफ या डीएफ इमेजिंग के फायदों को तौलने में, किसी को नमूने में कई लोचदार प्रकीर्णन के प्रभावों पर विचार करना चाहिए। बीएफ सिग्नल कई प्रकीर्णन द्वारा कम दूषित होता है और मोटे नमूनों^16,21 के लिए एक उच्च रिज़ॉल्यूशन दिखाता है।

अंगूठे का एक उपयोगी नियम अभिसरण की तुलना में कई गुना बड़े संग्रह कोण सेट करना है। नमूना जितना मोटा होगा, संग्रह डिस्क उतनी ही बड़ी होनी चाहिए। बहुत छोटी डिस्क कम सिग्नल तीव्रता प्रदान करेगी; बहुत बड़ी डिस्क के परिणामस्वरूप खराब छवि कंट्रास्ट होगा, क्योंकि केवल उच्चतम-कोण प्रकीर्णन योगदान देगा। संग्रह कोण ों को किसी दिए गए नमूने के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए। (विवर्तन) कैमरे की लंबाई के एक फ़ंक्शन के रूप में डिटेक्टर कोणों को स्वतंत्र रूप से कैलिब्रेट किया जाना चाहिए। उन्हें माइक्रोस्कोप सॉफ्टवेयर द्वारा आसानी से प्रदर्शित किया जा सकता है। व्यवहार में, संग्रह से रोशनी अर्ध-कोणों के अनुपात में दो से पांच का कारक, क्रमशः α से , सेलुलर नमूनों के सीएसटीईटी के लिए एक अनुशंसित प्रारंभिक बिंदु है।

निम्नलिखित प्रोटोकॉल माइक्रोस्कोप नियंत्रण^22,23 के लिए लोकप्रिय सीरियलईएम सॉफ्टवेयर का उपयोग करके एसटीईएम टोमोग्राफी ऑपरेशन का वर्णन करता ^है। सीरियलईएम एक विशिष्ट निर्माता से जुड़ा नहीं है, और इसका व्यापक रूप से टीईएम टोमोग्राफी में उपयोग किया जाता है। टोमोग्राफी के लिए स्थापित करने में अधिकांश ऑपरेशन सीधे टीईएम से किए जा सकते हैं। सीरियलईएम रणनीति स्कैनिंग सिस्टम को कैमरे के रूप में मॉडल करना है। यह टीईएम से एसटीईएम तक सरल क्रॉसओवर को सक्षम बनाता है। हालांकि, किसी को यह ध्यान रखना चाहिए कि आवर्धन और बिनिंग जैसे पैरामीटर पूरी तरह से कृत्रिम हैं। महत्वपूर्ण पैरामीटर माइक्रोन में दृश्य का क्षेत्र, दृश्य के क्षेत्र में पिक्सेल की संख्या और एक्सपोज़र समय हैं। पिक्सेल स्पेसिंग, या नमूनाकरण, पिक्सेल की संख्या से विभाजित रैखिक क्षेत्र है, जबकि रहने का समय एक्सपोज़र समय से विभाजित पिक्सेल की संख्या है।

एसटीईएम और सीएसटीईटी के लिए न्यूनतम कॉन्फ़िगरेशन में माइक्रोस्कोप पर तीन विशेषताएं शामिल हैं: एक स्कैन जनरेटर, एक एसटीईएम डिटेक्टर और टोमोग्राफी कंट्रोल सॉफ्टवेयर। प्रोटोकॉल एफईआई / थर्मो फिशर साइंटिफिक (टीएफएस) के नामकरण को संदर्भित करता है, लेकिन अवधारणाएं सामान्य हैं। टीएफएस के मालिकाना सॉफ्टवेयर को टीईएम²⁴ के लिए जोव में वर्णित किया गया है, और एसटीईएम ऑपरेशन बहुत समान है।

हम मानते हैं कि माइक्रोस्कोप को सेवा टीम या अनुभवी कर्मचारियों द्वारा अग्रिम में संरेखित किया गया है और फ़ाइल लोड करके कॉलम संरेखण को बुलाया जा सकता है। मामूली समायोजन को प्रत्यक्ष संरेखण कहा जाता है और इसे तथाकथित एफईजी रजिस्टरों (टीएफएस माइक्रोस्कोप) में संग्रहीत किया जा सकता है। प्रत्यक्ष संरेखण में रोटेशन केंद्र, धुरी बिंदु, विवर्तन संरेखण और कंडेनसर एस्टिगमैटिज्म के लिए मुआवजा शामिल है। समायोजन को पुनरावृत्ति रूप से किया जाना चाहिए। ध्यान दें कि टीएफएस माइक्रोस्कोप अलग-अलग नैनोप्रोब (एनपी) और माइक्रोप्रोब (μP) मोड को लागू करते हैं; किसी दिए गए कंडेनसर एपर्चर के लिए, ये क्रमशः टीईएम में समानांतर रोशनी और एसटीईएम में अधिक या कम अभिसरण (कसकर केंद्रित) इलेक्ट्रॉन बीम के साथ अपेक्षाकृत संकीर्ण या विस्तृत क्षेत्र प्रदान करते हैं। अन्य निर्माता अभिसरण कोणों की सीमा को कवर करने के लिए विभिन्न योजनाओं का उपयोग करते हैं।

शुरू करने से पहले, अध्ययन के तहत नमूने के आधार पर दृश्य, एल, और नमूनाकरण (पिक्सेल चौड़ाई), एल का क्षेत्र चुना जाना चाहिए। उदाहरण के लिए, l = 1 nm/pixel के लिए, एक 4,000 x 4,000 पिक्सेल छवि जो दृश्य 4 μm² के क्षेत्र को कवर करेगी, चुनी जानी चाहिए। रिज़ॉल्यूशन, अधिक से अधिक, स्थानिक नमूने से दोगुना होगा, इसलिए 2 एनएम, और जांच व्यास, डी, इससे मेल खाना चाहिए। जांच कोण का अंशांकन इस प्रोटोकॉल के दायरे से परे है, इसलिए हम मानते हैं कि एक तालिका या स्क्रीन रीडिंग उपलब्ध है। प्रोब व्यास लगभग इलेक्ट्रॉन तरंग दैर्ध्य है जो अर्ध-अभिसरण कोण (रेडियन में) से विभाजित है: d = o/o। तरंग दैर्ध्य, 300 केवी के लिए 0.002 एनएम और 200 केवी इलेक्ट्रॉनों के लिए 0.0025 एनएम है, इसलिए 1 मराड का व्यास क्रमशः 2 या 2.5 एनएम का स्पॉट व्यास प्रदान करेगा।

प्रोटोकॉल बढ़ती जटिलता की प्रगति में प्रस्तुत किया गया है। पहला कार्य एक एसटीईएम छवि का उत्पादन करना है, जो माइक्रोस्कोप निर्माता के सॉफ्टवेयर पर निर्भर करता है, और फिर एक झुकाव श्रृंखला, जिसके लिए हम सीरियलईएम का उपयोग करते हैं। कई पाठक निस्संदेह सीरियलईएम से परिचित होंगे, इसलिए अधिक जटिल कार्य स्वाभाविक रूप से आएंगे। प्रक्रियाओं का सख्ती से पालन करने की कोई आवश्यकता नहीं है। स्वचालन से संबंधित विकास सीधे एसटीईएम के साथ-साथ टीईएम के लिए भी लागू किया जा सकता है। अनुभवी उपयोगकर्ता संभवतः प्रोटोकॉल को उलट देंगे, जो फ्लोरेसेंस मैप्स के सापेक्ष पंजीकरण से शुरू होगा और बैच टोमोग्राफी स्थापित करना जारी रखेगा। अधिक विवरण सीरियलईएम के लिए व्यापक प्रलेखन और ट्यूटोरियल पुस्तकालयों में पाया जा सकता है, जिसमें स्वचालन²⁵ में नवीनतम विकास पर हाल ही में जोवे लेख शामिल है।

Protocol

1. एसटीईएम सेटअप

1. प्रारंभिक संरेखण: स्तंभ संरेखण फ़ाइल लोड करें, और उसके बाद स्तंभ वाल्व खोलें। यदि साइड-एंट्री क्रायो-होल्डर का उपयोग कर रहे हैं, तो क्रायो-शील्ड खोलें। TEM मोड में प्रारंभ करें। बीम स्क्रीन पर दिखाई देना चाहिए। यदि नहीं, तो आवर्धन को कम करें।
2. नियंत्रण कक्ष पर बटन दबाकर माइक्रोस्कोप को यूसेंट्रिक फोकस में लाएं।
3. फ्लोरोसेंट स्क्रीन को देखने के लिए स्पॉट आकार को एक सुविधाजनक मान (जैसे, 6) पर सेट करें, या तो सीधे या अंतर्निहित कैमरे के साथ (माइक्रोस्कोप मॉडल के आधार पर)।
4. माइक्रोस्कोप को एसटीईएम मोड पर सेट करें और सत्यापित करें कि फोकस उद्देश्य के बजाय कंडेनसर लेंस (तीव्रता) का उपयोग करता है। यूसेंट्रिक फोकस सेट करें। फिर, प्रारंभिक समायोजन के लिए विवर्तन मोड से बाहर जाएं।
5. सुनिश्चित करें कि बीम रिक्त नहीं है। स्क्रीन पर बीम दिखाई देने तक आवर्धन को कम करें। बीम शिफ्ट को केंद्र में समायोजित करें और बीम को केंद्र में रखते हुए लगभग 70 kx तक के चरणों में आवर्धन बढ़ाएं।
6. वांछित कंडेनसर एपर्चर डालें, आमतौर पर 50 μm। एपर्चर सेंटरिंग की जांच करें। फोकस नॉब को थोड़ा आगे और पीछे मोड़ते समय, स्पॉट को विस्तार ति और सिकुड़ना चाहिए, लेकिन जगह पर रहना चाहिए, जैसे कि एक विमान एक काल्पनिक ऊर्ध्वाधर घंटे के ग्लास को काटता है। यदि एपर्चर केंद्रित नहीं है, तो रोशनी पार्श्व में स्थानांतरित हो जाएगी, जैसे कि ऑवरग्लास झुका हुआ था।
7. बीम को फ़ोकस पर लाएं और संरेखण टैब में तीव्रता सूची फ़ोकस (यदि उपलब्ध हो) दबाएं, या 1.2 के रूप में यूसेंट्रिक फ़ोकस पर लौटें। बीम की स्थिति को केंद्र में रखें।
8. रोटेशन केंद्र समायोजित करें। फोकस स्टेप व्हील को कम से कम या एक कदम ऊपर की ओर घुमाएं, ताकि बीम धीरे से दाल सके, और सुनिश्चित करें कि यह स्थिर रहे क्योंकि फोकस ऊपर और नीचे जाता है।
9. धुरी बिंदुओं का चयन करें और X और Y समायोजन के साथ दो बिंदुओं को एक साथ लाएं।
   नोट: यदि एक चरण प्लेट टीएफएस उपकरण पर स्थापित है, तो केवल एक्स समायोजन का उपयोग किया जाना चाहिए।
10. बीम को थोड़ा डीफोकस करें, और डिस्क को गोल बनाने के लिए कंडेनसर स्टिग्माटर्स को समायोजित करें। ऑप्टिमाइज़ करने के लिए फ़ोकस के माध्यम से ऊपर और नीचे जाएं; फोकस पास करते समय एक दिशा या दूसरे में लम्बी होने की कोई प्रवृत्ति नहीं होनी चाहिए।
11. लेंस को सामान्य करें। फिर, स्थान को केंद्रित रखने के लिए बीम शिफ्ट का उपयोग करते समय आवर्धन को उत्तरोत्तर लगभग 240 kx तक बढ़ाएं, और रोटेशन सेंटर और धुरी बिंदु समायोजन (चरण 1.6-1.8) को दोहराएं।
12. विवर्तन मोड पर लौटें। बीम फ्लोरोसेंट स्क्रीन पर एक समान डिस्क के रूप में दिखाई देना चाहिए। कैमरा लंबाई (सीएल) अब डिटेक्टर के ऑप्टिकल दूरी को प्रभावी ढंग से नियंत्रित करती है, जैसा कि एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफी में होता है। इसे बदलें और देखें कि डिस्क सिकुड़ती है और बढ़ती है, जैसे कि स्क्रीन स्थान नमूने की ओर या उससे दूर चला जाएगा। यह शंकु बीएफ रोशनी का प्रतिनिधित्व करता है।
    नोट: प्रत्येक सीएल के लिए, अनुमानित बीम को केंद्रीय अक्ष पर लाने के लिए एक विवर्तन संरेखण को समायोजित किया जाना है। आम तौर पर उन सभी को परिष्कृत करने की कोई आवश्यकता नहीं होती है, केवल एक (या कुछ) का पता लगाने के लिए उपयोग किया जाता है।
13. उच्च आवर्धन पर एसटीईएम मोड संलग्न करें।
    1. यदि एक बीएफ एसटीईएम डिटेक्टर उपलब्ध है, तो उससे शुरू करें। चरण को एक खाली छेद वाले क्षेत्र में लाएं और वांछित सीएल का उपयोग करके बीम को केंद्र में रखने के लिए विवर्तन संरेखण को समायोजित करें।
    2. कई माइक्रोस्कोप केवल एक एचएएडीएफ डिटेक्टर से लैस हैं; बीएफ डिटेक्टर के रूप में इसका उपयोग करने की एक चाल है। सबसे पहले, डिटेक्टर को वापस लें, बीम को सीधे संरेखण में ऊपर के रूप में केंद्रित करें, एक उद्देश्य एपर्चर डालें, आमतौर पर 20 μm जैसे एक छोटा, और बीम को समान रूप से घेरने के लिए इसकी स्थिति को समायोजित करें। (ऐसा करने का सबसे आसान तरीका रोशनी के चारों ओर एक प्रभामंडल देखने के लिए एक नमूना या एक परीक्षण ग्रिड डालना है)। फिर, बीम को अक्ष से और डिटेक्टर क्षेत्र पर ले जाने के लिए विवर्तन संरेखण का उपयोग करें। स्क्रीन पर बीम देखते समय डिटेक्टर को डालें और वापस लें ताकि यह पुष्टि हो सके कि बीम डिटेक्टर द्वारा अवरुद्ध है।
    3. माइक्रोस्कोप सॉफ्टवेयर में एक स्कैन शुरू करें और चमक और कंट्रास्ट (बी / सी) सेटिंग्स को समायोजित करें ताकि बीम खाली होने पर सिग्नल 0 के करीब हो, और जब पूरी रोशनी डिटेक्टर पर पड़ती है तो संतृप्ति के करीब हो। सहायता के लिए स्कोप प्रदर्शन का उपयोग करें. सेटिंग्स को अप्रत्याशित तरीके से जोड़ा जा सकता है, इसलिए समायोजन को कई बार दोहराया जाना चाहिए।
14. कम मैग (एलएम) मोड में जाने के बिना, माइक्रोस्कोप को उच्च आवर्धन रजिस्टर (एसए मोड) में अपेक्षाकृत कम आवर्धन पर लौटाएं।
15. बाद में संदर्भ के लिए स्क्रीन वर्तमान नोट करें (चरण 3.1.1 देखें)। वर्तमान को बंदूक लेंस और स्पॉट आकार सेटिंग्स के साथ बदला जा सकता है, जैसा कि टीईएम में, कम प्रवाह के अनुरूप बढ़ती संख्या के साथ।
16. इस बिंदु पर, मानक मानों पर वापसी की सुविधा के लिए एक एफईजी रजिस्टर सहेजें।
    नोट: सुविधा एफईजी रजिस्टरों का एक डिफ़ॉल्ट सेट तैयार कर सकती है ताकि उपयोगकर्ता एक कार्यशील कॉन्फ़िगरेशन से शुरू कर सकें।

2. नमूना रखना

1. एलएम टीईएम मोड में, सुनिश्चित करें कि ग्रिड अपारदर्शी नहीं है। प्रारंभिक समायोजन करने के लिए एक ग्रिड स्क्वायर खोजें। कुछ खाली क्षेत्र, एक छेद, या एक फटे ग्रिड वर्ग को ढूंढना सुविधाजनक है। उन पर आसानी से लौटने के लिए मंच की स्थिति रिकॉर्ड करें।
2. नमूना को यूसेंट्रिक ऊंचाई पर लाएं। ऐसा करने के कई तरीके हैं। उदाहरण के लिए, जेड अक्ष के साथ नमूना ऊंचाई को स्थानांतरित करते समय ग्रिड को झुकाने के लिए स्टेज वॉबलर का उपयोग करें जब तक कि छवि पार्श्व रूप से स्थानांतरित होना बंद न हो जाए। वैकल्पिक रूप से, देखने की स्क्रीन पर कुछ विशेषताओं को चिह्नित करें और मंच को 30 ° तक झुकाएं। सुविधा पार्श्व रूप से आगे बढ़ेगी। इसे मूल स्थिति में वापस लाने के लिए नमूना ऊंचाई समायोजित करें। परिष्कृत करने के लिए आवर्धन या चरण झुकाव बढ़ाएँ. 0° झुकाव पर लौटें।
3. STEM मोड पर लौटें और STEM डिटेक्टर डालें। निम्नतम उच्च आवर्धन (SA) मोड पर जाएँ। सुनिश्चित करें कि कंप्यूटर स्क्रीन पर एक छवि देखी जाती है। अनावश्यक जोखिम से बचने के लिए तेजी से स्कैन करें; 1 μs/pixel या उससे कम विशिष्ट होगा। ध्यान दें कि स्कैन अत्यधिक तेज होने पर छवि बाईं सीमा पर विकृत दिखाई दे सकती है ( चित्रा 2 देखें)।
4. यूसेंट्रिक फोकस दबाएं, आवर्धन बढ़ाएं, और स्कैनिंग करते समय फोकस को परिष्कृत करें। माइक्रोस्कोप सॉफ्टवेयर द्वारा प्रदान किए गए फोकस लूप का उपयोग करना सुविधाजनक है।
5. कंडेनसर एस्टिगमैटिज्म को ट्यून करें। यह रोंचीग्राम विधि द्वारा सबसे सटीक रूप से किया जा सकता है। एक पतले नमूना क्षेत्र पर बीम के साथ, उस बिंदु पर ध्यान केंद्रित करें जहां प्रेषित बीम दोनों तरफ नमूने की छाया छवियों के बीच में उड़ता है। फिर, केंद्रीय डिस्क को गोल बनाने के लिए कंडेनसर ट्यूनिंग समायोजित करें। इसके लिए कुछ अभ्यास की आवश्यकता होती है, खासकर क्रायोजेनिक नमूनों के लिए।
   नोट: एक विकल्प कुछ सोने के कणों को ढूंढना है (अक्सर टोमोग्राफी में संरेखण के लिए फिड्यूशियल मार्कर के रूप में उपयोग किया जाता है)। आवर्धन को बढ़ाएं और ऊपर और नीचे ध्यान केंद्रित करें, अस्थिरता को ट्यून करें ताकि कण किसी भी दिशा में बढ़ाव के बिना गोल रहें।
6. एलएम एसटीईएम मोड पर जाएं और एक दिलचस्प क्षेत्र खोजने के लिए स्कैनिंग जारी रखें। यदि आवश्यक हो तो डिटेक्टर बी / सी सेटिंग्स को रीजस्ट करें (चरण 1.13.3), मोटे तौर पर इस बिंदु पर।

3. एक छवि रिकॉर्ड करना

1. रिकॉर्डिंग के लिए खुराक का अनुमान लगाएं। अंगूठे के एक नियम के रूप में, पूरे टोमोग्राम के लिए 100-150 ई^-/^ए2 का लक्ष्य रखें। प्रति नमूना खुराक सहनशीलता की जांच करें। एम्पीयर (ए) में विद्युत धारा को प्रति इलेक्ट्रॉन चार्ज से विभाजित किया जाता है, जो ई^-/एस की गणना का प्रतिनिधित्व करता है, जिसे एक्सपोज़र समय, टी, सेकंड में गुणा किया जाता है और ए2 में दृश्य क्षेत्र से विभाजित किया जाता^है। सुविधा के लिए, उपयुक्त कारकों के साथ, नैनोएम्पीयर (जैसा कि स्क्रीन से पढ़ा जाता है), माइक्रोमीटर में दृश्य के क्षेत्र की चौड़ाई, और फ्रेम एक्सपोजर समय को सेकंड में व्यक्त करें:
   
   श्रृंखला में कुल प्रदर्शन प्राप्त करने के लिए इस संख्या को झुकाव की संख्या से गुणा किया जाना चाहिए। उदाहरण के लिए, धारा I = 0.04 nA, एक फ़ील्ड L = 4 μm, और 12 s के एक्सपोजर समय के साथ, हम 61 अनुमानों की एक श्रृंखला के लिए 1.9 e-/O2 प्रति झुकाव, या लगभग 110 e^-/^A2 प्राप्त करते हैं।
2. चरण को एक छेद पर वापस करें (या ग्रिड को वापस लें) और वांछित स्क्रीन करंट तक पहुंचने के लिए स्पॉट आकार और / या गन लेंस सेटिंग्स का उपयोग करके बीम करंट को समायोजित करें। यदि माप 0 पढ़ता है, तो धारा को बढ़ाने के लिए एक बड़ा सी 2 एपर्चर डालें। फिर, माप को व्यास के अनुपात के वर्ग से विभाजित करके सही करें, और अंत में छोटे एपर्चर पर लौटें।
3. चरण 1.13.3 के अनुसार बी / सी सेटिंग्स को परिष्कृत करें, और अंत में चरण को रुचि के क्षेत्र में वापस करें और इमेजिंग स्थितियों के तहत प्रत्यक्ष संरेखण और अस्थिरता को फिर से जांचें।
4. एक परीक्षण छवि प्राप्त करें।

4. सीरियलईएम के साथ टोमोग्राफी

1. माइक्रोस्कोप कंप्यूटर पर SerialEM सर्वर प्रारंभ करें (SerialEM आमतौर पर एक अलग पर स्थापित होता है)। उसके बाद, SerialEM खोलें। एसटीईएम एक कैमरे की तरह सीरियलईएम में दिखाई देता है, एक ही इंटरफ़ेस के साथ। सुनिश्चित करें कि संचार सेटअप के लिए उचित रूप से चल रहे हैं। उदाहरण के लिए, माइक्रोस्कोप टैब को सही आवर्धन प्रदर्शित करना चाहिए। यदि यह काम नहीं करता है, तो यहां रुकें और समस्या निवारण करें।
2. कैमरा और स्क्रिप्ट टैब ढूंढें और सेटअप खोलें। सुनिश्चित करें कि एसटीईएम कैमरा चुना गया है, और प्रत्येक मोड के लिए उपयुक्त बिनिंग और रहने का समय चुनें। सुनिश्चित करें कि उपयुक्त डिटेक्टर (या डिटेक्टर) निचले बाईं ओर "प्राप्त करने के चैनल" बॉक्स में दिखाई देते हैं। परीक्षण करने के लिए नीचे अधिग्रहण दबाएं। फिर, यदि कुछ भी नहीं होता है, या यदि बीम रिक्त नहीं होता है, तो जारी न रखें। बंद करो और संचार की जांच करें।
   नोट: मोड का उपयोग टीईएम टोमोग्राफी के समान तरीके से किया जाता है। बिनिंग टीईएम के साथ संगतता के लिए एक कला है। महत्वपूर्ण पैरामीटर पिक्सेल गिनती है; विभिन्न माइक्रोस्कोप सिस्टम एक ही गिनती तक पहुंचने के लिए अलग-अलग बिनिंग का उपयोग करते हैं।
   1. दृश्य और खोज अपेक्षाकृत कम पिक्सेल के साथ तेज़ स्कैन होना चाहिए (उदाहरण के लिए, 1 s पर 512 x 512 पिक्सेल)।
   2. फोकस आम तौर पर तेजी से रिकॉर्डिंग के साथ एक छोटा सा क्षेत्र है। इस प्रकार, कम खुराक मोड में, फोकस को रिकॉर्ड मोड में एक अलग आवर्धन पर चुनें, जो सटीकता में सहायता कर सकता है। स्पॉट आकार को अपरिवर्तित छोड़ दें।
   3. रिकॉर्ड मोड के लिए, एक्सपोजर अनुमान में ऊपर चुने गए पैरामीटर का उपयोग करें। यदि उपलब्ध हो, तो डायनामिक फ़ोकस का भी चयन करें, जो झुकी हुई छवि में लाइन द्वारा फ़ोकस लाइन को सही करता है।
   4. बाद में सुविधा के लिए, पूर्वावलोकन के लिए बिनिंग चुनें जो दृश्य के समान हो (एन्हांसमेंट # 1, चरण 5.5 देखें)। छवि आकार (पिक्सेल की संख्या) समान होने की आवश्यकता नहीं है।
   5. अधिग्रहण के दौरान रिकॉर्ड क्षेत्र को केंद्रित रखने के लिए परीक्षण मोड का उपयोग करें. यह दृश्य के समान हो सकता है, लेकिन ध्यान रखें कि फ्रेम के बाईं ओर कोई स्कैन विकृतियां स्पष्ट न हों (उदाहरण के लिए चित्रा 2 देखें)। फिर, कम खुराक मोड में, परीक्षण में रिकॉर्ड मोड की तुलना में एक अलग आवर्धन हो सकता है।
   6. ग्रिड स्कैन के लिए तुरंत मोंटेज मोड का उपयोग करें। रुचि के क्षेत्रों को खोजने के लिए यह पर्याप्त पिक्सेल-घना होना चाहिए; सिफारिश: 512 x 512 या 1024 x 1024। सुनिश्चित करें कि छवि एक सभ्य गतिशील रेंज (छवि प्रदर्शन नियंत्रण में देखी गई) के साथ अच्छी है, क्योंकि इस मोड का उपयोग नमूना क्षेत्रों को खोजने के लिए किया जाता है।
   7. सेटिंग्स फ़ाइल सहेजें ताकि इन विकल्पों को अगले सत्र के लिए डिफ़ॉल्ट के रूप में रखा जाए (जो प्रोग्राम क्रैश होने की स्थिति में जल्द ही हो सकता है)।
3. छवि शिफ्ट और चरण शिफ्ट अंशांकन का परीक्षण करें। माइक्रोप्रोब (या नैनोप्रोब) मोड में, व्यू इमेज पर क्लिक करें, माउस के साथ उस पर मंडराएं, बटन को नीचे दबाएं, और दृश्य के क्षेत्र के लगभग एक चौथाई से तिरछा खींचें। फिर, एक और दृश्य लें। छवियों को पूरी तरह से ओवरलैप करना चाहिए। शिफ्ट कुंजी दबाए रखते हुए फिर से खींचकर दोहराएं (एक मंच आंदोलन को लागू करने के लिए)। छवियों को अच्छी तरह से ओवरलैप करना चाहिए, हालांकि शायद कम सटीक रूप से।
4. एलएम मोड पर जाएं और स्टेज शिफ्ट का परीक्षण करें। यदि ये परीक्षण विफल हो जाते हैं, तो रोकें और समस्या निवारण करें। बाकी काम नहीं करेगा।
5. पूरे ग्रिड का एक मोंटाज एलएम मानचित्र बनाएं। यह TEM में भी किया जा सकता है।
   1. सबसे कम आवर्धन एसटीईएम मोड पर जाएं जहां छवि एपर्चर द्वारा अवरुद्ध नहीं होती है, आमतौर पर लगभग 185x।
   2. नेविगेटर मेनू > खोलें क्लिक करें. उसके बाद, नेविगेटर मेनू > Nav. विकल्प क्लिक करें > मानचित्र को बाइट्स में कनवर्ट करें का चयन करें.
   3. पूर्ण मोंटेज सेटअप > > नेविगेटर मेनू चयन करें। एक मेनू खुल जाएगा। जांचने के विकल्प हैं: छवि को स्थानांतरित करने के बजाय चरण को स्थानांतरित करें, नेविगेटर खुलने पर प्रत्येक मोंटेज से मानचित्र बनाएं, और मोंटेज मैपिंग का उपयोग करें, न कि रिकॉर्ड पैरामीटर। छवि ग्रिड लगभग 6 x 6 या 7 x 7 होना चाहिए। दर्ज किए जाने वाले कुल क्षेत्र की तलाश करें। यदि बहुत अधिक छवियों की आवश्यकता होती है, तो आवर्धन माइक्रोस्कोप से सही ढंग से नहीं पढ़ा जा सकता है (चित्रा 3)। रुको और जाँच करो।
   4. मोंटेज अधिग्रहण प्रारंभ करने के लिए, कैमरा और स्क्रिप्ट के अंतर्गत मोंटेज नियंत्रण या मोंटेज पर प्रारंभ दबाएँ. फ़ाइल पैरामीटर चुनने के लिए एक और मेनू खुल जाएगा: एमआरसी, पूर्णांक के रूप में स्टोर करें, और अभी तक एक और संवाद में, भंडारण के लिए फ़ाइल नाम चुनें। डेटा को उपयुक्त डेटा क्षेत्र में संग्रहीत करना सुनिश्चित करें और SerialEM की अपनी उपयोगकर्ता सेटिंग्स के तहत नहीं। यह अनुशंसा की जाती है कि सी डिस्क पर बड़े डेटा को संग्रहीत न करें जहां सिस्टम रहता है।
   5. जब अधिग्रहण समाप्त हो जाता है तो मोंटाज मुख्य विंडो (चित्रा 4) में दिखाई देगा। अब कोई भी टीईएम की तरह नेविगेटर पर मार्कर और बिंदुओं का उपयोग करके ग्रिड के चारों ओर नेविगेट कर सकता है।
6. अस्थिरता सुधार को फिर से जांचें। आमतौर पर, एक छोटे से क्षेत्र को जल्दी से स्कैन करना और फोकस के साथ समायोजित करना पर्याप्त होता है ताकि सोने के नैनोकणों जैसी बिंदु जैसी विशेषताएं पूरी तरह से गोल रहें क्योंकि वे उच्च आवर्धन पर फोकस के अंदर और बाहर (एसईएम के रूप में) गुजरते हैं। अधिक रूढ़िवादी रूप से, कोई भी अस्थिरता को ठीक करने से पहले चरण 1.5-1.8 के प्रत्यक्ष संरेखण को दोहरा सकता है।
7. एलएम मोंटाज के लिए उच्च आवर्धन इमेजिंग को संरेखित करें।
   1. कुछ आसानी से पहचानने योग्य सुविधा के साथ एलएम मोंटाज पर एक स्थिति पर जाएं। एक बिंदु जोड़ें, नेविगेटर विंडो पर क्लिक करें > अंक जोड़ें, और सुविधा पर क्लिक करें। निष्क्रिय करने के लिए फिर से धक्का दें (जोड़ना बंद करें)।
   2. निम्नतम उच्च मैग (एचएम) आवर्धन पर दृश्य या परीक्षण छवि लें और इंगित आइटम ढूंढें। मार्कर को वहां (ग्रीन क्रॉस) रखें, और नेविगेटर विंडो में हाइलाइट किए गए संबंधित बिंदु के साथ, नेविगेटर मेनू में > मार्कर पर शिफ्ट करें ..., खुलने वाले संवाद में, सभी मानचित्र और सहेजें शिफ्ट चुनें, जैसा कि चित्र 5 में दिखाया गया है।
   3. मंच को अन्य पदों पर ले जाकर परीक्षण करें और सत्यापित करें कि एचएम छवि एलएम मोंटाज में चयनित समान स्थानों पर केंद्रित है। यदि सुविधा एचएम छवि में दिखाई नहीं दे रही है, तो एलएम और एचएम मोड के बीच बदलाव बहुत बड़ा हो सकता है। इस मामले में, एक बड़े क्षेत्र पर एक बहुभुज मोंटाज बनाएं। नेविगेटर विंडो पर क्लिक करें > बहुभुज जोड़ें, कुछ बिंदु चुनें, फिर बंद करने के लिए फिर से बहुभुज जोड़ें पर क्लिक करें। प्रारंभ > सेटअप सेटअप के > मॉन्टेजिंग और ग्रिड्स > नेविगेटर मेनू क्लिक करें, बहुभुज मोंटाज, और मोंटेज नियंत्रण. फिर, उपरोक्त के रूप में संबंधित बिंदुओं को ढूंढें और मार्कर पर शिफ्ट करें पर क्लिक करें ...।
8. कम खुराक मोड सेट करें।
   1. कम खुराक नियंत्रण टैब खोलें और कम खुराक मोड बॉक्स की जाँच करें ।
   2. निरंतर अद्यतन की जाँच करें और दृश्य पर जाएँ. इस मोड के लिए माइक्रोस्कोप आवर्धन चुनें, आमतौर पर सबसे कम या सबसे कम के बगल में। अगले मोड में से प्रत्येक चुनें और उचित आवर्धन सेट करें। वांछित पिक्सेल आकार प्राप्त करने के लिए रिकॉर्ड सेट किया जाना चाहिए, और फोकस आवर्धन इतना अधिक होना चाहिए कि ध्यान केंद्रित करने के लिए भौतिक मार्कर या अन्य उच्च कंट्रास्ट विशेषताएं स्पष्ट रूप से हल हो जाएंगी। फिर, तुरंत निरंतर अद्यतन को अनचेक करें।
      नोट: परीक्षण मोड या तो रिकॉर्ड के समान सेट किया जा सकता है, इस स्थिति में ट्रैकिंग क्षेत्र को जोखिम को कम करने के लिए रिकॉर्ड क्षेत्र से विस्थापित करना होगा, या कम आवर्धन के लिए, आसपास के अधिकांश हिस्से को शामिल करना होगा।
   3. एक दृश्य छवि लें और क्षेत्र की स्थिति को परिभाषित करने का उपयोग करके परीक्षण की स्थिति सेट करें: परीक्षण।
      नोट: सिफारिश # 1: नमूना क्षेत्र और समय में परिवर्तन को देखते हुए, कम मैग ट्रायल के लिए अतिरिक्त जोखिम न्यूनतम हो सकता है। जब तक ग्रिड बार दृश्य के क्षेत्र में प्रवेश नहीं करता है, तब तक ट्रैकिंग की यह विधि आमतौर पर अधिक विश्वसनीय होती है। सिफारिश # 2: फोकस जैसे विभिन्न मोड के लिए खुराक को समायोजित करने के लिए स्पॉट आकार को अपडेट करना भी संभव है। माइक्रोस्कोप ऑप्टिक्स सेटिंग्स में स्थिरता के लिए, हम ऐसा नहीं करने की सलाह देते हैं, बल्कि स्पॉट आकार को रिकॉर्ड के लिए उपयुक्त छोड़ देते हैं और फिर तेज स्कैन मोड के लिए आवश्यक होने पर एक्सपोज़र समय को समायोजित करते हैं।
   4. लो डोज कंट्रोल टैब पर क्लिक करें > पर जाएं: Rec., फिर वर्तमान स्थिति जोड़ने > लिए नेविगेटर मेनू > ओपन इमेजिंग स्टेट्स पर क्लिक करें। इसे एक नाम दें ताकि इसे आसानी से याद किया जा सके (उदाहरण के लिए, माइक्रोप्रोब एसटीईएम के लिए μP STEM)। विभिन्न राज्यों को विभिन्न कार्यों के लिए परिभाषित किया जा सकता है।
9. मंच को टोमोग्राफी के लिए रुचि के स्थान पर ले जाएं (नीचे नेविगेटर के उपयोग पर अधिक)।
   1. नेविगेटर विंडो > बिंदु जोड़ें क्लिक करके नेविगेटर में एक बिंदु जोड़ें।
   2. कार्यों > यूसेंट्रिकिटी > रफ का चयन करके यूसेंट्रिक ऊंचाई को परिष्कृत करें। नेविगेटर विंडो > अद्यतन Z.
   3. फोकस और परीक्षण के लिए क्षेत्रों को सेट करें। सबसे पहले, एक दृश्य छवि लें। फिर, कम खुराक नियंत्रण टैब में, क्षेत्र की स्थिति परिभाषित करें के तहत, फ़ोकस या परीक्षण का चयन करें। झुकाव अक्ष के साथ दो क्षेत्रों के लिए स्थितियों को समायोजित करें। फ़ोकस को रिकॉर्ड क्षेत्र को ओवरलैप नहीं करना चाहिए।
      नोट: ध्यान रखें कि कुछ ओवर-शूट है, विशेष रूप से बाएं किनारे पर, इसलिए न तो रिकॉर्ड क्षेत्र के तुरंत बगल में सेट किया जाना चाहिए। ओवर-शूट की सीमा का मूल्यांकन रिकॉर्ड आवर्धन पर बार-बार स्कैन करके परीक्षण क्षेत्र पर किया जा सकता है, और फिर व्यापक दृश्य प्राप्त करने के लिए आवर्धन को कम किया जा सकता है।
10. अच्छे माप के लिए (अनुभव के साथ वैकल्पिक), मंच को +60° और फिर -60° तक झुकाएं, हर बार दृश्य या पूर्वावलोकन छवि लेते हुए यह सुनिश्चित करने के लिए कि ग्रिड बार हरे रंग में दिखाए गए रिकॉर्ड क्षेत्र फ़ील्ड में प्रवेश न करे।
11. झुकाव श्रृंखला सेट करें।
    1. फ़ाइल > नया खोलें पर क्लिक करके डेटा सहेजने के लिए एक नई फ़ाइल खोलें और कोई फ़ाइल नाम चुनें. टिल्ट सीरीज़ सेटअप (चित्रा 6) > झुकाव श्रृंखला मेनू का चयन करें। समस्या निवारण: यदि नया खोलें बटन ग्रे है, तो जांचें कि पिछली झुकाव श्रृंखला समाप्त हो गई है। यदि नहीं, तो टिल्ट सीरीज़ > समाप्त करें पर क्लिक करके समाप्त करें।
    2. बक्से पर झुकाव और अंत में चरम झुकाव कोण सेट करें, आमतौर पर क्रमशः -60 ° और +60°, साथ ही वृद्धि, आमतौर पर 2 °।
    3. खुराक सममित मोड के लिए (अनुशंसित - सुनिश्चित करें कि कम खुराक मोड अभी भी सक्रिय है), _ _ रिक्त स्थान सामान्य रूप से 0 है, लेकिन इसका उपयोग पूर्व-झुके हुए एफआईबी लैमेला (जैसे, 20 ° पर) की भरपाई के लिए किया जा सकता है।
    4. सरलता के लिए, एक्सपोजर समय को स्थिर रखें। इसे बदलने के लिए एक्सपोज़र गणना के कुछ पुन: कार्य की आवश्यकता होती है और बीजगणितीय पुनर्निर्माण (जैसे, एआरटी / एसएआरटी / एसआईआरटी) में भी हस्तक्षेप कर सकता है, जो मूल डेटा के साथ अनुमानित तीव्रता की तुलना करता है (चरण 7.1 देखें)।
    5. ऑटोफोकसिंग स्किप करें। एक छोटा अर्ध-अभिसरण कोण, जैसे कि 1 mrad, क्षेत्र की इतनी लंबी गहराई का तात्पर्य है कि ध्यान केंद्रित करना अनावश्यक हो सकता है। एक परीक्षण के रूप में, 0 ° पर ध्यान केंद्रित करें, 60 ° या -60 ° तक झुकें, और रिकॉर्ड को धक्का दें। फोकस बनाए रखना मुख्य रूप से सटीक यूसेंट्रिक ऊंचाई का मामला है। बड़े अभिसरण के लिए, श्रृंखला के दौरान ध्यान केंद्रित करना आवश्यक हो सकता है। इस मामले में एक दृश्य लें, और कम खुराक नियंत्रण टैब में, क्षेत्र और फ़ोकस की स्थिति को परिभाषित करें, और फ़ोकस क्षेत्र को समायोजित करें।
    6. प्रारंभिक और अंतिम क्रियाएं: यदि यूसेंट्रिक ऊंचाई समायोजन सटीक रूप से किया गया था, तो इसे दोहराने की कोई आवश्यकता नहीं है। श्रृंखला के अंत में कॉलम वाल्व बंद करें जब तक कि ऐसा न करने का कोई अच्छा कारण न हो।
    7. नियंत्रण मापदंडों को ट्रैक करने के लिए, कई विकल्प हैं। अनअटेंडेड डेटा संग्रह के लिए, शीर्ष प्राथमिकता उपयोगकर्ता इनपुट के लिए प्रोग्राम को रोकने से बचना है। अनुशंसित सेटिंग्स का उपयोग करें: यदि खोए गए फ़ील्ड का प्रतिशत 5 से अधिक है, तो रिकॉर्ड दोहराएँ. फिर, ट्रैक के बाद ट्रैक करें और नया ट्रैक संदर्भ प्राप्त करने से पहले पूर्वावलोकन के साथ संरेखित करें और यदि रिकॉर्ड संरेखण 2% से भिन्न हो तो नया ट्रैक संदर्भ प्राप्त करें। उपस्थित डेटा संग्रह के लिए, उपकरण समय के घंटों को खोने के जोखिम से बचने के लिए अधिक कड़े पैरामीटर लागू करें।
    8. शुरू करने के लिए तैयार होने पर, विंडो के नीचे गो दबाएं। अंत में, टिल्ट सीरीज़ > समाप्त करें का चयन करें।

5. नेविगेटर (एन्हांसमेंट # 1) का उपयोग करके कई बिंदुओं पर बैच अधिग्रहण

नोट: प्रोटोकॉल अल्पविकसित है क्योंकि ए) यह टीईएम के समान है और बी) नए उपकरण उपलब्ध हो रहे हैं जो संभवतः पूर्ण विवरण को अप्रचलित कर देंगे।

1. पूर्ण ग्रिड मोंटाज को मुख्य विंडो पर लोड करें।
2. कई क्षेत्रों का चयन करें जो आशाजनक दिखते हैं। अंक जोड़ें पर क्लिक करें और चयनित ग्रिड वर्गों के केंद्रों में जोड़ें . मोड को निष्क्रिय करने के लिए फिर से अंक जोड़ें पर क्लिक करें.
3. कम खुराक इमेजिंग स्थिति सक्रिय होने के साथ, चयनित वर्गों में से प्रत्येक के लिए आइटम पर अधिग्रहण और नई फ़ाइल की जांच > के लिए नेविगेटर विंडो का चयन करें। पहले के लिए, फ़ाइल गुणों (चित्रा 7) और फिर फ़ाइल नाम के लिए एक संवाद खुलेगा। मोंटेज्ड छवियां चुनें, और फिर मोंटेज सेटअप संवाद (चित्रा 8) में, कम खुराक मोड में व्यू पैरामीटर का उपयोग करें की जांच करें और स्क्वायर (लगभग 100 x 100 μm) को कवर करने के लिए पर्याप्त ग्रिड बनाएं।
4. नेविगेटर मेनू पर क्लिक करें > आइटम प्राप्त करें और मैपिंग के लिए पैरामीटर का चयन करें। सबसे महत्वपूर्ण बात, प्राथमिक क्रियाओं में, नेविगेटर मानचित्र बनाएं, फिर रफ यूसेंट्रिकिटी और फाइन यूसेंट्रिकिटी की जांच करें, और गो दबाएं (चित्रा 9)। 200 जाल ग्रिड के लिए, इसके परिणामस्वरूप लगभग पूरे वर्ग का नक्शा होगा (चित्रा 10)।
5. टोमोग्राम स्थिति चयन के लिए तैयार रहें। फ़ाइल > नया खोलें क्लिक करके कोई नई फ़ाइल खोलें. इसे एक फ़ाइल नाम दें (उदाहरण के लिए, AnchorMaps.mrc)।
   1. कम खुराक मोड सक्रिय होने के साथ, सेटअप > कैमरा और स्क्रिप्ट दर्ज करें और सुनिश्चित करें कि दृश्य और पूर्वावलोकन एक ही बिनिंग पर हैं (अन्यथा, उन्हें एक ही फ़ाइल में नहीं सहेजा जा सकता है)।
   2. XYZ पर जाने के लिए नेविगेटर विंडो क्लिक करके वर्ग मानचित्र में बिंदुओं > जाएँ।
   3. मार्कर के साथ पहले टोमोग्राम के लिए एक स्थिति चुनें। एक पूर्वावलोकन छवि लें और दाएं माउस बटन के साथ खींचकर स्थिति को परिष्कृत करें। उसके बाद, नेविगेटर विंडो > नया मानचित्र चुनें, और सहेजने के लिए संवाद के लिए हाँ क्लिक करें। इसके बाद, उसी क्षेत्र की एक दृश्य छवि लें और फिर से एक नए मानचित्र के रूप में सहेजें। सुनिश्चित करें कि दृश्य मानचित्र हाइलाइट किया गया है, और शीर्ष दाईं ओर नेविगेटर विंडो में एंकर स्थिति की जाँच करें।
   4. दूसरी स्थिति चुनें, फिर से एक पूर्वावलोकन लें और ऊपर के रूप में स्थान को परिष्कृत करें, और इस बार नेविगेटर विंडो में एंकर मैप दबाएं। यह पूर्वावलोकन और दृश्य दोनों को नेविगेटर में नए नक्शे के रूप में सहेजेगा।
   5. सभी इच्छित स्थानों के लिए चरण 5.5.4 दोहराएँ। बिंदु का चयन करके और नेविगेटर विंडो में XYZ पर जाएं दबाकर एक ग्रिड वर्ग से दूसरे में जाएं।
6. संदर्भ फ़ोकस के लिए, ग्रिड का एक स्पष्ट क्षेत्र चुनें और ध्यान से, हाथ से या ऑटोफोकस द्वारा ध्यान केंद्रित करें। माइक्रोस्कोप पैनल पर रीसेट डीफोकस दबाएं। स्क्रिप्ट > संपादित करें > संपादित करें 15 (या किसी अन्य मुफ्त संख्या) पर क्लिक करके सीरियलईएम में एक स्क्रिप्ट बनाएं और दो पंक्तियां दर्ज करें: स्क्रिप्ट नाम SetDefocus, और SetDefocus 0।
7. नेविगेटर विंडो में, पहले स्थान को हाइलाइट करें (या तो पूर्वावलोकन या दृश्य). Shift-T दबाएँ और फिर अंतिम स्थान हाइलाइट करें और फिर Shift-T दबाएँ. फ़ाइल गुण संवाद खुल जाएगा. फ़ाइल नाम सहित सहेजने के लिए एकल-फ़्रेम छवियाँ और पैरामीटर चुनें. फ़ाइल नाम संपादित करें लेकिन अंत में आइटम लेबल छोड़ दें।
   नोट: संख्याओं में समाप्त होने वाले फ़ाइल नाम क्रमिक झुकाव श्रृंखला के लिए स्वचालित रूप से अपडेट हो जाएंगे। विकल्प नेविगेटर मेनू > नव का उपयोग करना सुविधाजनक है। विकल्प > फ़ाइल नाम में आइटम लेबल का उपयोग करें।
8. इसके बाद, टिल्ट सीरीज़ सेटअप मेनू स्वचालित रूप से खुल जाएगा। पहले की तरह भरें (चित्रा 6), लेकिन परिशोधित यूसेंट्रिकिटी का चयन न करें। नेविगेटर में पूर्वावलोकन बिंदुओं को अब टीएस के रूप में चिह्नित किया जाएगा। आइटम सूची के ऊपर नेविगेटर विंडो में बटन का उपयोग करके इस मेनू पर वापस आ सकते हैं।
9. नेविगेटर मेनू चुनें > आइटम्स प्राप्त करें. इस बार, अंतिम डेटा के लिए पैरामीटर का चयन करें। प्राथमिक क्रिया का चयन करें: झुकाव श्रृंखला प्राप्त करें और Dewars/Vacuum प्रबंधित करें चुनें, आइटम में पुन: संरेखित करें, ठीक यूसेंट्रिकिटी, और कार्रवाई से पहले स्क्रिप्ट चलाएं, जिसमें Script चलाने के लिए: SetDefocus है। सामान्य विकल्पों का चयन करें: त्रुटि होने पर कोई संदेश बॉक्स नहीं और अंत में कॉलम वाल्व बंद करें, फिर GO (चित्रा 11) दबाएं। सीरियलईएम अब सभी एंकर मानचित्रों का दौरा करेगा और प्रत्येक स्थिति में एक झुकाव श्रृंखला रिकॉर्ड करेगा (चित्रा 12)।

6. सीएलईएम मानचित्र पंजीकरण (वृद्धि # 2)

1. यदि यह पहले से ही नहीं किया गया है, तो पूर्ण ग्रिड मोंटाज को मुख्य विंडो में लोड करें, और फिर विंडो > नई विंडो पर क्लिक करके एक नई विंडो बनाएं और इसे एक नाम दें। ध्यान दें कि पूर्ण ग्रिड मोंटाज पंजीकरण 1 में दिखाई देता है।
2. आयात मानचित्र के नेविगेटर मेनू > क्लिक करके CLEM मैप छवि आयात करें. इसे पंजीकरण 2 में जाना चाहिए। इसे ऊपर के रूप में एक नई विंडो भी सौंपी जा सकती है।
3. पूर्ण ग्रिड मोंटाज के संबंध में सापेक्ष रोटेशन निर्धारित करने के लिए सीएलईएम मानचित्र का निरीक्षण करें। एक मानचित्र पर ऐसा करना सबसे आसान है जिसमें ग्रिड बार दिखाई देते हैं। ध्यान दें कि मानचित्र फ़्लिप भी किया जा सकता है। यदि आवश्यक हो तो फ्लिप के साथ नेविगेटर मेनू > रोटेट मैप का उपयोग करके इसे मोटे तौर पर संरेखित करें।
   नोट: निम्नलिखित चरण एक फ्लिप को भी समायोजित कर सकता है, लेकिन पहले से ऐसा करने से निम्नलिखित बहुत आसान हो जाता है। इस चरण को तब तक दोहराया जा सकता है जब तक कि संरेखण संतोषजनक न दिखे, लेकिन सटीक होना आवश्यक नहीं है।
4. सटीक संरेखण के लिए पंजीकरण बिंदुओं का परिचय दें। एक और फिर दूसरी विंडो पर कई संबंधित बिंदु रखें। ऐसे प्रत्येक बिंदु के लिए, नेविगेटर विंडो के शीर्ष पर पंजीकरण बिंदु की जांच करें। संबंधित बिंदुओं को आरोही सूचकांक के साथ लेबल किया जाएगा, इसके बाद क्रमशः ग्रिड मोंटाज या आयातित मानचित्र के लिए आर 1 या आर 2 होगा।
   नोट: खोजक ग्रिड का उपयोग इस कदम को बहुत सरल बनाता है। अन्यथा, केंद्र मार्कर या ग्रिड वर्गों के कोनों जैसी ठोस विशेषताएं चुनें। सिद्धांत रूप में, कच्चे संरेखण के लिए तीन अंक पर्याप्त हैं, लेकिन अधिक अंक मोंटेज निर्माण में मामूली बेमेल की भरपाई करने में मदद करते हैं।
5. यदि सीएलईएम मानचित्र के कई चैनल वांछित हैं, उदाहरण के लिए, उज्ज्वल क्षेत्र पृष्ठभूमि के बिना विभिन्न फ्लोरोसेंट रंग या प्रतिदीप्ति, उन्हें ऊपर दिए गए चरण 6.2 में आयात करें, और पंजीकरण को 2 में बदलें। इस तरह, वे पहले नक्शे से पंजीकरण बिंदु प्राप्त करेंगे।
6. आइटम ट्रांसफॉर्म करने के > नेविगेटर मेनू द्वारा पंजीकरण लागू करें। संबंधित पंजीकरण बिंदु अब सभी मानचित्रों पर दिखाई देंगे, जिन्हें पंजीकरण 1 में सूचीबद्ध किया जाएगा। विज़ुअल रूप से संरेखित करने के लिए, नेविगेटर मेनू > घुमाएँ मानचित्र क्लिक करें. ध्यान दें कि जब कोई मानचित्र नेविगेटर विंडो से लोड किया जाता है, तो इसे स्वचालित रूप से तब तक नहीं घुमाया जाता है जब तक कि लोड बॉक्स चेक नहीं किया जाता है। इसे हमेशा नेविगेटर विंडो से घुमाया जा सकता है।
7. अब प्रतिदीप्ति मानचित्र पर मार्कर या एक बिंदु रखना और चरण को ग्रिड पर संबंधित स्थान पर ले जाना संभव होना चाहिए (चित्रा 13)।

7.3D पुनर्निर्माण

1. इसमें टीईएम टोमोग्राफी के समान बुनियादी चरण शामिल हैं: झुकाव श्रृंखला का संरेखण आमतौर पर बैक-प्रोजेक्शन के बाद। कई सॉफ्टवेयर प्लेटफ़ॉर्म उपलब्ध हैं, और डेटा को टीईएम डेटा के समान माना जा सकता है, अपवाद के साथ कि सीटीएफ सुधार को छोड़ दिया जाना चाहिए।
2. उच्च झुकाव अनुमानों के योगदान को बढ़ाने या श्रृंखला के दौरान रोशनी में बदलाव को संतुलित करने के लिए तीव्रता सामान्यीकरण लागू करें, इस चेतावनी के साथ कि मात्रात्मक जानकारी प्रभावित होती है। IMOD²⁶ अच्छी तरह से काम करता है, उदाहरण के लिए, जबकि AreTomo²⁷ फिड्यूशियल-कम संरेखण के लिए बहुत उपयोगी है; जहां भौतिक कण मौजूद हैं, क्लस्टरअलाइन²⁸ उन्हें अलग-अलग स्थानों के बजाय क्लस्टर के रूप में अनुसरण कर सकता है; यह एसटीईएम डेटा के लिए विशेष रूप से उपयोगी है जहां उच्च-कंट्रास्ट सुविधाओं द्वारा धब्बे खो सकते हैं या छिपे हो सकते हैं।
3. कंट्रास्ट वृद्धि और डीनोइज़िंग के लिए 3 डी डीकन्वोल्यूशन²⁹ के साथ पुनर्निर्माण का पालन करें। एक बार पुनर्निर्माण के बाद, किसी भी मानक विधियों, जैसे ऑर्थोस्लाइस या आइसोसरफेस विभाजन द्वारा एसटीईएम वॉल्यूम डेटा का प्रतिनिधित्व करें। विशेष रूप से, तीव्रता वितरण एकध्रुवीय है, जिसमें पारंपरिक चरण-कंट्रास्ट टीईएम में दिखाई देने वाले कंट्रास्ट इनवर्शन या फूरियर फ्रिंज नहीं हैं। एसटीईएम टोमोग्राम के प्रतिनिधित्व का एक दिलचस्प साधन, सामान्य रूप से, उज्ज्वल क्षेत्र को उलटना है (चित्रा 14)। प्रभाव "एक्स-रे आंखों" का है, जो स्पष्ट सेल³⁰ के माध्यम से रुचि की घनी वस्तुओं को देखता है।

Representative Results

एसटीईएम में तैयार एक पूर्ण ग्रिड मोंटाज रुचि की कोशिकाओं वाले क्षेत्रों को दर्शाता है (चित्रा 4)। ध्यान दें कि छवि अंधेरे क्षेत्र में है, इसलिए खाली छेद अंधेरे दिखाई देते हैं। कोशिकाएं आंशिक रूप से उज्ज्वल दिखाई देती हैं, जहां इलेक्ट्रॉन एचएएडीएफ डिटेक्टर की ओर बिखरे होते हैं। सबसे मोटे हिस्सों में, आमतौर पर केंद्रों या ग्रिड सलाखों के पास, कंट्रास्ट फिर से अंधेरा हो जाता है। यह कई प्रकीर्णन के कारण होता है, जिससे इलेक्ट्रॉन डिटेक्टर द्वारा कैप्चर नहीं किए गए कोणों तक पहुंचते हैं। व्यवहार में, ये क्षेत्र टोमोग्राफी के लिए बहुत मोटे होंगे।

अगले चरण में मध्यवर्ती आवर्धन के नक्शे शामिल हैं (चित्रा 10)। इन्हें अक्सर मध्यम मोंटाज मानचित्र, या वर्ग मानचित्र कहा जाता है, जो आकार के बजाय ग्रिड वर्गों का उल्लेख करते हैं। यहां तक कि सबसे कम माइक्रोप्रोब एसटीईएम मोड पर, उन्हें मोंटाज छवियों के रूप में भी प्राप्त किया जाएगा। नेविगेटर विंडो में आइटम पर क्लिक करने से मानचित्र छवि मुख्य विंडो में लोड हो जाती है। टोमोग्राम अधिग्रहण के लिए विशिष्ट बिंदु इस क्षेत्र के भीतर चुने जाते हैं। रिकॉर्डिंग आवर्धन पर क्षेत्र का पता लगाने के लिए पूर्वावलोकन मोड का उपयोग करें। ध्यान रखें कि स्कैन गति के आधार पर पूर्वावलोकन और रिकॉर्ड के बीच एक पार्श्व बदलाव हो सकता है। एक एकल झुकाव श्रृंखला यहां दर्ज की जा सकती है। माइटोकॉन्ड्रिया, उदाहरण के लिए, अक्सर पूर्वावलोकन और रिकॉर्ड छवि (चित्रा 12) में पहचाना जा सकता है।

बैच टोमोग्राफी के लिए, मंच ग्रिड के चारों ओर यात्रा करेगा और ठीक उसी स्थान पर वापस नहीं आ सकता है। एंकर मैप्स का उपयोग यह सुनिश्चित करने के लिए किया जाता है कि पूर्वावलोकन छवि को कम आवर्धन दृश्य से मिलान करके वांछित रिकॉर्ड क्षेत्रों को विश्वसनीय रूप से फिर से पहचाना जाता है, भले ही चरण आंदोलन स्थानांतरित हो गया हो। PyEM^23,24 एक तेज़ विकल्प प्रदान करता है जो निश्चित रूप से अनुशंसित है, लेकिन अभी तक मानक स्थापना का हिस्सा नहीं है।

सीएलईएम दृष्टिकोण में, टोमोग्राफी के लिए रुचि के क्षेत्रों की पहचान करने के लिए एक प्रतिदीप्ति मानचित्र का उपयोग किया जा सकता है। प्रतिदीप्ति को बाहरी रूप से अधिग्रहित किया जाता है और इसे पूर्ण ग्रिड मोंटाज पर पंजीकृत किया जाना चाहिए। ग्रिड बार और छेद दिखाई देना उपयोगी है, इसलिए आयात से पहले एक मर्ज फ्लोरेसेंस + उज्ज्वल क्षेत्र समग्र तैयार किया जा सकता है, उदाहरण के लिए जीआईएमपी (https://www.gimp.org) या इमेजजे³¹ सॉफ्टवेयर में (ध्यान रखें कि इमेजजे ऊर्ध्वाधर अक्ष को उल्टा करता है)। जब प्रतिदीप्ति की गतिशील सीमा बड़ी होती है, तो संतृप्ति के बिना ऐसा मर्ज बनाना मुश्किल हो सकता है। इस मामले में, दो मानचित्रों को अलग-अलग आयात किया जा सकता है और फिर वर्णित के रूप में एक साथ पंजीकृत किया जा सकता है (चित्रा 13)। इस तरह, नेविगेटर विंडो में फ्लोरेसेंस मैप पर एक बिंदु, इसके बाद "गो टू एक्सवाई", चरण को टीईएम में लगाए गए ग्रिड पर संबंधित स्थिति में लाता है। ध्यान रखें कि मोंटाज (या प्रतिदीप्ति मानचित्र, यदि यह भी एक मोंटाज है) के निर्माण में छोटी विसंगतियां छोटे विस्थापन का कारण बनेंगी; इसलिए, इष्टतम परिशुद्धता के लिए, प्रतिदीप्ति को विशेष रूप से वर्ग मानचित्र पर फिर से पंजीकृत किया जाना चाहिए। समर्थन फिल्म में छेद या उज्ज्वल क्षेत्र प्रकाश छवि के साथ साझा की गई सुविधाओं के आधार पर अक्सर आंख से यह पंजीकरण करना पर्याप्त होता है।

झुकाव श्रृंखला के पुनर्निर्माण के परिणामस्वरूप 3 डी वॉल्यूम (चित्रा 14) होता है। इस उदाहरण में 2.042 एनएम का पिक्सेल आकार है, जिसके परिणामस्वरूप ~ 4 μm का दृश्य क्षेत्र होता है। कैल्शियम फॉस्फेट जमा (नारंगी तीर) आसपास की तुलना में उच्च परमाणु संख्या के कारण बाहर खड़े हैं। सूक्ष्मनलिकाएं (लाल तीर) को पूरे क्षेत्र में खोजा जा सकता है। इसके अलावा, आंतरिक और बाहरी माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली (हरे तीर) को स्पष्ट रूप से देखा जा सकता है। एक्टिन को बंडल ों के रूप में या व्यक्तिगत फिलामेंट्स के रूप में देखा जा सकता है। अधिक आइसोट्रोपिक संकल्प प्राप्त करने के लिए, पुनर्निर्माण को डीकॉन्वोल्यूशन द्वारा संसाधित किया जा सकता है।

चित्रा 1: टीईएम बनाम एसटीईएम की तुलना। टीईएम में, दृश्य के क्षेत्र को एक निकट-समानांतर बीम द्वारा रोशन किया जाता है, और उद्देश्य लेंस कैमरे पर एक आवर्धित छवि बनाता है। क्रायो-टीईएम के लिए, उद्देश्य एपर्चर को बिखरे हुए इलेक्ट्रॉन तरंगों (डैश्ड रेड लाइन) को पारित करने के लिए खोला जाता है, जो डीफोकस के साथ, बिखरे हुए (हरे) तरंगों के साथ हस्तक्षेप करके चरण विरोधाभास पैदा करता है। दूसरी ओर, एसटीईएम, नमूने में एक केंद्रित बीम को घुमाता है और बिखरे हुए इलेक्ट्रॉनों को पिक्सेल-दर-पिक्सेल तरीके से एकत्र करता है। कई डिटेक्टर विभिन्न कोणों पर बिखरे इलेक्ट्रॉनों को इकट्ठा कर सकते हैं। इस आंकड़े को³⁰ से संशोधित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

चित्रा 2: उच्च स्कैन दर के कारण बाईं ओर छवि विरूपण का उदाहरण। पीले तीर के तीर के साथ-साथ क्वांटिफॉइल में विकृत अंडाकार आकार के छेद द्वारा चिह्नित विकृति पर ध्यान दें। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

चित्रा 3: पूरे ग्रिड मोंटाज के लिए मोंटेज सेटअप संवाद। एक्स और वाई में आवर्धन और टुकड़ों की संख्या चुनें ताकि अधिकांश ग्रिड के लिए नक्शा प्राप्त करने के लिए कुल क्षेत्रफल लगभग 2,000 μm तक पहुंच जाए। छवि को स्थानांतरित करने के बजाय मूव स्टेज चुनें और मोंटेज मैपिंग का उपयोग करें, न कि रिकॉर्ड पैरामीटर। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

चित्रा 4: पूर्ण कम आवर्धन ग्रिडमैप एसटीईएम मोड में रिकॉर्ड किया गया। अंधेरे क्षेत्र की छवि में टूटे हुए क्षेत्र पूरी तरह से काले दिखाई देते हैं। गहरे भूरे रंग के क्षेत्र बहुत मोटे और खराब विट्रीफाइड होते हैं। टोमोग्राफी के लिए अच्छे उम्मीदवार क्षेत्र इस स्कैन में सफेद या हल्के भूरे रंग के होते हैं। स्केल बार = 100 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

चित्रा 5: मार्कर प्रक्रिया में बदलाव। एक पहचानने योग्य ऑब्जेक्ट को कम रिज़ॉल्यूशन मानचित्र में अंक जोड़ें (इस छवि में 38) द्वारा चिह्नित किया गया है। कम रिज़ॉल्यूशन मानचित्र (ग्रीन सर्कल) और मध्यम रिज़ॉल्यूशन मानचित्र (नारंगी सर्कल) के बीच बदलाव पर ध्यान दें। फिर, ऑब्जेक्ट को मार्कर (ग्रीन क्रॉस, रेड सर्कल) द्वारा चिह्नित किया जाता है, और मार्कर में शिफ्ट संवाद शुरू किया जाता है। चुना गया विकल्प सभी मानचित्रों को 245x पर समान राशि से स्थानांतरित करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

चित्रा 6: एसटीईएम झुकाव श्रृंखला के लिए झुकाव श्रृंखला सेटअप संवाद। खुराक-सममित योजना का उपयोग 2 ° के चरणों में -60° से +60° तक किया जाता है। कम अभिसरण कोण का उपयोग करते समय फोकस की उच्च गहराई के कारण ऑटोफोकस को छोड़ दिया जाता है। यूसेंट्रिकिटी को परिष्कृत करने की कोई आवश्यकता नहीं है क्योंकि यह पहले किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

चित्रा 7: मध्यम रिज़ॉल्यूशन मानचित्रों के लिए फ़ाइल गुण संवाद। MRC स्टैक फ़ाइल के रूप में सहेजें, पूर्णांक चुनें, और .mdoc मेटाडेटा फ़ाइल में अतिरिक्त जानकारी सहेजें. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

चित्रा 8: मध्यम रिज़ॉल्यूशन मानचित्रों को सहेजने के लिए मोंटेज सेटअप संवाद। 200 जाल ग्रिड पर एक वर्ग के लिए, जो 90 μm चौड़ा है, कम से कम 90 μm x 90 μm का कुल क्षेत्रफल उचित है। छवि स्थानांतरित करने के बजाय मूव स्टेज चुनें और कम खुराक मोड में व्यू पैरामीटर का उपयोग करें। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

चित्रा 9: रिकॉर्डिंग मध्यम रिज़ॉल्यूशन मानचित्र। मध्यम रिज़ॉल्यूशन मानचित्रों को रिकॉर्ड करने के लिए आइटम संवाद प्राप्त करें। मैपिंग चुनें, छवि या मोंटाज प्राप्त करें और सहेजें, और नेविगेटर मानचित्र बनाएं पर टिक करें। प्राथमिक से पहले या बाद के कार्यों में, रफ एंड फाइन यूसेंट्रिकिटी चुनें। जब सहायता प्राप्त न हो, तो त्रुटि उत्पन्न होने पर वैकल्पिक रूप से कोई संदेश नहीं बॉक्स चुनें और अंत में स्तंभ वाल्व बंद करें. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

चित्रा 10: मध्यम रिज़ॉल्यूशन मानचित्र की छवि। मध्यम रिज़ॉल्यूशन मानचित्र (स्क्वायर मैप) 3 x 3 के मोंटाज द्वारा एसटीईएम मोड में रिकॉर्ड किया गया। डेटा संग्रह के लिए दो मध्यम रिज़ॉल्यूशन एंकर मानचित्र नीले वर्गों द्वारा इंगित किए जाते हैं। स्केल बार = 10 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

चित्रा 11: बैच झुकाव श्रृंखला डेटा। बैच झुकाव श्रृंखला एकत्र करने के लिए आइटम संवाद में अधिग्रहण करें। झुकाव श्रृंखला डेटा संग्रह के लिए, अंतिम डेटा चुनें और झुकाव श्रृंखला प्राप्त करें. प्राथमिक से पहले या बाद के कार्यों में, Dewars/Vacuum प्रबंधित करें (सेटअप मेनू में उपयुक्त सेटिंग्स चुनें), आइटम में पुन: संरेखित करें, ठीक यूसेंट्रिकिटी, और कार्रवाई से पहले स्क्रिप्ट चलाएँ की जाँच करें. सामान्य विकल्पों में, त्रुटि उत्पन्न होने पर कोई संदेश नहीं बॉक्स चेक करें और अंत में स्तंभ वाल्व बंद करें (5.14 देखें)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

चित्र 12: माइटोकॉन्ड्रियन के एसटीईएम झुकाव श्रृंखला का 0 ° झुकाव। नारंगी तीर के तीर कैल्शियम फॉस्फेट जमा (मैट्रिक्स ग्रैन्यूल), हरे तीर के निशान क्रिस्टे को और लाल तीर के निशान को 15 एनएम गोल्ड फिड्यूशियल मार्करों को इंगित करते हैं। स्केल बार = 500 एनएम। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

चित्र 13: पंजीकृत क्रायो-सीएलईएम मानचित्र। (ए) मध्यम रिज़ॉल्यूशन एसटीईएम मानचित्र (स्क्वायर मैप, 26-ए) (बी) कम रिज़ॉल्यूशन एसटीईएम मानचित्र, (सी) बीएफ चैनल क्रायो-एफएम मैप, और (डी) जीएफपी चैनल क्रायो-एफएम मानचित्र में पंजीकृत है। नौ पंजीकरण बिंदु (लेबल 4-21) (ई) नेविगेटर में दिखाए गए हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

चित्र 14: वॉल्यूम रेंडरिंग। विभिन्न गहराई पर एक एसआईआरटी जैसे (30 चक्र) फ़िल्टर किए गए टोमोग्राम के माध्यम से (ए) 60 एनएम और ए (बी) 40 एनएम मोटे खंडों का वॉल्यूम रेंडरिंग। पिक्सेल का आकार 2.048 एनएम है, जिसके परिणामस्वरूप लगभग 4 μm का दृश्य क्षेत्र होता है। कृपया चित्र 12 की तुलना में उल्टे घनत्व पर ध्यान दें, जिसका अर्थ है कि उच्च तीव्रता वाली विशेषताएं उज्ज्वल हैं। नारंगी, सफेद, लाल, हरे और हल्के नीले तीर के तीर क्रमशः कैल्शियम फॉस्फेट जमा, राइबोसोम, सूक्ष्मनलिकाएं, आंतरिक और बाहरी माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली और एक्टिन फिलामेंट्स को इंगित करते हैं। स्केल बार = 500 एनएम। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Discussion

प्रोटोकॉल को जीवन विज्ञान माइक्रोस्कोपी की सहायता करनी चाहिए जो सेल के क्षेत्रों में इंट्रासेल्युलर ऑर्गेनेल के 3 डी दृश्य प्राप्त करने में रुचि रखते हैं जो पारंपरिक टीईएम टोमोग्राफी के लिए सुलभ नहीं हैं। इसी प्रोटोकॉल का उपयोग प्लास्टिक वर्गों के एसटीईएम टोमोग्राफी के लिए भी किया जा सकता है, जिसमें एक्सपोजर पर आराम की बाधाएं होती हैं। प्रोटोकॉल को कठोर नियमों के एक सेट के बजाय एक प्रारंभिक बिंदु के रूप में माना जाना चाहिए। दरअसल, एसटीईएम की शक्ति इसका लचीलापन है; इसे संचालित करने का कोई एक सही तरीका नहीं है।

हम इस बात पर जोर देते हैं कि एसटीईएम, केवल स्कैन की गई जांच को संदर्भित करता है और छवि गठन को परिभाषित नहीं करता है। कंट्रास्ट मुख्य रूप से डिटेक्टरों के विन्यास पर निर्भर करता है। अधिक सरल तरीके अक्षीय समरूपता वाले डिटेक्टरों को नियोजित करते हैं, या तो ऑप्टिक अक्ष पर केंद्रित डिस्क या इसके आसपास एक वार्षिकी। सामान्य तौर पर, जब रोशनी सीधे डिटेक्टर पर टकराती है, तो हम एक बीएफ छवि रिकॉर्ड करते हैं जहां (इलेक्ट्रॉन-प्रकीर्णन) नमूना अंधेरा दिखाई देता है; इसके विपरीत, जब डिटेक्टर केवल बिखरे हुए इलेक्ट्रॉनों को इकट्ठा करता है, तो हम एक डीएफ छवि रिकॉर्ड करते हैं जहां घना नमूना उज्ज्वल दिखाई देता है। जब उपयुक्त हार्डवेयर उपलब्ध होता है, तो सीरियलईएम इन दोनों संकेतों को एक साथ प्राप्त और रिकॉर्ड कर सकता है। अभी भी अधिक परिष्कृत कॉन्फ़िगरेशन उपलब्ध हैं, जिसमें कई खंडों वाले डिटेक्टरों से लेकर पूरी तरह से पिक्सेलेटेड कैमरे शामिल हैं। चरण कंट्रास्ट इमेजिंग को प्राप्त किया जा सकता है, उदाहरण के लिए, ऑफ-एक्सिस डिटेक्टर तत्वों^32,33 के बीच अंतर का मूल्यांकन करके। प्रति पिक्सेल पूरे 2 डी प्रकीर्णन (विवर्तन) पैटर्न को एकत्र करना 4 डी एसटीईएम³⁴ के रूप में जानी जाने वाली विधि को परिभाषित करता है, जो एक ही मूल डेटा से कई छवि विरोधाभासों के पुनर्निर्माण को सक्षम बनाता है। चार-आयामी एसटीईएम इलेक्ट्रॉन पीटीचोग्राफी को सक्षम करता है, जो चरण कंट्रास्ट³⁵ प्राप्त करने के लिए एक और साधन प्रदान करता है।

हमने विशेष एसटीईएम पद्धति पर ध्यान केंद्रित किया है जिसे हम ऑर्गेनेल और बरकरार कोशिकाओं या माइक्रोन-मोटी सेल वर्गों के अध्ययन के लिए सबसे उपयोगी मानते हैं। यह विशेष रूप से रोशनी में एक छोटे अर्ध-अभिसरण कोण और डिटेक्टर पर अपेक्षाकृत बड़े संग्रह कोण के साथ बीएफ इमेजिंग के उपयोग पर जोर देता है। छोटा अभिसरण क्षेत्र की एक बड़ी गहराई प्रदान करता है ताकि पूरा नमूना झुकाव श्रृंखला¹⁹ के दौरान फोकस में रहे। व्यवहार में, एक अच्छे माइक्रोस्कोप चरण के साथ, यह अधिग्रहण के दौरान फोकस समायोजन की आवश्यकता को भी समाप्त कर सकता है। कीमत समाधान में एक समझौता है, जैसा कि प्रोटोकॉल की धारा 3 में वर्णित है। हमने ~ 2 एनएम की जांच के साथ 4k छवियों का सुझाव दिया है, जो 1 एनएम पिक्सेल स्पेसिंग के साथ 4 μm के दृश्य के क्षेत्र तक पहुंचता है। हालांकि, पाठक को प्रयोग करने के लिए दृढ़ता से प्रोत्साहित किया जाता है। दूसरा विचार डिटेक्टर के पक्ष में है। जब रोशनी डिस्क ऑन-एक्सिस बीएफ डिटेक्टर को कम करती है, तो चरण कंट्रास्ट दबा दिया जाता है और प्रकीर्णन (आयाम) कंट्रास्ट हावी होता है; इस स्थिति को असंगत उज्ज्वल क्षेत्र कंट्रास्ट³⁶ कहा गया है। सवाल यह है कि किस अंश से कम भरना है, और उत्तर नमूने पर निर्भर करता है। एक बहुत पतला नमूना डिटेक्टर के साथ पूरी तरह से भरे हुए (यानी, रोशनी से मेल खाने वाला संग्रह कोण) के साथ सबसे अच्छा कंट्रास्ट दिखाएगा, लेकिन एक मोटा नमूना सभी तीव्रता को दूर कर देगा, जिससे खराब कंट्रास्ट के साथ शोर का संकेत छोड़ दिया जाएगा। अंगूठे का एक उपयोगी नियम यह है कि नमूना जितना मोटा होगा, बीएफ डिटेक्टर का बाहरी कटऑफ कोण²¹ होना चाहिए। डिटेक्टर आकार और स्थिति निश्चित रूप से तय की जाती है, इसलिए विवर्तन डिस्क आकार को कैमरे की लंबाई का उपयोग करके समायोजित किया जाता है, जैसा कि अनुभाग 1 में वर्णित है। यदि डिटेक्टर एम्पलीफायर सेटिंग्स ऐसी हैं कि सिग्नल गतिशील सीमा को भरता है लेकिन प्रत्यक्ष रोशनी (1.12.3) के तहत संतृप्त नहीं होता है, तो कैमरे की लंबाई को तब तक बढ़ाया जा सकता है जब तक कि उचित सिग्नल तीव्रता और कंट्रास्ट तक नहीं पहुंच जाता। फिर, पाठक को प्रयोग करने के लिए प्रोत्साहित किया जाता है। कला, इसलिए बोलने के लिए, कोणों में है।

एक और पैरामीटर, प्रोटोकॉल में चर्चा नहीं की गई है, माइक्रोस्कोप त्वरण वोल्टेज है। नमूने के साथ रोशन इलेक्ट्रॉनों की बातचीत कम वोल्टेज पर मजबूत होगी। बाकी सब समान होने के साथ, हम कम वोल्टेज पर उच्च कंट्रास्ट की उम्मीद कर सकते हैं। दूसरी ओर, यह नमूने के भीतर कई प्रकीर्णन की शुरुआत है जो उपयोग योग्य नमूना मोटाई को सीमित करता है, इसलिए एक उच्च वोल्टेज मोटे नमूनों के उपयोग की अनुमति देता है। हालांकि, ये प्रभाव सूक्ष्म हैं। 200 केवी और 300 केवी त्वरण के साथ आज तक के हमारे अनुभव समान हैं।

यह देखते हुए कि रिज़ॉल्यूशन के संदर्भ में एसटीईएम से क्या उम्मीद की जा सकती है, यह फिर से नमूना और डिटेक्टर कॉन्फ़िगरेशन पर निर्भर करता है। एकल कण विश्लेषण दृष्टिकोण का उपयोग करके, फेरिटिन पर धातु आयनों को कुछ एंगस्ट्रॉम³⁷ की सटीकता के लिए वलयाकार डार्क फील्ड एसटीईएम द्वारा स्थानीयकृत किया जा सकता है। हाल ही में, एकीकृत अंतर चरण कंट्रास्ट (आईडीपीसी) एसटीईएम³² के साथ-साथ पीटीचोग्राफी³⁵ द्वारा प्राप्त छवियों का उपयोग करके वायरस और प्रोटीन नमूनों के लिए उप-नैनोमीटर रिज़ॉल्यूशन हासिल किया गया था। मोटे सेलुलर नमूनों में अद्वितीय वस्तुओं के लिए, और यहां वर्णित विधियों के साथ, इस तरह के उच्च रिज़ॉल्यूशन यथार्थवादी नहीं है। इष्टतम रिज़ॉल्यूशन जांच व्यास है, जो वर्णित अर्ध-अभिसरण कोण से संबंधित है। अन्य कारक रिज़ॉल्यूशन को कम कर देंगे, विशेष रूप से एक बड़े क्षेत्र तक पहुंचने के लिए एक मोटे पिक्सेल नमूनाकरण, झुकाव श्रृंखला में गलत संरेखण और ट्रांसमिशन में जांच बीम का प्रसार। छवियां प्लास्टिक सेक्शन टोमोग्राफी के साथ अच्छी तरह से तुलना करती हैं। यहां वर्णित सेटअप के साथ, उदाहरण के लिए, सूक्ष्मनलिकाएं के खोखले कोर को देखना आसान होना चाहिए, लेकिन व्यक्तिगत प्रोटोफिलामेंट्स नहीं।

संक्षेप में, एसटीईएम विधियां और हार्डवेयर दोनों एक विकास चरण में हैं। हम उम्मीद कर सकते हैं कि इमेजिंग में नवाचार टोमोग्राफी को भी प्रभावित करेंगे, एसटीईएम को उन डोमेन में ले जाएंगे जो अन्य तकनीकों द्वारा सुलभ नहीं हैं। हम उम्मीद करते हैं कि आधुनिक ऑप्टिकल सुपर-रिज़ॉल्यूशन विधियों के आधार पर कोररिलेटिव क्रायोजेनिक फ्लोरेसेंस इमेजिंग के साथ अभिसरण विशेष रूप से फलदायी होगा। ऑर्गेनेल का पैमाना, 100-1,000 एनएम, इन उभरते तरीकों के लिए एक आदर्श लक्ष्य है।

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
SerialEM	University of Colorado	Veriosn 4.0	SerialEM is a free software platform for microscope control and data acquisition.
STEM-capable transmission electron microscope			The protocol was written based on experience with several microscopes of Thermo Fisher Scientific: Titan Krios, Talos Arctica, and Tecnai T20-F. In principle it should be applicable to other manufacturers as well.