Kriyo-STEM Tomografi ile Organellerin In Situ Görüntülenmesi

Summary

Kriyo-STEM tomografisi, bozulmamış hücrelerin organellerini gömme, kesitleme veya diğer invaziv preparatlar olmadan görselleştirmek için bir araç sağlar. Elde edilen 3D çözünürlük şu anda birkaç nanometre aralığında, birkaç mikrometrelik bir görüş alanı ve 1 μm mertebesinde erişilebilir bir kalınlık ile.

Abstract

Kriyojenik elektron mikroskobu (cryo-EM), doğal sulu ortamlarına gömülü biyolojik veya organik örneklerin görüntülenmesine dayanır; Su, kristalleşmeden bir bardağa (yani vitrifiye) katılaşır. Kriyo-EM yöntemi, biyolojik makromoleküllerin yapısını son zamanlarda atoma yakın bir çözünürlükte belirlemek için yaygın olarak kullanılmaktadır. Bu yaklaşım, tomografi kullanılarak organellerin ve hücrelerin incelenmesine genişletilmiştir, ancak geniş alan iletim EM görüntülemenin geleneksel modu numune kalınlığında ciddi bir sınırlama yaşamaktadır. Bu, odaklanmış bir iyon demeti kullanarak ince lamellerin frezelenmesi uygulamasına yol açmıştır; Rekonstrüksiyonlardan elde edilen subtomogram ortalaması ile yüksek çözünürlük elde edilir, ancak kalan katmanın dışındaki üç boyutlu ilişkiler kaybolur. Kalınlık sınırlaması, tarama EM veya konfokal lazer tarama mikroskobuna benzer şekilde taranmış prob görüntüleme ile aşılabilir. Malzeme biliminde taramalı iletim elektron mikroskobu (STEM) tek görüntülerde atomik çözünürlük sağlarken, kriyojenik biyolojik örneklerin elektron ışınlamasına duyarlılığı özel hususlar gerektirir. Bu protokol, STEM kullanarak kriyo-tomografi için bir kurulum sunar. Mikroskobun temel topikal konfigürasyonu hem iki hem de üç kondenser sistemleri için tanımlanırken, otomasyon ticari olmayan SerialEM yazılımı tarafından sağlanmaktadır. Toplu iş alımı ve daha önce edinilmiş floresan haritalarına korelasyon hizalaması için geliştirmeler de açıklanmaktadır. Örnek olarak, iç ve dış zarı ve kalsiyum fosfat granüllerini, ayrıca çevredeki mikrotübülleri, aktin filamentlerini ve ribozomları işaret ederek bir mitokondrinin rekonstrüksiyonunu gösteriyoruz. Kriyo-STEM tomografisi, sitoplazmadaki organellerin tiyatrosunu ve hatta bazı durumlarda kültürdeki yapışkan hücrelerin nükleer çevresini ortaya çıkarmada mükemmeldir.

Introduction

Organellerin üç boyutlu (3D) görselleştirilmesi, modern hücre biyolojisinde çok önemli bir görevdir. Salgı vezikülleri için onlarca nanometreden hücre çekirdeği için birçok mikrona kadar değişen ölçekler göz önüne alındığında, tüm uygulamalara uyacak tek bir mikroskopi tekniği bulmak zordur. Modern floresan mikroskopisi çözünürlük açısından aralığın çoğunu kapsayabilirken, yalnızca etiketli moleküller görünür. Hücresel tiyatro, elektron mikroskobunun alanı olmaya devam ediyor. Geleneksel kimyasal fiksasyon, plastik gömme ve ağır metallerle boyama yöntemleri güçlü bir şekilde invazivdir, bu nedenle sonuçlar numune hazırlamanın ayrıntılarına bağlı olabilir. Öte yandan Cryo-EM, sulu ortamı vitrifiye etme ihtiyacı ile sınırlıdır; Oluşan buz kristalleri, elektron aydınlatmasını kırar ve ilgilenilen organik malzemeden daha yüksek kontrastlı kontrast eserlere neden olur.

Son on yılda, hücresel çalışmalar için geliştirilen veya uyarlanan EM görüntüleme tekniklerinin çoğaldığı görülmüştür¹. Yinelemeli odaklanmış iyon demeti (FIB) frezeleme ve taramalı elektron mikroskobu (yani FIB-SEM) kullanılarak seri yüzey görüntüleme ile birlikte yüksek basınçlı dondurma şu anda büyük numuneler için tercih edilen yöntemdir². Kriyojenik yumuşak X-ışını tomografisi (cryo-SXT), sudaki yumuşak X-ışınlarının karakteristik absorpsiyon uzunluğu ^3,4,5 ile sınırlı olan birkaç mikron boyutundaki numuneler için uygundur. Bu ölçek birçok bozulmamış hücre tipini içerir ve X-ışını absorpsiyon kontrastının nicel doğası, konsantrasyon ölçümü⁶ veya spektroskopi^7'nin bir yönünü ekler. Subtomogram ortalaması ile kombine edildiğinde, faz kontrast iletim elektron mikroskobuna (TEM) dayanan kriyo-iletim elektron tomografisi (kriyo-ET), makromoleküller veya kompleksler için en yüksek çözünürlüğü sunar ^8,9,10. Bununla birlikte, bozulmamış organellerin o kadar düzenli olması nadirdir ki, bütün olarak ortalamaları alınabilir. Dahası, geniş alan TEM'in geleneksel modu, numunedeki elastik olmayan saçılma (enerji kaybını içeren) ve manyetik objektif lens^11,12'deki renk sapması kombinasyonu ile numune kalınlığı için birkaç yüz nanometre ile sınırlıdır. Büyük enerji yayılımı, ortaya çıkan odak dışı bulanıklığı gidermek için bir enerji filtresinin kullanılmasını belirler, ancak görüntü sinyali artan kalınlıkla katlanarak zayıflarken, hassas örnek hala radyasyon hasarına maruz kalır.

Alternatif görüntüleme modu olan tarama iletimi EM (STEM), enerji filtreleme ihtiyacını ortadan kaldırır ve şu anda TEM tomografisinden daha düşük bir çözünürlükte olmasına rağmen, görüntü oluşumu için elastik olmayan şekilde dağılmış elektronları korur (Şekil 1). Aslında, gerçek bir görüntü oluşmaz. Bunun yerine, bir tarama EM'sinde olduğu gibi, ölçümler noktadan noktaya yapılır ve görüntü bilgisayar tarafından monte edilir. Büyütme, lens akımlarını değiştirmeden yalnızca tarama adımlarının boyutuna göre belirlenir. Düzgün bir şekilde yapılandırıldığında, kriyo-STEM tomografisi (CSTET) için faydalı numune kalınlığı aralığı 1,5 veya hatta 2 μm'ye ulaşabilir, ancak yararlı sinyal yoğunluğunun aydınlatmanın önemli bir kısmı olarak kaldığı konfor bölgesi yaklaşık 600-900 nm^11,13'tür. Bu, sitoplazmanın büyük bir bölümünü ve bazen hücre çekirdeğinin bir kenarını görmek için yeterlidir. Uygulamada, standart kriyojenik sıvıya daldırma yöntemiyle vitrifikasyonun, kalınlık üzerinde STEM görüntülemeden daha ciddi bir kısıtlama getirdiğini görüyoruz. Bu video makalenin amacı, CSTET'in araştırma laboratuvarlarında ve mikroskopi tesislerinde hücre ve organel görüntüleme için alet sandığına dahil edilmesini kolaylaştırmaktır.

İlk zorluk, CSTET'teki mikroskop operasyonlarının kriyo-TEM tomografisinde olduğu gibi yaşam bilimleri uygulamaları için henüz standartlaştırılmamış olmasıdır. STEM donanımı nadiren (eğer varsa) cryo-EM pazarına hedeflenmiştir. Bununla birlikte, bu en yeni nesil mikroskoplarla değişiyor ve mevcut birçok araç güçlendirilebilir. Bir teknik olarak STEM, kriyojenik ve düşük dozlu yöntemlere de ilgi duyan malzeme bilimlerinde kalkmış ve büyük ölçüde devralınmıştır^14,15. Malzeme bilimi literatürü, karışıklığa katkıda bulunan BF-STEM, ADF-STEM, HAADF-STEM, 4D-STEM, DPC-STEM, vb. Kısaltmalarla doludur. Burada, Weizmann Bilim Enstitüsü'ndeki kolektif deneyimimizde, parlak alan (BF) STEM görüntüleme^16'ya dayanan yararlı sonuçlar için en genel protokolü sağlayan önerilen bir başlangıç noktası sunuyoruz. Hiçbir şekilde olasılık yelpazesini tüketmez veya hatta keşfetmez, ancak daha fazla iyileştirme için bir temel oluşturacaktır. Kriyo-STEM'i vurgulamamıza rağmen, protokolün çoğu plastik gömülü bölümlerin oda sıcaklığında STEM tomografisi için eşit derecede önemlidir.

STEM'in özü, numuneyi odaklanmış bir elektron probu (Şekil 1), aydınlatma konisi ile taramak ve iletimdeki kırınım (saçılma) düzleminden gelen sinyalleri piksel piksel kaydetmek, 2D görüntüler üretmektir^17,18. Çoğu hücresel materyal de dahil olmak üzere amorf örnekler, iletimde dağınık bir saçılma paterni üretecektir. En basit pratik STEM konfigürasyonu, merkezi diski (yani, bir numune olmadan iletilecek prob aydınlatmasını) kaydetmek için dairesel bir dedektör yerleştirmektir. Örnek, elektronları bu aydınlatma konisinden sinyalin azaldığı ölçüde uzağa saçar. Bu bir BF görüntüsü üretir - örnek parlak bir arka plan üzerinde karanlık görünür. Dairesel bir dedektör, aydınlatma konisinin dışındaki numuneden saçılımı tespit etmek için de (veya bunun yerine) kullanılabilir. Örnek çıkarıldığında sinyal yoktur. Bir örnek yerleştirildiğinde, nesneler karanlık alan (DF) görüntüsünde koyu bir arka plan üzerinde parlak görünür. STEM için isimlendirme (BF, dairesel karanlık alan [ADF], yüksek açılı dairesel karanlık alan [HAADF], vb.) esas olarak dedektörler için toplama açılarının aralıklarını ifade eder.

Aydınlatmanın yakınsama açısı, STEM'in hücresel tomografiye önemli bir adaptasyonunu temsil eder. En yüksek öncelik yüksek çözünürlük olduğunda, yakınsama açısı mümkün olduğunca büyük olmalıdır. (Bu, konfokal lazer tarama mikroskobuna benzer; çözünürlük, dalga boyunun sayısal açıklığa bölünmesiyle ölçeklenen prob çapı tarafından belirlenir. EM için yarım açı veya yarı yakınsama açısına atıfta bulunduğumuzu unutmayın.) Öte yandan, öncelik alan derinliği olduğunda, çözünürlükteki bir uzlaşma büyük bir avantaj sağlar, çünkü odaklanmış ışın, yarı açılı kareye bölünmüş dalga boyunun iki katına eşit bir mesafe için kabaca paralel kalır. İdeal olarak, tüm hücre hacmi odakta kalır¹⁹. Örneğin, 300 keV'de, elektron deBroglie dalga boyu 0.002 nm'dir, bu nedenle 1 mrad'lık bir yakınsama 2 nm'lik bir çözünürlük ve 4 mikronluk bir alan derinliği verir. Bu koşullar altında tomografi, veri toplama sürecinde odaklanmadan bile yapılabilmekle birlikte, edinimin başlangıcında sadece bir kez yapılabilir. Geleneksel tomografi özellikli bir STEM, 7 veya 8 mrad'lık bir yarı yakınsama açısına ulaşabilir; Bu nedenle, prensip olarak, 0.25 nm sırasına göre, ancak daha sonra sadece 62 nm'lik bir odak derinliği ile bir çözünürlüğe ulaşabiliriz. Bu açıkça hücresel görüntüleme için çok incedir. Üç kondansatörlü lensli daha gelişmiş mikroskoplar, yarı yakınsama açısının önemli bir aralıkta sürekli olarak ayarlanmasını sağlar. Daha geleneksel iki kondenser konfigürasyonu ile yakınsama, kondenser (C2) açıklığı tarafından ayrı ayrı sabitlenir.

Sağlam, plastiğe gömülü numuneler için, her eğimde bir odak serisi kaydedilebilir ve bunları yüksek çözünürlüklü²⁰ için birleştirebilir, ancak kriyojenik numuneler için radyasyon bütçesi çok ciddi şekilde kısıtlanır. Son olarak, BF veya DF görüntülemenin avantajlarını tartırken, kalın numuneler için, numunedeki çoklu elastik saçılmanın etkileri göz önünde bulundurulmalıdır. BF sinyali çoklu saçılma ile daha az bozulur ve kalın örnekler için daha yüksek çözünürlük gösterir^16,21.

Yararlı bir kural, toplama açılarını yakınsamadan birkaç kat daha büyük ayarlamak olmuştur. Örnek ne kadar kalın olursa, toplama diski o kadar büyük olmalıdır. Çok küçük bir disk düşük sinyal yoğunluğu sağlayacaktır; Çok büyük bir disk, yalnızca en yüksek açılı saçılma katkıda bulunacağından, zayıf görüntü kontrastına neden olur. Toplama açıları belirli bir numune için optimize edilmelidir. Kamera uzunluğunun (kırınım) bir fonksiyonu olarak dedektör açıları bağımsız olarak kalibre edilmelidir. Mikroskop yazılımı tarafından rahatça görüntülenebilirler. Uygulamada, toplama işleminin aydınlatma yarı açılarına, sırasıyla θ ila α oranında iki ila beş faktörlük bir faktör (Şekil 1), hücresel örneklerin CSTET'i için önerilen bir başlangıç noktasıdır.

Aşağıdaki protokol, mikroskop kontrolü için popüler SerialEM yazılımı^22,23 kullanılarak yapılan STEM tomografi operasyonunu açıklamaktadır. SerialEM belirli bir üreticiye bağlı değildir ve TEM tomografisinde yaygın olarak kullanılmaktadır. Tomografi hazırlama işlemlerinin çoğu doğrudan TEM'den gerçekleştirilebilir. SerialEM stratejisi, tarama sistemini bir kamera olarak modellemektir. Bu, TEM'den STEM'e basit geçişi mümkün kılar. Bununla birlikte, büyütme ve ciltleme gibi parametrelerin tamamen yapay olduğu akılda tutulmalıdır. Önemli parametreler mikron cinsinden görüş alanı, görüş alanındaki piksel sayısı ve pozlama süresidir. Piksel aralığı veya örnekleme, piksel sayısına bölünen doğrusal alandır, bekleme süresi ise pozlama süresine bölünen piksel sayısıdır.

STEM ve CSTET için minimum konfigürasyon mikroskopta üç özellik içerir: bir tarama jeneratörü, bir STEM dedektörü ve tomografi kontrol yazılımı. Protokol, FEI / Thermo Fisher Scientific'in (TFS) isimlendirilmesini ifade eder, ancak kavramlar geneldir. TFS'nin özel mülk yazılımı TEM²⁴ için JoVE'de açıklanmıştır ve STEM işlemi çok benzerdir.

Mikroskobun servis ekibi veya deneyimli personel tarafından önceden hizalandığını ve bir dosya yüklenerek bir sütun hizalamasının çağrılabileceğini varsayıyoruz. Küçük ayarlamalara doğrudan hizalama denir ve FEG yazmaçları (TFS mikroskopları) olarak adlandırılan yerlerde saklanabilir. Doğrudan hizalamalar arasında dönme merkezi, pivot noktaları, kırınım hizalaması ve kondenser astigmatizmasının telafisi bulunur. Ayarlamalar yinelemeli olarak yapılmalıdır. TFS mikroskoplarının farklı nanoprob (nP) ve mikroprob (μP) modları uyguladığını unutmayın; Belirli bir kondenser açıklığı için, bunlar sırasıyla TEM'de paralel aydınlatma ve STEM'de az ya da çok yakınsak (sıkıca odaklanmış) elektron ışını ile nispeten dar veya geniş bir görüş alanı sağlar. Diğer üreticiler, yakınsama açılarının aralığını kapsayacak şekilde farklı şemalar kullanır.

Başlamadan önce, incelenen örneğe bağlı olarak, görüş alanı, L ve örnekleme (piksel genişliği), l seçilmelidir. Örneğin, l = 1 nm/piksel için, 4 μm^2'lik bir görüş alanını kaplayacak 4.000 x 4.000 piksellik bir görüntü seçilmelidir. Çözünürlük, en iyi ihtimalle, uzamsal örneklemenin iki katı olacaktır, bu nedenle 2 nm ve prob çapı, d, bununla eşleşmelidir. Prob açısının kalibrasyonu bu protokolün kapsamı dışındadır, bu nedenle bir tablo veya ekran okumasının mevcut olduğunu varsayıyoruz. Prob çapı yaklaşık olarak elektron dalga boyunun yarı yakınsama açısına (radyan cinsinden) bölünmesiyle elde edilir: d = λ/θ. Dalga boyu, λ, 300 keV için 0.002 nm ve 200 keV elektron için 0.0025 nm'dir, bu nedenle 1 mrad'lık θ, sırasıyla 2 veya 2.5 nm'lik bir nokta çapı sağlayacaktır.

Protokol, artan karmaşıklığın ilerleyişinde sunulmaktadır. İlk görev, mikroskop üreticisinin yazılımına bağlı bir STEM görüntüsü ve ardından SerialEM kullandığımız bir eğim serisi üretmektir. Birçok okuyucu şüphesiz SerialEM'e aşina olacak, bu yüzden daha karmaşık görevler doğal olarak gelecek. Prosedürleri sıkı bir şekilde takip etmeye gerek yoktur. Otomasyonla ilgili gelişmeler doğrudan STEM için uygulanabileceği gibi TEM için de uygulanabilir. Deneyimli kullanıcılar muhtemelen floresan haritalarının korelasyon kaydından başlayarak ve toplu tomografi kurmaya devam ederek protokolü tersine çevirecektir. Daha fazla ayrıntı, otomasyon^25'teki en son gelişmeler hakkında yakın tarihli bir JoVE makalesi de dahil olmak üzere SerialEM'in kendisi için kapsamlı belgelerde ve öğretici kütüphanelerde bulunabilir.

Protocol

1. STEM kurulumu

1. Ön hizalamalar: Sütun hizalama dosyasını yükleyin ve ardından Sütun Vanaları'nı açın. Yandan girişli bir kriyo tutucu kullanıyorsanız, Cryo-shield'ı açın. TEM modunda başlatın. Işın ekranda görünmelidir. Değilse, büyütmeyi azaltın.
2. Kontrol panelindeki düğmeye basarak mikroskobu ösentrik odağa getirin.
3. Floresan ekranı doğrudan veya dahili kamerayla (mikroskop modeline bağlı olarak) görselleştirmek için spot boyutunu uygun bir değere (ör. 6) ayarlayın.
4. Mikroskobu STEM moduna ayarlayın ve odağın amaç yerine kondansatör lenslerini (yoğunluk) kullandığını doğrulayın. Ösentrik odağı ayarlayın. Ardından, ilk ayarlamalar için kırınım modundan çıkın.
5. Kirişin boş olmadığından emin olun. Işın ekranda görünene kadar büyütmeyi azaltın. Kiriş kaymasını merkeze doğru ayarlayın ve kirişi merkezde tutarken büyütmeyi yaklaşık 70kx'e kadar adım adım artırın.
6. İstediğiniz kondenser açıklığını, tipik olarak 50 μm'yi takın. Diyafram açıklığı merkezlemesini kontrol edin. Odak düğmesini hafifçe ileri geri çevirirken, nokta genişlemeli ve büzülmeli, ancak bir uçak hayali bir dikey kum saatini kesiyormuş gibi yerinde kalmalıdır. Diyafram açıklığı ortalanmamışsa, aydınlatma kum saati eğilmiş gibi yanal olarak kayacaktır.
7. Işını netlemeye getirin ve hizalamalar sekmesindeki Yoğunluk Listesi Netlemesi'ne (varsa) basın veya 1.2'deki gibi ösentrik netlemeye dönün. Işın konumunu merkeze göre yeniden ayarlayın.
8. Döndürme merkezini ayarlayın. Netleme adım tekerleğini minimuma veya bir adım yukarıya çevirin, böylece ışın hafifçe titreşir ve odak yukarı ve aşağı hareket ettikçe sabit kaldığından emin olun.
9. Pivot noktalarını seçin ve iki noktayı X ve Y ayarlamalarıyla bir araya getirin.
   NOT: TFS cihazına bir faz plakası takılıysa, yalnızca X ayarı kullanılmalıdır.
10. Kirişi hafifçe bulanıklaştırın ve diski yuvarlak hale getirmek için kondenser damgalayıcılarını ayarlayın. Optimize etmek için odaklanarak yukarı ve aşağı gidin; Odağı geçerken bir yönde veya diğerinde uzama eğilimi olmamalıdır.
11. Lensleri normalleştirin. Ardından, noktayı ortada tutmak için ışın kaydırmayı kullanırken büyütmeyi kademeli olarak yaklaşık 240kx'e yükseltin ve döndürme merkezi ve pivot noktası ayarlamalarını tekrarlayın (adım 1.6-1.8).
12. Kırınım moduna dönün. Işın, floresan ekranda tek tip bir disk olarak görünmelidir. Kamera uzunluğu (CL) artık X-ışını kristalografisinde olduğu gibi dedektöre olan optik mesafeyi etkili bir şekilde kontrol ediyor. Değiştirin ve ekran konumu örneğe doğru veya örnekten uzaklaşacakmış gibi diskin büzülüp büyüdüğünü izleyin. Bu koni BF aydınlatmasını temsil eder.
    NOT: Her CL için, yansıtılan kirişi merkezi eksene getirmek için ayarlanması gereken bir kırınım hizalaması vardır. Normalde hepsini hassaslaştırmaya gerek yoktur, yalnızca algılama için kullanılacak bir (veya birkaçı) vardır.
13. STEM modunu yüksek büyütmede kullanın.
    1. Bir BF STEM dedektörü mevcutsa, bununla başlayın. Sahne alanını boş delikli bir alana getirin ve istediğiniz CL'yi kullanarak kirişi ortalamak için kırınım hizalamasını ayarlayın.
    2. Birçok mikroskop sadece bir HAADF dedektörü ile donatılmıştır; bunu BF dedektörü olarak kullanmanın bir püf noktası var. İlk olarak, dedektörü geri çekin, kirişi doğrudan hizalamalarda yukarıdaki gibi ortalayın, tipik olarak 20 μm gibi küçük bir objektif diyafram açıklığı yerleştirin ve ışını düzgün bir şekilde çevreleyecek şekilde konumunu ayarlayın. (Bunu yapmanın en kolay yolu, aydınlatmanın etrafında bir halo görmek için bir örnek veya test ızgarası yerleştirmektir). Ardından, kirişi eksenden ve dedektör alanına taşımak için kırınım hizalamasını kullanın. Işının dedektör tarafından engellendiğini doğrulamak için ekrandaki ışını izlerken dedektörü takın ve geri çekin.
    3. Mikroskop yazılımında bir tarama başlatın ve parlaklık ve kontrast (B/C) ayarlarını, ışın boşaldığında sinyal 0'a yakın ve tam aydınlatma dedektöre düştüğünde doygunluğa yakın olacak şekilde ayarlayın. Yardımcı olması için kapsam ekranını kullanın. Ayarlar beklenmedik şekillerde birleştirilebilir, bu nedenle ayarlama birkaç kez yinelenmelidir.
14. Düşük mag (LM) moduna geçmeden mikroskobu yüksek büyütme kaydında (SA modu) nispeten düşük bir büyütmeye döndürün.
15. Daha sonra başvurmak üzere ekran akımını not edin (bkz. adım 3.1.1). Akım, TEM'de olduğu gibi silah lensi ve spot boyutu ayarlarıyla, azaltılmış bir akıma karşılık gelen artan sayılarla değiştirilebilir.
16. Bu noktada, standart değerlere dönüşü kolaylaştırmak için bir FEG kaydı kaydedin.
    NOT: Tesis, kullanıcıların çalışan bir yapılandırmadan başlayabilmesi için varsayılan bir FEG yazmaçları kümesi hazırlayabilir.

2. Numunenin yerleştirilmesi

1. LM TEM modunda, ızgaranın opak olmadığından emin olun. İlk ayarlamaları yapmak için bir ızgara karesi bulun. Bazı boş alanlar, bir delik veya yırtık bir ızgara karesi bulmak uygundur. Onlara rahatça geri dönmek için sahne pozisyonlarını kaydedin.
2. Numuneyi ösentrik yüksekliğe getirin. Bunu yapmak için birkaç yöntem vardır. Örneğin, görüntü yanal olarak kaymayı durdurana kadar numune yüksekliğini Z ekseni boyunca hareket ettirirken ızgarayı eğmek için sahne alanı yalpalayıcısını kullanın. Alternatif olarak, görüntüleme ekranındaki bazı özellikleri işaretleyin ve sahne alanını 30°'ye eğin. Özellik yanal olarak hareket edecektir. Orijinal konumuna geri getirmek için numune yüksekliğini ayarlayın. İyileştirmek için büyütme veya sahne eğimini artırın. 0° eğime geri dönün.
3. STEM moduna dönün ve STEM dedektörünü takın. En düşük yüksek büyütme (SA) moduna gidin. Bilgisayar ekranında bir görüntünün gözlendiğinden emin olun. Gereksiz maruziyeti önlemek için hızlı bir şekilde tarayın; 1 μs/piksel veya daha az tipik olacaktır. Tarama aşırı hızlı olduğunda görüntünün sol kenarlıkta bozuk görünebileceğini unutmayın (bkz. Şekil 2).
4. Ösentrik Netleme düğmesine basın, büyütmeyi artırın ve tarama sırasında odağı hassaslaştırın. Mikroskop yazılımı tarafından sağlanan odak büyüteçlerini kullanmak uygundur.
5. Kondenser astigmatizmasını ayarlayın. Bu en kesin olarak Ronchigram yöntemiyle yapılabilir. Işın ince bir numune alanı üzerindeyken, iletilen ışının patladığı noktaya, numunenin her iki taraftaki gölge görüntüleri arasında odaklanın. Ardından, merkezi diski yuvarlak hale getirmek için kondenser ayarını ayarlayın. Bu, özellikle kriyojenik numuneler için biraz pratik gerektirir.
   NOT: Bir alternatif, bazı altın parçacıklarını bulmaktır (genellikle tomografide hizalama için referans belirteçleri olarak kullanılır). Büyütmeyi artırın ve yukarı ve aşağı odaklanın, astigmatizmayı ayarlayın, böylece parçacıklar her iki yönde de uzamadan yuvarlak kalır.
6. LM STEM moduna gidin ve ilginç bir alan bulmak için taramaya devam edin. Gerekirse dedektör B / C ayarlarını yeniden düzenleyin (adım 1.13.3), kabaca bu noktada.

3. Görüntü kaydetme

1. Kayıt için dozu tahmin edin. Genel bir kural olarak, tüm tomogram için 100-150 e^-/Å^2'yi hedefleyin. Numune başına doz toleransını kontrol edin. Amper (A) cinsinden akımın elektron başına yüke bölünmesi, saniye cinsinden maruz kalma süresi (T) ile çarpılan ve Å^2'deki görüş alanına bölünen bir e^-/s sayısını temsil eder. Kolaylık sağlamak için, akımı nanoamper cinsinden (ekrandan okunduğu gibi), görüş alanının genişliğini mikrometre cinsinden ve çerçeve pozlama süresini saniye cinsinden uygun faktörlerle ifade edin:
   
   Bu sayı, serideki toplam pozlamayı elde etmek için eğim sayısıyla çarpılmalıdır. Örneğin, akım I = 0.04 nA, bir alan L = 4 μm ve 12 s'lik bir pozlama süresi ile, eğim başına 1.9 e-/ş2 veya 61 projeksiyonluk bir dizi için yaklaşık 110 e^-/Ų elde ederiz.
2. Sahne alanını bir deliğe geri döndürün (veya ızgarayı geri çekin) ve istenen ekran akımına ulaşmak için spot boyutu ve/veya tabanca lensi ayarlarını kullanarak ışın akımını ayarlayın. Ölçüm 0 değerini okursa, akımı artırmak için daha büyük bir C2 diyafram açıklığı takın. Ardından, ölçümü çap oranının karesine bölerek düzeltin ve son olarak daha küçük diyafram açıklığına geri dönün.
3. B / C ayarlarını adım 1.13.3'e göre hassaslaştırın ve son olarak sahneyi ilgi çekici bir alana geri döndürün ve görüntüleme koşulları altında doğrudan hizalamaları ve astigmatizmayı yeniden kontrol edin.
4. Bir test görüntüsü edinin.

4. SerialEM ile Tomografi

1. Mikroskop bilgisayarında SerialEM sunucusunu başlatın (SerialEM normalde farklı bir bilgisayara yüklenir). Ardından, SerialEM'yi açın. STEM, SerialEM'de aynı arayüze sahip bir kamera gibi görünür. İletişimlerin kurulum için uygun şekilde çalıştığından emin olun. Örneğin, mikroskop sekmesi doğru büyütmeyi görüntülemelidir. Bu işe yaramazsa, burada durun ve sorun giderin.
2. Kamera ve komut dosyası sekmesini bulun ve Kurulum'u açın. STEM kameranın seçildiğinden emin olun ve her mod için uygun ciltleme ve bekleme sürelerini seçin. Uygun dedektörün (veya dedektörlerin) sol alttaki "alınacak kanallar" kutusunda göründüğünden emin olun. Test etmek için alt kısımdaki Acquire tuşuna basın. Yine, hiçbir şey olmazsa veya kiriş boşalmazsa devam etmeyin. İletişimi durdurun ve kontrol edin.
   NOT: Modlar TEM tomografisine benzer şekilde kullanılmaktadır. Binning, TEM ile uyumluluk için bir yapaylıktır. Önemli parametre piksel sayısıdır; Farklı mikroskop sistemleri aynı sayıma ulaşmak için farklı ciltleme kullanır.
   1. Görüntüle ve Arama, nispeten az piksele sahip hızlı taramalar olmalıdır (ör. 1 sn'de 512 x 512 piksel).
   2. Netleme genellikle hızlı kayıt yapılan küçük bir alandır. Bu nedenle, düşük doz modunda, doğruluğa yardımcı olabilecek Kayıt modundan farklı bir büyütmede olmak için Odak'ı seçin. Spot boyutunu değiştirmeden bırakın.
   3. Kayıt modu için, pozlama tahmininde yukarıda seçilen parametreleri kullanın. Varsa, eğimli bir görüntüde netlemeyi satır satır düzelten Dinamik Netleme'yi de seçin.
   4. Daha sonra kolaylık sağlamak için, önizleme için gruplamayı View ile aynı olacak şekilde seçin (bkz. Geliştirme #1, adım 5.5). Görüntü boyutunun (piksel sayısı) aynı olması gerekmez.
   5. Alma sırasında Kayıt alanını ortada tutmak için Deneme modunu kullanın. Görünüm'e benzer olabilir, ancak çerçevenin sol tarafında belirgin tarama bozulmaları olmamasına dikkat edin (örnek için Şekil 2'ye bakın). Yine, Düşük Doz modunda, Deneme Kayıt modundan farklı bir büyütmeye sahip olabilir.
   6. Izgara taraması için hemen Montaj modunu kullanın. İlgi alanlarını bulmak için yeterince piksel yoğunluklu olmalıdır; Öneri: 512 x 512 veya 1024 x 1024. Bu mod örnek alanlarını bulmak için kullanıldığından, görüntünün iyi bir dinamik aralıkla (görüntü görüntüleme kontrollerinde görülür) iyi olduğundan emin olun.
   7. Ayarlar dosyasını, bu seçimlerin bir sonraki oturum için varsayılan olarak tutulması için kaydedin (programın çökmesi durumunda yakında ortaya çıkabilir).
3. Görüntü kaydırma ve sahne kaydırma kalibrasyonlarını test edin. Mikroprob (veya nanoprob) modunda, Görüntüyü Görüntüle'ye tıklayın, fareyle üzerine gelin, düğmeyi basılı tutun ve görüş alanının yaklaşık dörtte biri kadar çapraz olarak sürükleyin. Ardından, başka bir Görünüm alın. Görüntüler mükemmel bir şekilde üst üste binmelidir. Shift tuşunu basılı tutarken tekrar sürükleyerek tekrarlayın (bir sahne alanı hareketini zorlamak için). Görüntüler, belki de daha az kesin olsa da, iyi örtüşmelidir.
4. LM moduna gidin ve sahne alanı kaydırmasını test edin. Bu testler başarısız olursa, durdurun ve sorun giderin. Gerisi işe yaramayacak.
5. Tüm ızgaranın montaj LM haritasını yapın. Bu TEM'de de yapılabilir.
   1. Görüntünün diyafram açıklıkları tarafından engellenmediği, genellikle 185x civarında olan en düşük büyütmeli STEM moduna gidin.
   2. Aç'> Gezgin menüsünü tıklatın. Ardından, Gezinti menüsü > Gezinti. Seçenekler'i tıklatın > Haritaları Bayta Dönüştür'ün seçimini kaldırın.
   3. Tam Montajı Ayarla > Montaj ve Kılavuzlar > Gezgin menüsünü seçin. Bir menü açılacaktır. Kontrol edilecek seçenekler şunlardır: Görüntüyü kaydırmak yerine sahne alanını taşı, Gezgin açıksa her montajdan harita oluştur ve Kayıt parametrelerini değil Montaj Eşlemesini kullan. Görüntü ızgarası kabaca 6 x 6 veya 7 x 7 olmalıdır. Kaydedilecek toplam alanı arayın. Çok fazla görüntü gerekiyorsa, büyütme mikroskoptan doğru okunamayabilir (Şekil 3). Durun ve kontrol edin.
   4. Montaj alımını başlatmak için, Montaj Kontrolleri'nde Başlat'a veya Kamera ve Komut Dosyası altında Montaj'a basın. Dosya Parametreleri: mrc, tamsayı olarak sakla'yı seçmek için başka bir menü açılacak ve başka bir iletişim kutusunda depolama için dosya adını seçecektir. Verileri SerialEM'in kendi kullanıcı ayarları altında değil, uygun veri alanında sakladığınızdan emin olun. Büyük verilerin sistemin bulunduğu C diskinde depolanmaması önerilir.
   5. Satın alma tamamlandığında montaj ana pencerede görünecektir (Şekil 4). Artık tıpkı TEM'de olduğu gibi Navigatör üzerindeki işaretçiyi ve noktaları kullanarak ızgaranın etrafında gezinebilirsiniz.
6. Astigmat düzeltmesini tekrar kontrol edin. Genellikle, küçük bir alanı hızlı bir şekilde taramak ve odakla birlikte ayarlamak yeterlidir, böylece altın nanopartiküller gibi nokta benzeri özellikler, yüksek büyütmede odağa girip çıkarken (SEM'de olduğu gibi) tamamen yuvarlak kalır. Daha konservatif olarak, astigmatizmayı düzeltmeden önce 1.5-1.8 adımlarının doğrudan hizalamaları tekrarlanabilir.
7. Yüksek büyütme oranlı görüntülemeyi LM montajıyla hizalayın.
   1. LM montajında kolayca tanınabilir bir özelliğe sahip bir konuma gidin. Bir nokta ekleyin, Gezgin penceresine tıklayın > Puan Ekle'ye tıklayın ve özelliğe tıklayın. Devre dışı bırakmak için tekrar itin (eklemeyi durdurun).
   2. En düşük yüksek mag (HM) büyütme hızında bir Görünüm veya Deneme görüntüsü alın ve belirtilen öğeyi bulun. İşaretçiyi oraya yerleştirin (yeşil çarpı) ve Gezgin penceresinde ilgili nokta vurgulanmış olarak, Gezgin menüsünde > İşaretçiye Kaydır..., açılan iletişim kutusunda, Şekil 5'te gösterildiği gibi Tüm Haritalar ve Kaydırmayı Kaydet'i seçin.
   3. Sahne alanını başka konumlara taşıyarak ve HM görüntüsünün LM montajında seçilen konumlarda ortalandığını doğrulayarak test edin. Özellik HM görüntüsünde görünmüyorsa, LM ve HM modları arasındaki geçiş çok büyük olabilir. Bu durumda, daha geniş bir alana poligon montajı yapın. Çokgen Ekle'> Gezgin penceresini tıklayın, bazı noktaları seçin, sonra kapatmak için Çokgen Ekle'yi tekrar tıklayın. Montaj ve Kılavuzlar'> Çokgen Montajı Ayarla'> Gezgin menüsünü, Başlangıç > Montaj Denetimleri'ni tıklatın. Ardından, yukarıdaki gibi ilgili noktaları bulun ve İşaretleyiciye Kaydır...'ı tıklayın.
8. Düşük doz modunu ayarlayın.
   1. Düşük Doz Kontrolü sekmesini açın ve Düşük Doz Modu kutusunu işaretleyin.
   2. Sürekli güncelleştirme'yi işaretleyin ve Görüntüle'ye gidin. Bu mod için mikroskop büyütmesini seçin, genellikle en düşük veya en düşük olanın yanında. Sonraki modların her birini seçin ve uygun büyütmeyi ayarlayın. Kayıt, istenen piksel boyutuna ulaşacak şekilde ayarlanmalı ve Netleme büyütmesi, netleme için referans işaretleyicilerin veya diğer yüksek kontrast özelliklerinin açıkça çözüleceği kadar yüksek olmalıdır. Ardından, Sürekli güncelleştirme'nin işaretini hemen kaldırın.
      NOT: Deneme modu, Kayıt'a benzer şekilde ayarlanabilir, bu durumda maruz kalmayı en aza indirmek için izleme alanının Kayıt alanından çıkarılması veya çevrenin çoğunu kapsayan düşük büyütme oranına getirilmesi gerekir.
   3. Bir Görünüm görüntüsü alın ve Alanın konumunu tanımla: Deneme öğesini kullanarak Deneme konumunu ayarlayın.
      NOT: Öneri #1: Örneklenen alan ve zamandaki değişiklik göz önüne alındığında, düşük mag Deneme için eklenen maruz kalma minimum düzeyde olabilir. Izgara çubuğu görüş alanına girmediği sürece, bu izleme yöntemi genellikle daha güvenilirdir. Öneri #2: Odak gibi farklı modlar için dozu ayarlamak amacıyla spot boyutunu güncellemek de mümkündür. Mikroskop optik ayarlarında kararlılık için, bunu yapmamanızı, bunun yerine spot boyutunu Kayıt için uygun olduğu gibi bırakmanızı ve ardından daha hızlı tarama modları için gerekirse pozlama süresini ayarlamanızı öneririz.
   4. Düşük Doz Kontrolü sekmesine tıklayın > Şuraya gidin: Rec., ardından Görüntüleme Durumlarını Aç > Geçerli Durumu Ekle > Navigator menüsüne tıklayın. Kolayca geri çağrılabilmesi için bir isim verin (örneğin, mikroprob STEM için μP STEM). Farklı görevler için çeşitli durumlar tanımlanabilir.
9. Sahne alanını tomografi için ilgi çekici bir yere taşıyın (aşağıda Gezgin'in kullanımı hakkında daha fazla bilgi).
   1. Gezgin penceresini > Puan Ekle'yi tıklatarak Gezgin'e bir nokta ekleyin.
   2. Ösantriklik > Görevler > Kaba seçeneğini belirleyerek ösantrik yüksekliği hassaslaştırın. Gezgin penceresi > Update Z.
   3. Odaklanma ve Deneme alanlarını ayarlayın. İlk olarak, bir View resmi alın. Ardından, Düşük Doz Kontrolü sekmesinde, Alanın konumunu tanımla altında, Odak veya Deneme'yi seçin. Eğim ekseni boyunca iki alanın konumlarını ayarlayın. Odak, Kayıt alanıyla çakışmamalıdır.
      NOT: Özellikle sol kenarda bazı aşımlar olduğunu unutmayın, bu nedenle ikisi de Kayıt alanının hemen bitişiğinde ayarlanmamalıdır. Aşırı çekimin kapsamı, Kayıt büyütmede tekrar tekrar tarama yaparak ve daha sonra daha geniş bir görünüm elde etmek için büyütmeyi azaltarak bir test alanında değerlendirilebilir.
10. İyi bir ölçü için (deneyim ile isteğe bağlı), ızgara çubuğunun yeşil renkte gösterilen Kayıt alanı görünüm alanına girmediğinden emin olmak için her seferinde bir Görünüm veya Önizleme görüntüsü alarak sahne alanını +60° ve ardından -60°'ye eğin.
11. Eğme serisini ayarlayın.
    1. Dosya > Yeni Aç'ı tıklatıp bir dosya adı seçerek verileri kaydetmek için yeni bir dosya açın. Tilt Series Setup (Eğme Serisi Ayarı) > Tilt Series (Tilt Serisi Kurulumu) menüsünü seçin (Şekil 6). Sorun giderme: Yeni Aç düğmesi griyse, önceki eğme serisinin sonlandırılıp sonlandırılmadığını kontrol edin. Değilse, Tilt Series > Terminate'i tıklatarak sonlandırın.
    2. Eğme ve Bitiş noktalarındaki aşırı eğim açılarını, sırasıyla -60° ve +60° olmak üzere ve tipik olarak 2°'lik artışı ayarlayın.
    3. Doz simetrik modu için (önerilir - Düşük Doz modunun hala etkin olduğundan emin olun), Seriyi ___'den iki yönde çalıştır'ı işaretleyin. Boşluk normalde 0'dır, ancak önceden eğilmiş FIB lamellerini telafi etmek için kullanılabilir (örneğin, 20 ° 'de).
    4. Kolaylık sağlamak için Keep exposure time constant (Pozlama süresini sabit tut) seçeneğini işaretleyin. Bunu değiştirmek, maruz kalma hesaplamasının bir miktar yeniden işlenmesini gerektirir ve ayrıca öngörülen yoğunlukları orijinal verilerle karşılaştıran cebirsel rekonstrüksiyonlara (örneğin, ART / SART / SIRT) müdahale edebilir (bkz. adım 7.1).
    5. Otomatik netlemeyi atla'yı işaretleyin. 1 mrad gibi küçük bir yarı yakınsama açısı, odaklanmanın gereksiz olabileceği kadar uzun bir alan derinliği anlamına gelir. Test olarak, 0°'ye odaklanın, 60° veya -60°'ye eğin ve Kaydet'e basın. Odağı korumak, öncelikle kesin bir ösentrik yükseklik meselesidir. Daha büyük yakınsama için, seri sırasında odaklanmak gerekebilir. Bu durumda bir görünüm alın ve Düşük Doz Kontrolü sekmesinde, alanın ve odağın konumunu tanımlayın ve netleme alanını ayarlayın.
    6. İlk ve Son Eylemler: Ösentrik yükseklik ayarı doğru bir şekilde yapılmışsa, tekrarlamaya gerek yoktur. Bunu yapmamak için iyi bir neden olmadıkça serinin sonundaki kolon valflerini kapat seçeneğinin işaretini kaldırın.
    7. Kontrol parametrelerini izlemek için birçok seçenek vardır. Katılımsız veri toplama için en önemli öncelik, programın kullanıcı girişi için durmasını önlemektir. Önerilen ayarları kullanın: Kaybedilen alanın yüzdesi 5'ten fazlaysa Kaydet'i tekrarlayın. Ardından, daha sonra izleyin ve yeni parça referansı almadan önce Önizleme ile Hizala'yı ve Kayıt hizalaması %2 oranında farklılık gösteriyorsa Yeni parça referansı al'ı işaretleyin. Katılımlı veri toplama için, saatlerce cihaz zamanını kaybetme riskini önlemek için daha katı parametreler uygulayın.
    8. Başlamaya hazır olduğunuzda, pencerenin altındaki GO düğmesine basın. Sonunda, Tilt Series > Sonlandır'ı seçin.

5. Navigator'ı kullanarak birden fazla noktada toplu alım (Geliştirme #1)

NOT: Protokol ilkeldir, çünkü a) TEM ile aynıdır ve b) tam bir açıklamayı geçersiz kılacak yeni araçlar kullanıma sunulmaktadır.

1. Tam ızgara montajını ana pencereye yükleyin.
2. Umut verici görünen bir dizi alan seçin. Puan Ekle'ye tıklayın ve seçilen ızgara karelerinin merkezlerine ekleyin. Modu devre dışı bırakmak için Puan Ekle'yi tekrar tıklatın.
3. Düşük doz görüntüleme durumu etkinleştirildiğinde, Gezgin penceresini seçin > seçilen karelerin her biri için Öğede Al ve Yeni Dosya seçeneklerini işaretleyin. İlk olarak, dosya özellikleri (Şekil 7) ve ardından dosya adı için bir iletişim kutusu açılır. Montajlanmış görüntüler'i seçin ve ardından Montaj Ayarları iletişim kutusunda (Şekil 8), Düşük Doz modunda Görünüm parametrelerini kullan seçeneğini işaretleyin ve kareyi kaplayacak kadar büyük bir ızgara yapın (kabaca 100 x 100 μm).
4. Öğelerde Al > Gezgin menüsüne tıklayın ve eşleme parametrelerini seçin. En önemlisi, Birincil eylemlerde, Gezgin Haritası Yap'ı, ardından Kaba Ösantriklik ve İnce Ösantriklik'i işaretleyin ve Git tuşuna basın (Şekil 9). 200 örgülü bir ızgara için bu, kabaca tüm karenin bir haritasıyla sonuçlanacaktır (Şekil 10)
5. Tomogram pozisyon seçimlerine hazırlanın. Dosya > Yeni Aç'ı tıklatarak yeni bir dosya açın. Bir dosya adı verin (örneğin, AnchorMaps.mrc).
   1. Düşük Doz modu etkinken Kamera ve Senaryo > Ayarlar'a girin ve Görüntüle ve Önizleme'nin aynı gruplamada olduğundan emin olun (aksi takdirde aynı dosyaya kaydedilemezler).
   2. XYZ'ye Git > Gezgin penceresini tıklatarak kare haritalardaki noktaları ziyaret edin.
   3. İşaretleyici ile ilk tomogram için bir konum seçin. Bir Önizleme görüntüsü alın ve farenin sağ tuşuyla sürükleyerek konumu hassaslaştırın. Ardından, Yeni Harita> Gezgin penceresini seçin ve kaydetmek için iletişim kutusuna evet'i tıklatın. Ardından, aynı alanın Görünüm görüntüsünü alın ve tekrar yeni bir harita olarak kaydedin. Haritayı görüntüle'nin vurgulandığından emin olun ve sağ üstteki Gezgin penceresinde Bağlantı durumu için seçeneğini işaretleyin.
   4. İkinci konumu seçin, tekrar bir Önizleme yapın ve konumu yukarıdaki gibi hassaslaştırın ve bu sefer Gezgin penceresinde Anchor Map'e basın. Bu, hem Önizleme'yi hem de Görünüm'ü Gezgin'de yeni haritalar olarak kaydeder.
   5. İstenen tüm konumlar için adım 5.5.4'ü yineleyin. Noktayı seçip Gezgin penceresinde XYZ'ye Git tuşuna basarak bir ızgara karesinden diğerine geçin.
6. Referans odaklama için, ızgaranın net bir alanını seçin ve elle veya otomatik netleme ile dikkatlice netleyin. Mikroskop panelinde Defokusu sıfırla düğmesine basın. Komut Dosyası > Düzenle > Düzenle 15'i (veya başka bir boş sayıyı) tıklatarak SerialEM'de bir komut dosyası oluşturun ve iki satır girin: ScriptName, SetDefocus ve SetDefocus 0.
7. Gezgin penceresinde, ilk konumu vurgulayın (Önizleme veya Görünüm). Shift-T tuşlarına basın, ardından son konumu vurgulayın ve tekrar Shift-T tuşlarına basın. Dosya Özellikleri iletişim kutusu açılır. Dosya adı da dahil olmak üzere kaydedilecek tek kare görüntüleri ve parametreleri seçin. Dosya adını düzenleyin, ancak öğe etiketini sonunda bırakın.
   NOT: Sayılarla biten dosya adları, ardışık eğme serileri için otomatik olarak güncellenir. Dosya Adlarında Öğe Etiketlerini Kullan > Gezinti Seçenekleri > Gezgin menüsünü kullanmak uygundur.
8. Ardından, Tilt Serisi Ayarları menüsü otomatik olarak açılacaktır. Daha önce olduğu gibi doldurun (Şekil 6), ancak Ösantrikliği İyileştir'i seçmeyin. Gezgin'deki Önizleme noktaları artık TS olarak işaretlenecektir. Öğeler listesinin üzerindeki Gezgin penceresindeki düğmeyi kullanarak bu menüye geri dönülebilir.
9. Gezgin menüsünü > Öğeleri al'ı seçin. Bu kez, Son Veri için parametreleri seçin. Birincil Eylemi Seç: Eğme serisini edinin ve Savaşları Yönet/Vakum, Öğeye Yeniden Hizala, İnce Ösantrisite ve Eylemden Önce Komut Dosyası Çalıştır'ı seçin, çalıştırmak için S cript: SetDefocus. Genel seçenekleri seçin: hata oluştuğunda mesaj kutusu yok ve sonunda sütun valflerini kapatın, ardından GO tuşuna basın (Şekil 11). SerialEM şimdi tüm Anchor haritalarını ziyaret edecek ve her konumda bir eğim serisi kaydedecektir (Şekil 12).

6. CLEM harita kaydı (Geliştirme #2)

1. Henüz yapılmadıysa, tam ızgara montajını ana pencereye yükleyin ve ardından Pencere > Yeni Pencere'yi tıklatarak yeni bir pencere oluşturun ve bir ad verin. Tam ızgara montajının Kayıt 1'de göründüğünü unutmayın.
2. Gezgin menüsünü > Haritayı içe aktar'ı tıklatarak CLEM eşleme görüntüsünü içe aktarın. Kayıt 2'ye girmelidir. Ayrıca yukarıdaki gibi yeni bir pencere atanabilir.
3. Tam ızgara montajına göre göreli dönüşü belirlemek için CLEM haritasını inceleyin. Bunu ızgara çubuklarının göründüğü bir haritada yapmak en kolay yoldur. Haritanın ters çevrilmiş de olabileceğini unutmayın. Gerekirse Çevir ile Navigatör menüsünü > Haritayı Döndür'ü kullanarak kabaca hizalayın.
   NOT: Aşağıdaki adım bir çevirme işlemine de uyum sağlayabilir, ancak bunu önceden yapmak aşağıdakileri çok daha kolay hale getirir. Bu adım, hizalama tatmin edici görünene kadar tekrarlanabilir, ancak kesin olmak gerekli değildir.
4. Hassas hizalama için kayıt noktalarını tanıtın. Birine ve ardından diğer pencereye karşılık gelen birkaç nokta yerleştirin. Bu tür her nokta için, Gezgin penceresinin en üstündeki Kayıt noktası'nı işaretleyin. İlgili noktalar artan bir dizinle etiketlenir, ardından ızgara montajı veya içe aktarılan harita için sırasıyla R1 veya R2 gelir.
   NOT: Bulucu ızgaralarının kullanımı bu adımı çok kolaylaştırır. Aksi takdirde, merkez işaretçisi veya ızgara karelerinin köşeleri gibi katı unsurları seçin. Prensip olarak, kaba bir hizalama için üç nokta yeterlidir, ancak daha fazla nokta montaj yapılarındaki küçük uyumsuzlukları telafi etmeye yardımcı olur.
5. Bir CLEM haritasının birkaç kanalı, örneğin farklı floresan renkleri veya parlak alan arka planı olmayan floresan isteniyorsa, bunları yukarıdaki adım 6.2'de olduğu gibi içe aktarın ve kayıtları 2 olarak değiştirin. Bu şekilde, kayıt noktalarını ilk haritadan devralacaklar.
6. Kaydı Gezgin menüsü > Öğeleri dönüştür seçeneğiyle uygulayın. İlgili kayıt noktaları artık Kayıt 1'de listelenecek olan tüm haritalarda görünecektir. Görsel olarak hizalamak için, Gezgin menüsünü > Haritayı Döndür'ü tıklatın. Bir harita Gezgin penceresinden yüklendiğinde, Yüklendiğinde döndür kutusu işaretlenmediği sürece haritanın otomatik olarak döndürülmediğini unutmayın. Her zaman Gezgin penceresinden döndürülebilir.
7. Artık işaretleyiciyi veya bir noktayı floresan haritasına yerleştirmek ve sahneyi ızgara üzerinde karşılık gelen konuma taşımak mümkün olmalıdır (Şekil 13).

7.3D yeniden yapılanma

1. Bu, TEM tomografisi ile aynı temel adımları içerir: eğim serisinin hizalanması ve ardından tipik olarak geri projeksiyon. Çeşitli yazılım platformları mevcuttur ve CTF düzeltmesinin atlanması gerektiği dışında, veriler TEM verilerine benzer şekilde işlenebilir.
2. Yüksek eğimli projeksiyonların katkısını artırmak veya seri sırasında aydınlatmadaki bir değişikliği dengelemek için nicel bilgilerin etkilendiği uyarısıyla yoğunluk normalleştirmeleri uygulayın. Örneğin, IMOD²⁶ iyi çalışırken, AreTomo²⁷ güvensiz hizalama için çok kullanışlıdır; referans parçacıklarının bulunduğu yerlerde, ClusterAlign²⁸ onları tek tek noktalar yerine kümeler olarak takip edebilir; bu, özellikle lekelerin yüksek kontrastlı özelliklerle kaybolabileceği veya gizlenebileceği STEM verileri için kullanışlıdır.
3. Kontrast iyileştirme ve gürültü giderme için 3D dekonvolüsyon²⁹ ile rekonstrüksiyonu takip edin. Yeniden yapılandırıldıktan sonra, STEM hacim verilerini ortezler veya izoyüzey segmentasyonu gibi standart yöntemlerden herhangi biriyle temsil edin. Özellikle, yoğunluk dağılımı, geleneksel faz-kontrast TEM'de görünen kontrast inversiyonları veya Fourier saçakları olmadan tek kutupludur. Genel olarak STEM tomogramlarının ilginç bir temsil şekli, parlak alanı tersine çevirmektir (Şekil 14). Etki, "X-ışını gözleri" nin etkisidir, açıklığa kavuşturulmuş hücre³⁰ aracılığıyla yoğun ilgi çekici nesneleri görür.

Representative Results

STEM'de hazırlanan tam ızgara montajı, ilgilenilen hücrelerin bulunduğu alanları göstermektedir (Şekil 4). Görüntünün karanlık alanda olduğunu, bu nedenle boş deliklerin karanlık göründüğünü unutmayın. Hücreler, elektronların HAADF dedektörüne doğru dağıldığı kısmen parlak görünür. En kalın kısımlarda, tipik olarak merkezlerde veya ızgara çubuklarının yakınında, kontrast tekrar kararır. Bunun nedeni, elektronların dedektör tarafından yakalanmayan açılara ulaştığı çoklu saçılmadır. Uygulamada, bu alanlar tomografi için çok kalın olacaktır.

Bir sonraki aşama ara büyütme haritalarını içerir (Şekil 10). Bunlara genellikle orta montaj haritaları veya şekil yerine ızgara karelerine atıfta bulunan kare haritalar denir. En düşük mikroprob STEM modunda bile, montaj görüntüleri olarak da elde edilecektir. Gezgin penceresindeki öğeye tıklandığında, harita görüntüsü ana pencereye yüklenir. Bu alanda tomogram elde etmek için belirli noktalar seçilir. Kayıt büyütmede alanı bulmak için Önizleme modunu kullanın. Tarama hızlarına bağlı olarak Önizleme ve Kayıt arasında yanal bir geçiş olabileceğini unutmayın. Burada tek bir eğme serisi kaydedilebilir. Örneğin mitokondri, genellikle Önizleme ve Kayıt görüntüsünde tanımlanabilir (Şekil 12).

Toplu tomografi için, sahne ızgaranın etrafında hareket eder ve tam olarak aynı yere geri dönmeyebilir. Bağlantı haritaları, sahne alanı hareketi değişmiş olsa bile, Önizleme görüntüsünü daha düşük bir büyütme Görünümüyle eşleştirerek istenen Kayıt alanlarının güvenilir bir şekilde yeniden tanımlanmasını sağlamak için kullanılır. PyEM^23,24, kesinlikle tavsiye edilen^, ancak henüz standart kurulumun bir parçası olmayan daha hızlı bir alternatif sunar.

CLEM yaklaşımında, tomografi için ilgi alanlarını belirlemek için bir floresan haritası kullanılabilir. Floresan harici olarak elde edilir ve tam ızgara montajına kaydedilmelidir. Izgara çubuklarının ve deliklerinin görünür olması yararlıdır, bu nedenle içe aktarmadan önce, örneğin GIMP (https://www.gimp.org) veya ImageJ³¹ yazılımında birleştirilmiş bir floresan + parlak alan kompoziti hazırlanabilir (ImageJ'nin dikey ekseni tersine çevirmesine dikkat edin). Floresanın dinamik aralığı büyük olduğunda, doygunluk olmadan böyle bir birleşme oluşturmak zor olabilir. Bu durumda, iki harita ayrı ayrı içe aktarılabilir ve daha sonra açıklandığı gibi birlikte kaydedilebilir (Şekil 13). Bu şekilde, Navigator penceresindeki floresan haritasındaki bir nokta ve ardından "Go To XY", sahne alanını TEM'e monte edildiği gibi ızgara üzerinde karşılık gelen konuma getirir. Montajın (veya eğer bir montaj ise, floresan haritasının) oluşturulmasındaki küçük tutarsızlıkların küçük yer değiştirmelere yol açmasına dikkat edin; Bu nedenle, optimum hassasiyet için, floresan özellikle kare haritaya yeniden kaydedilmelidir. Bu kaydın gözle, destek filmindeki deliklere veya parlak alan ışığı görüntüsüyle paylaşılan özelliklere dayanarak yapılması genellikle yeterlidir.

Eğim serisinin yeniden yapılandırılması 3B hacimle sonuçlanır (Şekil 14). Bu örnekte 2,042 nm piksel boyutu vardır ve bu da ~4 μm'lik bir görüş alanıyla sonuçlanır. Kalsiyum fosfat birikintileri (turuncu ok uçları), çevreye kıyasla daha yüksek atom numarası nedeniyle göze çarpmaktadır. Mikrotübüller (kırmızı ok uçları) tüm görüş alanı boyunca izlenebilir. Ayrıca, iç ve dış mitokondriyal membranlar (yeşil ok uçları) açıkça görülebilir. Aktin, demetler veya bireysel filamentler olarak gözlemlenebilir. Daha izotropik bir çözünürlük elde etmek için, rekonstrüksiyon dekonvolüsyon ile işlenebilir.

Şekil 1: TEM ile STEM'in karşılaştırılması. TEM'de, görüş alanı paralele yakın bir ışınla aydınlatılır ve objektif lens kamera üzerinde büyütülmüş bir görüntü oluşturur. Kriyo-TEM için, objektif açıklık, dağınık elektron dalgalarını (kesikli kırmızı çizgi) geçmek için açılır, bu da defokus ile, dağılmamış (yeşil) dalgalarla etkileşime girerek faz kontrastı üretir. Öte yandan STEM, numune boyunca odaklanmış bir ışın rastlar ve dağınık elektronları piksel piksel bir şekilde toplar. Birden fazla dedektör, farklı açılara dağılmış elektronları toplayabilir. Bu rakam^30'dan değiştirildi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Yüksek tarama hızı nedeniyle sol taraftaki görüntü bozulması örneği. Sarı ok uçlarıyla işaretlenmiş bozulmanın yanı sıra Quantifoil'deki çarpık oval şekilli deliklere dikkat edin. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Tüm ızgara montajı için montaj kurulum diyaloğu . X ve Y'deki büyütmeyi ve parça sayısını seçin, böylece ızgaranın çoğu için bir harita elde etmek üzere toplam alan yaklaşık 2.000 μm'ye ulaşır. Ayrıca görüntüyü kaydırmak yerine Sahne alanını taşı ve Kayıt parametrelerini değil Montaj Eşlemesini Kullan'ı seçin. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: STEM modunda kaydedilen tam düşük büyütmeli GridMap. Kırık alanlar karanlık alan görüntüsünde tamamen siyah görünür. Koyu gri alanlar muhtemelen çok kalın ve zayıf vitrifiye edilmiştir. Bu taramada tomografi için iyi aday alanlar beyaz veya açık gridir. Ölçek çubuğu = 100 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 5: İşaretleyici işlemine geçiş. Tanınabilir bir nesne, düşük çözünürlüklü haritada Nokta Ekle (bu resimde 38) ile işaretlenir. Düşük çözünürlüklü harita (yeşil daire) ile orta çözünürlüklü harita (turuncu daire) arasındaki geçişe dikkat edin. Ardından, nesne işaretçiyle (yeşil çarpı, kırmızı daire) işaretlenir ve İşaretçiye Kaydır iletişim kutusu başlatılır. Seçilen seçenek, tüm haritaları 245x'te aynı miktarda taşır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 6: Bir STEM eğme serisi için eğme serisi kurulum iletişim kutusu. Doz-simetrik şema, 2 ° 'lik adımlarla -60 ° ila + 60 ° arasında kullanılır. Düşük yakınsama açısı kullanılırken yüksek netleme derinliği nedeniyle otomatik netleme atlanır. Bu daha önce yapıldığı gibi ösantrikliği rafine etmeye gerek yok. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 7: Orta çözünürlüklü eşlemeler için dosya özellikleri iletişim kutusu. MRC yığın dosyası olarak kaydedin, tamsayıları seçin ve ek bilgileri bir .mdoc meta veri dosyasına kaydedin. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 8: Orta çözünürlüklü haritaları kaydetmek için montaj kurulum iletişim kutusu. 90 μm genişliğinde 200 örgü ızgara üzerindeki bir kare için, en az 90 μm x 90 μm toplam alan önerilir. Görüntüyü kaydırmak yerine Sahneyi taşı ve Düşük Doz modunda Görünüm parametrelerini kullan'ı seçin. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 9: Orta çözünürlüklü haritayı kaydetme. Orta çözünürlüklü haritaları kaydetmek için Öğeler iletişim kutusundan edinin. Eşleme'yi seçin, Görüntü veya montaj alın ve kaydedin ve Gezgin haritası yap'ı işaretleyin. Birincil'den önceki veya sonraki görevler'de Kaba ve İnce Ösantriklik'i seçin. Yardımsız olduğunda, isteğe bağlı olarak Hata oluştuğunda mesaj kutusu yok ve sonunda sütun valflerini kapat'ı seçin. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 10: Orta çözünürlüklü haritanın görüntüsü. STEM modunda 3 x 3 montajla kaydedilen orta çözünürlüklü harita (Kare Harita). Veri toplama için iki orta çözünürlüklü Bağlantı Haritası mavi karelerle gösterilir. Ölçek çubuğu = 10 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 11: Toplu eğme serisi verileri. Toplu eğme serilerini toplamak için Öğeler iletişim kutusundan edinin. Eğme serisi veri toplama için Son Verileri ve Eğme serisini al'ı seçin. Birincil'den önceki veya sonraki görevler'de Dewars/Vacuum'u Yönet (Ayarlar menüsünde uygun ayarları seçin), Öğeye Yeniden Hizala, İnce Ösantriklik ve Komut Dosyasını Eylemden Önce Çalıştır'ı işaretleyin. Genel seçeneklerde, Hata oluştuğunda mesaj yok kutusunu ve sonunda sütun valflerini kapat'ı işaretleyin (bkz. 5.14). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 12: Bir mitokondrinin STEM eğim serisinin 0° eğimi. Turuncu ok uçları kalsiyum fosfat birikintilerine (matris granülleri), yeşil ok uçları cristae'ye ve kırmızı ok uçları 15 nm altın referans belirteçlerine işaret eder. Ölçek çubuğu = 500 nm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 13: Kayıtlı kriyo-CLEM haritaları. (A) Orta çözünürlüklü STEM haritası (Kare harita, 26-A), (B) düşük çözünürlüklü STEM Haritasına, (C) BF kanalı kriyo-FM Haritasına ve (D) GFP kanal kriyo-FM haritasına kayıtlıdır. Dokuz kayıt noktası (etiketler 4-21) (E) Gezgini'nde gösterilir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 14: Toplu işleme. Farklı derinliklerde SIRT benzeri (30 döngü) filtrelenmiş bir tomogram aracılığıyla (A) 60 nm ve (B) 40 nm kalınlığında kesitlerin hacim oluşturması. Piksel boyutu 2,048 nm'dir ve bu da yaklaşık 4 μm'lik bir görüş alanına neden olur. Lütfen Şekil 12'ye kıyasla ters çevrilmiş yoğunluğa dikkat edin, bu da yüksek yoğunluklu özelliklerin parlak olduğu anlamına gelir. Turuncu, beyaz, kırmızı, yeşil ve açık mavi ok uçları sırasıyla kalsiyum fosfat birikintilerine, ribozomlara, mikrotübüllere, iç ve dış mitokondriyal membrana ve aktin filamentlerine işaret eder. Ölçek çubuğu = 500 nm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Discussion

Protokol, geleneksel TEM tomografisi ile erişilemeyen hücre bölgelerindeki hücre içi organellerin 3D görünümünü elde etmek isteyen yaşam bilimleri mikroskopistlerine yardımcı olmalıdır. Aynı protokol, plastik kesitlerin STEM tomografisi için de kullanılabilir ve maruziyet üzerinde rahat kısıtlamalar olabilir. Protokol, bir dizi katı kuraldan ziyade bir başlangıç noktası olarak görülmelidir. Aslında, STEM'in gücü esnekliğidir; onu çalıştırmanın tek bir doğru yolu yoktur.

STEM'in kendi başına yalnızca taranan probu ifade ettiğini ve görüntü oluşumunu tanımlamadığını vurguluyoruz. Kontrast öncelikle dedektörlerin konfigürasyonuna bağlıdır. Daha basit yöntemler, optik eksen üzerinde ortalanmış bir disk veya onu çevreleyen bir anulus olan eksenel simetriye sahip dedektörler kullanır. Genel olarak, aydınlatma doğrudan dedektöre çarptığında, (elektron saçılımı) numunenin karanlık göründüğü bir BF görüntüsü kaydederiz; tersine, dedektör sadece dağınık elektronları topladığında, yoğun numunenin parlak göründüğü bir DF görüntüsü kaydederiz. Uygun donanım mevcut olduğunda, SerialEM bu sinyallerin her ikisini de aynı anda alabilir ve kaydedebilir. Birden fazla segmente sahip dedektörlerden tamamen pikselli kameralara kadar daha gelişmiş konfigürasyonlar mevcuttur. Faz kontrast görüntüleme, örneğin, eksen dışı dedektör elemanları arasındaki farkı değerlendirerek elde edilebilir^32,33. Piksel başına tüm 2B saçılma (kırınım) deseninin toplanması, aynı orijinal verilerden birden fazla görüntü kontrastının yeniden oluşturulmasını sağlayan 4D STEM³⁴ olarak bilinen yöntemi tanımlar. Dört boyutlu STEM, faz kontrastı^35'i elde etmek için başka bir yol sağlayan elektron ptikografisini mümkün kılar.

Organellerin ve bozulmamış hücrelerin veya mikron kalınlığındaki hücre bölümlerinin incelenmesi için en yararlı olduğunu düşündüğümüz belirli STEM modalitesine odaklandık. Bu, özellikle aydınlatmada küçük bir yarı yakınsama açısı ve dedektörde nispeten büyük bir toplama açısı ile BF görüntülemenin kullanılmasını gerektirir. Küçük yakınsama, geniş bir alan derinliği sağlar, böylece tüm numune eğim serisi¹⁹ boyunca odakta kalır. Uygulamada, iyi bir mikroskop aşaması ile, edinim sırasında odak ayarlama ihtiyacını da ortadan kaldırabilir. Fiyat, protokolün 3. bölümünde açıklandığı gibi çözümde bir uzlaşmadır. 1 nm piksel aralığıyla 4 μm'lik bir görüş alanına ulaşan ~ 2 nm'lik bir proba sahip 4k görüntüler önerdik. Bununla birlikte, okuyucunun denemeye şiddetle teşvik edilir. İkinci husus dedektörün yan tarafındadır. Aydınlatma diski eksen üstü BF dedektörünü yetersiz doldurduğunda, faz kontrastı bastırılır ve saçılma (genlik) kontrastı hakimdir; Bu duruma tutarsız parlak alan kontrastı³⁶ adı verilmiştir. Soru, hangi fraksiyonun eksik doldurulacağıdır ve cevap örneğe bağlıdır. Çok ince bir numune, dedektör tamamen doluyken en iyi kontrastı gösterecektir (yani, aydınlatmanınkiyle eşleşen toplama açısı), ancak daha kalın bir numune tüm yoğunluğu dağıtacak ve zayıf kontrastlı gürültülü bir sinyal bırakacaktır. Yararlı bir kural, numune ne kadar kalın olursa, BF dedektörünün dış kesme açısının^o kadar büyük olması gerektiğidir. Dedektör boyutu ve konumu elbette sabittir, bu nedenle kırınım diski boyutu, bölüm 1'de açıklandığı gibi kamera uzunluğu kullanılarak ayarlanır. Dedektör amplifikatörü ayarları, sinyalin dinamik aralığı doldurduğu ancak doğrudan aydınlatma altında doymadığı (1.12.3) şekildeyse, makul bir sinyal yoğunluğuna ve kontrastına ulaşılana kadar kamera uzunluğu artırılabilir. Yine, okuyucu denemeye teşvik edilir. Sanat, tabiri caizse, açılardadır.

Protokolde tartışılmayan bir başka parametre de mikroskop ivme voltajıdır. Aydınlatıcı elektronların numune ile etkileşimi daha düşük bir voltajda daha güçlü olacaktır. Diğer her şey eşit olduğunda, daha düşük voltajda daha yüksek kontrast bekleyebiliriz. Öte yandan, kullanılabilir numune kalınlığını sınırlayan numune içinde çoklu saçılmanın başlangıcıdır, bu nedenle daha yüksek bir voltaj daha kalın numunelerin kullanılmasına izin verir. Bununla birlikte, bu etkiler oldukça incedir. 200 kV ve 300 kV ivmelenme ile bugüne kadarki deneyimlerimiz benzerdir.

Çözünürlük açısından STEM'den ne beklenebileceği göz önüne alındığında, bu yine numuneye ve dedektör konfigürasyonuna bağlıdır. Tek bir parçacık analizi yaklaşımı kullanılarak, ferritin üzerindeki metal iyonları, dairesel karanlık alan STEM ile birkaç angstrom³⁷ hassasiyetine kadar lokalize edilebilir. Daha yakın zamanlarda, entegre diferansiyel faz kontrastı (iDPC) STEM³² ve ptikografi³⁵ ile elde edilen görüntüler kullanılarak virüs ve protein örnekleri için nanometre altı çözünürlük elde edilmiştir. Kalın hücresel örneklerdeki benzersiz nesneler için ve burada açıklanan yöntemlerle, bu kadar yüksek çözünürlük gerçekçi değildir. En uygun çözünürlük, açıklandığı gibi yarı yakınsama açısıyla ilgili olan prob çapıdır. Diğer faktörler çözünürlüğü düşürür, özellikle geniş bir görüş alanına ulaşmak için kaba piksel örneklemesi, eğim serisindeki yanlış hizalamalar ve prob ışınının iletimde yayılması. Görüntüler plastik kesitli tomografi ile iyi karşılaştırılır. Burada açıklanan kurulumla, örneğin, mikrotübüllerin içi boş çekirdeğini görmek kolay olmalı, ancak bireysel protofilamentleri görememelidir.

Özetlemek gerekirse, STEM yöntemleri ve donanımlarının her ikisi de geliştirme aşamasındadır. Görüntülemedeki yeniliklerin tomografiyi de etkileyeceğini ve STEM'i diğer tekniklerle erişilemeyen alanlara yönlendireceğini bekleyebiliriz. Modern optik süper çözünürlüklü yöntemlere dayanan korelasyonlu kriyojenik floresan görüntüleme ile yakınsamanın özellikle verimli olacağını umuyoruz. Organellerin ölçeği, 100-1.000 nm, bu yeni ortaya çıkan yöntemler için ideal bir hedeftir.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
SerialEM	University of Colorado	Veriosn 4.0	SerialEM is a free software platform for microscope control and data acquisition.
STEM-capable transmission electron microscope			The protocol was written based on experience with several microscopes of Thermo Fisher Scientific: Titan Krios, Talos Arctica, and Tecnai T20-F. In principle it should be applicable to other manufacturers as well.