Visualisation d’organites in situ par tomographie cryo-STEM

Summary

La tomographie cryo-STEM permet de visualiser les organites de cellules intactes sans enrobage, sectionnement ou autres préparations invasives. La résolution 3D obtenue est actuellement de l’ordre de quelques nanomètres, avec un champ de vision de plusieurs micromètres et une épaisseur accessible de l’ordre de 1 μm.

Abstract

La microscopie électronique cryogénique (cryo-EM) repose sur l’imagerie de spécimens biologiques ou organiques incorporés dans leur milieu aqueux natif; L’eau est solidifiée en verre (c.-à-d. vitrifiée) sans cristallisation. La méthode cryo-EM est largement utilisée pour déterminer la structure de macromolécules biologiques récemment à une résolution quasi atomique. L’approche a été étendue à l’étude des organites et des cellules par tomographie, mais le mode conventionnel d’imagerie EM à transmission à grand champ souffre d’une limitation sévère de l’épaisseur de l’échantillon. Cela a conduit à une pratique de broyage de lamelles minces à l’aide d’un faisceau d’ions focalisés; La haute résolution est obtenue par sous-tomogramme en faisant la moyenne des reconstructions, mais les relations tridimensionnelles à l’extérieur de la couche restante sont perdues. La limitation d’épaisseur peut être contournée par l’imagerie par sonde scannées, similaire à l’EM à balayage ou au microscope confocal à balayage laser. Alors que la microscopie électronique à transmission à balayage (STEM) en science des matériaux fournit une résolution atomique dans des images uniques, la sensibilité des échantillons biologiques cryogéniques à l’irradiation électronique nécessite des considérations particulières. Ce protocole présente une configuration pour la cryotomographie utilisant STEM. La configuration topique de base du microscope est décrite pour les systèmes à deux et trois condensateurs, tandis que l’automatisation est fournie par le logiciel non commercial SerialEM. Les améliorations apportées à l’acquisition des lots et à l’alignement corrélatif sur les cartes de fluorescence acquises précédemment sont également décrites. À titre d’exemple, nous montrons la reconstruction d’une mitochondrie, en soulignant la membrane interne et externe et les granules de phosphate de calcium, ainsi que les microtubules, les filaments d’actine et les ribosomes environnants. La tomographie cryo-STEM excelle à révéler le théâtre des organites dans le cytoplasme et, dans certains cas, même la périphérie nucléaire des cellules adhérentes en culture.

Introduction

La visualisation tridimensionnelle (3D) des organites est une tâche primordiale en biologie cellulaire moderne. Compte tenu des échelles impliquées, allant de dizaines de nanomètres pour les vésicules sécrétoires à de nombreux microns pour le noyau cellulaire, il est difficile de trouver une seule technique de microscopie adaptée à toutes les applications. Alors que la microscopie à fluorescence moderne peut couvrir une grande partie de la gamme en termes de résolution, seules les molécules marquées apparaissent. Le théâtre cellulaire reste le domaine de la microscopie électronique. Les méthodes conventionnelles de fixation chimique, d’enrobage plastique et de coloration avec des métaux lourds sont fortement invasives, de sorte que les résultats peuvent dépendre des détails de la préparation des échantillons. La cryo-EM, d’autre part, est contrainte par la nécessité de vitrifier le milieu aqueux; Les cristaux de glace qui forment diffractent l’illumination électronique, provoquant des artefacts de contraste plus contrastés que le matériau organique d’intérêt.

La dernière décennie a vu une prolifération de techniques d’imagerie EM développées ou adaptées pour les études cellulaires¹. La congélation à haute pression combinée au fraisage itératif par faisceau d’ions focalisés (FIB) et à l’imagerie de surface en série à l’aide du microscope électronique à balayage (c.-à-d. FIB-SEM) est actuellement la méthode de choix pour les grands échantillons². La tomographie cryogénique à rayons X mous (cryo-SXT) convient aux échantillons de plusieurs microns, limités par la longueur d’absorption caractéristique des rayons X mous dans l’eau ^3,4,5. Cette échelle comprend de nombreux types de cellules intactes, et la nature quantitative du contraste d’absorption des rayons X ajoute un aspect de mesure de concentration⁶ ou spectroscopie⁷. Lorsqu’elle est combinée à la moyenne des sous-tomogrammes, la cryotomographie électronique à transmission (cryo-ET), basée sur la microscopie électronique à transmission à contraste de phase (MET), offre la résolution la plus élevée pour les macromolécules ou les complexes ^8,9,10. Cependant, il est rare que les organites intacts soient si réguliers qu’ils puissent être moyennés entiers. De plus, le mode conventionnel de TEM grand champ est limité pour l’épaisseur de l’échantillon à quelques centaines de nanomètres par la combinaison de la diffusion inélastique (impliquant une perte d’énergie) dans l’échantillon et de l’aberration chromatique dans la lentille magnétique de l’objectif^11,12. La grande dispersion d’énergie dicte l’utilisation d’un filtre à énergie pour éliminer la brume floue qui en résulte, mais l’échantillon sensible subit toujours des dommages de rayonnement tandis que le signal d’image devient exponentiellement plus faible avec l’épaisseur croissante.

Le mode d’imagerie alternatif, la transmission à balayage EM (STEM), contourne le besoin de filtrage de l’énergie et conserve les électrons dispersés inélastiquement pour la formation d’images, bien qu’actuellement à une résolution inférieure à celle de la tomographie TEM (Figure 1). En fait, aucune image réelle n’est formée. Au lieu de cela, comme dans un EM de numérisation, les mesures sont effectuées point par point et l’image est assemblée par l’ordinateur. Le grossissement est déterminé uniquement par la taille des étapes de numérisation sans modifier les courants de l’objectif. Lorsqu’elle est correctement configurée, la plage utile d’épaisseur de l’échantillon pour la tomographie cryo-STEM (CSTET) peut atteindre 1,5 ou même 2 μm, bien que la zone de confort, où l’intensité du signal utile reste une fraction significative de l’éclairage, soit d’environ 600-900 nm^11,13. Ceci est suffisant pour voir une grande fraction du cytoplasme, et parfois un bord du noyau cellulaire. En pratique, nous constatons que la vitrification par la méthode standard de plongée dans le fluide cryogénique impose une contrainte d’épaisseur plus sévère que l’imagerie STEM. L’objectif de cet article vidéo est de faciliter l’incorporation du CSTET dans le coffre à outils pour l’imagerie cellulaire et organite dans les laboratoires de recherche et les installations de microscopie.

Le premier défi est que les opérations de microscope au CSTET ne sont pas encore normalisées pour les applications des sciences de la vie comme elles l’ont été pour la tomographie cryo-TEM. Le matériel STEM a rarement (voire jamais) été ciblé sur le marché cryo-EM. Cependant, cela change avec la dernière génération de microscopes, et de nombreux outils existants peuvent être installés ultérieurement. Les STIM en tant que technique ont pris leur envol et ont largement pris le dessus dans les sciences des matériaux, où il existe également un intérêt naissant pour les méthodes cryogéniques et à faible dose^14,15. La littérature sur la science des matériaux regorge d’acronymes BF-STEM, ADF-STEM, HAADF-STEM, 4D-STEM, DPC-STEM, etc., qui ajoutent à la confusion. Nous proposons ici un point de départ recommandé qui, dans notre expérience collective à l’Institut Weizmann des sciences, fournit le protocole le plus général pour des résultats utiles basés sur l’imagerie STEM en fond clair (BF)¹⁶. Il n’épuise ni n’explore en aucun cas l’éventail des possibilités, mais il servira de base à d’autres améliorations. Bien que nous mettions l’accent sur la cryo-STEM, la majeure partie du protocole est également pertinente pour la tomographie STEM à température ambiante des sections incorporées dans du plastique.

L’essence de STEM est de scanner l’échantillon avec une sonde électronique focalisée (Figure 1), le cône d’éclairage, et d’enregistrer les signaux du plan de diffraction (diffusion) en transmission, pixel par pixel, pour produire des images 2D^17,18. Les échantillons amorphes, y compris la plupart des matériaux cellulaires, produiront un schéma de diffusion diffuse lors de la transmission. La configuration pratique la plus simple consiste à placer un détecteur circulaire pour enregistrer le disque central (c.-à-d. l’éclairage de la sonde qui serait transmis sans échantillon). L’échantillon disperse les électrons loin de ce cône d’illumination dans la mesure où le signal diminue. Cela produit une image BF - le spécimen apparaît sombre sur un fond clair. Un détecteur annulaire peut également (ou à la place) être utilisé pour détecter la diffusion de l’échantillon à l’extérieur du cône d’éclairage. Une fois l’échantillon retiré, il n’y a pas de signal. Lorsqu’un spécimen est en place, les objets apparaissent lumineux sur un fond sombre dans l’image en champ sombre (DF). La nomenclature pour les STEM (BF, champ noir annulaire [ADF], champ noir annulaire à angle élevé [HAADF], etc.) se réfère principalement aux gammes d’angles de collecte pour les détecteurs.

L’angle de convergence de l’éclairage représente une adaptation essentielle des STEM à la tomographie cellulaire. Lorsque la priorité absolue est la haute résolution, l’angle de convergence doit être aussi grand que possible. (Ceci est similaire à la microscopie confocale à balayage laser; la résolution est déterminée par le diamètre de la sonde, qui évolue comme la longueur d’onde divisée par l’ouverture numérique. Notez que nous nous référons au demi-angle ou à l’angle de semi-convergence pour EM.) Lorsque la priorité est la profondeur de champ, en revanche, un compromis de résolution offre un grand avantage, car le faisceau focalisé reste à peu près parallèle sur une distance égale à deux fois la longueur d’onde divisée par un demi-angle au carré. Idéalement, l’ensemble du volume cellulaire reste au centre^{des préoccupations 19}. Par exemple, à 300 keV, la longueur d’onde de deBroglie de l’électron est de 0,002 nm, donc une convergence de 1 mrad donne une résolution de 2 nm et une profondeur de champ de 4 microns. Dans ces conditions, la tomographie peut être effectuée même sans focalisation pendant le processus de collecte des données, mais une seule fois au début de l’acquisition. Un STEM conventionnel capable de tomographie peut atteindre un angle de semi-convergence de 7 ou 8 mrad; Par conséquent, en principe, nous pourrions atteindre une résolution de l’ordre de 0,25 nm, mais avec une profondeur focale de seulement 62 nm. C’est clairement trop mince pour l’imagerie cellulaire. Les microscopes plus avancés avec trois lentilles à condensateur offrent un réglage continu de l’angle de semi-convergence sur une plage considérable. Avec la configuration plus traditionnelle à deux condensateurs, la convergence est fixée discrètement par l’ouverture du condensateur (C2).

Pour les échantillons robustes et incorporés dans du plastique, on peut enregistrer une série focale à chaque inclinaison et les combiner pour une haute résolution²⁰, mais pour les échantillons cryogéniques, le bilan de rayonnement est trop sévèrement limité. Enfin, en pesant les avantages de l’imagerie BF ou DF, pour les éprouvettes épaisses, il faut tenir compte des effets de la diffusion élastique multiple dans l’échantillon. Le signal BF est moins corrompu par la diffusion multiple et montre une résolution plus élevée pour les échantillons épais^16,21.

Une règle empirique utile a été de définir des angles de collecte plusieurs fois plus grands que la convergence. Plus le spécimen est épais, plus le disque de collecte doit être grand. Un disque trop petit fournira une faible intensité de signal; Un disque trop grand entraînera un mauvais contraste d’image, car seule la diffusion à angle le plus élevé y contribuera. Les angles de collecte doivent être optimisés pour un échantillon donné. Les angles du détecteur en fonction de la longueur (diffraction) de la caméra doivent être étalonnés indépendamment. Ils peuvent être affichés commodément par le logiciel de microscope. Dans la pratique, un facteur de deux à cinq dans le rapport entre les demi-angles de collecte et d’éclairage, θ à α, respectivement (figure 1), est un point de départ recommandé pour le CSTET d’échantillons cellulaires.

Le protocole suivant décrit le fonctionnement de la tomographie STEM à l’aide du logiciel populaire SerialEM pour le contrôle du microscope^22,23. SerialEM n’est pas lié à un fabricant spécifique et est largement utilisé en tomographie TEM. La plupart des opérations de mise en place de la tomographie peuvent être reportées directement de TEM. La stratégie de SerialEM consiste à modéliser le système de numérisation comme une caméra. Cela permet un passage simple de TEM à STEM. Il faut cependant garder à l’esprit que les paramètres tels que le grossissement et le regroupement sont entièrement artificiels. Les paramètres importants sont le champ de vision en microns, le nombre de pixels dans le champ de vision et le temps d’exposition. L’espacement des pixels, ou échantillonnage, est le champ linéaire divisé par le nombre de pixels, tandis que le temps de séjour est le nombre de pixels divisé par le temps d’exposition.

La configuration minimale pour STEM et CSTET implique trois caractéristiques sur le microscope: un générateur de balayage, un détecteur STEM et un logiciel de contrôle de la tomographie. Le protocole fait référence à la nomenclature de FEI/Thermo Fisher Scientific (TFS), mais les concepts sont génériques. Le logiciel propriétaire de TFS a été décrit dans JoVE pour TEM²⁴, et le fonctionnement STEM est très similaire.

Nous supposons que le microscope a été aligné à l’avance par l’équipe de service ou le personnel expérimenté et qu’un alignement de colonne peut être appelé en chargeant un fichier. Les ajustements mineurs sont appelés alignements directs et peuvent être stockés dans des registres dits FEG (microscopes TFS). Les alignements directs comprennent le centre de rotation, les points de pivot, l’alignement de diffraction et la compensation de l’astigmatisme du condenseur. Les ajustements doivent être effectués de manière itérative. Notez que les microscopes TFS implémentent des modes distincts de nanosonde (nP) et de microsonde (μP); pour une ouverture de condensateur donnée, ceux-ci fournissent un champ de vision relativement étroit ou large avec un éclairage parallèle en TEM et un faisceau d’électrons plus ou moins convergent (étroitement focalisé) en STEM, respectivement. D’autres fabricants utilisent des schémas différents pour couvrir la gamme des angles de convergence.

Avant de commencer, le champ de vision, L, et l’échantillonnage (largeur de pixels), l, doivent être choisis en fonction de l’échantillon étudié. Par exemple, pour l = 1 nm/pixel, une image de 4 000 x 4 000 pixels qui couvrira un champ de vision de 4 μm² doit être choisie. La résolution sera, au mieux, deux fois supérieure à l’échantillonnage spatial, donc 2 nm, et le diamètre de la sonde, d, devrait correspondre à cela. L’étalonnage de l’angle de la sonde dépasse le cadre de ce protocole, nous supposons donc qu’un tableau ou une lecture d’écran est disponible. Le diamètre de la sonde est approximativement la longueur d’onde électronique divisée par l’angle de semi-convergence (en radians): d = λ/θ. La longueur d’onde, λ, est de 0,002 nm pour 300 keV et de 0,0025 nm pour les électrons de 200 keV, de sorte que θ de 1 mrad fournira un diamètre de point de 2 ou 2,5 nm, respectivement.

Le protocole est présenté dans une progression de plus en plus complexe. La première tâche consiste à produire une image STEM, qui dépend du logiciel du fabricant du microscope, puis une série d’inclinaison, pour laquelle nous utilisons SerialEM. De nombreux lecteurs seront sans aucun doute familiers avec SerialEM, de sorte que les tâches les plus compliquées viendront naturellement. Il n’est pas nécessaire de suivre strictement les procédures. Les développements relatifs à l’automatisation peuvent être mis en œuvre directement pour les STEM ainsi que pour la GDT. Les utilisateurs expérimentés inverseront probablement le protocole, en commençant par l’enregistrement corrélatif des cartes de fluorescence et en continuant à mettre en place la tomographie par lots. Vous trouverez plus de détails dans la documentation complète et les bibliothèques de tutoriels de SerialEM lui-même, y compris un article récent de JoVE sur les derniers développements en matière d’automatisation²⁵.

Protocol

1. Configuration STEM

1. Alignements préliminaires : chargez le fichier d’alignement de colonne, puis ouvrez Vannes de colonne. Si vous utilisez un porte-cryo à entrée latérale, ouvrez le Cryo-shield. Démarrez en mode TEM. Le faisceau doit apparaître à l’écran. Si ce n’est pas le cas, réduisez le grossissement.
2. Amenez le microscope à la mise au point eucentrique en appuyant sur le bouton du panneau de commande.
3. Réglez la taille du spot sur une valeur pratique (par exemple, 6) pour visualiser l’écran fluorescent, directement ou avec la caméra intégrée (selon le modèle de microscope).
4. Réglez le microscope sur le mode STEM et vérifiez que la mise au point utilise les lentilles du condensateur (intensité) plutôt que l’objectif. Définissez une focalisation eucentrique. Ensuite, sortez du mode de diffraction pour les réglages initiaux.
5. Assurez-vous que le faisceau n’est pas occulté. Réduisez le grossissement jusqu’à ce que le faisceau apparaisse à l’écran. Ajustez le déplacement du faisceau vers le centre et augmentez le grossissement par paliers jusqu’à environ 70 kx tout en gardant le faisceau au centre.
6. Insérez l’ouverture souhaitée du condenseur, généralement de 50 μm. Vérifiez le centrage de l’ouverture. Lorsque vous tournez légèrement le bouton de mise au point d’avant en arrière, l’endroit doit se dilater et se contracter mais rester en place, comme si un avion coupait un sablier vertical imaginaire. Si l’ouverture n’est pas centrée, l’éclairage se déplacera latéralement, comme si le sablier était incliné.
7. Mettez le faisceau au point et appuyez sur Mise au point de la liste d’intensité (si disponible) dans l’onglet Alignements, ou revenez à la mise au point eucentrique comme dans 1.2. Réajustez la position du faisceau au centre.
8. Ajustez le centre de rotation. Tournez la molette de mise au point au minimum ou un pas au-dessus, de sorte que le faisceau pulse doucement, et assurez-vous qu’il reste immobile lorsque la mise au point se déplace de haut en bas.
9. Sélectionnez les points pivots et réunissez les deux points avec les réglages X et Y.
   REMARQUE : Si une plaque de phase est installée sur un instrument TFS, seul le réglage X doit être utilisé.
10. Défocalisez légèrement le faisceau et ajustez les stigmateurs du condensateur pour rendre le disque rond. Montez et descendez à travers la mise au point pour optimiser; Il ne devrait pas y avoir de tendance à s’allonger dans un sens ou dans l’autre lors du passage de la mise au point.
11. Normalisez les lentilles. Ensuite, augmentez progressivement le grossissement jusqu’à environ 240 kx tout en utilisant le décalage de faisceau pour maintenir le point centré, et répétez les réglages du centre de rotation et du point de pivot (étapes 1.6-1.8).
12. Revenez au mode de diffraction. Le faisceau doit apparaître comme un disque uniforme sur l’écran fluorescent. La longueur de la caméra (CL) contrôle désormais efficacement la distance optique au détecteur, comme dans la cristallographie aux rayons X. Changez-le et regardez le disque se contracter et s’agrandir, comme si l’emplacement de l’écran se déplaçait vers ou loin de l’échantillon. Ce cône représente l’illumination BF.
    NOTE: Pour chaque CL, il y a un alignement de diffraction à ajuster afin d’amener le faisceau projeté à l’axe central. Il n’est normalement pas nécessaire de tous les affiner, seulement un (ou quelques-uns) à utiliser pour la détection.
13. Enclenchez le mode STEM à fort grossissement.
    1. Si un détecteur BF STEM est disponible, commencez par cela. Amenez la scène dans une zone avec un trou vide et ajustez l’alignement de la diffraction pour centrer la poutre en utilisant le CL souhaité.
    2. De nombreux microscopes ne sont équipés que d’un détecteur HAADF; il existe une astuce pour l’utiliser comme détecteur BF. Tout d’abord, rétractez le détecteur, centrez le faisceau comme ci-dessus dans les alignements directs, insérez une ouverture d’objectif, généralement petite telle que 20 μm, et ajustez sa position pour entourer le faisceau uniformément. (La façon la plus simple de le faire est d’insérer un échantillon ou une grille de test pour voir un halo autour de l’éclairage). Ensuite, utilisez l’alignement de diffraction pour déplacer le faisceau hors de l’axe et sur la zone du détecteur. Insérez et rétractez le détecteur tout en regardant le faisceau sur l’écran afin de confirmer que le faisceau est bloqué par le détecteur.
    3. Lancez une numérisation dans le logiciel du microscope et réglez les paramètres de luminosité et de contraste (B/C) de sorte que le signal soit proche de 0 lorsque le faisceau est occulté et proche de la saturation lorsque l’éclairage complet tombe sur le détecteur. Utilisez l’affichage de l’étendue pour vous aider. Les paramètres peuvent être couplés de manière inattendue, de sorte que le réglage doit être itéré plusieurs fois.
14. Remettez le microscope à un grossissement relativement faible dans le registre à fort grossissement (mode SA), sans passer en mode faible magnification (LM).
15. Notez le courant de l’écran pour référence ultérieure (voir l’étape 3.1.1). Le courant peut être modifié avec la lentille du pistolet et les réglages de taille du spot, comme dans TEM, avec des nombres croissants correspondant à un courant réduit.
16. À ce stade, enregistrez un registre FEG pour faciliter le retour aux valeurs standard.
    REMARQUE : L’installation peut préparer un ensemble par défaut de registres FEG afin que les utilisateurs puissent démarrer à partir d’une configuration de travail.

2. Mise en place du spécimen

1. En mode LM TEM, assurez-vous que la grille n’est pas opaque. Trouvez un carré de grille pour effectuer les ajustements initiaux. Il est pratique de trouver une zone vide, un trou ou un carré de grille déchiré. Enregistrez les positions de scène afin d’y revenir facilement.
2. Amener l’échantillon à la hauteur eucentrique. Il existe plusieurs méthodes pour ce faire. Par exemple, utilisez le vacillement de scène pour incliner la grille tout en déplaçant la hauteur de l’échantillon le long de l’axe Z jusqu’à ce que l’image cesse de se déplacer latéralement. Vous pouvez également marquer certaines caractéristiques sur l’écran de visualisation et incliner la scène à 30°. La fonctionnalité se déplacera latéralement. Ajustez la hauteur de l’échantillon pour le ramener à sa position initiale. Augmentez le grossissement ou l’inclinaison de la scène pour affiner. Retour à 0° d’inclinaison.
3. Revenez en mode STEM et insérez le détecteur STEM. Passez au mode de grossissement élevé (SA) le plus bas. Assurez-vous qu’une image est observée sur l’écran de l’ordinateur. Balayer rapidement afin d’éviter une exposition inutile; 1 μs/pixel ou moins serait typique. Notez que l’image peut apparaître déformée au bord gauche lorsque la numérisation est excessivement rapide (voir Figure 2).
4. Appuyez sur Eucentric Focus, augmentez le grossissement et affinez la mise au point pendant la numérisation. Il est pratique d’utiliser la loupe de mise au point fournie par le logiciel de microscope.
5. Réglez l’astigmatisme du condensateur. Cela peut être fait plus précisément par la méthode Ronchigram. Avec le faisceau au-dessus d’une zone d’échantillon mince, concentrez-vous sur le point où le faisceau transmis explose, entre les images d’ombre de l’échantillon de chaque côté. Ensuite, réglez le réglage du condensateur pour arrondir le disque central. Cela nécessite une certaine pratique, en particulier pour les échantillons cryogéniques.
   NOTE: Une alternative est de trouver des particules d’or (souvent utilisées comme marqueurs fiduciaires pour l’alignement en tomographie). Augmentez le grossissement et faites la mise au point de haut en bas, en ajustant l’astigmatisme de sorte que les particules restent rondes sans allongement dans les deux sens.
6. Passez en mode LM STEM et continuez à numériser pour trouver une zone intéressante. Réajustez les réglages B/C du détecteur si nécessaire (étape 1.13.3), à peu près à ce stade.

3. Enregistrement d’une image

1. Estimer la dose à enregistrer. En règle générale, visez 100-150 e^-/Ų pour l’ensemble du tomogramme. Vérifiez la tolérance de dose par échantillon. Le courant en Ampère (A) divisé par la charge par électron représente un nombre de e^-/s, qui est multiplié par le temps d’exposition, T, en secondes et divisé par le champ de vision en Ų. Pour plus de commodité, exprimez le courant en nanoampères (lu à partir de l’écran), la largeur du champ de vision en micromètres et le temps d’exposition du cadre en secondes, avec des facteurs appropriés:
   
   Ce nombre doit être multiplié par le nombre d’inclinaisons pour obtenir l’exposition totale de la série. Par exemple, avec un courant I = 0,04 nA, un champ L = 4 μm, et un temps d’exposition de 12 s, on obtient 1,9 e-/Å2^par inclinaison, soit environ 110 e^-/^Å2 pour une série de 61 projections.
2. Remettez la scène dans un trou (ou rétractez la grille) et ajustez le courant du faisceau à l’aide de la taille du spot et/ou des réglages de l’objectif du pistolet pour atteindre le courant d’écran souhaité. Si la mesure indique 0, insérez une plus grande ouverture C2 pour augmenter le courant. Ensuite, corrigez en divisant la mesure par le carré du rapport des diamètres, et enfin revenez à la plus petite ouverture.
3. Affinez les réglages B/C conformément à l’étape 1.13.3, puis replacez la scène dans une zone d’intérêt et revérifiez les alignements directs et l’astigmatisme dans les conditions d’imagerie.
4. Acquérir une image de test.

4. Tomographie avec SerialEM

1. Démarrez le serveur SerialEM sur l’ordinateur du microscope (SerialEM est normalement installé sur un autre). Ensuite, ouvrez SerialEM. STEM apparaît dans SerialEM comme une caméra, avec la même interface. Assurez-vous que les communications fonctionnent correctement pour la configuration. Par exemple, la languette du microscope doit afficher le grossissement correct. Si cela ne fonctionne pas, arrêtez-vous ici et dépannez.
2. Recherchez l’onglet caméra et script et ouvrez Configuration. Assurez-vous que la caméra STEM est sélectionnée et, pour chaque mode, choisissez des temps de rangement et de séjour appropriés. Assurez-vous que le ou les détecteurs appropriés apparaissent dans la case « Canaux à acquérir » en bas à gauche. Appuyez sur Acquérir en bas pour tester. Encore une fois, ne continuez pas si rien ne se passe ou si le faisceau ne se dévoile pas. Arrêtez-vous et vérifiez les communications.
   NOTE: Les modes sont utilisés de la même manière que la tomographie TEM. La binning est un artifice de compatibilité avec la GDT. Le paramètre important est le nombre de pixels ; Différents systèmes de microscope utilisent différents rangements pour atteindre le même nombre.
   1. L’affichage et la recherche doivent être des numérisations rapides avec relativement peu de pixels (par exemple, 512 x 512 pixels à 1 s).
   2. La mise au point est généralement une petite zone avec un enregistrement rapide. Ainsi, en mode faible dose, choisissez Focus pour être à un grossissement différent du mode Enregistrement, ce qui peut améliorer la précision. Laissez la taille du spot inchangée.
   3. Pour le mode Enregistrement, utilisez les paramètres choisis ci-dessus dans l’estimation de l’exposition. Si disponible, sélectionnez également Mise au point dynamique, qui corrige la mise au point ligne par ligne dans une image inclinée.
   4. Pour plus de commodité ultérieurement, choisissez le regroupement pour l’aperçu pour qu’il soit identique à celui pour la vue (voir Amélioration #1, étape 5.5). La taille de l’image (nombre de pixels) n’a pas besoin d’être la même.
   5. Utilisez le mode Version d’évaluation pour garder la zone d’enregistrement centrée pendant l’acquisition. Il peut être similaire à View, mais veillez à ce qu’il n’y ait pas de distorsions de balayage apparentes sur le côté gauche de l’image (voir la figure 2 pour un exemple). Encore une fois, en mode Faible dose, l’essai peut avoir un grossissement différent de celui du mode Enregistrement.
   6. Utilisez immédiatement le mode Montage pour le balayage de la grille. Il doit être suffisamment dense en pixels pour trouver des zones d’intérêt; Recommandation : 512 x 512 ou 1024 x 1024. Assurez-vous que l’image est bonne, avec une plage dynamique décente (vue dans les commandes d’affichage d’image), car ce mode est utilisé pour trouver les zones d’échantillonnage.
   7. Enregistrez le fichier de paramètres afin que ces choix soient conservés par défaut pour la prochaine session (ce qui peut se produire bientôt en cas de plantage du programme).
3. Testez les étalonnages de décalage d’image et de décalage de scène. En mode microsonde (ou nanosonde), cliquez sur Afficher l’image, survolez-la avec la souris, maintenez le bouton enfoncé et faites glisser la diagonale d’environ un quart du champ de vision. Ensuite, prenez une autre vue. Les images doivent se chevaucher parfaitement. Répétez l’opération en faisant glisser à nouveau tout en maintenant la touche Maj enfoncée (pour forcer un mouvement de scène). Les images doivent bien se chevaucher, mais peut-être moins précisément.
4. Passez en mode LM et testez le changement de scène. Si ces tests échouent, arrêtez-les et dépannez. Le reste ne fonctionnera pas.
5. Faites un montage LM carte de l’ensemble de la grille. Cela peut également être fait dans le cadre de la GDT.
   1. Passez au mode STEM à grossissement le plus bas où l’image n’est pas bloquée par des ouvertures, généralement autour de 185x.
   2. Cliquez sur le menu Navigateur > Ouvrir. Ensuite, cliquez sur le menu Navigateur > Navigation. Options > désélectionnez Convertir les cartes en octets.
   3. Sélectionnez le menu Navigateur > Montaging & Grids > Setup Full Montage. Un menu s’ouvrira. Les options à cocher sont les suivantes : Déplacer l’étape au lieu de déplacer l’image, Créer une carte à partir de chaque montage si le Navigateur est ouvert et Utiliser le mappage de montage, pas les paramètres d’enregistrement. La grille d’images doit être d’environ 6 x 6 ou 7 x 7. Recherchez la surface totale à enregistrer. Si trop d’images sont nécessaires, le grossissement peut ne pas être lu correctement à partir du microscope (Figure 3). Arrêtez-vous et vérifiez.
   4. Pour démarrer l’acquisition du montage, appuyez sur Démarrer sur les commandes de montage ou sur Montage sous Caméra et script. Un autre menu s’ouvrira pour choisir les paramètres du fichier : mrc, stocker sous forme d’entiers, et dans une autre boîte de dialogue, choisissez le nom de fichier pour le stockage. Assurez-vous de stocker les données dans la zone de données appropriée et non dans les paramètres utilisateur de SerialEM. Il est recommandé de ne pas stocker de données volumineuses sur le disque C où réside le système.
   5. Lorsque l’acquisition est terminée, le montage apparaît dans la fenêtre principale (Figure 4). On peut maintenant naviguer autour de la grille en utilisant le marqueur et les points sur le navigateur, tout comme dans TEM.
6. Revérifiez la correction de l’astigmatisme. Habituellement, il suffit de balayer rapidement une petite zone et de l’ajuster avec la mise au point afin que les caractéristiques ponctuelles telles que les nanoparticules d’or restent complètement rondes lorsqu’elles entrent et sortent de la mise au point (comme sur un MEB) à fort grossissement. De manière plus conservatrice, on peut répéter les alignements directs des étapes 1.5-1.8 avant de corriger l’astigmatisme.
7. Alignez l’image à fort grossissement sur le montage LM.
   1. Allez à une position sur le montage LM avec une fonction facilement reconnaissable. Ajoutez un point, cliquez sur la fenêtre Navigateur > Ajouter des points, puis cliquez sur la fonctionnalité. Appuyez à nouveau (arrêter d’ajouter) pour désactiver.
   2. Prenez une image Vue ou Version d’évaluation au grossissement le plus bas et recherchez l’élément indiqué. Placez le marqueur à cet endroit (croix verte) et, avec le point correspondant mis en surbrillance dans la fenêtre du navigateur, dans le menu Navigateur > Shift to Marker..., dans la boîte de dialogue qui s’ouvre, choisissez All Maps (Toutes les cartes et Save Maj), comme illustré à la figure 5.
   3. Testez en déplaçant la scène vers d’autres positions et en vérifiant que l’image HM est centrée aux mêmes endroits sélectionnés dans le montage LM. Si la fonction n’est pas visible dans l’image HM, le décalage entre les modes LM et HM peut être trop important. Dans ce cas, faites un montage polygonal sur une plus grande surface. Cliquez sur Fenêtre Navigateur > Ajouter un polygone, choisissez des points, puis cliquez à nouveau sur Ajouter un polygone pour fermer. Cliquez sur le menu Navigateur > Montage et grilles > Configurer le montage polygonal et Commandes de montage > Démarrer. Ensuite, recherchez les points correspondants comme ci-dessus et cliquez sur Shift to Marker....
8. Configurez le mode faible dose.
   1. Ouvrez l’onglet Contrôle des faibles doses et cochez la case Mode de faible dose .
   2. Cochez Mise à jour continue et accédez à Affichage. Choisissez le grossissement du microscope pour ce mode, généralement le plus bas ou à côté du plus bas. Choisissez chacun des modes suivants et réglez le grossissement approprié. L’enregistrement doit être réglé pour atteindre la taille de pixel souhaitée et le grossissement de la mise au point doit être suffisamment élevé pour que les marqueurs fiduciaires ou d’autres caractéristiques de contraste élevé pour la mise au point soient clairement résolus. Ensuite, décochez immédiatement Mise à jour continue.
      REMARQUE : Le mode d’essai peut être défini de la même manière que Enregistrement, auquel cas la zone de suivi devra être déplacée de la zone d’enregistrement afin de minimiser l’exposition, soit à faible grossissement, englobant une grande partie de l’environnement.
   3. Prenez une image View et définissez la position d’essai à l’aide de Define position of area : Trial.
      NOTE: Recommandation #1: Compte tenu du changement dans la zone échantillonnée et le temps, l’exposition supplémentaire pour un essai à faible mag peut être minime. Tant que la barre de grille n’entre pas dans le champ de vision, cette méthode de suivi est généralement plus fiable. Recommandation #2: Il est également possible de mettre à jour la taille du spot afin d’ajuster la dose pour différents modes, tels que Focus. Pour la stabilité des paramètres optiques du microscope, nous recommandons de ne pas le faire, mais plutôt de laisser la taille du point appropriée pour Enregistrement, puis d’ajuster le temps d’exposition si nécessaire pour les modes de balayage plus rapides.
   4. Cliquez sur l’onglet Contrôle des faibles doses > allez à : Rec., puis cliquez sur le menu Navigateur > Ouvrir les états d’imagerie > Ajouter l’état actuel. Donnez-lui un nom afin qu’il puisse être rappelé facilement (p. ex., μP STEM pour microsonde STEM). Différents états peuvent être définis pour différentes tâches.
9. Déplacez la scène vers un lieu d’intérêt pour la tomographie (plus d’informations sur l’utilisation du Navigateur ci-dessous).
   1. Ajoutez un point dans le navigateur en cliquant sur la fenêtre Navigateur > Ajouter des points.
   2. Affinez la hauteur eucentrique en sélectionnant Tâches > Eucentricité > Rugueux. Fenêtre Navigateur > Update Z.
   3. Définissez les domaines de Focus et d’essai. Tout d’abord, prenez une image View. Ensuite, dans l’onglet Contrôle des faibles doses , sous Définir la position de la zone, sélectionnez Focus ou Essai. Ajustez les positions des deux zones le long de l’axe d’inclinaison. Le focus ne doit pas chevaucher la zone Enregistrement.
      REMARQUE: Gardez à l’esprit qu’il y a un certain dépassement, en particulier sur le bord gauche, donc ni l’un ni l’autre ne doit être réglé immédiatement à côté de la zone d’enregistrement. L’étendue du dépassement peut être évaluée sur une zone de test en balayant à plusieurs reprises au grossissement de l’enregistrement, puis en réduisant le grossissement pour obtenir une vue plus large.
10. Pour faire bonne mesure (facultatif avec expérience), inclinez la scène à +60° puis -60°, en prenant à chaque fois une image Vue ou Aperçu pour vous assurer que la barre de grille n’entre pas dans le champ de vision de la zone d’enregistrement affiché en vert.
11. Configurez la série d’inclinaison.
    1. Ouvrez un nouveau fichier pour enregistrer les données en cliquant sur Fichier > Ouvrir Nouveau et choisissez un nom de fichier. Sélectionnez le menu Tilt Series > Tilt Series Setup (Série Tilt) (Figure 6). Résolution des problèmes : si le bouton Ouvrir un nouveau bouton est gris, vérifiez que la série d’inclinaison précédente a été terminée. Si ce n’est pas le cas, terminez en cliquant sur Tilt Series > Terminate.
    2. Réglez les angles d’inclinaison extrêmes dans les cases d’inclinaison vers et d’extrémité, généralement -60° et +60°, respectivement, ainsi que l’incrément, généralement de 2°.
    3. Pour le mode symétrique de dose (recommandé - assurez-vous que le mode Faible dose est toujours actif), cochez Exécuter la série dans deux directions à partir de ___. L’ébauche est normalement égale à 0, mais peut être utilisée pour compenser les lamelles FIB préinclinées (par exemple, à 20°).
    4. Pour plus de simplicité, cochez Maintenir le temps d’exposition constant. Changer cela nécessite un certain remaniement du calcul de l’exposition et peut également interférer avec les reconstructions algébriques (par exemple, ART/SART/SIRT), qui comparent les intensités projetées avec les données originales (voir l’étape 7.1).
    5. Cochez Ignorer la mise au point automatique. Un petit angle de semi-convergence, tel que 1 mrad, implique une profondeur de champ si longue qu’il peut être inutile de faire la mise au point. En guise de test, effectuez la mise au point à 0°, inclinez à 60° ou -60° et appuyez sur Enregistrer. Le maintien de la concentration est avant tout une question de hauteur eucentrique précise. Pour une plus grande convergence, il peut être nécessaire de se concentrer pendant la série. Dans ce cas, prenez une vue et, dans l’onglet Contrôle des faibles doses , définissez la position de la zone et du foyer, puis ajustez la zone de mise au point.
    6. Actions initiales et finales: Si le réglage eucentrique de la hauteur a été effectué avec précision, il n’est pas nécessaire de le répéter. Décochez Fermer les vannes de colonne à la fin de la série , sauf s’il y a une bonne raison de ne pas le faire.
    7. Pour suivre les paramètres de contrôle, il existe de nombreuses options. Pour la collecte de données sans surveillance, la priorité absolue est d’éviter que le programme ne s’arrête pour l’entrée de l’utilisateur. Utilisez les paramètres recommandés : répétez l’enregistrement si le pourcentage de champ perdu est supérieur à 5. Ensuite, suivez après et cochez Aligner avec l’aperçu avant d’obtenir une nouvelle référence de piste et Obtenir une nouvelle référence de piste si l’alignement de l’enregistrement diffère de 2%. Pour la collecte de données assistées, appliquez des paramètres plus stricts pour éviter le risque de perdre des heures de temps d’instrument.
    8. Lorsque vous êtes prêt à démarrer, appuyez sur GO en bas de la fenêtre. À la fin, sélectionnez Tilt Series > Terminate.

5. Acquisition par lots à plusieurs endroits à l’aide du Navigateur (Amélioration #1)

REMARQUE : Le protocole est rudimentaire parce que a) il est identique à la GDT et b) de nouveaux outils deviennent disponibles qui rendront probablement une description complète obsolète.

1. Chargez le montage de grille complet dans la fenêtre principale.
2. Choisissez un certain nombre de domaines qui semblent prometteurs. Cliquez sur Ajouter des points et ajoutez aux centres des carrés de grille sélectionnés. Cliquez à nouveau sur Ajouter des points pour désactiver le mode.
3. Lorsque l’état d’imagerie à faible dose est activé, sélectionnez la fenêtre Navigateur > cochez Acquérir et Nouveau fichier à l’article pour chacun des carrés sélectionnés. Pour le premier, une boîte de dialogue s’ouvre pour les propriétés du fichier (Figure 7), puis le nom du fichier. Choisissez Montaged images (Images montées), puis dans la boîte de dialogue Configuration du montage (Figure 8), cochez la case Utiliser les paramètres View en mode Low Dose (Faible dose) et créez une grille suffisamment grande pour couvrir le carré (environ 100 x 100 μm).
4. Cliquez sur le menu Navigateur > Acquérir aux éléments et sélectionnez les paramètres de mappage. Plus important encore, dans Actions principales, cochez Créer une carte du navigateur, puis Eucentricité approximative et Eucentricité fine, puis appuyez sur OK (Figure 9). Pour une grille de 200 mailles, cela se traduira par une carte d’environ tout le carré (Figure 10)
5. Préparez-vous à la sélection des positions de tomogramme. Ouvrez un nouveau fichier en cliquant sur Fichier > Ouvrir nouveau. Donnez-lui un nom de fichier (par exemple, AnchorMaps.mrc).
   1. Lorsque le mode Faible dose est actif, entrez Configuration de l>'appareil photo et du script et assurez-vous que la vue et l’aperçu sont au même regroupement (sinon, ils ne peuvent pas être enregistrés dans le même fichier).
   2. Visitez les points dans les cartes carrées en cliquant sur la fenêtre Navigateur > Accédez à XYZ.
   3. Choisissez une position pour le premier tomogramme avec le marqueur. Prenez une image d’aperçu et affinez la position en la faisant glisser avec le bouton droit de la souris. Ensuite, sélectionnez la fenêtre Navigateur > Nouvelle carte, puis cliquez sur Oui à la boîte de dialogue pour enregistrer. Ensuite, prenez une image View de la même zone et enregistrez-la à nouveau en tant que nouvelle carte. Assurez-vous que Afficher la carte est mis en surbrillance et vérifiez l’état d’ancrage dans la fenêtre du navigateur en haut à droite.
   4. Choisissez la deuxième position, prenez à nouveau un aperçu et affinez l’emplacement comme ci-dessus, et cette fois appuyez sur la carte d’ancrage dans la fenêtre du navigateur. Cela enregistrera à la fois l’aperçu et la vue en tant que nouvelles cartes dans le navigateur.
   5. Répétez l’étape 5.5.4 pour tous les emplacements souhaités. Déplacez-vous d’un carré de grille à l’autre en sélectionnant le point et en appuyant sur Aller à XYZ dans la fenêtre du navigateur.
6. Pour la mise au point de référence, choisissez une zone claire de la grille et effectuez la mise au point avec soin, à la main ou par autofocus. Appuyez sur Réinitialiser la mise au point sur le panneau du microscope. Créez un script dans SerialEM en cliquant sur Script > Modifier > Modifier 15 (ou un autre numéro libre) et entrez deux lignes : ScriptName SetDefocus et SetDefocus 0.
7. Dans la fenêtre Navigateur, mettez en surbrillance le premier emplacement (Aperçu ou Affichage). Appuyez sur Maj-T, puis mettez en surbrillance le dernier emplacement, puis appuyez à nouveau sur Maj-T. La boîte de dialogue Propriétés du fichier s’ouvre. Choisissez des images et des paramètres à image unique à enregistrer, y compris le nom du fichier. Modifiez le nom du fichier mais laissez l’étiquette de l’élément à la fin.
   REMARQUE: Les noms de fichiers se terminant par des nombres seront automatiquement mis à jour pour les séries d’inclinaison successives. Il est pratique d’utiliser l’option Menu Navigateur > Nav. Options > Utiliser des étiquettes d’élément dans les noms de fichiers.
8. Ensuite, le menu Configuration de la série Tilt s’ouvre automatiquement. Remplissez comme précédemment (Figure 6), mais ne choisissez pas Affiner l’eucentricité. Les points d’aperçu dans le navigateur seront désormais marqués comme TS. On peut revenir à ce menu en utilisant le bouton dans la fenêtre Navigateur au-dessus de la liste des éléments.
9. Choisissez le menu Navigateur > Acquérir des éléments. Cette fois, sélectionnez les paramètres pour les données finales. Sélectionnez Action principale : Acquérir la série d’inclinaison et choisissez Gérer les dewars/vide, Réaligner sur l’élément, Eucentricité fine et Exécuter le script avant l’action, avec Script pour exécuter : DéfinirDéconcentrer. Sélectionnez les options générales : aucune boîte de message en cas d’erreur et fermez les vannes de colonne à la fin, puis appuyez sur GO (Figure 11). SerialEM va maintenant visiter toutes les cartes d’ancrage et enregistrer une série d’inclinaison à chaque position (Figure 12).

6. Enregistrement de la carte CLEM (Amélioration #2)

1. Si ce n’est pas déjà fait, chargez le montage de grille complet dans la fenêtre principale, puis créez une nouvelle fenêtre en cliquant sur Fenêtre > Nouvelle fenêtre et donnez-lui un nom. Notez que le montage de grille complet apparaît dans Enregistrement 1.
2. Importez l’image de la carte CLEM en cliquant sur le menu Navigateur > Importer la carte. Il devrait aller dans l’enregistrement 2. Une nouvelle fenêtre peut également lui être attribuée comme ci-dessus.
3. Inspectez la carte CLEM pour déterminer la rotation relative par rapport au montage de la grille complète. Il est plus facile de le faire sur une carte dans laquelle les barres de grille apparaissent. Notez que la carte peut également être inversée. Alignez-le grossièrement à l’aide du menu Navigateur > Rotation de la carte, avec Retourner si nécessaire.
   REMARQUE: L’étape suivante peut également accueillir un retournement, mais le faire à l’avance rend la suivante beaucoup plus facile. Cette étape peut être répétée jusqu’à ce que l’alignement semble satisfaisant, mais il n’est pas nécessaire d’être précis.
4. Introduisez des points d’enregistrement pour un alignement précis. Placez un certain nombre de points correspondants sur l’une puis l’autre fenêtre. Pour chacun de ces points, cochez Point d’enregistrement tout en haut de la fenêtre du navigateur. Les points correspondants seront étiquetés avec un index croissant, suivi de R1 ou R2 pour le montage de grille ou la carte importée, respectivement.
   REMARQUE: L’utilisation de grilles de recherche rend cette étape très simple. Sinon, choisissez des entités solides telles que le marqueur central ou les coins des carrés de grille. En principe, trois points suffisent pour un alignement brut, mais plus de points aident à compenser les décalages mineurs dans les constructions de montage.
5. Si plusieurs canaux d’une carte CLEM sont souhaités, par exemple, différentes couleurs fluorescentes ou fluorescence sans fond clair, importez-les comme à l’étape 6.2 ci-dessus et remplacez les enregistrements par 2. De cette façon, ils hériteront des points d’enregistrement de la première carte.
6. Imposer l’inscription par le menu Navigateur > Transformer les éléments. Les points d’enregistrement correspondants apparaîtront désormais sur toutes les cartes, qui seront répertoriées dans l’enregistrement 1. Pour aligner visuellement, cliquez sur le menu Navigateur > Faire pivoter la carte. Notez que lorsqu’une carte est chargée à partir de la fenêtre du navigateur, elle n’est pas automatiquement pivotée, sauf si la case Rotation lors du chargement est cochée. Il peut toujours être tourné à partir de la fenêtre du navigateur.
7. Il devrait maintenant être possible de placer le marqueur ou un point sur la carte de fluorescence et de déplacer l’étage à l’emplacement correspondant sur la grille (Figure 13).

7.3D Reconstruction

1. Cela implique les mêmes étapes de base que la tomographie TEM: alignement de la série d’inclinaison suivi généralement d’une rétroprojection. Plusieurs plates-formes logicielles sont disponibles et les données peuvent être traitées de la même manière que les données TEM, à l’exception de la correction CTF qui doit être ignorée.
2. Appliquer des normalisations d’intensité pour améliorer la contribution des projections à forte inclinaison ou pour équilibrer un changement d’éclairage au cours de la série, avec la mise en garde que l’information quantitative est affectée. IMOD²⁶ fonctionne bien, par exemple, tandis qu’AreTomo²⁷ est très utile pour l’alignement sans fiduciaire; lorsque des particules fiduciaires sont présentes, ClusterAlign²⁸ peut les suivre en grappes plutôt qu’en tant que taches individuelles; ceci est particulièrement utile pour les données STEM où les taches peuvent être perdues ou masquées par des caractéristiques à contraste élevé.
3. Suivez la reconstruction avec la déconvolution^{3D 29} pour améliorer le contraste et le débruitage. Une fois reconstruites, représenter les données de volume STEM par l’une des méthodes standard, telles que les orthoslices ou la segmentation isosurface. Notamment, la distribution d’intensité est unipolaire, sans inversions de contraste ni franges de Fourier qui apparaissent dans la TEM conventionnelle à contraste de phase. Un moyen intéressant de représentation des tomographies STEM, en général, est d’inverser le champ lumineux (Figure 14). L’effet est celui des « yeux radiographiques », voyant les objets denses d’intérêt à travers la cellule clarifiée³⁰.

Representative Results

Un montage de grille complet préparé dans STEM montre les zones avec des cellules d’intérêt (Figure 4). Notez que l’image est en champ sombre, de sorte que les trous vides apparaissent sombres. Les cellules apparaissent partiellement brillantes, où les électrons sont dispersés vers le détecteur HAADF. Dans les parties les plus épaisses, généralement les centres ou près des barres de grille, le contraste redevient sombre. Cela est dû à la diffusion multiple, par laquelle les électrons atteignent des angles non capturés par le détecteur. En pratique, ces zones seront trop épaisses pour la tomographie.

L’étape suivante implique des cartes de grossissement intermédiaire (Figure 10). Celles-ci sont souvent appelées cartes de montage moyen, ou cartes carrées, se référant aux carrés de la grille plutôt qu’à la forme. Même au mode STEM de microsonde le plus bas, ils seront également acquis sous forme d’images de montage. Cliquez sur l’élément dans la fenêtre Navigateur pour charger l’image de la carte dans la fenêtre principale. Des points spécifiques pour l’acquisition du tomogramme sont choisis dans cette zone. Utilisez le mode Aperçu pour localiser la zone au niveau du grossissement de l’enregistrement. Gardez à l’esprit qu’il peut y avoir un décalage latéral entre l’aperçu et l’enregistrement, en fonction des vitesses d’analyse. Une seule série d’inclinaison peut être enregistrée ici. Les mitochondries, par exemple, peuvent souvent être identifiées dans l’image Aperçu et enregistrement (Figure 12).

Pour la tomographie par lots, l’étage se déplacera autour de la grille et ne pourra pas revenir exactement au même endroit. Les cartes d’ancrage sont utilisées pour s’assurer que les zones d’enregistrement souhaitées sont réidentifiées de manière fiable en faisant correspondre l’image d’aperçu à une vue à grossissement inférieur, même si le mouvement de la scène a changé. PyEM^23,24 offre une alternative plus rapide qui est certainement recommandée^, mais ne fait pas encore partie de l’installation standard.

Dans l’approche CLEM, une carte de fluorescence peut être utilisée pour identifier les zones d’intérêt pour la tomographie. La fluorescence est acquise à l’extérieur et doit être enregistrée sur le montage de la grille complète. Il est utile d’avoir les barres de grille et les trous visibles, de sorte qu’un composite fluorescence + champ clair fusionné peut être préparé avant l’importation, par exemple dans le logiciel GIMP (https://www.gimp.org) ou ImageJ³¹ (veillez à ce qu’ImageJ inverse l’axe vertical). Lorsque la plage dynamique de la fluorescence est grande, il peut être difficile de créer une telle fusion sans saturation. Dans ce cas, les deux cartes peuvent être importées séparément, puis enregistrées ensemble comme décrit (Figure 13). De cette façon, un point sur la carte de fluorescence dans la fenêtre du navigateur, suivi de « Go To XY », amène la scène à la position correspondante sur la grille telle que montée dans le TEM. Veillez à ce que de petites incohérences dans la création du montage (ou de la carte de fluorescence, s’il s’agit également d’un montage) entraînent de petits déplacements; Par conséquent, pour une précision optimale, la fluorescence doit être réenregistrée spécifiquement sur la carte carrée. Il suffit souvent de faire cet enregistrement à l’œil, sur la base de trous dans le film de support ou de caractéristiques partagées avec l’image de lumière en champ lumineux.

La reconstruction de la série d’inclinaison donne un volume 3D (Figure 14). Cet exemple a une taille de pixel de 2,042 nm, ce qui donne un champ de vision de ~4 μm. Les dépôts de phosphate de calcium (pointes de flèches orange) se distinguent par leur numéro atomique plus élevé par rapport à l’environnement. Les microtubules (pointes de flèches rouges) peuvent être tracés dans tout le champ de vision. En outre, les membranes mitochondriales internes et externes (pointes de flèches vertes) peuvent être clairement vues. L’actine peut être observée sous forme de faisceaux ou de filaments individuels. Pour obtenir une résolution plus isotrope, la reconstruction peut être traitée par déconvolution.

Figure 1 : Comparaison entre la GDT et les STIM. En TEM, le champ de vision est éclairé par un faisceau quasi parallèle et l’objectif forme une image agrandie sur la caméra. Pour la cryo-TEM, l’ouverture de l’objectif est ouverte pour laisser passer les ondes électroniques diffusées (ligne rouge pointillée) qui, avec la défocalisation, produisent un contraste de phase par interférence avec les ondes non diffusées (vertes). STEM, d’autre part, rasters un faisceau focalisé à travers l’échantillon et recueille les électrons diffusés de manière pixel par pixel. Plusieurs détecteurs peuvent recueillir des électrons dispersés sous différents angles. Ce chiffre a été modifié par rapport à³⁰. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Exemple de distorsion de l’image sur le côté gauche en raison de la fréquence de numérisation élevée. Notez la distorsion marquée par les pointes de flèches jaunes, ainsi que les trous ovales déformés dans le Quantifoil. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Boîte de dialogue de configuration du montage pour l’ensemble du montage de la grille. Choisissez le grossissement et le nombre de pièces dans X et Y afin que la surface totale atteigne environ 2 000 μm pour obtenir une carte pour la majeure partie de la grille. Choisissez également Déplacer l’étape au lieu de déplacer l’image et Utiliser le mappage de montage, pas les paramètres d’enregistrement. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : GridMap à faible grossissement complet enregistré en mode STEM. Les zones brisées apparaissent complètement noires dans l’image en champ sombre. Les zones gris foncé sont probablement trop épaisses et mal vitrifiées. Les bonnes zones candidates pour la tomographie sont le blanc ou le gris clair dans ce scan. Barre d’échelle = 100 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5 : Passage au processus de marqueur. Un objet reconnaissable est marqué dans la carte basse résolution par Ajouter des points (38 dans cette image). Notez le décalage entre la carte basse résolution (cercle vert) et la carte de résolution moyenne (cercle orange). Ensuite, l’objet est marqué par le marqueur (croix verte, cercle rouge) et la boîte de dialogue Shift to Marker est lancée. L’option choisie déplace toutes les cartes à 245x de la même quantité. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 6 : Boîte de dialogue de configuration de la série d’inclinaison pour une série d’inclinaison STEM. Le schéma dose-symétrique est utilisé de -60° à +60° par pas de 2°. L’autofocus est ignoré en raison de la profondeur de champ élevée lors de l’utilisation d’un faible angle de convergence. Pas besoin d’affiner l’eucentrisme comme cela a déjà été fait. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 7 : Boîte de dialogue des propriétés de fichier pour les cartes de résolution moyenne. Enregistrez en tant que fichier de pile MRC, choisissez des entiers et enregistrez des informations supplémentaires dans un fichier de métadonnées .mdoc. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 8 : boîte de dialogue de configuration du montage pour enregistrer des cartes de résolution moyenne. Pour un carré sur une grille de 200 mailles, d’une largeur de 90 μm, une surface totale d’au moins 90 μm x 90 μm est conseillée. Choisissez Déplacer l’étape au lieu de déplacer l’image et Utiliser les paramètres d’affichage en mode Faible dose. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 9 : Carte d’enregistrement de résolution moyenne. Acquérir dans la boîte de dialogue Items pour enregistrer des cartes de résolution moyenne. Choisissez Mapping, Acquérir et enregistrer une image ou un montage, puis cochez Créer une carte Navigator. Dans les Tâches avant ou après la Primaire, choisissez Eucentricité rugueuse et fine. En cas d’absence d’assistance, choisissez éventuellement la case Aucun message en cas d’erreur et Fermer les vannes de colonne à la fin. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 10 : Image de la carte de résolution moyenne. Carte moyenne résolution (Square Map) enregistrée en mode STEM par un montage de 3 x 3. Les deux cartes d’ancrage de résolution moyenne pour la collecte de données sont indiquées par les carrés bleus. Barre d’échelle = 10 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 11 : Données de série d’inclinaison par lots. Acquérir dans la boîte de dialogue Items pour collecter des séries d’inclinaison par lots. Pour la collecte de données de série d’inclinaison, choisissez Données finales et Acquérir la série d’inclinaison. Dans Tâches avant ou après l’analyse principale, cochez Gérer Dewars/Vacuum (choisissez les paramètres appropriés dans le menu Configuration), Réaligner sur l’élément, Eucentricité fine et Exécuter le script avant l’action. Dans les options Général, cochez la case Aucun message en cas d’erreur et Fermez les vannes de colonne à la fin (voir 5.14). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 12 : inclinaison de 0° d’une série d’inclinaison STEM d’une mitochondrie. Les pointes de flèches orange pointent vers des dépôts de phosphate de calcium (granules de matrice), les pointes de flèches vertes vers les cristae et les pointes de flèches rouges vers des marqueurs fiduciaux d’or de 15 nm. Barre d’échelle = 500 nm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 13 : Cartes cryo-CLEM enregistrées. (A) Carte STEM moyenne résolution (carte carrée, 26-A) est enregistrée sur la carte STEM basse résolution, (C) la carte cryo-FM du canal BF et (D) la carte cryo-FM du canal GFP. Les neuf points d’enregistrement (étiquettes 4 à 21) sont indiqués dans le navigateur (E). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 14 : Rendu du volume. Rendu volumique de sections (A) 60 nm et A (B) 40 nm d’épaisseur à travers un tomogramme filtré de type SIRT (30 cycles) à différentes profondeurs. La taille des pixels est de 2,048 nm, ce qui donne un champ de vision d’environ 4 μm. Veuillez noter la densité inversée par rapport à la figure 12, ce qui signifie que les caractéristiques de haute intensité sont lumineuses. Les pointes de flèches orange, blanche, rouge, verte et bleu clair indiquent des dépôts de phosphate de calcium, des ribosomes, des microtubules, la membrane mitochondriale interne et externe et des filaments d’actine, respectivement. Barre d’échelle = 500 nm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Discussion

Le protocole devrait aider les microscopistes des sciences de la vie qui souhaitent obtenir une vue 3D des organites intracellulaires dans des régions de la cellule qui ne sont pas accessibles à la tomographie TEM conventionnelle. Le même protocole peut également être utilisé pour la tomographie STEM des sections en plastique, avec des contraintes assouplies sur l’exposition. Le protocole devrait être considéré comme un point de départ plutôt que comme un ensemble de règles strictes. En effet, la puissance des STIM réside dans leur flexibilité; Il n’y a pas une seule bonne façon de l’exploiter.

Nous soulignons que STEM, en soi, ne fait référence qu’à la sonde scannée et ne définit pas la formation de l’image. Le contraste dépend principalement de la configuration des détecteurs. Les méthodes les plus simples utilisent des détecteurs à symétrie axiale, soit un disque centré sur l’axe optique, soit un anneau l’entourant. En général, lorsque l’éclairage frappe directement le détecteur, nous enregistrons une image BF où l’échantillon (diffusion d’électrons) apparaît sombre; à l’inverse, lorsque le détecteur ne collecte que des électrons dispersés, nous enregistrons une image DF où le spécimen dense apparaît brillant. Lorsque le matériel approprié est disponible, SerialEM peut acquérir et enregistrer ces deux signaux simultanément. Des configurations encore plus sophistiquées sont disponibles, allant des détecteurs à segments multiples aux caméras entièrement pixélisées. L’imagerie de contraste de phase peut être réalisée, par exemple, en évaluant la différence entre les éléments détecteurs hors axe^32,33. La collecte de l’ensemble du motif de diffusion 2D (diffraction) par pixel définit la méthode connue sous le nom de 4D STEM³⁴, qui permet la reconstruction de plusieurs contrastes d’image à partir des mêmes données d’origine. Le STEM quadridimensionnel permet la ptychographie électronique, ce qui fournit un autre moyen d’obtenir un contraste de phase³⁵.

Nous nous sommes concentrés sur la modalité STEM particulière que nous considérons comme la plus utile pour l’étude des organites et des cellules intactes ou des sections de cellules de l’épaisseur du micron. Cela implique spécifiquement l’utilisation de l’imagerie BF avec un petit angle de semi-convergence dans l’éclairage et un angle de collecte relativement grand au niveau du détecteur. La petite convergence offre une grande profondeur de champ de sorte que l’ensemble de l’échantillon reste au point tout au long de la série d’inclinaison¹⁹. En pratique, avec un bon étage de microscope, il peut également éliminer le besoin d’ajustement de la mise au point lors de l’acquisition. Le prix est un compromis dans la résolution, tel que décrit à la section 3 du protocole. Nous avons suggéré des images 4k avec une sonde de ~2 nm, qui avec un espacement de pixels de 1 nm atteint un champ de vision de 4 μm. Cependant, le lecteur est fortement encouragé à expérimenter. La deuxième considération est du côté du détecteur. Lorsque le disque d’éclairage sous-remplit le détecteur BF sur axe, le contraste de phase est supprimé et le contraste de diffusion (amplitude) domine; Cette condition a été appelée contraste de champ lumineux incohérent³⁶. La question est de savoir par quelle fraction sous-remplir, et la réponse dépend de l’échantillon. Un échantillon très mince montrera le meilleur contraste avec le détecteur complètement rempli (c’est-à-dire que l’angle de collecte correspond à celui de l’éclairage), mais un échantillon plus épais dispersera toute l’intensité, laissant un signal bruyant avec un faible contraste. Une règle empirique utile est que plus l’échantillon est épais, plus l’angle de coupure externe du détecteur BF doit être de²¹. La taille et la position du détecteur sont bien sûr fixes, de sorte que la taille du disque de diffraction est ajustée en fonction de la longueur de la caméra, comme décrit dans la section 1. Si les réglages de l’amplificateur du détecteur sont tels que le signal remplit la plage dynamique mais ne sature pas sous éclairage direct (1.12.3), la longueur de la caméra peut être augmentée jusqu’à ce qu’une intensité et un contraste raisonnables soient atteints. Encore une fois, le lecteur est encouragé à expérimenter. L’art, pour ainsi dire, est dans les angles.

Un autre paramètre, non abordé dans le protocole, est la tension d’accélération du microscope. L’interaction des électrons éclairants avec l’échantillon sera plus forte à une tension inférieure. Toutes choses égales par ailleurs, nous pouvons nous attendre à un contraste plus élevé à une tension inférieure. D’autre part, c’est le début de la diffusion multiple dans l’échantillon qui limite l’épaisseur utilisable de l’échantillon, de sorte qu’une tension plus élevée permet l’utilisation d’échantillons plus épais. Ces effets sont cependant plutôt subtils. Nos expériences à ce jour avec les accélérations de 200 kV et 300 kV sont similaires.

Compte tenu de ce que l’on peut attendre de STEM en termes de résolution, cela dépend encore une fois de l’échantillon et de la configuration du détecteur. En utilisant une approche d’analyse de particules unique, les ions métalliques sur ferritine pourraient être localisés par champ noir annulaire STEM avec une précision de quelques angströms³⁷. Plus récemment, une résolution subnanométrique a été atteinte pour des échantillons de virus et de protéines en utilisant des images obtenues par contraste de phase différentiel intégré (iDPC) STEM³² ainsi que par ptychographie³⁵. Pour des objets uniques dans des spécimens cellulaires épais, et avec les méthodes décrites ici, une telle résolution élevée n’est pas réaliste. La résolution optimale est le diamètre de la sonde, qui se rapporte à l’angle de semi-convergence tel que décrit. D’autres facteurs dégraderont la résolution, en particulier un échantillonnage grossier des pixels pour atteindre un grand champ de vision, des désalignements dans la série d’inclinaison et l’étalement du faisceau de la sonde lors de la transmission. Les images se comparent bien à la tomographie en coupe. Avec la configuration décrite ici, par exemple, il devrait être facile de voir le noyau creux des microtubules, mais pas les protofilaments individuels.

Pour résumer, les méthodes et le matériel STEM sont tous deux en phase de développement. Nous pouvons nous attendre à ce que les innovations en imagerie aient également un impact sur la tomographie, conduisant les STIM dans des domaines qui n’ont pas été accessibles par d’autres techniques. Nous nous attendons à ce qu’une convergence avec l’imagerie cryogénique de fluorescence corrélative basée sur des méthodes modernes de super-résolution optique soit particulièrement fructueuse. L’échelle des organites, 100-1 000 nm, est une cible idéale pour ces méthodes émergentes.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
SerialEM	University of Colorado	Veriosn 4.0	SerialEM is a free software platform for microscope control and data acquisition.
STEM-capable transmission electron microscope			The protocol was written based on experience with several microscopes of Thermo Fisher Scientific: Titan Krios, Talos Arctica, and Tecnai T20-F. In principle it should be applicable to other manufacturers as well.