Visualisering af organeller in situ ved kryo-STEM-tomografi

Summary

Kryo-STEM-tomografi giver et middel til at visualisere organeller af intakte celler uden indlejring, sektionering eller andre invasive præparater. Den opnåede 3D-opløsning ligger i øjeblikket i området omkring et par nanometer med et synsfelt på flere mikrometer og en tilgængelig tykkelse i størrelsesordenen 1 μm.

Abstract

Kryogenelektronmikroskopi (cryo-EM) er afhængig af billeddannelse af biologiske eller organiske prøver indlejret i deres oprindelige vandige medium; Vand størkner i et glas (dvs. forglasset) uden krystallisation. Kryo-EM-metoden anvendes i vid udstrækning til at bestemme strukturen af biologiske makromolekyler for nylig ved en næratomopløsning. Tilgangen er blevet udvidet til undersøgelse af organeller og celler ved hjælp af tomografi, men den konventionelle form for bredfelttransmission EM-billeddannelse lider en alvorlig begrænsning i prøvetykkelsen. Dette har ført til en praksis med fræsning af tynde lameller ved hjælp af en fokuseret ionstråle; Den høje opløsning opnås ved subtomogram gennemsnit fra rekonstruktionerne, men tredimensionelle relationer uden for det resterende lag går tabt. Tykkelsesbegrænsningen kan omgås ved scannet sondebilleddannelse, svarende til scannings-EM eller det konfokale laserscanningsmikroskop. Mens scanning transmission elektronmikroskopi (STEM) i materialevidenskab giver atomopløsning i enkeltbilleder, kræver følsomheden af kryogene biologiske prøver til elektronbestråling særlige overvejelser. Denne protokol præsenterer en opsætning til kryotomografi ved hjælp af STEM. Den grundlæggende topiske konfiguration af mikroskopet er beskrevet for både to- og tre-kondensatorsystemer, mens automatisering leveres af den ikke-kommercielle SerialEM-software. Forbedringer til batchanskaffelse og korreleret justering til tidligere erhvervede fluorescenskort beskrives også. Som et eksempel viser vi rekonstruktionen af et mitokondrie, der peger på den indre og ydre membran og calciumphosphatgranulat samt omgivende mikrotubuli, actinfilamenter og ribosomer. Kryo-STEM-tomografi udmærker sig ved at afsløre organellernes teater i cytoplasmaet og i nogle tilfælde endda den nukleare periferi af klæbende celler i kultur.

Introduction

Tredimensionel (3D) visualisering af organeller er en altafgørende opgave i moderne cellebiologi. I betragtning af de involverede skalaer, der spænder fra snesevis af nanometer til sekretoriske vesikler til mange mikrometer til cellekernen, er det udfordrende at finde en enkelt mikroskopiteknik, der passer til alle applikationer. Mens moderne fluorescensmikroskopi kan spænde over meget af området med hensyn til opløsning, vises kun de mærkede molekyler. Det cellulære teater forbliver elektronmikroskopiens rige. Konventionelle metoder til kemisk fiksering, plastindlejring og farvning med tungmetaller er stærkt invasive, så resultaterne kan afhænge af detaljerne i prøveforberedelsen. Cryo-EM er derimod begrænset af behovet for at forglase det vandige medium; Iskrystaller, der dannes, diffrakterer elektronbelysningen, hvilket forårsager kontrastartefakter med højere kontrast end det organiske materiale af interesse.

Det sidste årti har set en spredning af EM-billeddannelsesteknikker udviklet eller tilpasset til cellulære undersøgelser¹. Højtryksfrysning kombineret med iterativ fokuseret ionstrålefræsning (FIB) og seriel overfladebilleddannelse ved hjælp af scanningelektronmikroskopet (dvs. FIB-SEM) er i øjeblikket den foretrukne metode til store prøver². Kryogen, blød røntgentomografi (cryo-SXT) er velegnet til prøver af flere mikron i størrelse, begrænset af den karakteristiske absorptionslængde af de bløde røntgenstråler i vand ^3,4,5. Denne skala omfatter mange intakte celletyper, og den kvantitative karakter af røntgenabsorptionskontrasten tilføjer et aspekt af koncentrationsmåling⁶ eller spektroskopi⁷. Når det kombineres med subtomogramgennemsnit, tilbyder kryotransmissionselektrontomografi (cryo-ET), baseret på fasekontrasttransmissionselektronmikroskopi (TEM), den højeste opløsning for makromolekyler eller komplekser ^8,9,10. Det er dog sjældent, at intakte organeller er så regelmæssige, at de kan beregnes i gennemsnit hele. Desuden er den konventionelle tilstand af vidvinkel-TEM begrænset for prøvetykkelse til nogle få hundrede nanometer ved kombinationen af uelastisk spredning (der involverer energitab) i prøven og kromatisk aberration i den magnetiske objektivlinse^11,12. Den store energispredning dikterer brugen af et energifilter til at fjerne den resulterende dis ude af fokus, men den følsomme prøve lider stadig strålingsskade, mens billedsignalet bliver eksponentielt svagere med stigende tykkelse.

Den alternative billeddannelsestilstand, scanningstransmission EM (STEM), omgår behovet for energifiltrering og bevarer de uelastisk spredte elektroner til billeddannelse, omend i øjeblikket med en lavere opløsning end for TEM-tomografi (figur 1). Faktisk dannes der ikke noget rigtigt billede. I stedet, som i en scanning EM, foretages målinger punkt for punkt, og billedet samles af computeren. Forstørrelsen bestemmes kun af størrelsen på scanningstrinnene uden at ændre linsestrømmene. Når den er korrekt konfigureret, kan det nyttige prøvetykkelsesområde til kryo-STEM-tomografi (CSTET) nå 1,5 eller endda 2 μm, selvom komfortzonen, hvor den nyttige signalintensitet forbliver en betydelig brøkdel af belysningen, er omkring 600-900 nm^11,13. Dette er tilstrækkeligt til at se en stor brøkdel af cytoplasmaet og lejlighedsvis en kant af cellekernen. I praksis finder vi, at forglasning ved standardmetoden til at kaste sig ned i kryogen væske pålægger en mere alvorlig begrænsning af tykkelsen end STEM-billeddannelse. Målet med denne videoartikel er at lette inkorporeringen af CSTET i værktøjskisten til celle- og organelbilleddannelse i forskningslaboratorier og mikroskopifaciliteter.

Den første udfordring er, at mikroskopoperationer i CSTET endnu ikke er standardiseret til biovidenskabelige applikationer på samme måde, som de har været for kryo-TEM-tomografi. STEM-hardware har sjældent (hvis nogensinde) været målrettet mod cryo-EM-markedet. Dette ændrer sig dog med den nyeste generation af mikroskoper, og mange eksisterende værktøjer kan eftermonteres. STEM som teknik har taget fart og stort set overtaget i materialevidenskaben, hvor der også er spirende interesse for kryogene og lavdosismetoder^14,15. Materialevidenskabslitteraturen bugner af akronymer BF-STEM, ADF-STEM, HAADF-STEM, 4D-STEM, DPC-STEM osv., Som øger forvirringen. Vi tilbyder her et anbefalet udgangspunkt, der i vores kollektive erfaring på Weizmann Institute of Science giver den mest generelle protokol for nyttige resultater baseret på lyst felt (BF) STEM-billeddannelse¹⁶. På ingen måde udtømmer eller udforsker det endda rækkevidden af muligheder, men det vil tjene som grundlag for yderligere forbedringer. Mens vi understreger kryo-STEM, er det meste af protokollen lige så relevant for STEM-tomografi ved stuetemperatur af plastindlejrede sektioner.

Essensen af STEM er at scanne prøven med en fokuseret elektronsonde (figur 1), lyskeglen og at optage signaler fra diffraktionsplanet (spredning) i transmission, pixel for pixel, for at producere 2D-billeder^17,18. Amorfe prøver, herunder de fleste cellulære materialer, vil producere et diffust spredningsmønster i transmission. Den enkleste praktiske STEM-konfiguration er at placere en cirkulær detektor til registrering af den centrale disk (dvs. sondebelysningen, der ville blive transmitteret uden en prøve). Prøven spreder elektroner væk fra denne lyskegle i det omfang, signalet falder. Dette giver et BF-billede - prøven ser mørk ud på en lys baggrund. En ringformet detektor kan også (eller i stedet) bruges til at detektere spredningen fra prøven uden for lyskeglen. Når prøven er fjernet, er der intet signal. Når en prøve er på plads, vises objekter lyse på en mørk baggrund i billedet af det mørke felt (DF). Nomenklaturen for STEM (BF, ringformet mørkt felt [ADF], højvinkel ringformet mørkt felt [HAADF] osv.) henviser hovedsageligt til områderne for indsamlingsvinkler for detektorerne.

Belysningens konvergensvinkel repræsenterer en væsentlig tilpasning af STEM til cellulær tomografi. Når topprioriteten er høj opløsning, skal konvergensvinklen være så stor som muligt. (Dette svarer til konfokal laserscanningsmikroskopi; opløsningen bestemmes af sondediameteren, som skaleres som bølgelængden divideret med den numeriske blænde. Bemærk, at vi henviser til halvvinkel- eller semikonvergensvinklen for EM.) Når prioriteten er dybdeskarpheden, giver et kompromis i opløsning derimod en stor fordel, da den fokuserede stråle forbliver nogenlunde parallel i en afstand svarende til to gange bølgelængden divideret med halvvinkel i kvadrat. Ideelt set forbliver hele cellevolumen i fokus¹⁹. For eksempel er elektronen deBroglie-bølgelængden ved 300 keV 0,002 nm, så en konvergens på 1 mrad giver en opløsning på 2 nm og en dybdeskarphed på 4 mikron. Under disse forhold kan tomografi udføres selv uden fokus under dataindsamlingsprocessen, men kun én gang i begyndelsen af erhvervelsen. En konventionel tomografi-kapabel STEM kan nå en semi-konvergensvinkel på 7 eller 8 mrad; Derfor kunne vi i princippet nå en opløsning i størrelsesordenen 0.25 nm, men derefter med en brændvidde på kun 62 nm. Dette er klart for tyndt til cellulær billeddannelse. Mere avancerede mikroskoper med tre kondensatorlinser giver kontinuerlig justering af semikonvergensvinklen over et betydeligt område. Med den mere traditionelle to-kondensatorkonfiguration fastgøres konvergensen diskret af kondensatorens (C2) blænde.

For robuste, plastindlejrede prøver kan man optage en brændvidde ved hver hældning og kombinere dem til høj opløsning²⁰, men for kryogene prøver er strålingsbudgettet for alvorligt begrænset. Endelig bør man ved afvejning af fordelene ved BF- eller DF-billeddannelse for tykke prøver overveje virkningerne af flere elastiske spredninger i prøven. BF-signalet er mindre ødelagt af flere spredninger og viser en højere opløsning for tykke prøver ^16,21.

En nyttig tommelfingerregel har været at indstille indsamlingsvinkler, der er flere gange større end konvergensen. Jo tykkere prøven er, desto større skal opsamlingsdisken være. For lille en disk giver en lav signalintensitet; For stor en disk vil resultere i dårlig billedkontrast, da kun den højeste vinkelspredning vil bidrage. Opsamlingsvinklerne skal optimeres for en given prøve. Detektorvinklerne som funktion af (diffraktion) kameralængde skal kalibreres uafhængigt. De kan vises bekvemt af mikroskopsoftwaren. I praksis er en faktor på to til fem i forholdet mellem opsamling og belysningshalvvinkler, henholdsvis θ til α (figur 1), et anbefalet udgangspunkt for CSTET af cellulære prøver.

Følgende protokol beskriver STEM-tomografidrift ved hjælp af den populære SerialEM-software til mikroskopkontrol^22,23. SerialEM er ikke bundet til en bestemt producent, og den er meget udbredt i TEM-tomografi. De fleste af de operationer, der er forbundet med opsætning af tomografi, kan overføres direkte fra TEM. SerialEM-strategien er at modellere scanningssystemet som et kamera. Dette muliggør den enkle crossover fra TEM til STEM. Man skal dog huske på, at parametre som forstørrelse og binning er helt kunstige. De vigtige parametre er synsfeltet i mikron, antallet af pixels i synsfeltet og eksponeringstiden. Pixelafstanden eller prøveudtagningen er det lineære felt divideret med antallet af pixels, mens opholdstiden er antallet af pixels divideret med eksponeringstiden.

Den mindste konfiguration for STEM og CSTET involverer tre funktioner på mikroskopet: en scanningsgenerator, en STEM-detektor og tomografistyringssoftware. Protokollen henviser til nomenklaturen for FEI/Thermo Fisher Scientific (TFS), men begreberne er generiske. TFS's proprietære software er beskrevet i JoVE for TEM²⁴, og STEM-operationen er meget ens.

Vi antager, at mikroskopet er blevet justeret på forhånd af serviceteamet eller erfarent personale, og at en kolonnejustering kan kaldes op ved at indlæse en fil. Mindre justeringer kaldes direkte justeringer og kan gemmes i såkaldte FEG-registre (TFS-mikroskoper). Direkte justeringer omfatter rotationscenter, pivotpunkter, diffraktionsjustering og kompensation for kondensatorastigmatisme. Justeringer skal udføres iterativt. Bemærk, at TFS-mikroskoper implementerer forskellige nanoprobe (nP) og mikroprobe (μP) tilstande; for en given kondensatorblænde giver disse et relativt smalt eller bredt synsfelt med parallel belysning i TEM og en mere eller mindre konvergent (tæt fokuseret) elektronstråle i STEM. Andre producenter bruger forskellige ordninger til at dække konvergensvinklerne.

Før start skal synsfeltet, L, og prøveudtagningen (pixelbredde), l, vælges, afhængigt af prøven under undersøgelse. For l = 1 nm/pixel skal der f.eks. vælges et billede på 4.000 x 4.000 pixel, der dækker et synsfelt på 4 μm² . Opløsningen vil i bedste fald være to gange den rumlige prøveudtagning, så 2 nm og sondediameteren, d, skal matche det. Kalibrering af sondevinklen ligger uden for denne protokols anvendelsesområde, så vi antager, at en tabel eller en skærmlæsning er tilgængelig. Sondediameteren er omtrent elektronbølgelængden divideret med halvkonvergensvinklen (i radianer): d = λ / θ. Bølgelængden, λ, er 0,002 nm for 300 keV og 0,0025 nm for 200 keV elektroner, så θ på 1 mrad vil give en spotdiameter på henholdsvis 2 eller 2,5 nm.

Protokollen præsenteres i en progression af stigende kompleksitet. Den første opgave er at producere et STEM-billede, der afhænger af mikroskopproducentens software, og derefter en vippeserie, som vi bruger SerialEM til. Mange læsere vil uden tvivl være bekendt med SerialEM, så de mere komplicerede opgaver kommer naturligt. Det er ikke nødvendigt at følge procedurerne nøje. Udviklingen inden for automatisering kan implementeres direkte for STEM såvel som for TEM. Erfarne brugere vil sandsynligvis invertere protokollen, begyndende med korrelativ registrering af fluorescenskort og fortsætte med at oprette batchtomografi. Yderligere detaljer kan findes i de omfattende dokumentations- og vejledningsbiblioteker til SerialEM selv, herunder en nylig JoVE-artikel om den seneste udvikling inden for automatisering²⁵.

Protocol

1. STEM-opsætning

1. Foreløbige justeringer: Indlæs kolonnejusteringsfilen, og åbn derefter søjleventiler. Hvis du bruger en kryoholder med sideindgang, skal du åbne Cryo-shield. Start i TEM-tilstand. Strålen skal vises på skærmen. Hvis ikke, sænk forstørrelsen.
2. Bring mikroskopet til eucentrisk fokus ved at trykke på knappen på kontrolpanelet.
3. Indstil spotstørrelsen til en praktisk værdi (f.eks. 6) til visualisering af den fluorescerende skærm, enten direkte eller med det indbyggede kamera (afhængigt af mikroskopmodellen).
4. Indstil mikroskopet til STEM-tilstand, og kontroller, at fokus bruger kondensatorlinserne (intensitet) snarere end målet. Indstil eucentrisk fokus. Gå derefter ud af diffraktionstilstand for indledende justeringer.
5. Sørg for, at bjælken ikke er tom. Reducer forstørrelsen, indtil strålen vises på skærmen. Juster stråleskiftet til midten og øg forstørrelsen i trin op til ca. 70kx, mens du holder strålen i midten.
6. Indsæt den ønskede kondensatoråbning, typisk 50 μm. Kontroller blændecentreringen. Når du drejer fokusknappen lidt frem og tilbage, skal stedet udvide sig og trække sig sammen, men forblive på plads, som om et plan skærer et imaginært lodret timeglas. Hvis blænden ikke er centreret, skifter belysningen sideværts, som om timeglasset blev vippet.
7. Få strålen til at fokusere, og tryk på Intensitetslistefokus (hvis tilgængelig) under fanen Justeringer, eller vend tilbage til eucentrisk fokus som i 1.2. Juster strålepositionen tilbage til midten.
8. Juster rotationscentret. Drej fokustrinhjulet til et minimum eller et trin over, så strålen pulserer forsigtigt, og sørg for, at den forbliver stationær, når fokus bevæger sig op og ned.
9. Vælg omdrejningspunkterne, og bring de to punkter sammen med X- og Y-justeringer.
   BEMÆRK: Hvis der er installeret en faseplade på et TFS-instrument, skal kun X-justeringen bruges.
10. Defokuser strålen lidt, og juster kondensatorstigmatorerne for at gøre disken rund. Gå op og ned gennem fokus for at optimere; Der bør ikke være nogen tendens til at forlænge i den ene eller den anden retning, når man passerer fokus.
11. Normaliser linserne. Forøg derefter forstørrelsen gradvist til ca. 240 kx, mens du bruger stråleskiftet til at holde punktet centreret, og gentag justeringerne af rotationscentret og drejepunktet (trin 1.6-1.8).
12. Gå tilbage til diffraktionstilstand. Strålen skal vises som en ensartet disk på den fluorescerende skærm. Kameralængden (CL) styrer nu effektivt den optiske afstand til detektoren, som i røntgenkrystallografi. Skift det, og se, når disken trækker sig sammen og forstørres, som om skærmplaceringen ville bevæge sig mod eller væk fra prøven. Denne kegle repræsenterer BF-belysningen.
    BEMÆRK: For hver CL er der en diffraktionsjustering, der skal justeres for at bringe den projicerede stråle til den centrale akse. Der er normalt ingen grund til at forfine dem alle, kun den ene (eller få), der skal bruges til detektion.
13. Aktiver STEM-tilstand ved høj forstørrelse.
    1. Hvis en BF STEM-detektor er tilgængelig, skal du starte med det. Bring scenen til et område med et tomt hul, og juster diffraktionsjusteringen for at centrere strålen ved hjælp af den ønskede CL.
    2. Mange mikroskoper er kun udstyret med en HAADF-detektor; der er et trick til at bruge dette som en BF-detektor. Træk først detektoren tilbage, centrer strålen som ovenfor i de direkte justeringer, indsæt en objektiv blænde, typisk en lille, såsom 20 μm, og juster dens position for at omgive strålen ensartet. (Den nemmeste måde at gøre dette på er ved at indsætte en prøve eller et testgitter for at se en glorie omkring belysningen). Brug derefter diffraktionsjusteringen til at flytte strålen væk fra aksen og ind på detektorområdet. Indsæt og træk detektoren tilbage, mens du ser strålen på skærmen for at bekræfte, at strålen er blokeret af detektoren.
    3. Start en scanning i mikroskopsoftwaren, og juster indstillingerne for lysstyrke og kontrast (B/C), så signalet er tæt på 0, når strålen er tom, og tæt på mætning, når den fulde belysning falder på detektoren. Brug visningen af kikkertsigtet til at hjælpe. Indstillingerne kan kobles på uventede måder, så justeringen skal gentages flere gange.
14. Sæt mikroskopet tilbage til en relativt lav forstørrelse i registret med høj forstørrelse (SA-tilstand) uden at gå i tilstanden lav mag (LM).
15. Bemærk den aktuelle skærm som reference senere (se trin 3.1.1). Strømmen kan ændres med pistollinsen og spotstørrelsesindstillingerne, som i TEM, med stigende tal svarende til en reduceret strøm.
16. På dette tidspunkt skal du gemme et FEG-register for at lette en tilbagevenden til standardværdier.
    BEMÆRK: Anlægget kan udarbejde et standardsæt FEG-registre, så brugerne kan starte fra en fungerende konfiguration.

2. Anbringelse af prøveeksemplaret

1. I LM TEM-tilstand skal du sikre dig, at gitteret ikke er uigennemsigtigt. Find en gitterfirkant til at foretage indledende justeringer. Det er praktisk at finde et tomt område, et hul eller en revet gitterfirkant. Optag scenepositionerne for at vende tilbage til dem bekvemt.
2. Bring prøven til eucentrisk højde. Der er flere metoder til at gøre dette. Du kan f.eks. bruge scenewobleren til at vippe gitteret, mens du flytter prøvehøjden langs Z-aksen, indtil billedet holder op med at skifte sideværts. Du kan også markere nogle funktioner på skærmen og vippe scenen til 30°. Funktionen bevæger sig sideværts. Juster prøvehøjden for at bringe den tilbage til den oprindelige position. Forøg forstørrelsen eller trinhældningen for at finjustere. Vend tilbage til 0° hældning.
3. Gå tilbage til STEM-tilstand, og indsæt STEM-detektoren. Gå til tilstanden med laveste høje forstørrelse (SA). Sørg for, at der observeres et billede på computerskærmen. Scan hurtigt for at undgå unødvendig eksponering; 1 μs/pixel eller mindre ville være typisk. Bemærk, at billedet kan virke forvrænget ved venstre kant, når scanningen er for hurtig (se figur 2).
4. Tryk på Eucentrisk fokus, øg forstørrelsen, og finjuster fokus under scanning. Det er praktisk at bruge fokuslup, der leveres af mikroskopsoftwaren.
5. Indstil kondensatorens astigmatisme. Dette kan gøres mest præcist ved hjælp af Ronchigram-metoden. Med strålen over et tyndt prøveområde skal du fokusere på det punkt, hvor den transmitterede stråle blæser op, mellem skyggebilleder af prøven på begge sider. Juster derefter kondensatorindstillingen for at gøre den centrale disk rund. Dette kræver en vis øvelse, især for kryogene prøver.
   BEMÆRK: Et alternativ er at finde nogle guldpartikler (ofte brugt som fiduciale markører til justering i tomografi). Forøg forstørrelsen og fokuser op og ned, og indstil bygningsfejlen, så partiklerne forbliver runde uden forlængelse i begge retninger.
6. Gå til LM STEM-tilstand, og fortsæt scanningen for at finde et interessant område. Juster om nødvendigt detektorens B/C-indstillinger (trin 1.13.3) omtrent på dette tidspunkt.

3. Optagelse af et billede

1. Anslå dosis til optagelse. Som tommelfingerregel skal du sigte efter 100-150 e^-/Ų for hele tomogrammet. Kontroller dosistolerancen pr. prøve. Strømmen i Ampere (A) divideret med ladningen pr. elektron repræsenterer et antal e^-/s, som ganges med eksponeringstiden, T, i sekunder og divideres med synsfeltet i Ų. For nemheds skyld skal du udtrykke strømmen i nanoampere (som læst fra skærmen), synsfeltets bredde i mikrometer og rammens eksponeringstid i sekunder med passende faktorer:
   
   Dette tal skal ganges med antallet af hældninger for at få den samlede eksponering i serien. For eksempel med en strøm I = 0,04 nA, et felt L = 4 μm og en eksponeringstid på 12 s opnår vi 1,9 e-/Å 2 pr. hældning eller ca. 110 e^-/Ų for en serie på 61 fremskrivninger.
2. Sæt scenen tilbage i et hul (eller træk gitteret tilbage), og juster strålestrømmen ved hjælp af spotstørrelse og/eller indstillinger for pistolobjektiv for at nå den ønskede skærmstrøm. Hvis målingen lyder 0, skal du indsætte en større C2-blænde for at øge strømmen. Korriger derefter ved at dividere målingen med kvadratet af forholdet mellem diametre og til sidst vende tilbage til den mindre blænde.
3. Finjuster B/C-indstillingerne i henhold til trin 1.13.3, og vend til sidst scenen tilbage til et interesseområde, og kontroller direkte justeringer og bygningsfejl igen under billeddannelsesforholdene.
4. Få et testbillede.

4. Tomografi med SerialEM

1. Start SerialEM-serveren på mikroskopcomputeren (SerialEM installeres normalt på en anden). Åbn derefter SerialEM. STEM vises i SerialEM som et kamera med samme grænseflade. Sørg for, at kommunikationen kører korrekt for opsætningen. For eksempel skal mikroskopfanen vise den korrekte forstørrelse. Hvis dette ikke virker, skal du stoppe her og fejlfinde.
2. Find fanen Kamera og script, og åbn Opsætning. Sørg for, at STEM-kameraet er valgt, og vælg passende binning og opholdstider for hver tilstand. Sørg for, at den eller de relevante detektorer vises i feltet "kanaler, der skal hentes" nederst til venstre. Tryk på Hent nederst for at teste. Igen, fortsæt ikke, hvis der ikke sker noget, eller hvis strålen ikke løsnes. Stop og kontroller kommunikationen.
   BEMÆRK: Tilstandene bruges på samme måde som TEM-tomografi. Binning er et kunstgreb for kompatibilitet med TEM. Den vigtige parameter er pixelantallet; Forskellige mikroskopsystemer bruger forskellige binning for at nå det samme antal.
   1. Vis og søg skal være hurtige scanninger med relativt få pixels (f.eks. 512 x 512 pixels ved 1 sekund).
   2. Fokus er generelt et lille område med hurtig optagelse. I lavdosistilstand skal du derfor vælge Fokus for at være i en anden forstørrelse end optagetilstand, hvilket kan hjælpe med nøjagtighed. Lad spotstørrelsen være uændret.
   3. For optagetilstand skal du bruge de parametre, der er valgt ovenfor i eksponeringsestimeringen. Hvis det er tilgængeligt, skal du også vælge Dynamisk fokus, som korrigerer fokus linje for linje i et skråt billede.
   4. For nemheds skyld senere skal du vælge binning for forhåndsvisning for at være identisk med den for Vis (se Forbedring #1, trin 5.5). Billedstørrelsen (antal pixels) behøver ikke at være den samme.
   5. Brug prøvetilstand til at holde postområdet centreret under anskaffelsen. Det kan ligne Vis, men pas på, at der ikke er nogen synlige scanningsforvrængninger i venstre side af rammen (se et eksempel i figur 2 ). Igen kan forsøget i lavdosistilstand have en anden forstørrelse end i optagetilstand.
   6. Brug Montage-tilstand med det samme til gitterscanningen. Det skal være tilstrækkeligt pixeltæt til at finde områder af interesse; Anbefaling: 512 x 512 eller 1024 x 1024. Sørg for, at billedet er godt med et anstændigt dynamisk område (set i billedvisningskontroller), da denne tilstand bruges til at finde prøveområderne.
   7. Gem indstillingsfilen, så disse valg bevares som standard til næste session (hvilket kan forekomme snart, hvis programmet går ned).
3. Test kalibreringerne af billedskift og faseskift. I mikroprobetilstand (eller nanosonde) skal du klikke på Vis billede, holde markøren over det med musen, holde knappen nede og trække diagonalt med ca. en fjerdedel af synsfeltet. Tag derefter en anden visning. Billederne skal overlappe perfekt. Gentag ved at trække igen, mens du holder Skift-tasten nede (for at gennemtvinge en scenebevægelse). Billederne skal overlappe godt, men måske mindre præcist.
4. Gå til LM-tilstand, og test sceneskiftet. Hvis disse test mislykkes, skal du stoppe og foretage fejlfinding. Resten fungerer ikke.
5. Lav et montage LM kort over hele nettet. Dette kan også gøres i TEM.
   1. Gå til STEM-tilstand med laveste forstørrelse, hvor billedet ikke blokeres af blændeåbninger, typisk omkring 185x.
   2. Klik på menuen Navigator > Åbn. Klik derefter på menuen Navigator > Nav. Indstillinger > fravælge Konverter kort til byte.
   3. Vælg menuen Navigator > Montaging & Grids > Setup Full Montage. En menu åbnes. Indstillingerne for at kontrollere er: Flyt fase i stedet for at skifte billede, Opret kort fra hver montage, hvis Navigator er åben , og Brug montagetilknytning, ikke Optag parametre. Billedgitteret skal være ca. 6 x 6 eller 7 x 7. Se efter det samlede areal, der skal registreres. Hvis der kræves for mange billeder, læses forstørrelsen muligvis ikke korrekt fra mikroskopet (figur 3). Stop og tjek.
   4. For at starte Montage-anskaffelsen skal du trykke på Start på montagekontrollerne eller montage under Kamera & script. En anden menu åbnes for at vælge Filparametre: mrc, gem som heltal, og i endnu en dialog skal du vælge filnavnet til opbevaring. Sørg for at gemme data i det passende dataområde og ikke under SerialEMs egne brugerindstillinger. Det anbefales ikke at gemme store data på C-disken, hvor systemet ligger.
   5. Når overtagelsen er afsluttet, vises montagen i hovedvinduet (figur 4). Man kan nu navigere rundt i gitteret ved hjælp af markøren og punkterne på Navigatoren, ligesom i TEM.
6. Kontroller astigmatismekorrektionen igen. Normalt er det tilstrækkeligt at scanne et lille område hurtigt og justere sammen med fokus, så punktlignende funktioner såsom guldnanopartikler forbliver helt runde, når de passerer ind og ud af fokus (som på en SEM) ved høj forstørrelse. Mere konservativt kan man gentage de direkte justeringer af trin 1.5-1.8, før man løser astigmatisme.
7. Juster billedet med høj forstørrelse til LM-montagen.
   1. Gå til en position på LM-montagen med nogle let genkendelige funktioner. Tilføj et punkt, klik på Navigator-vinduet > Tilføj point, og klik på funktionen. Tryk igen (stop med at tilføje) for at deaktivere.
   2. Tag et visnings- eller prøvebillede ved den laveste høje mag (HM) forstørrelse, og find det angivne element. Placer markøren der (grønt kryds), og med det tilsvarende punkt fremhævet i vinduet Navigator, i menuen Navigator > Skift til markør..., i dialogboksen, der åbnes, skal du vælge Alle kort og Gem skift som vist i figur 5.
   3. Test ved at flytte scenen til andre positioner og kontrollere, at HM-billedet er centreret på de samme steder, der er valgt i LM-montagen. Hvis funktionen ikke er synlig i HM-billedet, kan skiftet mellem LM- og HM-tilstand være for stort. I dette tilfælde skal du lave en polygonmontage over et større område. Klik på vinduet Navigator > Tilføj polygon, vælg nogle punkter, og klik derefter på Tilføj polygon igen for at lukke. Klik på menuen Navigator > Montaging og Grids > Opsætning Polygonmontage og Montage Controls > Start. Find derefter tilsvarende punkter som ovenfor, og klik på Skift til markør ....
8. Indstil lavdosistilstand.
   1. Åbn fanen Lavdosiskontrol , og marker afkrydsningsfeltet Lavdosistilstand .
   2. Markér Løbende opdatering , og gå til Vis. Vælg mikroskopforstørrelsen for denne tilstand, typisk den laveste eller næst efter den laveste. Vælg hver af de næste tilstande, og indstil den passende forstørrelse. Optag skal indstilles for at opnå den ønskede pixelstørrelse, og fokusforstørrelsen skal være høj nok til, at fiduciale markører eller andre funktioner med høj kontrast til fokusering løses tydeligt. Fjern derefter straks markeringen af Løbende opdatering.
      BEMÆRK: Prøvetilstand kan enten indstilles svarende til Optag, i hvilket tilfælde sporingsområdet skal forskydes fra Optag-området for at minimere eksponeringen, eller til lav forstørrelse, der omfatter meget af omgivelserne.
   3. Tag et visningsbillede, og indstil prøvepositionen ved hjælp af Definer placering af område: Prøve.
      BEMÆRK: Anbefaling #1: I betragtning af ændringen i det undersøgte område og tid kan den ekstra eksponering for et lavt mag-forsøg være minimal. Så længe gitterlinjen ikke kommer ind i synsfeltet, er denne sporingsmetode typisk mere pålidelig. Anbefaling #2: Det er også muligt at opdatere spotstørrelsen for at justere dosis for forskellige tilstande, såsom Focus. For stabilitet i mikroskopets optiske indstillinger anbefaler vi ikke at gøre dette, men snarere at lade spotstørrelsen være, som det er passende for Optag, og derefter justere eksponeringstiden, hvis det er nødvendigt for de hurtigere scanningstilstande.
   4. Klik på fanen Lavdosiskontrol > Gå til: Rec., Klik derefter på Navigator-menuen > Åbn billedtilstande > Tilføj aktuel tilstand. Giv det et navn, så det let kan huskes (f.eks. μP STEM for mikroprobe STEM). Forskellige tilstande kan defineres for forskellige opgaver.
9. Flyt scenen til et sted af interesse for tomografi (mere om brugen af Navigator nedenfor).
   1. Tilføj et punkt i navigatoren ved at klikke på vinduet Navigator > Tilføj point.
   2. Finjuster den eucentriske højde ved at vælge Opgaver > Eucentricitet > Grov. Navigator-vinduet > Update Z.
   3. Indstil områderne for fokus og forsøg. Først skal du tage et Vis billede. Vælg derefter Fokus eller Forsøg under Definer placering af område under fanen Lavdosiskontrol. Juster positionerne for de to områder langs hældningsaksen. Fokus må ikke overlappe området Post.
      BEMÆRK: Husk, at der er en vis overskridelse, især i venstre kant, så ingen af dem bør indstilles umiddelbart ved siden af postområdet. Omfanget af overskridelsen kan evalueres på et testområde ved gentagne gange at scanne ved postforstørrelsen og derefter reducere forstørrelsen for at få et bredere overblik.
10. For god ordens skyld (valgfrit med erfaring) skal du vippe scenen til +60° og derefter -60°, hver gang du tager et Vis eller Vis billede for at sikre, at gitterlinjen ikke kommer ind i synsfeltet Postområde, der vises med grønt.
11. Konfigurer vippeserien.
    1. Åbn en ny fil for at gemme dataene ved at klikke på Filer > Åbn ny , og vælg et filnavn. Vælg menuen Tilt Series > Tilt Series Setup (Figur 6). Fejlfinding: Hvis knappen Åbn ny er grå, skal du kontrollere, at den forrige vippeserie er afsluttet. Hvis ikke, skal du afslutte ved at klikke på Tilt Series > Afslut.
    2. Indstil de ekstreme hældningsvinkler i felterne Tilt til og Slut ved , typisk henholdsvis -60° og +60°, samt intervallet, typisk 2°.
    3. For dosissymmetrisk tilstand (anbefales - sørg for, at lavdosistilstand stadig er aktiv), skal du kontrollere Kør serie i to retninger fra ___. Blindprøven er normalt 0, men kan bruges til at kompensere for forudvippede FIB-lameller (f.eks. ved 20°).
    4. For nemheds skyld skal du markere Hold eksponeringstiden konstant. Ændring af dette kræver en vis omarbejdning af eksponeringsberegningen og kan også interferere med algebraiske rekonstruktioner (f.eks. ART/SART/SIRT), som sammenligner forventede intensiteter med originale data (se trin 7.1).
    5. Markér Spring autofokus over. En lille semikonvergensvinkel, såsom 1 mrad, indebærer en så lang dybdeskarphed, at det kan være unødvendigt at fokusere. Som en test skal du fokusere på 0°, vippe til 60° eller -60° og trykke på Optag. At bevare fokus er primært et spørgsmål om præcis eucentrisk højde. For større konvergens kan det være nødvendigt at fokusere i løbet af serien. I dette tilfælde skal du tage et synspunkt, og i fanen Lavdosiskontrol skal du definere placeringen af område og fokus og justere fokusområdet.
    6. Indledende og endelige handlinger: Hvis eucentrisk højdejustering blev udført nøjagtigt, er det ikke nødvendigt at gentage det. Fjern markeringen af Luk søjleventiler i slutningen af serien, medmindre der er god grund til ikke at gøre det.
    7. Til sporing af kontrolparametrene er der mange muligheder. For uovervåget dataindsamling er topprioriteten at undgå, at programmet stopper for brugerinput. Brug de anbefalede indstillinger: Gentag Optag, hvis procentdelen af mistet felt er mere end 5. Spor derefter efter, og markér Juster med forhåndsvisning, før du får ny sporreference og Hent ny sporreference , hvis postjusteringen afviger med 2 %. Ved overvåget dataindsamling skal du anvende strengere parametre for at undgå risikoen for at miste timer med instrumenttid.
    8. Når du er klar til at starte, skal du trykke på GO nederst i vinduet. I slutningen skal du vælge Tilt Series > Terminate.

5. Batchhentning på flere punkter ved hjælp af Navigator (forbedring #1)

BEMÆRK: Protokollen er rudimentær, fordi a) den er identisk med TEM og b) nye værktøjer bliver tilgængelige, der sandsynligvis vil gøre en fuldstændig beskrivelse forældet.

1. Indlæs hele gittermontagen i hovedvinduet.
2. Vælg en række områder, der ser lovende ud. Klik på Tilføj punkter , og føj dem til midten af de markerede gitterfirkanter. Klik på Tilføj point igen for at deaktivere tilstanden.
3. Når billedbehandlingstilstanden med lav dosis er aktiveret, skal du vælge Navigator-vinduet > markere Hent og Ny fil ved element for hver af de valgte firkanter. For det første åbnes en dialog for filegenskaberne (figur 7) og derefter filnavnet. Vælg Montaged images, og markér derefter Brug visningsparametre i Low Dose-tilstand i dialogboksen Montage Setup (Figur 8), og lav et gitter, der er stort nok til at dække kvadratet (ca. 100 x 100 μm).
4. Klik på menuen Navigator > Hent på elementer, og vælg parametrene til kortlægning. Vigtigst er det, at du i Primære handlinger skal markere Opret navigatorkort, derefter Grov eucentricitet og fin eucentricitet og trykke på Gå (figur 9). For et gitter med 200 masker vil dette resultere i et kort over stort set hele kvadratet (figur 10)
5. Forbered dig på valg af tomogramposition. Åbn en ny fil ved at klikke på Filer > Åbn ny. Giv det et filnavn (f.eks. AnchorMaps.mrc).
   1. Når lavdosistilstanden er aktiv, skal du indtaste Camera &; Script > Setup og sikre, at View og Preview er på samme binning (ellers kan de ikke gemmes i den samme fil).
   2. Besøg punkter på de firkantede kort ved at klikke på Navigator-vinduet > Gå til XYZ.
   3. Vælg en position for det første tomogrammer med markøren. Tag et eksempelbillede, og finjuster placeringen ved at trække med højre museknap. Vælg derefter Navigator vindue > Nyt kort, og klik ja til dialogen for at gemme. Tag derefter et visningsbillede af det samme område og gem igen som et nyt kort. Sørg for, at Vis kort er fremhævet, og markér For ankertilstand i vinduet Navigator øverst til højre.
   4. Vælg den anden position, tag igen en forhåndsvisning og finjuster placeringen som ovenfor, og tryk denne gang på Anchor Map i navigatorvinduet. Dette gemmer både Preview og View som nye kort i Navigator.
   5. Gentag trin 5.5.4 for alle de ønskede placeringer. Flyt fra et gitterkvadrat til et andet ved at markere punktet og trykke på Gå til XYZ i navigatorvinduet.
6. For referencefokus skal du vælge et klart område af gitteret og fokusere omhyggeligt, manuelt eller med autofokus. Tryk på Nulstil defokusering på mikroskoppanelet. Opret et script i SerialEM ved at klikke på Script > Rediger > Rediger 15 (eller et andet ledigt nummer), og indtast to linjer: ScriptName SetDefocus og SetDefocus 0.
7. I vinduet Navigator skal du markere den første placering (enten Eksempel eller Vis). Tryk på Skift-T, fremhæv derefter den sidste placering, og tryk igen på Skift-T. Dialogboksen Filegenskaber åbnes. Vælg enkeltrammebilleder og parametre, der skal gemmes, herunder filnavnet. Rediger filnavnet, men lad elementetiketten stå i slutningen.
   BEMÆRK: Filnavne, der ender på tal, opdateres automatisk for efterfølgende vippeserier. Det er praktisk at bruge indstillingen Navigator-menu > Nav. Indstillinger > Brug vareetiketter i filnavne.
8. Derefter åbnes menuen Tilt Series Setup automatisk. Udfyld som før (figur 6), men vælg ikke Finjuster eucentricitet. Eksempelpunkterne i navigatoren markeres nu som TS. Man kan vende tilbage til denne menu ved hjælp af knappen i navigatorvinduet over varelisten.
9. Vælg menuen Navigator > Hent på emner. Denne gang skal du vælge parametre for Endelige data. Vælg Primær handling: Hent vippeserier , og vælg Administrer Dewars/Vacuum, Rejuster to Item, Fine Eucentricitet og Kør script før handling med S-cripttil at køre: SetDefocus. Vælg generelle indstillinger: ingen meddelelsesboks, når der opstår fejl , og luk søjleventiler i slutningen, og tryk derefter på GO (figur 11). SerialEM vil nu besøge alle ankerkortene og registrere en vippeserie på hver position (figur 12).

6. CLEM kort registrering (Forbedring #2)

1. Hvis det ikke allerede er gjort, skal du indlæse hele gittermontagen i hovedvinduet og derefter oprette et nyt vindue ved at klikke på Vindue > nyt vindue og give det et navn. Bemærk, at den fulde gittermontage vises i registrering 1.
2. Importer CLEM-kortbilledet ved at klikke på menuen Navigator > Importer kort. Det skal gå ind i registrering 2. Det kan også tildeles et nyt vindue som ovenfor.
3. Undersøg CLEM-kortet for at bestemme den relative rotation i forhold til den fulde gittermontage. Det er nemmest at gøre dette på et kort, hvor gitterbjælkerne vises. Bemærk, at kortet også kan vendes. Juster det nogenlunde ved hjælp af Navigator-menuen > Roter kort, med Vend, hvis det er nødvendigt.
   BEMÆRK: Følgende trin kan også rumme en flip, men at gøre det på forhånd gør følgende meget lettere. Dette trin kan gentages, indtil linjeføringen ser tilfredsstillende ud, men det er ikke nødvendigt at være præcis.
4. Indfør registreringspunkter for præcis justering. Placer et antal tilsvarende punkter på det ene og derefter det andet vindue. For hvert sådant punkt skal du kontrollere registreringspunktet øverst i Navigator-vinduet. Tilsvarende punkter vil blive mærket med et stigende indeks efterfulgt af R1 eller R2 for henholdsvis gittermontagen eller det importerede kort.
   BEMÆRK: Brug af findergitre gør dette trin meget enkelt. Ellers skal du vælge udfyldte funktioner som midtermærket eller hjørnerne af gitterfirkanter. I princippet er tre punkter tilstrækkelige til en grov linjeføring, men flere punkter hjælper med at kompensere for mindre uoverensstemmelser i montagekonstruktionerne.
5. Hvis der ønskes flere kanaler på et CLEM-kort, f.eks. forskellige fluorescerende farver eller fluorescens uden en lys feltbaggrund, skal du importere dem som i trin 6.2 ovenfor og ændre registreringerne til 2. På denne måde arver de registreringspunkterne fra det første kort.
6. Indfør registrering med Navigator-menuen > Transformér elementer. De tilsvarende registreringspunkter vises nu på alle kort, som vil blive vist i Registrering 1. For at justere visuelt skal du klikke på menuen Navigator > Roter kort. Bemærk, at når et kort indlæses fra navigatorvinduet, roteres det ikke automatisk, medmindre afkrydsningsfeltet Roter, når indlæsning er markeret. Det kan altid drejes fra Navigator-vinduet.
7. Det skulle nu være muligt at placere markøren eller et punkt på fluorescenskortet og flytte scenen til det tilsvarende sted på gitteret (figur 13).

7.3D genopbygning

1. Dette involverer de samme grundlæggende trin som TEM-tomografi: justering af hældningsserien efterfulgt typisk af tilbageprojektion. Flere softwareplatforme er tilgængelige, og dataene kan behandles på samme måde som TEM-data med den undtagelse, at CTF-korrektion bør springes over.
2. Anvend intensitetsnormaliseringer for at øge bidraget fra fremskrivninger med høj hældning eller for at afbalancere en ændring i belysningen under serien med det forbehold, at kvantitativ information påvirkes. IMOD²⁶ fungerer for eksempel godt, mens AreTomo²⁷ er meget nyttig til fiducial-less justering; hvor fiduciale partikler er til stede, kan ClusterAlign²⁸ følge dem som klynger snarere end individuelle pletter; dette er især nyttigt for STEM-data, hvor pletter kan gå tabt eller skjules af funktioner med høj kontrast.
3. Følg rekonstruktionen med 3D-deconvolution²⁹ for kontrastforbedring og denoising. Når de er rekonstrueret, repræsenterer STEM-volumendataene ved hjælp af en af standardmetoderne, såsom orthoslices eller isosurface-segmentering. Især intensitetsfordelingen er unipolær uden kontrastinversioner eller Fourier-frynser, der vises i konventionel fasekontrast-TEM. Et interessant middel til repræsentation af STEM-tomogrammer generelt er at invertere det lyse felt (figur 14). Effekten er "røntgenøjne", der ser de tætte genstande af interesse gennem den klarede celle³⁰.

Representative Results

En komplet gittermontage udarbejdet i STEM viser områderne med celler af interesse (figur 4). Bemærk, at billedet er i mørkt felt, så tomme huller ser mørke ud. Cellerne fremstår delvist lyse, hvor elektronerne er spredt mod HAADF-detektoren. På de tykkeste dele, typisk centrene eller i nærheden af gitterbjælkerne, bliver kontrasten mørk igen. Dette skyldes flere spredninger, hvorved elektronerne når vinkler, der ikke er fanget af detektoren. I praksis vil disse områder være for tykke til tomografi.

Den næste fase omfatter kort over mellemforstørrelse (figur 10). Disse kaldes ofte mellemstore montagekort eller firkantede kort, der henviser til gitterfirkanterne snarere end formen. Selv i den laveste mikroprobe STEM-tilstand erhverves de også som montagebilleder. Ved at klikke på elementet i Navigator-vinduet indlæses kortbilledet i hovedvinduet. Specifikke punkter for tomogram erhvervelse er valgt inden for dette område. Brug eksempeltilstand til at finde området ved optagelsesforstørrelsen. Husk, at der kan være et sideværts skift mellem Vis og Optag, afhængigt af scanningshastighederne. En enkelt vippeserie kan optages her. Mitokondrier kan for eksempel ofte identificeres i billedet Vis og optag (figur 12).

For batchtomografi vil scenen rejse rundt i gitteret og muligvis ikke vende tilbage til nøjagtigt det samme sted. Ankerkort bruges til at sikre, at de ønskede postområder identificeres pålideligt igen ved at matche eksempelbilledet med en visning med lavere forstørrelse, selvom scenebevægelsen er skiftet. PyEM^23,24 tilbyder et hurtigere alternativ, der bestemt anbefales^, men som endnu ikke er en del af standardinstallationen.

I CLEM-tilgangen kan et fluorescenskort bruges til at identificere interesseområderne for tomografi. Fluorescensen erhverves eksternt og skal registreres på den fulde gittermontage. Det er nyttigt at have gitterbjælkerne og hullerne synlige, så en fusioneret fluorescens + lysfeltkomposit kan fremstilles før import, for eksempel i GIMP (https://www.gimp.org) eller ImageJ^31-software (sørg for, at ImageJ inverterer den lodrette akse). Når fluorescensens dynamiske område er stort, kan det være svært at skabe en sådan fusion uden mætning. I dette tilfælde kan de to kort importeres separat og derefter registreres sammen som beskrevet (figur 13). På denne måde bringer et punkt på fluorescenskortet i Navigator-vinduet efterfulgt af "Gå til XY" scenen til den tilsvarende position på gitteret som monteret i TEM. Pas på, at små uoverensstemmelser i oprettelsen af montagen (eller fluorescenskortet, hvis det også er en montage) vil føre til små forskydninger; For optimal præcision bør fluorescensen derfor genregistreres specifikt til det firkantede kort. Det er ofte tilstrækkeligt at foretage denne registrering med øjet på grundlag af huller i støttefilmen eller funktioner, der deles med det lyse feltlysbillede.

Rekonstruktion af vippeserien resulterer i et 3D-volumen (figur 14). Dette eksempel har en pixelstørrelse på 2,042 nm, hvilket resulterer i et synsfelt på ~4 μm. Calciumphosphataflejringer (orange pilespidser) skiller sig ud på grund af det højere atomnummer sammenlignet med det omkringliggende. Mikrotubuli (røde pilespidser) kan spores i hele synsfeltet. Også de indre og ydre mitokondriemembraner (grønne pilespidser) kan tydeligt ses. Actin kan observeres som bundter eller som individuelle filamenter. For at opnå en mere isotrop opløsning kan rekonstruktionen behandles ved dekonvolution.

Figur 1: Sammenligning af TEM versus STEM. I TEM oplyses synsfeltet af en nærparallel stråle, og objektivlinsen danner et forstørret billede på kameraet. For cryo-TEM åbnes objektivblænden for at passere de spredte elektronbølger (stiplede røde linjer), som med defokusering producerer fasekontrast ved interferens med de uspredte (grønne) bølger. STEM rasler derimod en fokuseret stråle over prøven og samler de spredte elektroner på en pixel-for-pixel måde. Flere detektorer kan indsamle elektroner spredt til forskellige vinkler. Dette tal er ændret fra³⁰. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 2: Eksempel på billedforvrængning i venstre side på grund af den høje scanningshastighed. Bemærk forvrængningen markeret med gule pilespidser samt de forvrængede ovale formede huller i Quantifoil. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 3: Montageopsætningsdialog for hele gittermontagen. Vælg forstørrelsen og antallet af stykker i X og Y, så det samlede areal når omkring 2.000 μm for at få et kort over det meste af gitteret. Vælg også Flyt fase i stedet for at skifte billede og Brug montagetilknytning, ikke Optag parametre. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 4: Gitterkort med fuld lav forstørrelse optaget i STEM-tilstand. Brudte områder vises helt sorte i billedet med det mørke felt. Mørkegrå områder er sandsynligvis for tykke og dårligt forglassede. Gode kandidatområder til tomografi er hvide eller lysegrå i denne scanning. Skalabjælke = 100 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 5: Skift til markørproces. Et genkendeligt objekt er markeret på kortet med lav opløsning med Tilføj punkter (38 på dette billede). Bemærk skiftet mellem kortet med lav opløsning (grøn cirkel) og kortet med medium opløsning (orange cirkel). Derefter markeres objektet med markøren (grønt kryds, rød cirkel), og dialogboksen Skift til markør startes. Den valgte indstilling flytter alle kort på 245x med samme beløb. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 6: Dialogboksen Opsætning af vippeserier for en STEM-vippeserie. Det dosissymmetriske skema anvendes fra -60° til +60° i trin på 2°. Autofokus springes over på grund af den høje dybdeskarphed, når du bruger en lav konvergensvinkel. Ingen grund til at forfine eucentricitet, da dette er blevet gjort før. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 7: Dialog med filegenskaber for kort med medium opløsning. Gem som en MRC-stakfil, vælg heltal, og gem ekstra oplysninger i en .mdoc-metadatafil. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 8: Montageopsætningsdialog til lagring af kort med medium opløsning. For en firkant på et 200 maskegitter, som er 90 μm bredt, anbefales et samlet areal på mindst 90 μm x 90 μm. Vælg Flyt fase i stedet for at skifte billede og Brug visningsparametre i lavdosistilstand. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 9: Optagelse af kort med medium opløsning. Dialogboksen Hent på elementer til optagelse af kort med medium opløsning. Vælg Tilknytning, Hent og gem billede eller montage, og marker Opret navigatorkort. I Opgaver før eller efter Primær skal du vælge Grov og fin Eucentricitet. Når du ikke får hjælp, kan du vælge Ingen meddelelsesboks, når der opstår fejl og Luk søjleventiler i slutningen. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 10: Billede af kort med mellemopløsning. Kort med medium opløsning (Square Map) optaget i STEM-tilstand ved en montage på 3 x 3. De to ankerkort med medium opløsning til dataindsamling er angivet med de blå firkanter. Skalabjælke = 10 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 11: Data for batchhældningsserier. Dialogboksen Hent på varer til indsamling af batchhældningsserier. For dataindsamling af vippeserier skal du vælge Endelige data og Hent vippeserier. Under Opgaver før eller efter Primær skal du markere Administrer Dewars/Vacuum (vælg relevante indstillinger i menuen Opsætning), Juster igen til element, Fin eucentricitet og Kør script før handling. I indstillingerne Generelt skal du markere afkrydsningsfeltet Ingen meddelelse, når der opstår fejl og Luk søjleventiler i slutningen (se 5.14). Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 12: 0° hældning af en STEM-hældningsserie af et mitokondrie. Orange pilespidser peger på calciumphosphataflejringer (matrixgranulater), grønne pilespidser til cristae og røde pilespidser til 15 nm guldfiducialmarkører. Skalastang = 500 nm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 13: Registrerede cryo-CLEM-kort. (A) STEM-kort med medium opløsning (kvadratisk kort, 26-A) er registreret til (B) STEM-kort med lav opløsning, (C) BF-kanalkryo-FM-kort og (D) GFP-kanalkryo-FM-kort. De ni registreringspunkter (etiket 4-21) vises i (E) Navigator. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 14: Gengivelse af lydstyrke. Volumengengivelse af (A) 60 nm og a (B) 40 nm tykke profiler gennem et SIRT-lignende (30 cyklusser) filtreret tomogram i forskellige dybder. Pixelstørrelsen er 2.048 nm, hvilket resulterer i et synsfelt på ca. 4 μm. Bemærk den inverterede tæthed sammenlignet med figur 12, hvilket betyder, at højintensitetsfunktioner er lyse. Orange, hvide, røde, grønne og lyseblå pilespidser peger på calciumphosphataflejringer, ribosomer, mikrotubuli, henholdsvis den indre og ydre mitokondriemembran og actinfilamenter. Skalastang = 500 nm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Discussion

Protokollen skal hjælpe biovidenskabelige mikroskopister, der er interesserede i at opnå en 3D-visning af intracellulære organeller i områder af cellen, der ikke er tilgængelige for konventionel TEM-tomografi. Den samme protokol kan også anvendes til STEM-tomografi af plastsektioner med lempede begrænsninger for eksponeringen. Protokollen bør betragtes som et udgangspunkt snarere end et sæt hårde regler. Faktisk er kraften i STEM dens fleksibilitet; Der er ingen rigtig måde at betjene det på.

Vi understreger, at STEM i sig selv kun refererer til den scannede sonde og ikke definerer billeddannelsen. Kontrast afhænger primært af konfigurationen af detektorer. De mere enkle metoder anvender detektorer med aksial symmetri, enten en disk centreret på den optiske akse eller en annulus omkring den. Generelt, når belysningen rammer detektoren direkte, optager vi et BF-billede, hvor prøven (elektronspredning) ser mørk ud; omvendt, når detektoren kun samler spredte elektroner, optager vi et DF-billede, hvor den tætte prøve ser lys ud. Når passende hardware er tilgængelig, kan SerialEM erhverve og optage begge disse signaler samtidigt. Stadig mere sofistikerede konfigurationer er tilgængelige, lige fra detektorer med flere segmenter til fuldt pixelerede kameraer. Fasekontrastbilleddannelse kan opnås ved at evaluere forskellen mellem detektorelementer uden for aksen^32,33. Indsamling af hele 2D-spredningsmønsteret (diffraktion) pr. pixel definerer metoden kendt som 4D STEM³⁴, som muliggør rekonstruktion af flere billedkontraster fra de samme originale data. Firedimensionel STEM muliggør elektronptychografi, hvilket giver et andet middel til at opnå fasekontrast³⁵.

Vi har fokuseret på den særlige STEM-modalitet, som vi anser for at være mest nyttig til undersøgelse af organeller og intakte celler eller mikrontykke cellesektioner. Dette indebærer specifikt brugen af BF-billeddannelse med en lille semikonvergensvinkel i belysningen og en relativt stor opsamlingsvinkel ved detektoren. Den lille konvergens giver en stor dybdeskarphed, så hele prøven forbliver i fokus gennem hele hældningsserie¹⁹. I praksis kan det med et godt mikroskopstadium også eliminere behovet for fokusjustering under erhvervelsen. Prisen er et kompromis i opløsning, som beskrevet i afsnit 3 i protokollen. Vi har foreslået 4k-billeder med en sonde på ~ 2 nm, som med 1 nm pixelafstand når et synsfelt på 4 μm. Læseren opfordres dog kraftigt til at eksperimentere. Den anden overvejelse er på detektorens side. Når belysningsskiven underfylder BF-detektoren på aksen, undertrykkes fasekontrasten, og kontrasten til spredning (amplitude) dominerer; Denne tilstand er blevet kaldt usammenhængende lysfeltkontrast³⁶. Spørgsmålet er, hvilken brøkdel der skal underfyldes, og svaret afhænger af prøven. En meget tynd prøve vil vise den bedste kontrast med detektoren helt fyldt (dvs. opsamlingsvinklen svarer til belysningen), men en tykkere prøve vil sprede al intensiteten væk og efterlade et støjende signal med dårlig kontrast. En nyttig tommelfingerregel er, at jo tykkere prøven er, jo større skal BF-detektorens ydre afskæringsvinkel være²¹. Detektorens størrelse og position er naturligvis fast, så diffraktionsskivens størrelse justeres ved hjælp af kameralængden, som beskrevet i afsnit 1. Hvis detektorforstærkerindstillingerne er sådan, at signalet fylder det dynamiske område, men ikke mættes under direkte belysning (1.12.3), kan kameralængden øges, indtil en rimelig signalintensitet og kontrast er nået. Igen opfordres læseren til at eksperimentere. Kunsten ligger så at sige i vinklerne.

En anden parameter, der ikke diskuteres i protokollen, er mikroskopaccelerationsspændingen. Interaktion mellem de lysende elektroner og prøven vil være stærkere ved en lavere spænding. Med alt andet lige kan vi forvente højere kontrast ved lavere spænding. På den anden side er det begyndelsen af flere spredninger inden for prøven, der begrænser den anvendelige prøvetykkelse, så en højere spænding tillader brugen af tykkere prøver. Disse virkninger er dog ret subtile. Vores hidtidige erfaringer med 200 kV og 300 kV accelerationer er ens.

I betragtning af hvad der kan forventes af STEM med hensyn til opløsning, afhænger dette igen af prøven og detektorkonfigurationen. Ved hjælp af en enkelt partikelanalysemetode kunne metalioner på ferritin lokaliseres ved ringformet mørkt felt STEM med en præcision på nogle få angstrom³⁷. For nylig blev subnanometeropløsning opnået for virus- og proteinprøver ved hjælp af billeder opnået ved integreret differentialfasekontrast (iDPC) STEM³² samt ptychografi³⁵. For unikke objekter i tykke cellulære prøver, og med de metoder, der er beskrevet her, er sådan høj opløsning ikke realistisk. Den optimale opløsning er sondediameteren, der vedrører halvkonvergensvinklen som beskrevet. Andre faktorer vil forringe opløsningen, især en grov pixelprøveudtagning for at nå et stort synsfelt, forskydninger i vippeserien og spredning af sondestrålen i transmission. Billeder sammenligner godt med plastiksektiontomografi. Med opsætningen beskrevet her skulle det for eksempel være let at se den hule kerne af mikrotubuli, men ikke de enkelte protofilamenter.

For at opsummere er STEM-metoder og hardware begge i en udviklingsfase. Vi kan forvente, at innovationer inden for billeddannelse også vil påvirke tomografi og føre STEM til domæner, der ikke har været tilgængelige med andre teknikker. Vi forventer, at en konvergens med korrelativ kryogen fluorescensbilleddannelse baseret på moderne optiske superopløsningsmetoder vil være særlig frugtbar. Skalaen af organeller, 100-1.000 nm, er et ideelt mål for disse nye metoder.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
SerialEM	University of Colorado	Veriosn 4.0	SerialEM is a free software platform for microscope control and data acquisition.
STEM-capable transmission electron microscope			The protocol was written based on experience with several microscopes of Thermo Fisher Scientific: Titan Krios, Talos Arctica, and Tecnai T20-F. In principle it should be applicable to other manufacturers as well.