Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Visualisering av organeller in situ ved kryo-STEM-tomografi

Published: June 23, 2023 doi: 10.3791/65052
Automatic Translation
1, 1, 2, 1
1Department of Chemical and Biological Physics, Weizmann Institute of Sciences, 2Department of Chemical Research Support, Weizmann Institute of Sciences

Summary

Kryo-STEM-tomografi gir et middel til å visualisere organeller av intakte celler uten innebygging, seksjonering eller andre invasive preparater. Den oppnådde 3D-oppløsningen ligger for tiden i området noen få nanometer, med et synsfelt på flere mikrometer og en tilgjengelig tykkelse i størrelsesorden 1 μm.

Abstract

Kryogen elektronmikroskopi (kryo-EM) er avhengig av avbildning av biologiske eller organiske prøver innebygd i deres opprinnelige vandige medium; Vann størknes til et glass (dvs. vitrifisert) uten krystallisering. Kryo-EM-metoden er mye brukt til å bestemme strukturen av biologiske makromolekyler nylig ved en nær atomoppløsning. Tilnærmingen har blitt utvidet til studiet av organeller og celler ved hjelp av tomografi, men den konvensjonelle modusen for bredfeltsoverføring EM-avbildning lider av en alvorlig begrensning i prøvetykkelsen. Dette har ført til en praksis med å frese tynne lameller ved hjelp av en fokusert ionstråle; Den høye oppløsningen oppnås ved subtomogram gjennomsnitt fra rekonstruksjonene, men tredimensjonale relasjoner utenfor det gjenværende laget går tapt. Tykkelsesbegrensningen kan omgås ved skannet sondebildebehandling, som ligner på skanning EM eller konfokal laserskanningsmikroskop. Mens skanning av transmisjonselektronmikroskopi (STEM) i materialvitenskap gir atomoppløsning i enkeltbilder, krever følsomheten til kryogene biologiske prøver for elektronbestråling spesielle hensyn. Denne protokollen presenterer et oppsett for kryotomografi ved hjelp av STEM. Den grunnleggende topiske konfigurasjonen av mikroskopet er beskrevet for både to- og tre-kondensatorsystemer, mens automatisering leveres av den ikke-kommersielle SerialEM-programvaren. Forbedringer for batchoppkjøp og korrelativ justering til tidligere ervervede fluorescenskart er også beskrevet. Som et eksempel viser vi rekonstruksjonen av en mitokondrion, som peker på den indre og ytre membranen og kalsiumfosfatgranulatet, samt omkringliggende mikrotubuli, aktinfilamenter og ribosomer. Kryo-STEM-tomografi utmerker seg ved å avsløre organellteateret i cytoplasma og i noen tilfeller til og med den nukleære periferien av adherente celler i kultur.

Introduction

Tredimensjonal (3D) visualisering av organeller er en viktig oppgave i moderne cellebiologi. Gitt skalaene som er involvert, alt fra titalls nanometer for sekretoriske vesikler til mange mikron for cellekjernen, er det utfordrende å finne en enkelt mikroskopiteknikk som passer til alle applikasjoner. Mens moderne fluorescensmikroskopi kan spenne over mye av området når det gjelder oppløsning, vises bare de merkede molekylene. Det cellulære teatret forblir riket for elektronmikroskopi. Konvensjonelle metoder for kjemisk fiksering, plastinnstøping og farging med tungmetaller er sterkt invasive, så resultatene kan avhenge av detaljene i prøveprepareringen. Cryo-EM, derimot, er begrenset av behovet for å vitrifisere det vandige medium; Iskrystaller som danner diffrakterer elektronbelysningen, noe som forårsaker kontrastartefakter med høyere kontrast enn det organiske materialet av interesse.

Det siste tiåret har sett en spredning av EM-bildebehandlingsteknikker utviklet eller tilpasset for cellulære studier1. Høytrykksfrysing kombinert med iterativ fokusert ionstråle (FIB) fresing og seriell overflateavbildning ved hjelp av skanningelektronmikroskopet (dvs. FIB-SEM) er for tiden den valgte metoden for store prøver2. Kryogen myk røntgentomografi (cryo-SXT) er egnet for prøver av flere mikron i størrelse, begrenset av den karakteristiske absorpsjonslengden til de myke røntgenstrålene i vann 3,4,5. Denne skalaen inneholder mange intakte celletyper, og den kvantitative naturen til røntgenabsorpsjonskontrasten legger til et aspekt av konsentrasjonsmåling6 eller spektroskopi7. Når det kombineres med subtomogramgjennomsnitt, gir kryotransmisjonselektrontomografi (kryo-ET), basert på fasekontrasttransmisjonselektronmikroskopi (TEM), den høyeste oppløsningen for makromolekyler eller komplekser 8,9,10. Det er imidlertid sjelden at intakte organeller er så vanlige at de kan gjennomsnittes hele. Videre er den konvensjonelle modusen for bredfelt-TEM begrenset for prøvetykkelse til noen få hundre nanometer ved kombinasjonen av uelastisk spredning (som involverer energitap) i prøven og kromatisk aberrasjon i den magnetiske objektivlinsen11,12. Den store energispredningen dikterer bruken av et energifilter for å fjerne den resulterende ufokuserte disen, men den følsomme prøven lider fortsatt av strålingsskade mens bildesignalet blir eksponentielt svakere med økende tykkelse.

Den alternative avbildningsmodusen, scanning transmission EM (STEM), omgår behovet for energifiltrering og beholder de uelastisk spredte elektronene for bildedannelse, om enn for tiden i en lavere oppløsning enn for TEM-tomografi (figur 1). Faktisk dannes ikke noe ekte bilde. I stedet, som i en skanning EM, blir målinger gjort punkt for punkt, og bildet er samlet av datamaskinen. Forstørrelsen bestemmes bare av størrelsen på skannetrinnene uten å endre linsestrømmene. Når det er riktig konfigurert, kan det nyttige prøvetykkelsesområdet for kryo-STEM-tomografi (CSTET) nå 1,5 eller til og med 2 μm, selv om komfortsonen, der den nyttige signalintensiteten forblir en betydelig del av belysningen, er rundt 600-900 nm11,13. Dette er tilstrekkelig til å se en stor del av cytoplasma, og av og til en kant av cellekjernen. I praksis finner vi at vitrifisering ved standardmetoden for å stupe ned i kryogen væske legger en strengere begrensning på tykkelsen enn STEM-avbildning. Målet med denne videoartikkelen er å lette innlemmelsen av CSTET i verktøykassen for celle- og organellavbildning i forskningslaboratorier og mikroskopianlegg.

Den første utfordringen er at mikroskopoperasjoner i CSTET ennå ikke er standardisert for biovitenskapelige applikasjoner på samme måte som de har vært for kryo-TEM-tomografi. STEM-maskinvare har sjelden (eller aldri) vært målrettet mot kryo-EM-markedet. Dette endrer seg imidlertid med den nyeste generasjonen mikroskoper, og mange eksisterende verktøy kan ettermonteres. STEM som teknikk har tatt av og i stor grad tatt over i materialvitenskapene, hvor det også er spirende interesse for kryogene og lavdosemetoder14,15. Materialvitenskapslitteraturen florerer med akronymer BF-STEM, ADF-STEM, HAADF-STEM, 4D-STEM, DPC-STEM, etc., som legger til forvirringen. Vi tilbyr her et anbefalt utgangspunkt som, i vår kollektive erfaring ved Weizmann Institute of Science, gir den mest generelle protokollen for nyttige resultater basert på bright field (BF) STEM-avbildning16. På ingen måte eksos det eller til og med utforske omfanget av muligheter, men det vil tjene som grunnlag for ytterligere forbedringer. Mens vi legger vekt på kryo-STEM, er det meste av protokollen like relevant for romtemperatur STEM-tomografi av plast-innebygde seksjoner.

Essensen av STEM er å skanne prøven med en fokusert elektronsonde (figur 1), belysningskjeglen, og å registrere signaler fra diffraksjonsplanet (spredning) i overføring, piksel for piksel, for å produsere 2D-bilder17,18. Amorfe prøver, inkludert de fleste cellulære materialer, vil produsere et diffust spredningsmønster i overføring. Den enkleste praktiske STEM-konfigurasjonen er å plassere en sirkulær detektor for å registrere den sentrale disken (dvs. sondebelysningen som vil bli overført uten prøve). Prøven sprer elektroner bort fra denne belysningskjeglen i den grad signalet avtar. Dette gir et BF-bilde - prøven ser mørk ut på en lys bakgrunn. En ringformet detektor kan også (eller i stedet) brukes til å oppdage spredningen fra prøven utenfor belysningskjeglen. Når prøven er fjernet, er det ikke noe signal. Når et eksemplar er på plass, vises objekter lyse på en mørk bakgrunn i bildet av det mørke feltet (DF). Nomenklaturen for STEM (BF, ringformet mørkt felt [ADF], høyvinklet ringformet mørkt felt [HAADF], etc.) refererer hovedsakelig til områdene av innsamlingsvinkler for detektorene.

Konvergensvinkelen til belysningen representerer en viktig tilpasning av STEM til cellulær tomografi. Når toppprioriteten er høy oppløsning, bør konvergensvinkelen være så stor som mulig. (Dette ligner på konfokal laserskanningsmikroskopi; oppløsningen bestemmes av sondediameteren, som skalerer som bølgelengden dividert med den numeriske blenderåpningen. Merk at vi refererer til halvvinkel- eller halvkonvergensvinkelen for EM.) Når prioriteten er dybdeskarpheten, derimot, gir et kompromiss i oppløsning en stor fordel, da den fokuserte strålen forblir omtrent parallell i en avstand som er lik to ganger bølgelengden delt på halvvinkelkvadrat. Ideelt sett forblir hele cellevolumet i fokus19. For eksempel, ved 300 keV, er elektronen deBroglie bølgelengde 0, 002 nm, så en konvergens på 1 mrad gir en oppløsning på 2 nm og en dybdeskarphet på 4 mikron. Under disse forholdene kan tomografi utføres selv uten å fokusere under datainnsamlingsprosessen, men bare en gang i begynnelsen av oppkjøpet. En konvensjonell tomografi-stand STEM kan nå en semi-konvergens vinkel på 7 eller 8 mrad; Derfor kunne vi i prinsippet nå en oppløsning i størrelsesorden 0.25 nm, men da med en brennvidde på bare 62 nm. Dette er tydeligvis for tynt for cellulær bildebehandling. Mer avanserte mikroskoper med tre kondensatorlinser gir kontinuerlig justering av semi-konvergensvinkelen over et betydelig område. Med den mer tradisjonelle to-kondensatorkonfigurasjonen bestemmes konvergensen diskret av kondensatoråpningen (C2).

For robuste, plastinnebygde prøver kan man registrere en fokalserie ved hver tilt og kombinere dem for høy oppløsning20, men for kryogene prøver er strålingsbudsjettet for sterkt begrenset. Til slutt, når man veier fordelene med BF- eller DF-avbildning, for tykke prøver, bør man vurdere effekten av flere elastiske spredning i prøven. BF-signalet er mindre ødelagt av flere spredninger og viser en høyere oppløsning for tykke prøver16,21.

En nyttig tommelfingerregel har vært å sette samlingsvinkler flere ganger større enn konvergens. Jo tykkere prøven er, desto større skal samlingsdisken være. For liten disk vil gi lav signalintensitet; For stor disk vil føre til dårlig bildekontrast, da bare spredning med høyest vinkel vil bidra. Oppsamlingsvinklene bør optimaliseres for en gitt prøve. Detektorvinklene som funksjon av (diffraksjon) kameralengde må kalibreres uavhengig. De kan vises praktisk av mikroskopprogramvaren. I praksis er en faktor på to til fem i forholdet mellom innsamling og belysningshalvvinkler, henholdsvis θ og α (figur 1), et anbefalt utgangspunkt for CSTET av cellulære prøver.

Følgende protokoll beskriver STEM-tomografioperasjon ved hjelp av den populære SerialEM-programvaren for mikroskopkontroll22,23. SerialEM er ikke knyttet til en bestemt produsent, og den er mye brukt i TEM-tomografi. De fleste operasjonene i å sette opp for tomografi kan overføres direkte fra TEM. SerialEM-strategien er å modellere skannesystemet som et kamera. Dette muliggjør den enkle crossoveren fra TEM til STEM. Man bør imidlertid huske på at parametere som forstørrelse og binning er helt kunstige. De viktige parametrene er synsfeltet i mikron, antall piksler i synsfeltet og eksponeringstiden. Pikselavstanden, eller samplingen, er det lineære feltet delt på antall piksler, mens oppholdstiden er antall piksler delt på eksponeringstiden.

Minimumskonfigurasjonen for STEM og CSTET innebærer tre funksjoner på mikroskopet: en skannegenerator, en STEM-detektor og tomografikontrollprogramvare. Protokollen viser til nomenklaturen til FEI/Thermo Fisher Scientific (TFS), men begrepene er generiske. Den proprietære programvaren til TFS er beskrevet i JoVE for TEM24, og STEM-operasjonen er veldig lik.

Vi antar at mikroskopet har blitt justert på forhånd av serviceteamet eller erfarne medarbeidere, og at en kolonnejustering kan hentes opp ved å laste inn en fil. Mindre justeringer kalles direkte justeringer og kan lagres i såkalte FEG-registre (TFS-mikroskop). Direkte justeringer inkluderer rotasjonssenter, pivotpunkter, diffraksjonsjustering og kompensasjon for kondensator astigmatisme. Justeringer må utføres iterativt. Merk at TFS-mikroskoper implementerer forskjellige nanoprobe (nP) og mikrosonde (μP) modus; for en gitt kondensatoråpning gir disse et relativt smalt eller bredt synsfelt med parallell belysning i TEM og en mer eller mindre konvergent (tett fokusert) elektronstråle i STEM. Andre produsenter bruker forskjellige ordninger for å dekke rekkevidden av konvergensvinkler.

Før du starter, bør synsfeltet, L og prøvetakingen (pikselbredde), l, velges, avhengig av prøven som studeres. For eksempel, for l = 1 nm / piksel, bør et bilde på 4 000 x 4 000 piksler som dekker et synsfelt 4 μm2 velges. Oppløsningen vil i beste fall være det dobbelte av romlig prøvetaking, så 2 nm, og sondediameteren, d, skal samsvare med det. Kalibrering av sondevinkelen er utenfor omfanget av denne protokollen, så vi antar at en tabell eller en skjermavlesning er tilgjengelig. Sondediameteren er omtrent elektronbølgelengden dividert med halvkonvergensvinkelen (i radianer): d = λ/θ. Bølgelengden, λ, er 0,002 nm for 300 keV og 0,0025 nm for 200 keV elektroner, så θ på 1 mrad vil gi en punktdiameter på henholdsvis 2 eller 2,5 nm.

Protokollen presenteres i en progresjon av økende kompleksitet. Den første oppgaven er å produsere et STEM-bilde, som avhenger av mikroskopprodusentens programvare, og deretter en vippeserie, som vi bruker SerialEM til. Mange lesere vil utvilsomt være kjent med SerialEM, så de mer kompliserte oppgavene kommer naturlig. Det er ikke nødvendig å følge prosedyrene strengt. Utviklingen knyttet til automatisering kan implementeres direkte for STEM så vel som for TEM. Erfarne brukere vil sannsynligvis invertere protokollen, som begynner med korrelativ registrering av fluorescenskart og fortsetter å sette opp batchtomografi. Ytterligere detaljer finner du i de omfattende dokumentasjons- og opplæringsbibliotekene for SerialEM selv, inkludert en nylig JoVE-artikkel om den siste utviklingen innen automatisering25.

Protocol

1. STEM-oppsett

  1. Foreløpige justeringer: Last inn kolonnejusteringsfilen, og åpne deretter kolonneventiler. Hvis du bruker en sideinngangskryoholder, åpner du Cryo-skjold. Start i TEM-modus. Strålen skal vises på skjermen. Hvis ikke, senk forstørrelsen.
  2. Bring mikroskopet til eusentrisk fokus ved å trykke på knappen på kontrollpanelet.
  3. Sett punktstørrelsen til en praktisk verdi (f.eks. 6) for å visualisere den fluorescerende skjermen, enten direkte eller med det innebygde kameraet (avhengig av mikroskopmodellen).
  4. Sett mikroskopet i STEM-modus og kontroller at fokus bruker kondensatorlinsene (intensiteten) i stedet for objektivet. Sett eusentrisk fokus. Gå deretter ut av diffraksjonsmodus for innledende justeringer.
  5. Forsikre deg om at strålen ikke er blank. Reduser forstørrelsen til strålen vises på skjermen. Juster stråleskiftet til midten og øk forstørrelsen i trinn opp til ca. 70 kx mens du holder strålen i midten.
  6. Sett inn ønsket kondensatoråpning, vanligvis 50 μm. Sjekk sentreringen av blenderåpningen. Når du vrir fokusknappen litt frem og tilbake, skal stedet utvide seg og trekke seg sammen, men forbli på plass, som om et fly kutter et imaginært vertikalt timeglass. Hvis blenderåpningen ikke er sentrert, vil belysningen skifte sideveis, som om timeglasset ble vippet.
  7. Bring strålen i fokus og trykk på Intensitetslistefokus (hvis tilgjengelig) i justeringsfanen, eller gå tilbake til eusentrisk fokus som i 1.2. Juster stråleposisjonen til midten.
  8. Juster rotasjonssenteret. Vri fokustrinnhjulet til minimum eller ett trinn over, slik at strålen pulserer forsiktig, og sørg for at den står stille når fokuset beveger seg opp og ned.
  9. Velg pivotpunktene og bring de to punktene sammen med X- og Y-justeringer.
    MERK: Hvis en faseplate er installert på et TFS-instrument, skal bare X-justeringen brukes.
  10. Defokuser strålen litt, og juster kondensatorstigmatorene for å gjøre disken rund. Gå opp og ned gjennom fokus for å optimalisere; Det bør ikke være noen tendens til å strekke seg i den ene eller den andre retningen når du passerer fokus.
  11. Normaliser linsene. Deretter øker du forstørrelsen gradvis til ca. 240 kx mens du bruker stråleskiftet for å holde punktet sentrert, og gjenta justeringene av rotasjonssenteret og dreiepunktet (trinn 1.6-1.8).
  12. Gå tilbake til diffraksjonsmodus. Strålen skal vises som en jevn disk på fluorescerende skjerm. Kameralengden (CL) styrer nå effektivt den optiske avstanden til detektoren, som i røntgenkrystallografi. Endre den og se på når disken trekker seg sammen og forstørres, som om skjermplasseringen ville bevege seg mot eller bort fra prøven. Denne kjeglen representerer BF-belysningen.
    MERK: For hver CL er det en diffraksjonsjustering som skal justeres for å bringe den projiserte strålen til sentralaksen. Det er normalt ikke nødvendig å avgrense dem alle, bare den ene (eller få) som skal brukes til deteksjon.
  13. Aktiver STEM-modus ved høy forstørrelse.
    1. Hvis en BF STEM-detektor er tilgjengelig, start med det. Ta scenen til et område med et tomt hull og juster diffraksjonsjusteringen for å sentrere strålen ved hjelp av ønsket CL.
    2. Mange mikroskoper er kun utstyrt med en HAADF-detektor; det er et triks for å bruke dette som en BF-detektor. Først trekker du detektoren, sentrerer strålen som ovenfor i de direkte justeringene, sett inn en objektiv blenderåpning, vanligvis en liten som 20 μm, og juster posisjonen for å omgi strålen jevnt. (Den enkleste måten å gjøre dette på er å sette inn et eksemplar eller et testrutenett for å se en glorie rundt belysningen). Bruk deretter diffraksjonsjusteringen til å flytte strålen utenfor aksen og inn på detektorområdet. Sett inn og trekk inn detektoren mens du ser på strålen på skjermen for å bekrefte at strålen er blokkert av detektoren.
    3. Start en skanning i mikroskopprogramvaren og juster innstillingene for lysstyrke og kontrast (B / C) slik at signalet er nær 0 når strålen er blank, og nær metning når full belysning faller på detektoren. Bruk omfangsvisningen for å hjelpe. Innstillingene kan kobles på uventede måter, så justeringen bør gjentas flere ganger.
  14. Returner mikroskopet til en relativt lav forstørrelse i registeret med høy forstørrelse (SA-modus), uten å gå i modus for lav mag (LM).
  15. Legg merke til skjermstrømmen for referanse senere (se trinn 3.1.1). Strømmen kan endres med pistollinsen og punktstørrelsesinnstillingene, som i TEM, med økende tall som tilsvarer redusert strøm.
  16. På dette tidspunktet lagrer du et FEG-register for å lette en retur til standardverdier.
    MERK: Anlegget kan forberede et standardsett med FEG-registre slik at brukere kan starte fra en fungerende konfigurasjon.

2. Plassering av prøven

  1. I LM TEM-modus må du kontrollere at rutenettet ikke er ugjennomsiktig. Finn en rutenettfirkant for å gjøre innledende justeringer. Det er praktisk å finne et tomt område, et hull eller et revet rutenett. Registrer sceneposisjonene for å komme tilbake til dem på en enkel måte.
  2. Ta prøven til eucentrisk høyde. Det er flere metoder for å gjøre dette. Du kan for eksempel bruke scenewobbleren til å vippe rutenettet mens du flytter prøvehøyden langs Z-aksen til bildet slutter å skifte sideveis. Alternativt kan du markere noen funksjoner på skjermen og vippe scenen til 30°. Funksjonen vil bevege seg sideveis. Juster prøvehøyden for å bringe den tilbake til opprinnelig posisjon. Øk forstørrelsen eller trinnhellingen for å finjustere. Gå tilbake til vipping på 0°.
  3. Gå tilbake til STEM-modus og sett inn STEM-detektoren. Gå til laveste SA-modus (høy forstørrelse). Forsikre deg om at et bilde blir observert på dataskjermen. Skann raskt for å unngå unødvendig eksponering; 1 μs/piksel eller mindre vil være typisk. Vær oppmerksom på at bildet kan virke forvrengt på venstre kant når skanningen er for rask (se figur 2).
  4. Trykk på Eucentric Focus, øk forstørrelsen og finjuster fokuset mens du skanner. Det er praktisk å bruke fokusluppen som tilbys av mikroskopprogramvaren.
  5. Tune kondensatoren astigmatisme. Dette kan gjøres mest presist ved Ronchigram-metoden. Med strålen over et tynt prøveområde, fokuser du på punktet der den overførte strålen blåser opp, mellom skyggebilder av prøven på hver side. Juster deretter kondensatorinnstillingen for å gjøre sentraldisken rund. Dette krever litt øvelse, spesielt for kryogene prøver.
    MERK: Et alternativ er å finne noen gullpartikler (ofte brukt som fiducial markører for justering i tomografi). Øk forstørrelsen og fokuset opp og ned, innstilling av astigmatismen slik at partiklene forblir runde uten forlengelse i begge retninger.
  6. Gå til LM STEM-modus og fortsett skanningen for å finne et interessant område. Juster detektorens B/C-innstillinger om nødvendig (trinn 1.13.3), omtrent på dette punktet.

3. Ta opp et bilde

  1. Beregn dosen for opptak. Som en tommelfingerregel, sikte på 100-150 e-/Å2 for hele tomogrammet. Kontroller dosetoleransen per prøve. Strømmen i Ampere (A) dividert med ladningen per elektron representerer et antall e-/s, som multipliseres med eksponeringstiden, T, i sekunder og divideres med synsfeltet i Å2. For enkelhets skyld, uttrykk strømmen i nanoampere (som lest fra skjermen), bredden på synsfeltet i mikrometer og rammeeksponeringstiden i sekunder, med passende faktorer:
    Equation 1
    Dette tallet skal multipliseres med antall vipper for å få den totale eksponeringen i serien. For eksempel, med en strøm I = 0,04 nA, et felt L = 4 μm, og en eksponeringstid på 12 s, får vi 1,9 e-/Å 2 per tilt, eller ca. 110 e-/Å2 for en serie på 61 fremskrivninger.
  2. Sett scenen tilbake til et hull (eller trekk inn rutenettet) og juster strålestrømmen ved hjelp av punktstørrelse og/eller pistollinseinnstillinger for å nå ønsket skjermstrøm. Hvis målingen viser 0, setter du inn en større C2-blenderåpning for å øke strømmen. Deretter korrigerer du ved å dele målingen med kvadratet av forholdet mellom diametre, og til slutt gå tilbake til den mindre blenderåpningen.
  3. Finjuster B / C-innstillingene i henhold til trinn 1.13.3, og til slutt returner scenen til et område av interesse og kontroller direkte justeringer og astigmatisme under bildeforholdene.
  4. Skaff deg et testbilde.

4. Tomografi med SerialEM

  1. Start SerialEM-serveren på mikroskopdatamaskinen (SerialEM er vanligvis installert på en annen). Åpne deretter SerialEM. STEM vises i SerialEM som et kamera, med samme grensesnitt. Kontroller at kommunikasjonen kjører som den skal for oppsettet. For eksempel skal mikroskopfanen vise riktig forstørrelse. Hvis dette ikke virker, stopp her og feilsøk.
  2. Finn kategorien kamera og skript og åpne Oppsett. Forsikre deg om at STEM-kameraet er valgt, og velg passende binning og oppholdstider for hver modus. Forsikre deg om at riktig detektor (eller detektorer) vises i boksen "kanaler for å anskaffe" nederst til venstre. Trykk på Acquire nederst for å teste. Igjen, ikke fortsett hvis ingenting skjer, eller hvis strålen ikke tømmes. Stopp og sjekk kommunikasjonen.
    MERK: Modusene brukes på samme måte som TEM-tomografi. Binning er en kunstighet for kompatibilitet med TEM. Den viktige parameteren er pikselantallet; Ulike mikroskopsystemer bruker forskjellig binning for å nå samme telling.
    1. Visning og søk bør være raske skanninger med relativt få piksler (f.eks. 512 x 512 piksler ved 1 s).
    2. Fokus er vanligvis et lite område med raske opptak. I lavdosemodus velger du derfor Fokus for å være i en annen forstørrelse enn opptaksmodus, noe som kan hjelpe til med nøyaktighet. La spotstørrelsen være uendret.
    3. For opptaksmodus bruker du parameterne som er valgt ovenfor i eksponeringsestimeringen. Hvis tilgjengelig, velger du også Dynamisk fokus, som korrigerer fokus linje for linje i et skråstilt bilde.
    4. For enkelhets skyld senere velger du binning for forhåndsvisning som skal være identisk med den for View (se Ekstrautstyr #1, trinn 5.5). Bildestørrelsen (antall piksler) trenger ikke være den samme.
    5. Bruk prøvemodus til å holde Post-området midtstilt under anskaffelsen. Det kan ligne på View, men pass på at det ikke er noen skanneforvrengninger på venstre side av rammen (se figur 2 for et eksempel). Igjen, i lavdosemodus, kan prøveversjonen ha en annen forstørrelse enn i opptaksmodus.
    6. Bruk Montage-modus umiddelbart for rutenettskanningen. Det bør være tilstrekkelig pikseltett til å finne områder av interesse; Anbefaling: 512 x 512 eller 1024 x 1024. Forsikre deg om at bildet er bra, med et anstendig dynamisk område (sett i bildevisningskontroller), da denne modusen brukes til å finne prøveområdene.
    7. Lagre innstillingsfilen slik at disse valgene beholdes som standard for neste økt (som kan skje snart i tilfelle programmet krasjer).
  3. Test kalibreringene av bildeskift og trinnskift. I mikroprobe (eller nanoprobe) -modus, klikk på Vis bilde, hold musepekeren over den, hold knappen nede og dra diagonalt med omtrent en fjerdedel av synsfeltet. Ta deretter en annen visning. Bildene skal overlappe perfekt. Gjenta ved å dra igjen mens du holder nede Skift-tasten (for å fremtvinge en scenebevegelse). Bildene skal overlappe godt, men kanskje mindre presist.
  4. Gå til LM-modus og test sceneskiftet. Hvis disse testene mislykkes, stopp og feilsøk. Resten vil ikke fungere.
  5. Lag en montasje LM kart over hele rutenettet. Dette kan også gjøres i TEM.
    1. Gå til STEM-modus med laveste forstørrelse der bildet ikke blokkeres av blenderåpninger, vanligvis rundt 185x.
    2. Klikk Navigator-menyen > Åpne. Klikk deretter Navigator-menyen > Nav. Alternativer > fjerne merket for Konverter kart til byte.
    3. Velg Navigator-menyen > Montaging &; Rutenett > Oppsett Full Montage. En meny åpnes. Alternativene som skal kontrolleres er: Flytt trinn i stedet for å skifte bilde, Lag kart fra hver montasje hvis Navigator er åpen , og Bruk Montage-tilordning, ikke Registrer parametere. Bilderutenettet bør være omtrent 6 x 6 eller 7 x 7. Se etter det totale området som skal registreres. Hvis det kreves for mange bilder, kan det hende at forstørrelsen ikke leses riktig fra mikroskopet (figur 3). Stopp og sjekk.
    4. For å starte Montage-anskaffelsen, trykk Start på Montage Controls eller Montage under Camera & Script. En annen meny åpnes for å velge filparametere: mrc, lagre som heltall, og i enda en dialogboks, velg filnavnet for lagring. Sørg for å lagre data i det passende dataområdet og ikke under SerialEMs egne brukerinnstillinger. Det anbefales ikke å lagre store data på C-disken der systemet ligger.
    5. Når oppkjøpet er fullført, vises montasjen i hovedvinduet (figur 4). Man kan nå navigere rundt i rutenettet ved hjelp av markøren og punktene på navigatøren, akkurat som i TEM.
  6. Kontroller astigmatismekorreksjonen på nytt. Vanligvis er det tilstrekkelig å skanne et lite område raskt og justere sammen med fokuset slik at punktlignende funksjoner som gullnanopartikler forblir helt runde når de passerer inn og ut av fokus (som på en SEM) ved høy forstørrelse. Mer konservativt kan man gjenta de direkte justeringene av trinn 1,5-1,8 før man fikser astigmatisme.
  7. Juster avbildningen med høy forstørrelse til LM-montasjen.
    1. Gå til en posisjon på LM-montasjen med noen lett gjenkjennelige funksjoner. Legg til et punkt, klikk på Navigator-vinduet > Legg til poeng, og klikk på funksjonen. Trykk igjen (slutt å legge til) for å deaktivere.
    2. Ta et visnings- eller prøvebilde ved laveste HM-forstørrelse (High Mag) og finn det angitte elementet. Plasser markøren der (grønt kryss), og med det tilsvarende punktet uthevet i Navigator-vinduet, i Navigator-menyen > Skift til markør ..., i dialogboksen som åpnes, velg Alle kart og Lagre Skift, som vist i figur 5.
    3. Test ved å flytte scenen til andre posisjoner og kontrollere at HM-bildet er sentrert på de samme stedene som er valgt i LM-montasjen. Hvis funksjonen ikke er synlig i HM-bildet, kan skiftet mellom LM- og HM-modus være for stort. I dette tilfellet lager du en polygonmontasje over et større område. Klikk Navigator-vinduet > Legg til polygon, velg noen punkter, og klikk deretter Legg til mangekant på nytt for å lukke. Klikk Navigator-menyen > Montaging og rutenett > Oppsett Polygonmontasje og Montasjekontroller > Start. Finn deretter tilsvarende punkter som ovenfor og klikk Skift til markør ....
  8. Sett opp lavdosemodus.
    1. Åpne kategorien Lav dosekontroll og merk av for Lav dosemodus .
    2. Merk av for Kontinuerlig oppdatering og gå til Vis. Velg mikroskopforstørrelse for denne modusen, vanligvis den laveste eller ved siden av den laveste. Velg hver av de neste modusene og angi riktig forstørrelse. Opptaket bør settes for å oppnå ønsket pikselstørrelse, og fokusforstørrelsen bør være høy nok til at fiducialmarkører eller andre funksjoner med høy kontrast for fokusering vil bli tydelig løst. Fjern deretter merket for Kontinuerlig oppdatering.
      MERK: Prøvemodus kan enten angis på samme måte som Record, i så fall må sporingsområdet forskyves fra opptaksområdet for å minimere eksponeringen, eller til lav forstørrelse, som omfatter mye av omgivelsene.
    3. Ta et visningsbilde og angi prøveposisjonen ved hjelp av Definer posisjonen til området: Prøveversjon.
      MERK: Anbefaling #1: Gitt endringen i prøveområdet og tiden, kan den ekstra eksponeringen for en lav mag-prøve være minimal. Så lenge rutenettlinjen ikke kommer inn i synsfeltet, er denne sporingsmetoden vanligvis mer pålitelig. Anbefaling #2: Det er også mulig å oppdatere punktstørrelsen for å justere dosen for forskjellige moduser, for eksempel Fokus. For stabilitet i mikroskopets optikkinnstillinger anbefaler vi at du ikke gjør dette, men heller lar punktstørrelsen være slik den passer for Record, og deretter justere eksponeringstiden om nødvendig for raskere skannemoduser.
    4. Klikk på kategorien Lav dosekontroll > Gå til: Rec., og klikk deretter på Navigator-menyen > Åpne bildetilstander > Legg til nåværende tilstand. Gi den et navn slik at den lett kan hentes frem (f.eks. μP STEM for mikrosonde STEM). Ulike tilstander kan defineres for ulike oppgaver.
  9. Flytt scenen til et sted av interesse for tomografi (mer om bruk av navigatøren nedenfor).
    1. Legg til et punkt i navigatoren ved å klikke på Navigator-vinduet > Legg til punkt.
    2. Finjuster den eusentriske høyden ved å velge Aktiviteter > Eucentrisitet > Grov. Navigator-vinduet > Oppdater Z.
    3. Angi områdene for Fokus og Prøveversjon. Først tar du et visningsbilde. Deretter, i kategorien Lav dosekontroll , under Definer posisjon av område, velger du Fokus eller Prøveversjon. Juster posisjonene for de to områdene langs vippeaksen. Fokus bør ikke overlappe opptaksområdet.
      MERK: Husk at det er noe overskyting, spesielt i venstre kant, så ingen av dem bør settes rett ved siden av Record-området. Omfanget av overskytingen kan evalueres på et testområde ved å skanne gjentatte ganger ved postforstørrelsen, og deretter redusere forstørrelsen for å få en bredere visning.
  10. For godt mål (valgfritt med erfaring) vipper du scenen til +60° og deretter -60° hver gang du tar et visnings- eller forhåndsvisningsbilde for å sikre at rutenettlinjen ikke kommer inn i synsfeltet Opptaksområde som vises i grønt.
  11. Sett opp vippeserien.
    1. Åpne en ny fil for å lagre dataene ved å klikke Fil > Åpne ny og velg et filnavn. Velg menyen Vippeserie-> Oppsett for vippeserier (Oppsett for vippeserie) (figur 6). Feilsøking: Hvis Åpne ny-knappen er grå, må du kontrollere at den forrige vippeserien er avsluttet. Hvis ikke, avslutt ved å klikke Tilt Series > Terminate.
    2. Angi de ekstreme hellingsvinklene i boksene Vipp til og Avslutt ved boksene, vanligvis henholdsvis -60° og +60°, samt intervallet, vanligvis 2°.
    3. For den symmetriske dosemodusen (anbefalt - sørg for at lavdosemodusen fortsatt er aktiv), sjekk Kjør-serien i to retninger fra ___. Emnet er normalt 0, men kan brukes til å kompensere for forhåndsvippede FIB-lameller (f.eks. ved 20°).
    4. For enkelhets skyld, sjekk Hold eksponeringstiden konstant. Endring av dette krever noe omarbeiding av eksponeringsberegningen og kan også forstyrre algebraiske rekonstruksjoner (f.eks. ART/SART/SIRT), som sammenligner anslått intensitet med originaldata (se trinn 7.1).
    5. Merk av for Hopp over autofokus. En liten semi-konvergensvinkel, for eksempel 1 mrad, innebærer en så lang dybdeskarphet at det kan være unødvendig å fokusere. Som en test fokuserer du på 0°, vipper til 60° eller -60° og trykker på Record. Å opprettholde fokus er først og fremst et spørsmål om presis eusentrisk høyde. For større konvergens kan det være nødvendig å fokusere i løpet av serien. I dette tilfellet ta en visning, og i kategorien Lav dosekontroll , definer posisjonen til område og fokus, og juster fokusområdet.
    6. Innledende og endelige handlinger: Hvis eusentrisk høydejustering ble utført nøyaktig, er det ikke nødvendig å gjenta det. Fjern merket for Lukk kolonneventiler på slutten av serien, med mindre det er god grunn til ikke å gjøre det.
    7. For sporing av kontrollparametrene er det mange alternativer. For uovervåket datainnsamling er topp prioritet å unngå at programmet stopper for brukerinngang. Bruk de anbefalte innstillingene: gjenta Registrer hvis prosentandelen av feltet som er tapt, er mer enn 5. Deretter sporer du etter og merker av for Juster med forhåndsvisning før du får ny sporreferanse og Få ny sporreferanse hvis oppføringsjusteringen varierer med 2 %. For overvåket datainnsamling, bruk strengere parametere for å unngå risikoen for å miste timer med instrumenttid.
    8. Når du er klar til å starte, trykker du på GO nederst i vinduet. På slutten velger du Vippeserie > Avslutt.

5. Batch oppkjøp på flere punkter ved hjelp av Navigator (Enhancement # 1)

MERK: Protokollen er rudimentær fordi a) den er identisk med TEM og b) nye verktøy blir tilgjengelige som sannsynligvis vil gjøre en fullstendig beskrivelse foreldet.

  1. Legg hele rutenettmontasjen til hovedvinduet.
  2. Velg en rekke områder som ser lovende ut. Klikk Legg til punkt , og legg det til i midten av de valgte rutene. Klikk Legg til punkt igjen for å deaktivere modusen.
  3. Når lavdose-bildetilstanden er aktivert, velger du Navigator-vinduet > merker av for Hent og ny fil ved element for hver av de valgte rutene. For det første åpnes en dialogboks for filegenskapene (figur 7) og deretter filnavnet. Velg Montasjerte bilder, og merk deretter av for Bruk visningsparametere i lavdosemodus i dialogboksen Montasjeoppsett (figur 8) og gjør et rutenett stort nok til å dekke kvadratet (omtrent 100 x 100 μm).
  4. Klikk på Navigator-menyen > Skaff på elementer og velg parametrene for kartlegging. Viktigst av alt, i Primære handlinger, sjekk Lag Navigatorkart, deretter Grov eusentrisitet og Fin eusentrisitet, og trykk på Go (figur 9). For et rutenett på 200 nett vil dette resultere i et kart over omtrent hele kvadratet (figur 10)
  5. Forbered deg på valg av tomogramposisjon. Åpne en ny fil ved å klikke Fil > Åpne ny. Gi den et filnavn (for eksempel AnchorMaps.mrc).
    1. Når lavdosemodus er aktiv, går du til Kamera og skript > Oppsett og kontrollerer at Visning og Forhåndsvisning er i samme binning (ellers kan de ikke lagres i samme fil).
    2. Besøk punkter i de firkantede kartene ved å klikke Navigator-vinduet > Gå til XYZ.
    3. Velg en posisjon for det første tomogrammet med markøren. Ta et forhåndsvisningsbilde og finjuster posisjonen ved å dra med høyre museknapp. Velg deretter Navigator-vinduet > Nytt kart, og klikk ja til dialogboksen for å lagre. Deretter tar du et Vis-bilde av det samme området og lagrer igjen som et nytt kart. Kontroller at Vis kart er uthevet, og se etter ankertilstand i Navigator-vinduet øverst til høyre.
    4. Velg den andre posisjonen, ta igjen en forhåndsvisning og avgrens plasseringen som ovenfor, og denne gangen trykker du på ankerkart i Navigator-vinduet. Dette lagrer både forhåndsvisningen og visningen som nye kart i navigatoren.
    5. Gjenta trinn 5.5.4 for alle de ønskede stedene. Flytt fra en rutenettfirkant til en annen ved å velge punktet og trykke Gå til XYZ i Navigator-vinduet.
  6. For referansefokus, velg et tydelig område i rutenettet og fokuser nøye, for hånd eller med autofokus. Trykk på Tilbakestill ufokusert på mikroskoppanelet. Opprett et skript i SerialEM ved å klikke Skript > Rediger > Rediger 15 (eller et annet fritt nummer) og skriv inn to linjer: ScriptName, SetDefocus og SetDefocus 0.
  7. I Navigator-vinduet markerer du den første plasseringen (enten Forhåndsvisning eller Vis). Trykk på Shift-T og deretter den siste plasseringen, og trykk igjen på Shift-T. Dialogboksen Filegenskaper åpnes. Velg bilder og parametere med én ramme du vil lagre, inkludert filnavnet. Rediger filnavnet, men la elementetiketten være på slutten.
    MERK: Filnavn som slutter på tall, oppdateres automatisk for påfølgende vippeserier. Det er praktisk å bruke alternativet Navigator-menyen > Nav. Alternativer > bruke elementetiketter i filnavn.
  8. Deretter åpnes oppsettmenyen for Tilt Series automatisk. Fyll som før (figur 6), men ikke velg Avgrens eusentrisitet. Forhåndsvisningspunktene i navigatoren vil nå bli merket som TS. Man kan gå tilbake til denne menyen ved hjelp av knappen i Navigator-vinduet over elementlisten.
  9. Velg Navigator-menyen > Skaff på elementer. Denne gangen velger du parametere for Endelige data. Velg Primærhandling: Hent vippeserier og velg Administrer Dewars/Vakuum, Juster til element, Fin eusentrisitet og Kjør skript før handling, med Script å kjøre: SetDefocus. Velg generelle alternativer: ingen meldingsboks når det oppstår feil , lukk kolonneventilene på slutten, og trykk deretter på GO (figur 11). SerialEM vil nå besøke alle ankerkartene og registrere en vippeserie på hver posisjon (figur 12).

6. CLEM kart registrering (Ekstrautstyr # 2)

  1. Hvis det ikke allerede er gjort, laster du inn hele rutenettmontasjen i hovedvinduet, og oppretter deretter et nytt vindu ved å klikke på Vindu > nytt vindu og gi det et navn. Merk at hele rutenettmontasjen vises i registrering 1.
  2. Importer CLEM-kartbildet ved å klikke Navigator-menyen > Importer tilknytning. Det skal gå inn i registrering 2. Det kan også tildeles et nytt vindu som ovenfor.
  3. Inspiser CLEM-kartet for å bestemme den relative rotasjonen med hensyn til hele rutenettmontasjen. Det er enklest å gjøre dette på et kart der rutenettstolpene vises. Merk at kartet også kan bli snudd. Juster det grovt ved hjelp av Navigator-menyen > Roter kart, med Vend om nødvendig.
    MERK: Følgende trinn kan også romme en flip, men å gjøre det på forhånd gjør følgende mye enklere. Dette trinnet kan gjentas til justeringen ser tilfredsstillende ut, men det er ikke nødvendig å være presis.
  4. Introduser registreringspunkter for presis justering. Plasser et antall tilsvarende punkter på det ene og deretter det andre vinduet. For hvert slikt punkt, sjekk Registreringspunkt helt øverst i Navigator-vinduet. Tilsvarende punkter vil bli merket med en stigende indeks, etterfulgt av R1 eller R2 for henholdsvis rutenettmontasjen eller importert kart.
    MERK: Bruk av finder-rutenett gjør dette trinnet veldig enkelt. Ellers velger du solide funksjoner som midtmarkøren eller hjørnene på rutenettfirkanter. I prinsippet er tre poeng tilstrekkelig for en grov justering, men flere poeng bidrar til å kompensere for mindre feilpasninger i montasjekonstruksjonene.
  5. Hvis du ønsker flere kanaler i et CLEM-kart, for eksempel forskjellige fluorescerende farger eller fluorescens uten lys feltbakgrunn, importerer du disse som i trinn 6.2 ovenfor, og endrer registreringene til 2. På denne måten vil de arve registreringspunktene fra det første kartet.
  6. Pålegg registrering etter Navigator-menyen > Transformer elementer. De tilsvarende registreringspunktene vil nå vises på alle kart, som vil bli oppført i registrering 1. For å justere visuelt, klikk Navigator-menyen > Roter kart. Vær oppmerksom på at når et kart lastes inn fra Navigator-vinduet, roteres det ikke automatisk med mindre det er merket av for Roter når innlasting . Den kan alltid roteres fra Navigator-vinduet.
  7. Det skal nå være mulig å plassere markøren eller et punkt på fluorescenskartet og flytte scenen til tilsvarende sted på rutenettet (figur 13).

7.3D Rekonstruksjon

  1. Dette innebærer de samme grunnleggende trinnene som TEM-tomografi: justering av vippeserien etterfulgt vanligvis av tilbakeprojeksjon. Flere programvareplattformer er tilgjengelige, og dataene kan behandles på samme måte som TEM-data, med unntak av at CTF-korreksjon skal hoppes over.
  2. Bruk intensitetsnormaliseringer for å forbedre bidraget fra høye tiltprojeksjoner eller for å balansere en endring i belysning i løpet av serien, med forbehold om at kvantitativ informasjon påvirkes. IMOD26 fungerer for eksempel bra, mens AreTomo27 er veldig nyttig for fiducial-less justering; der fiducialpartikler er til stede, kan ClusterAlign28 følge dem som klynger i stedet for individuelle flekker; Dette er spesielt nyttig for STEM-data der flekker kan gå tapt eller skjules av funksjoner med høy kontrast.
  3. Følg rekonstruksjon med 3D-dekonvolusjon29 for kontrastforbedring og støyfjerning. Når de er rekonstruert, representerer du STEM-volumdataene ved hjelp av en av standardmetodene, for eksempel ortoslicer eller isooverflatesegmentering. Spesielt er intensitetsfordelingen unipolar, uten kontrastinversjoner eller Fourierfrynser som vises i konvensjonell fasekontrast TEM. En interessant måte å representere STEM-tomogrammer generelt på er å invertere det lyse feltet (figur 14). Effekten er "røntgenøyne", å se de tette gjenstandene av interesse gjennom den avklarte cellen30.

Representative Results

En full grid montasje utarbeidet i STEM viser områdene med celler av interesse (figur 4). Legg merke til at bildet er i mørkt felt, så tomme hull virker mørke. Cellene ser delvis lyse ut, der elektronene er spredt mot HAADF-detektoren. På de tykkeste delene, vanligvis sentrene eller i nærheten av rutenettstengene, blir kontrasten mørk igjen. Dette skyldes flere spredninger, hvor elektronene når vinkler som ikke fanges opp av detektoren. I praksis vil disse områdene være for tykke for tomografi.

Neste trinn innebærer kart over mellomforstørrelse (figur 10). Disse kalles ofte middels montasjekart, eller firkantede kart, og refererer til rutenettrutene i stedet for formen. Selv i den laveste mikrosonden STEM-modus, vil de også bli anskaffet som montasjebilder. Ved å klikke på elementet i Navigator-vinduet lastes kartbildet inn i hovedvinduet. Spesifikke punkter for tomogramoppkjøp er valgt innenfor dette området. Bruk forhåndsvisningsmodus for å finne området ved opptaksforstørrelsen. Husk at det kan være en sideforskyvning mellom forhåndsvisning og opptak, avhengig av skannehastighetene. En enkelt vippeserie kan registreres her. Mitokondrier kan for eksempel ofte identifiseres i forhåndsvisnings- og opptaksbildet (figur 12).

For batchtomografi vil scenen reise rundt rutenettet og kan ikke komme tilbake til nøyaktig samme sted. Ankerkart brukes til å sikre at de ønskede postområdene identifiseres på en pålitelig måte ved å tilpasse forhåndsvisningsbildet til en visning med lavere forstørrelse, selv om trinnbevegelsen er forskjøvet. PyEM23,24 tilbyr et raskere alternativ som absolutt anbefales, men er ennå ikke en del av standardinstallasjonen.

I CLEM-tilnærmingen kan et fluorescenskart brukes til å identifisere områdene av interesse for tomografi. Fluorescensen anskaffes eksternt og må registreres på hele rutenettmontasjen. Det er nyttig å ha gitterstengene og hullene synlige, slik at en sammenslått fluorescens + lysfeltkompositt kan fremstilles før import, for eksempel i GIMP (https://www.gimp.org) eller ImageJ31-programvare (pass på at ImageJ inverterer den vertikale aksen). Når fluorescensens dynamiske område er stort, kan det være vanskelig å lage en slik sammenslåing uten metning. I slike tilfeller kan de to kartene importeres hver for seg og deretter registreres sammen som beskrevet (figur 13). På denne måten bringer et punkt på fluorescenskartet i Navigator-vinduet, etterfulgt av "Go To XY", scenen til den tilsvarende posisjonen på rutenettet som montert i TEM. Pass på at små uoverensstemmelser i opprettelsen av montasjen (eller fluorescenskartet, hvis det også er en montasje) vil føre til små forskyvninger; Derfor, for optimal presisjon, bør fluorescensen omregistreres spesifikt til det firkantede kartet. Det er ofte tilstrekkelig å gjøre denne registreringen med øye, på grunnlag av hull i støttefilmen eller funksjoner som deles med det lyse feltlysbildet.

Rekonstruksjon av vippeserien resulterer i et 3D-volum (figur 14). Dette eksemplet har en pikselstørrelse på 2,042 nm, noe som resulterer i et synsfelt på ~4 μm. Kalsiumfosfatavsetninger (oransje pilspisser) skiller seg ut på grunn av det høyere atomnummeret sammenlignet med omgivelsene. Mikrotubuli (røde pilspisser) kan spores gjennom hele synsfeltet. Også de indre og ytre mitokondriemembranene (grønne pilspisser) kan tydelig ses. Aktin kan observeres som bunter eller som individuelle filamenter. For å oppnå en mer isotrop oppløsning kan rekonstruksjonen behandles ved dekonvolusjon.

Figure 1
Figur 1: Sammenligning av TEM versus STEM. I TEM er synsfeltet opplyst av en nesten parallell stråle, og objektivlinsen danner et forstørret bilde på kameraet. For cryo-TEM åpnes objektivåpningen for å passere de spredte elektronbølgene (stiplet rød linje), som med defokus produserer fasekontrast ved interferens med de uspredte (grønne) bølgene. STEM, derimot, rasterer en fokusert stråle over prøven og samler de spredte elektronene på en piksel-for-piksel måte. Flere detektorer kan samle elektroner spredt til forskjellige vinkler. Dette tallet er endret fra30. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Eksempel på bildeforvrengning på venstre side på grunn av den høye skannefrekvensen. Legg merke til forvrengningen markert med gule pilspisser, så vel som de forvrengte ovalformede hullene i Quantifoil. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Montasjeoppsettdialog for hele rutenettmontasjen. Velg forstørrelse og antall brikker i X og Y slik at det totale arealet når rundt 2,000 μm for å få et kart for det meste av rutenettet. Velg også Flytt fase i stedet for å skifte bilde og Bruk montasjetilordning, ikke Registrer parametere. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Rutenettkart med full lav forstørrelse registrert i STEM-modus. Ødelagte områder vises helt svarte i det mørke feltbildet. Mørkegrå områder er sannsynligvis for tykke og dårlig vitrifiserte. Gode kandidatområder for tomografi er hvite eller lysegrå i denne skanningen. Skala bar = 100 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: Skift til markørprosess. Et gjenkjennelig objekt er markert i kartet med lav oppløsning med Legg til punkt (38 i dette bildet). Legg merke til skiftet mellom kartet med lav oppløsning (grønn sirkel) og kartet med middels oppløsning (oransje sirkel). Deretter markeres objektet med markøren (grønt kryss, rød sirkel), og dialogboksen Skift til markør startes. Det valgte alternativet flytter alle kart med samme mengde 245x med samme mengde. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 6
Figur 6: Oppsettdialog for vippeserier for en STEM-vippeserie. Det dosesymmetriske skjemaet brukes fra -60° til +60° i trinn på 2°. Autofokus hoppes over på grunn av den høye fokusdybden når du bruker en lav konvergensvinkel. Ingen grunn til å avgrense eusentrisitet da dette har blitt gjort før. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 7
Figur 7: Dialogboks for filegenskaper for kart med middels oppløsning. Lagre som en MRC-stakkfil, velg heltall, og lagre ekstra informasjon i en .mdoc-metadatafil. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 8
Figur 8: Dialogboks for montasjeoppsett for lagring av kart med middels oppløsning. For et kvadrat på et 200 mesh rutenett, som er 90 μm bredt, anbefales et samlet areal på minst 90 μm x 90 μm. Velg Flytt fase i stedet for å skifte bilde og Bruk visningsparametere i lavdosemodus. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 9
Figur 9: Opptak av mellomoppløsningskart. Skaff deg på elementer dialog for opptak av middels oppløsning kart. Velg Kartlegging, Skaff og lagre bilde eller montasje, og merk av for Lag navigatørkart. I Oppgaver før eller etter Primær velger du Grov og Fin eusentrisitet. Når det ikke er assistert, velger du eventuelt Ingen meldingsboks når det oppstår feil og Lukk kolonneventiler på slutten. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 10
Figur 10: Bilde av kart med middels oppløsning. Kart med middels oppløsning (kvadratisk kart) tatt opp i STEM-modus med en montasje på 3 x 3. De to ankerkartene med middels oppløsning for datainnsamling er angitt med de blå firkantene. Skala bar = 10 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 11
Figur 11: Data for batchvippeserier. Skaff deg på elementer dialog for å samle batch tilt serien. For datainnsamling i vippeserier velger du Endelige data og Hent vippeserie. På Oppgaver før eller etter Primær, merk av for Administrer Dewars/Vacuum (velg passende innstillinger i Oppsett-menyen), Juster til element, Fin Eucentricity og Kjør skript før handling. I de generelle alternativene merker du av for Ingen meldingsboks når det oppstår feil og Lukk kolonneventiler på slutten (se 5.14). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 12
Figur 12: 0° tilt av en STEM-tiltserie av en mitokondrion. Oransje pilspisser peker på kalsiumfosfatavsetninger (matriksgranulat), grønne pilspisser til cristae og røde pilspisser til 15 nm gullfiducialmarkører. Skala bar = 500 nm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 13
Figur 13: Registrerte kryo-CLEM-kart. (A) STEM-kart med middels oppløsning (kvadratisk kart, 26-A) er registrert på (B) STEM-kart med lav oppløsning, (C) BF-kanalkryo-FM-kart og (D) GFP-kanalkryo-FM-kart. De ni registreringspunktene (etikettene 4-21) vises i (E) Navigator. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 14
Figur 14: Volumgjengivelse. Volumgjengivelse av (A) 60 nm og et (B) 40 nm tykt snitt gjennom et SIRT-lignende (30 sykluser) filtrert tomogram på forskjellige dybder. Pikselstørrelsen er 2.048 nm, noe som resulterer i et synsfelt på omtrent 4 μm. Vær oppmerksom på den inverterte tettheten sammenlignet med figur 12, noe som betyr at høyintensitetsfunksjonene er lyse. Oransje, hvite, røde, grønne og lyseblå pilspisser peker på kalsiumfosfatavsetninger, ribosomer, mikrotubuli, henholdsvis indre og ytre mitokondriemembran og aktinfilamenter. Skala bar = 500 nm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Discussion

Protokollen skal hjelpe biovitenskapelige mikroskopister som er interessert i å få en 3D-visning av intracellulære organeller i regioner av cellen som ikke er tilgjengelige for konvensjonell TEM-tomografi. Den samme protokollen kan også brukes for STEM-tomografi av plastseksjoner, med avslappede begrensninger på eksponeringen. Protokollen bør betraktes som et utgangspunkt snarere enn et sett med harde regler. Faktisk er kraften til STEM dens fleksibilitet; Det er ingen riktig måte å betjene den på.

Vi understreker at STEM i seg selv kun refererer til den skannede sonden og ikke definerer bildedannelsen. Kontrasten avhenger hovedsakelig av konfigurasjonen av detektorer. De mer enkle metodene benytter detektorer med aksial symmetri, enten en disk sentrert på den optiske aksen eller et ringrom som omgir den. Generelt, når belysningen treffer detektoren direkte, registrerer vi et BF-bilde der (elektronspredning) prøven ser mørk ut; Omvendt, når detektoren bare samler spredte elektroner, registrerer vi et DF-bilde der det tette eksemplaret ser lyst ut. Når egnet maskinvare er tilgjengelig, kan SerialEM anskaffe og registrere begge disse signalene samtidig. Enda mer sofistikerte konfigurasjoner er tilgjengelige, alt fra detektorer med flere segmenter til fullt pikselerte kameraer. Avbildning av fasekontrast kan for eksempel oppnås ved å evaluere forskjellen mellom off-axis detektorelementer32,33. Innsamling av hele 2D-spredningsmønsteret (diffraksjon) per piksel definerer metoden kjent som 4D STEM34, som muliggjør rekonstruksjon av flere bildekontraster fra de samme opprinnelige dataene. Firedimensjonal STEM muliggjør elektronptykografi, som gir et annet middel for å oppnå fasekontrast35.

Vi har fokusert på den spesielle STEM-modaliteten som vi anser for å være mest nyttig for studiet av organeller og intakte celler eller mikrontykke celleseksjoner. Dette innebærer spesifikt bruk av BF-avbildning med liten semi-konvergensvinkel i belysningen og en relativt stor oppsamlingsvinkel ved detektoren. Den lille konvergensen gir stor dybdeskarphet slik at hele prøven forblir i fokus gjennom hele vippeserien19. I praksis, med et godt mikroskopstadium, kan det også eliminere behovet for fokusjustering under oppkjøpet. Prisen er et kompromiss i oppløsning, som beskrevet i punkt 3 i protokollen. Vi har foreslått 4k-bilder med en sonde på ~ 2 nm, som med 1 nm pikselavstand når et synsfelt på 4 μm. Leseren oppfordres imidlertid sterkt til å eksperimentere. Det andre hensynet er på siden av detektoren. Når belysningsdisken underfyller BF-detektoren på aksen, undertrykkes fasekontrast og spredning (amplitude) kontrast dominerer; Denne tilstanden har blitt kalt usammenhengende lysfeltkontrast36. Spørsmålet er hvilken brøkdel som skal underfylles, og svaret avhenger av utvalget. En veldig tynn prøve vil vise best kontrast med detektoren fullstendig fylt (dvs. oppsamlingsvinkelen som samsvarer med belysningen), men en tykkere prøve vil spre all intensiteten bort, og etterlate et støyende signal med dårlig kontrast. En nyttig tommelfingerregel er at jo tykkere prøven er, desto større er den ytre grensevinkelen til BF-detektoren21. Detektorens størrelse og posisjon er selvfølgelig fast, så størrelsen på diffraksjonsdisken justeres ved hjelp av kameralengden, som beskrevet i avsnitt 1. Hvis innstillingene for detektorforsterkeren er slik at signalet fyller det dynamiske området, men ikke metter under direkte belysning (1.12.3), kan kameralengden økes til en rimelig signalintensitet og kontrast er nådd. Igjen oppfordres leseren til å eksperimentere. Kunsten ligger så å si i vinklene.

En annen parameter, som ikke er omtalt i protokollen, er mikroskopets akselerasjonsspenning. Samspillet mellom de lysende elektronene og prøven vil bli sterkere ved lavere spenning. Med alt annet likt kan vi forvente høyere kontrast ved lavere spenning. På den annen side er det utbruddet av flere spredninger i prøven som begrenser den brukbare prøvetykkelsen, så en høyere spenning tillater bruk av tykkere prøver. Disse effektene er imidlertid ganske subtile. Våre erfaringer så langt med 200 kV og 300 kV akselerasjoner er like.

Med tanke på hva som kan forventes av STEM når det gjelder oppløsning, avhenger dette igjen av prøven og detektorkonfigurasjonen. Ved hjelp av en enkelt partikkelanalysetilnærming kunne metallioner på ferritin lokaliseres med ringformet mørkt felt STEM til en presisjon på noen få angstrom37. Mer nylig ble sub-nanometeroppløsning oppnådd for virus- og proteinprøver ved hjelp av bilder oppnådd ved integrert differensialfasekontrast (iDPC) STEM32 samt ptykografi35. For unike objekter i tykke cellulære prøver, og med metodene beskrevet her, er så høy oppløsning ikke realistisk. Den optimale oppløsningen er sondediameteren, som relaterer seg til semi-konvergensvinkelen som beskrevet. Andre faktorer vil redusere oppløsningen, spesielt en grov pikselsampling for å nå et stort synsfelt, feiljusteringer i vippeserien og spredning av sondestrålen i overføring. Bilder sammenligner godt med plastseksjonstomografi. Med oppsettet beskrevet her, for eksempel, bør det være lett å se den hule kjernen i mikrotubuli, men ikke de enkelte protofilamentene.

For å oppsummere er både realfagsmetoder og maskinvare i en utviklingsfase. Vi kan forvente at innovasjoner innen bildebehandling også vil påvirke tomografi, og føre STEM inn i domener som ikke har vært tilgjengelige med andre teknikker. Vi forventer at en konvergens med korrelativ kryogen fluorescensavbildning basert på moderne optiske superoppløsningsmetoder vil være spesielt fruktbar. Skalaen av organeller, 100-1000 nm, er et ideelt mål for disse nye metodene.

Disclosures

Forfatterne oppgir ingen interessekonflikter.

Acknowledgments

Vi er svært takknemlige for den kontinuerlige og konstante støtten fra forfatteren og vedlikeholderen av SerialEM-programvarepakken, David Mastronade, og Günther Resch. PK ble finansiert av Austrian Science Fund (FWF) gjennom et Schrödinger Fellowship J4449-B. For formålet med åpen tilgang har forfatterne brukt en CC-BY offentlig opphavsrettslisens til enhver forfatterakseptert manuskriptversjon som oppstår fra denne innsendingen. M.E. og S.G.W. anerkjenner finansiering fra Israel Science Foundation, grant no.1696/18, og fra European Union Horizon 2020 Twinning-prosjektet, ImpaCT (grant no.857203). M.E. anerkjenner finansiering fra ERC i CryoSTEM-prosjektet (grant no. 101055413). ME er den sittende av Sam og Ayala Zacks professorstol og leder av Irving og Cherna Moskowitz Center for Nano og Bio-Nano Imaging. Laboratoriet til ME har dratt nytte av den historiske generøsiteten til Harold Perlman-familien. Vi anerkjenner også finansieringen fra EU. Synspunkter og meninger som uttrykkes er imidlertid bare forfatterens/forfatternes, og reflekterer ikke nødvendigvis synspunktene til EU eller Det europeiske forskningsrådets utøvende organ. Verken EU eller den bevilgende myndighet kan holdes ansvarlig for dem.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
 SerialEM University of Colorado Veriosn 4.0 SerialEM is a free software platform for microscope control and data acquisition. 
STEM-capable transmission electron microscope The protocol was written based on experience with several microscopes of Thermo Fisher Scientific: Titan Krios, Talos Arctica, and Tecnai T20-F. In principle it should be applicable to other manufacturers as well.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Elbaum, M. Expanding horizons of cryo-tomography to larger volumes. Current Opinion in Microbiology. 43, 155-161 (2018).
  2. Schertel, A., et al. Cryo FIB-SEM: Volume imaging of cellular ultrastructure in native frozen specimens. Journal of Structural Biology. 184 (2), 355-360 (2013).
  3. Do, M., Isaacson, S. A., McDermott, G., Le Gros, M. A., Larabell, C. A. Imaging and characterizing cells using tomography. Archives of Biochemistry and Biophysics. 581, 111-121 (2015).
  4. Groen, J., Conesa, J. J., Valcárcel, R., Pereiro, E. The cellular landscape by cryo soft X-ray tomography. Biophysical Reviews. 11 (4), 611-619 (2019).
  5. Kapishnikov, S., et al. Oriented nucleation of hemozoin at the digestive vacuole membrane in Plasmodium falciparum. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (28), 11188-11193 (2012).
  6. Kapishnikov, S., et al. Unraveling heme detoxification in the malaria parasite by in situ correlative X-ray fluorescence microscopy and soft X-ray tomography. Scientific Reports. 7 (1), (2017).
  7. Sviben, S., et al. A vacuole-like compartment concentrates a disordered calcium phase in a key coccolithophorid alga. Nature Communications. 7, 11228 (2016).
  8. Wan, W., Briggs, J. A. Cryo-electron tomography and subtomogram averaging. Methods in Enzymology. , 329-367 (2016).
  9. Zhang, P. Advances in cryo-electron tomography and subtomogram averaging and classification. Current Opinion in Structural Biology. 58, 249-258 (2019).
  10. Bäuerlein, F. J. B., Baumeister, W. Towards visual proteomics at high resolution. Journal of Molecular Biology. 433 (20), 167187 (2021).
  11. Elbaum, M., Seifer, S., Houben, L., Wolf, S. G., Rez, P. Toward compositional contrast by cryo-STEM. Accounts of Chemical Research. 54 (19), 3621-3631 (2021).
  12. Elbaum, M., Wolf, S. G., Houben, L. Cryo-scanning transmission electron tomography of biological cells. MRS Bulletin. 41 (7), 542-548 (2016).
  13. Wolf, S. G., Houben, L., Elbaum, M. Cryo-scanning transmission electron tomography of vitrified cells. Nature Methods. 11 (4), 423-428 (2014).
  14. Houben, L., Weissman, H., Wolf, S. G., Rybtchinski, B. A mechanism of ferritin crystallization revealed by cryo-STEM tomography. Nature. 579 (7800), 540-543 (2020).
  15. Li, Y., Huang, W., Li, Y., Chiu, W., Cui, Y. Opportunities for cryogenic electron microscopy in materials science and nanoscience. ACS Nano. 14 (8), 9263-9276 (2020).
  16. Hohmann-Marriott, M. F., et al. Nanoscale 3D cellular imaging by axial scanning transmission electron tomography. Nature Methods. 6 (10), 729-731 (2009).
  17. Engel, A. Scanning transmission electron microscopy: biological applications. Advances in Imaging and Electron Physics. 159, 357-386 (2009).
  18. Wolf, S. G., Elbaum, M. CryoSTEM tomography in biology. Methods in Cell Biology. 152, 197-215 (2019).
  19. Biskupek, J., Leschner, J., Walther, P., Kaiser, U. Optimization of STEM tomography acquisition-A comparison of convergent beam and parallel beam STEM tomography. Ultramicroscopy. 110 (9), 1231-1237 (2010).
  20. Trepout, S., Messaoudi, C., Perrot, S., Bastin, P., Marco, S. Scanning transmission electron microscopy through-focal tilt-series on biological specimens. Micron. 77, 9-15 (2015).
  21. Rez, P., Larsen, T., Elbaum, M. Exploring the theoretical basis and limitations of cryo-STEM tomography for thick biological specimens. Journal of Structural Biology. 196 (3), 466-478 (2016).
  22. Mastronarde, D. N. Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements. Journal of Structural Biology. 152 (1), 36-51 (2005).
  23. Schorb, M., Haberbosch, I., Hagen, W. J. H., Schwab, Y., Mastronarde, D. N. Software tools for automated transmission electron microscopy. Nature Methods. 16 (6), 471-477 (2019).
  24. Sheng, Y., Morris, K., Radecke, J., Zhang, P. Cryo-electron tomography remote data collection and subtomogram averaging. Journal of Visualized Experiments. (185), e63923 (2022).
  25. Weis, F., Hagen, W. J. H., Schorb, M., Mattei, S. Strategies for optimization of cryogenic electron tomography data acquisition. Journal of Visualized Experiments. (169), e62383 (2021).
  26. O'Toole, E., vander Heide, P., McIntosh, J. R., Mastronarde, D. Large-scale electron tomography of cells using SerialEM and IMOD. Cellular Imaging: Electron Tomography and Related Techniques. , 95-116 (2018).
  27. Zheng, S., et al. AreTOMO: An integrated software package for automated marker-free, motion-corrected cryo-electron tomographic alignment and reconstruction. Journal of Structural Biology. (6), 100068 (2022).
  28. Seifer, S., Elbaum, M. ClusterAlign: A fiducial tracking and tilt series alignment tool for thick sample tomography. Biological Imaging. 2, 7 (2022).
  29. Waugh, B., et al. Three-dimensional deconvolution processing for STEM cryotomography. Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (44), 27374-27380 (2020).
  30. Kirchenbuechler, D., et al. Cryo-STEM tomography of intact vitrified fibroblasts. AIMS Biophysics. 2 (3), 259-273 (2015).
  31. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  32. Lazić, I., et al. Single-particle cryo-EM structures from iDPC-STEM at near-atomic resolution. Nature Methods. 19 (9), 1126-1136 (2022).
  33. Seifer, S., Houben, L., Elbaum, M. Flexible STEM with simultaneous phase and depth contrast. Microscopy and Microanalysis. , 1-12 (2021).
  34. Ophus, C. Four-dimensional scanning transmission electron microscopy (4D-STEM): from scanning nanodiffraction to ptychography and beyond. Microscopy and Microanalysis. 25 (3), 563-582 (2019).
  35. Zhou, L., et al. Low-dose phase retrieval of biological specimens using cryo-electron ptychography. Nature Communications. 11 (1), 2773 (2020).
  36. Nellist, P. D. The principles of STEM imaging. Scanning Transmission Electron Microscopy: Imaging and Analysis. , 91-115 (2011).
  37. Elad, N., Bellapadrona, G., Houben, L., Sagi, I., Elbaum, M. Detection of isolated protein-bound metal ions by single-particle cryo-STEM. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (42), 11139-11144 (2017).

Tags

Biologi utgave 196
Visualisering av organeller <em>in situ</em> ved kryo-STEM-tomografi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kirchweger, P., Mullick, D., Wolf,… More

Kirchweger, P., Mullick, D., Wolf, S. G., Elbaum, M. Visualization of Organelles In Situ by Cryo-STEM Tomography. J. Vis. Exp. (196), e65052, doi:10.3791/65052 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter