Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Визуализация органелл in situ с помощью крио-STEM-томографии

Published: June 23, 2023 doi: 10.3791/65052
Automatic Translation
1, 1, 2, 1
1Department of Chemical and Biological Physics, Weizmann Institute of Sciences, 2Department of Chemical Research Support, Weizmann Institute of Sciences

Summary

Крио-STEM-томография позволяет визуализировать органеллы интактных клеток без встраивания, сечения или других инвазивных препаратов. Полученное 3D-разрешение в настоящее время находится в диапазоне нескольких нанометров, с полем зрения в несколько микрометров и доступной толщиной порядка 1 мкм.

Abstract

Криогенная электронная микроскопия (крио-ЭМ) основана на визуализации биологических или органических образцов, встроенных в их нативную водную среду; Вода затвердевает в стакане (т.е. остекловывается) без кристаллизации. Метод крио-ЭМ в последнее время широко используется для определения структуры биологических макромолекул с околоатомным разрешением. Этот подход был распространен на изучение органелл и клеток с помощью томографии, но традиционный режим широкопольной трансмиссионной ЭМ-визуализации страдает от серьезного ограничения толщины образца. Это привело к практике фрезерования тонких ламелей с помощью сфокусированного ионного пучка; Высокое разрешение достигается путем усреднения субтомограмм по реконструкциям, но трехмерные связи за пределами оставшегося слоя теряются. Ограничение толщины можно обойти с помощью сканированной зондовой визуализации, аналогичной сканирующему ЭМ или конфокальному лазерному сканирующему микроскопу. В то время как сканирующая просвечивающая электронная микроскопия (STEM) в материаловедении обеспечивает атомное разрешение на отдельных изображениях, чувствительность криогенных биологических образцов к электронному облучению требует особых соображений. Этот протокол представляет собой установку для криотомографии с использованием STEM. Описана базовая топическая конфигурация микроскопа как для двух-, так и для трехконденсорных систем, в то время как автоматизация обеспечивается некоммерческим программным обеспечением SerialEM. Также описаны усовершенствования для сбора партий и корреляционного выравнивания с ранее полученными флуоресцентными картами. В качестве примера мы показываем реконструкцию митохондрии, указывая на внутреннюю и внешнюю мембрану и гранулы фосфата кальция, а также окружающие микротрубочки, актиновые филаменты и рибосомы. Крио-STEM-томография превосходно выявляет театр органелл в цитоплазме и, в некоторых случаях, даже ядерную периферию адгезивных клеток в культуре.

Introduction

Трехмерная (3D) визуализация органелл является первостепенной задачей в современной клеточной биологии. Учитывая масштабы, варьирующиеся от десятков нанометров для секреторных везикул до многих микрон для ядра клетки, сложно найти единый метод микроскопии, подходящий для всех приложений. В то время как современная флуоресцентная микроскопия может охватывать большую часть диапазона с точки зрения разрешения, появляются только меченые молекулы. Клеточный театр остается областью электронной микроскопии. Традиционные методы химической фиксации, пластического встраивания и окрашивания тяжелыми металлами являются сильно инвазивными, поэтому результаты могут зависеть от деталей пробоподготовки. Крио-ЭМ, с другой стороны, ограничен необходимостью остекловывания водной среды; Кристаллы льда, которые образуют дифрагию электронного освещения, вызывают контрастные артефакты более высокого контраста, чем интересующий органический материал.

В последнее десятилетие наблюдается распространение методов ЭМ-визуализации, разработанных или адаптированных для клеточных исследований1. Замораживание под высоким давлением в сочетании с итеративным фрезерованием сфокусированным ионным пучком (FIB) и последовательной визуализацией поверхности с использованием сканирующего электронного микроскопа (т.е. FIB-SEM) в настоящее время является предпочтительным методом для больших образцов2. Криогенная мягкая рентгеновская томография (крио-SXT) подходит для образцов размером в несколько микрон, ограниченных характерной длиной поглощения мягких рентгеновских лучей в воде 3,4,5. Эта шкала включает в себя множество типов интактных клеток, а количественный характер контраста поглощения рентгеновских лучей добавляет аспект измерения концентрации6 или спектроскопии7. В сочетании с субтомограммным усреднением крио-просвечивающая электронная томография (крио-ЭТ), основанная на фазово-контрастной просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ), обеспечивает самое высокое разрешение для макромолекул или комплексов 8,9,10. Однако редко бывает, что интактные органеллы настолько регулярны, что их можно усреднить целиком. Кроме того, обычный режим широкопольной ПЭМ ограничен для толщины образца несколькими сотнями нанометров сочетанием неупругого рассеяния (с потерей энергии) в образце и хроматической аберрации в магнитной линзеобъектива 11,12. Большой разброс энергии диктует использование энергетического фильтра для удаления образующейся не в фокусе дымки, но чувствительный образец по-прежнему страдает от радиационного повреждения, в то время как сигнал изображения становится экспоненциально слабее с увеличением толщины.

Альтернативный режим визуализации, сканирующий пропускание EM (STEM), обходит необходимость фильтрации энергии и сохраняет неупруго рассеянные электроны для формирования изображения, хотя в настоящее время с более низким разрешением, чем для ПЭМ-томографии (рис. 1). На самом деле никакого реального образа не образуется. Вместо этого, как и в сканирующем ЭМ, измерения производятся точка за точкой, а изображение собирается компьютером. Увеличение определяется только размером шагов сканирования без изменения токов объектива. При правильной настройке полезный диапазон толщины образца для крио-STEM-томографии (CSTET) может достигать 1,5 или даже 2 мкм, хотя зона комфорта, где полезная интенсивность сигнала остается значительной частью освещенности, составляет около 600-900 нм11,13. Этого достаточно, чтобы увидеть большую часть цитоплазмы, а иногда и край клеточного ядра. На практике мы обнаруживаем, что витрификация стандартным методом погружения в криогенную жидкость накладывает более серьезные ограничения на толщину, чем STEM-визуализация. Цель этой видеостатьи — облегчить включение CSTET в инструментальный сундук для визуализации клеток и органелл в исследовательских лабораториях и микроскопических установках.

Первая проблема заключается в том, что микроскопические операции в CSTET еще не стандартизированы для применения в науках о жизни так, как это было для крио-ПЭМ-томографии. Аппаратное обеспечение STEM редко (если вообще когда-либо) было нацелено на рынок крио-ЭМ. Однако ситуация меняется с появлением микроскопов новейшего поколения, и многие существующие инструменты могут быть модернизированы. STEM как метод получил широкое распространение и в значительной степени завоевал популярность в материаловедении, где также растет интерес к криогенным и низкодозовым методам14,15. Материаловедческая литература изобилует аббревиатурами BF-STEM, ADF-STEM, HAADF-STEM, 4D-STEM, DPC-STEM и т. д., которые добавляют путаницы. Мы предлагаем здесь рекомендуемую отправную точку, которая, по нашему коллективному опыту в Научном институте Вейцмана, предоставляет наиболее общий протокол для полезных результатов, основанных на визуализации STEM светлого поля (BF)16. Он ни в коем случае не исчерпывает и даже не исследует спектр возможностей, но послужит основой для дальнейших улучшений. Несмотря на то, что мы делаем упор на крио-STEM, большая часть протокола в равной степени актуальна для STEM-томографии при комнатной температуре пластиковых срезов.

Суть STEM заключается в сканировании образца сфокусированным электронным зондом (рис. 1), конусом освещения и записи сигналов из дифракционной (рассеивающей) плоскости пропускания, пиксель за пикселем, для получения 2D-изображений17,18. Аморфные образцы, включая большинство клеточных материалов, будут производить диффузную картину рассеяния при передаче. Простейшая практическая конфигурация STEM заключается в размещении круглого детектора для записи центрального диска (т. е. освещения зонда, которое будет передаваться без образца). Образец рассеивает электроны от этого конуса освещения до такой степени, что сигнал уменьшается. В результате получается изображение BF - образец кажется темным на ярком фоне. Кольцевой детектор также может быть использован (или вместо него) для обнаружения рассеяния от образца за пределами конуса освещения. При удаленном образце сигнала нет. Когда образец находится на месте, объекты выглядят яркими на темном фоне на изображении темного поля (DF). Номенклатура для STEM (BF, кольцевое темное поле [ADF], высокоугловое кольцевое темное поле [HAADF] и т. Д.) Относится в основном к диапазонам углов сбора для детекторов.

Угол схождения освещения представляет собой существенную адаптацию STEM к клеточной томографии. Когда главным приоритетом является высокое разрешение, угол схождения должен быть как можно больше. (Это похоже на конфокальную лазерную сканирующую микроскопию; разрешение определяется диаметром зонда, который масштабируется как длина волны, деленная на числовую апертуру. Обратите внимание, что мы ссылаемся на угол полуугла или полуконвергенции для EM.) С другой стороны, когда приоритетом является глубина резкости, компромисс в разрешении дает большое преимущество, поскольку сфокусированный луч остается примерно параллельным на расстоянии, равном удвоенной длине волны, деленной на полуугол в квадрате. В идеале весь объем ячейки остается в фокусе19. Например, при 300 кэВ длина волны де Бройля электрона составляет 0,002 нм, поэтому сходимость в 1 мрад дает разрешение 2 нм и глубину резкости 4 мкм. В этих условиях томография может быть выполнена даже без фокусировки в процессе сбора данных, но только один раз в начале сбора. Обычный STEM с возможностью томографии может достигать угла полуконвергенции 7 или 8 мрад; Поэтому, в принципе, мы могли бы достичь разрешения порядка 0,25 нм, но тогда с фокусной глубиной всего 62 нм. Это явно слишком тонко для клеточной визуализации. Более совершенные микроскопы с тремя конденсорными линзами обеспечивают непрерывную регулировку угла полуконвергенции в значительном диапазоне. В более традиционной конфигурации с двумя конденсаторами сходимость дискретно фиксируется апертурой конденсатора (C2).

Для прочных образцов, залитых пластиком, можно записать фокальную серию при каждом наклоне и объединить их для получения высокого разрешения20, но для криогенных образцов радиационный бюджет слишком сильно ограничен. Наконец, при взвешивании преимуществ визуализации BF или DF для толстых образцов следует учитывать эффекты многократного упругого рассеяния в образце. Сигнал BF менее искажен многократным рассеянием и показывает более высокое разрешение для толстых образцов16,21.

Полезное эмпирическое правило заключалось в том, чтобы установить углы сбора, в несколько раз превышающие конвергенцию. Чем толще образец, тем больше должен быть коллекционный диск. Слишком маленький диск обеспечит низкую интенсивность сигнала; Слишком большой диск приведет к плохой контрастности изображения, так как будет способствовать только рассеивание под самым высоким углом. Углы сбора должны быть оптимизированы для данного образца. Углы детектора в зависимости от длины камеры (дифракции) должны быть откалиброваны независимо. Они могут быть удобно отображены программным обеспечением микроскопа. На практике коэффициент от двух до пяти в отношении полууглов сбора к освещению, θ к α соответственно (рис. 1), является рекомендуемой отправной точкой для CSTET клеточных образцов.

Следующий протокол описывает работу STEM-томографии с использованием популярного программного обеспечения SerialEM для управления микроскопом22,23. SerialEM не привязан к конкретному производителю, и он широко используется в ПЭМ-томографии. Большинство операций по настройке томографии могут быть перенесены непосредственно из ТЭМ. Стратегия SerialEM заключается в моделировании системы сканирования в виде камеры. Это позволяет легко перейти от TEM к STEM. Однако следует иметь в виду, что такие параметры, как увеличение и биннинг, являются полностью искусственными. Важными параметрами являются поле зрения в микронах, количество пикселей в поле зрения и время экспозиции. Интервал между пикселями, или дискретизация, — это линейное поле, деленное на количество пикселей, а время выдержки — это количество пикселей, деленное на время экспозиции.

Минимальная конфигурация для STEM и CSTET включает в себя три функции микроскопа: генератор сканирования, детектор STEM и программное обеспечение для управления томографией. Протокол относится к номенклатуре FEI/Thermo Fisher Scientific (TFS), но концепции являются общими. Проприетарное программное обеспечение TFS было описано в JoVE для TEM24, и операция STEM очень похожа.

Мы предполагаем, что микроскоп был заранее выровнен сервисной группой или опытным персоналом и что выравнивание столбцов можно вызвать, загрузив файл. Незначительные корректировки называются прямыми выравниваниями и могут храниться в так называемых регистрах FEG (микроскопы TFS). Прямое выравнивание включает центр вращения, точки поворота, дифракционное выравнивание и компенсацию астигматизма конденсатора. Корректировки должны выполняться итеративно. Обратите внимание, что микроскопы TFS реализуют различные режимы нанозонда (nP) и микрозонда (μP); для данной апертуры конденсатора они обеспечивают относительно узкое или широкое поле зрения с параллельным освещением в ПЭМ и более или менее сходящимся (плотно сфокусированным) электронным пучком в STEM соответственно. Другие производители используют другие схемы, чтобы покрыть диапазон углов сходимости.

Перед началом следует выбрать поле зрения, L, и выборку (ширину пикселя), l, в зависимости от исследуемого образца. Например, для l = 1 нм/пиксель следует выбрать изображение размером 4 000 x 4 000 пикселей, которое будет охватывать поле зрения 4мкм2 . Разрешение будет, в лучшем случае, в два раза больше пространственной выборки, поэтому 2 нм и диаметр зонда, d, должны соответствовать этому. Калибровка угла зонда выходит за рамки этого протокола, поэтому мы предполагаем, что доступна таблица или чтение с экрана. Диаметр зонда равен примерно длине волны электрона, деленной на угол полусходимости (в радианах): d = λ/θ. Длина волны λ составляет 0,002 нм для электронов 300 кэВ и 0,0025 нм для электронов 200 кэВ, поэтому θ 1 мрад обеспечит диаметр пятна 2 или 2,5 нм соответственно.

Протокол представлен в прогрессии возрастающей сложности. Первая задача — получить STEM-изображение, которое зависит от программного обеспечения производителя микроскопа, а затем наклонную серию, для которой мы используем SerialEM. Многие читатели, несомненно, знакомы с SerialEM, поэтому более сложные задачи придут естественным образом. Нет необходимости строго следовать процедурам. Разработки, связанные с автоматизацией, могут быть реализованы непосредственно как для STEM, так и для TEM. Опытные пользователи, скорее всего, инвертируют протокол, начиная с корреляционной регистрации флуоресцентных карт и заканчивая настройкой пакетной томографии. Более подробную информацию можно найти в обширной документации и библиотеках учебных пособий для самого SerialEM, включая недавнюю статью JoVE о последних разработках в области автоматизации25.

Protocol

1. Настройка STEM

  1. Предварительные выравнивания: загрузите файл выравнивания колонн, а затем откройте клапаны колонн. Если вы используете криодержатель с боковым входом, откройте Cryo-shield. Запуск в режиме ТЕМ. Луч должен появиться на экране. Если нет, уменьшите увеличение.
  2. Приведите микроскоп в эуцентрический фокус, нажав кнопку на панели управления.
  3. Установите размер пятна на удобное значение (например, 6) для визуализации флуоресцентного экрана напрямую или с помощью встроенной камеры (в зависимости от модели микроскопа).
  4. Переведите микроскоп в режим STEM и убедитесь, что при фокусировке используются конденсорные линзы (интенсивность), а не объектив. Установите эуцентрический фокус. Затем выйдите из режима дифракции для первоначальной настройки.
  5. Убедитесь, что балка не заглушена. Уменьшайте увеличение, пока луч не появится на экране. Отрегулируйте смещение луча к центру и увеличивайте увеличение с шагом примерно до 70 км, удерживая луч в центре.
  6. Вставьте желаемое отверстие конденсатора, обычно 50 мкм. Проверьте центровку диафрагмы. При легком повороте ручки фокусировки вперед и назад пятно должно расширяться и сжиматься, но оставаться на месте, как если бы плоскость разрезала воображаемые вертикальные песочные часы. Если диафрагма не отцентрирована, подсветка будет смещаться вбок, как если бы песочные часы были наклонены.
  7. Установите луч на фокус и нажмите Intensity List Focus (если доступно) на вкладке выравнивания или вернитесь к эуцентрическому фокусу, как в 1.2. Отрегулируйте положение луча по центру.
  8. Отрегулируйте центр вращения. Поверните ступенчатое колесо фокусировки на минимум или на одну ступень выше, чтобы луч мягко пульсировал, и убедитесь, что он остается неподвижным, когда фокус перемещается вверх и вниз.
  9. Выделите точки поворота и соедините две точки с помощью корректировок X и Y.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если фазная пластина установлена на приборе TFS, следует использовать только регулировку X.
  10. Слегка расфокусируйте луч и отрегулируйте стигматоры конденсатора, чтобы диск был круглым. Двигайтесь вверх и вниз по фокусу для оптимизации; Не должно быть тенденции к удлинению в ту или иную сторону при прохождении фокуса.
  11. Нормализуйте линзы. Затем постепенно увеличивайте увеличение примерно до 240 кС, используя сдвиг луча, чтобы удерживать пятно по центру, и повторите регулировку центра вращения и точки поворота (шаги 1.6-1.8).
  12. Вернитесь в режим дифракции. Луч должен выглядеть как однородный диск на флуоресцентном экране. Длина камеры (CL) теперь эффективно контролирует оптическое расстояние до детектора, как в рентгеновской кристаллографии. Измените его и наблюдайте, как диск сжимается и увеличивается, как если бы расположение экрана двигалось к образцу или от него. Этот конус представляет собой подсветку BF.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для каждого CL необходимо отрегулировать дифракционное выравнивание, чтобы привести проецируемый луч к центральной оси. Обычно нет необходимости уточнять их все, только один (или несколько), который будет использоваться для обнаружения.
  13. Включите режим STEM при большом увеличении.
    1. Если детектор BF STEM доступен, начните с него. Поднесите сцену к области с пустым отверстием и отрегулируйте дифракционное выравнивание, чтобы отцентрировать луч, используя желаемый CL.
    2. Многие микроскопы оснащены только детектором HAADF; есть хитрость, чтобы использовать это в качестве детектора BF. Во-первых, втяните детектор, центрируйте луч, как указано выше, в прямом выравнивании, вставьте апертуру объектива, обычно небольшую, например, 20 мкм, и отрегулируйте ее положение, чтобы равномерно окружать луч. (Самый простой способ сделать это — вставить образец или тестовую сетку, чтобы увидеть ореол вокруг освещения). Затем используйте дифракционное выравнивание, чтобы переместить луч от оси в область детектора. Вставляйте и убирайте датчик, наблюдая за лучом на экране, чтобы убедиться, что луч заблокирован датчиком.
    3. Запустите сканирование в программном обеспечении микроскопа и отрегулируйте настройки яркости и контрастности (B/C) так, чтобы сигнал был близок к 0 при гашении луча и близок к насыщенности, когда на детектор падает полное освещение. Используйте дисплей прицела, чтобы помочь. Настройки могут быть связаны неожиданным образом, поэтому настройку следует повторять несколько раз.
  14. Верните микроскоп к относительно низкому увеличению в регистре с большим увеличением (режим SA), не переходя в режим малого магнита (LM).
  15. Обратите внимание на текущий экран для справки позже (см. этап 3.1.1). Ток может быть изменен с помощью настроек объектива пушки и размера пятна, как в TEM, с увеличением чисел, соответствующих уменьшенному току.
  16. На этом этапе сохраните регистр FEG, чтобы облегчить возврат к стандартным значениям.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Средство может подготовить набор регистров FEG по умолчанию, чтобы пользователи могли начать работу с рабочей конфигурацией.

2. Размещение образца

  1. В режиме LM TEM убедитесь, что сетка не непрозрачна. Найдите квадрат сетки для внесения первоначальных корректировок. Удобно найти какой-нибудь пустой участок, дыру или разорванный квадрат сетки. Записывайте положения сцены, чтобы удобно возвращаться к ним.
  2. Доведите образец до эуцентрической высоты. Для этого есть несколько способов. Например, с помощью воблера предметного столика можно наклонять сетку, перемещая высоту образца вдоль оси Z до тех пор, пока изображение не перестанет смещаться вбок. Кроме того, отметьте некоторые элементы на экране просмотра и наклоните сцену на 30°. Объект будет перемещаться в боковом направлении. Отрегулируйте высоту образца, чтобы вернуть его в исходное положение. Увеличьте увеличение или наклон сцены для уточнения. Вернитесь к наклону 0°.
  3. Вернитесь в режим STEM и вставьте детектор STEM. Перейдите в режим наименьшего большого увеличения (SA). Убедитесь, что на экране компьютера отображается изображение. Быстрое сканирование, чтобы избежать ненужного воздействия; Типичным будет 1 мкс на пиксель или меньше. Обратите внимание, что изображение может выглядеть искаженным на левой границе при чрезмерно быстром сканировании (см. рис. 2).
  4. Нажмите Eucentric Focus, увеличьте увеличение и уточните фокусировку во время сканирования. Удобно использовать фокусирующую лупу, предоставляемую программным обеспечением микроскопа.
  5. Настройте конденсаторный астигматизм. Наиболее точно это можно сделать методом Ронхиграма. Наведя луч на тонкую область образца, сфокусируйтесь на точке, где проходит луч, между теневыми изображениями образца с обеих сторон. Затем отрегулируйте настройку конденсатора, чтобы сделать центральный диск круглым. Это требует некоторой практики, особенно для криогенных образцов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Альтернативой является поиск некоторых частиц золота (часто используемых в качестве реперных маркеров для выравнивания в томографии). Увеличьте увеличение и сфокусируйтесь вверх и вниз, настраивая астигматизм так, чтобы частицы оставались круглыми без удлинения в любом направлении.
  6. Перейдите в режим LM STEM и продолжите сканирование, чтобы найти интересную область. При необходимости отрегулируйте настройки датчика B / C (шаг 1.13.3), примерно на этом этапе.

3. Запись изображения

  1. Оцените дозу для регистрации. Как правило, стремитесь к 100-150 e-/Å2 для всей томограммы. Проверьте допуск дозы для каждого образца. Ток в амперах (А), деленный на заряд на электрон, представляет собой количество e-/s, которое умножается на время экспозиции, T, в секундах и делится на поле зрения в Å2. Для удобства выразите ток в наноамперах (как считывается с экрана), ширину поля зрения в микрометрах и время экспозиции кадра в секундах, с подходящими множителями:
    Equation 1
    Это число следует умножить на количество наклонов, чтобы получить общую экспозицию в серии. Например, при токе I = 0,04 нА, поле L = 4 мкм и времени экспозиции 12 с мы получаем 1,9 e-/Å 2 на наклон, или около 110 e-/Å 2 для серии из 61 проекции.
  2. Верните столик в отверстие (или втяните сетку) и отрегулируйте ток луча, используя размер пятна и/или настройки объектива пистолета, чтобы достичь желаемого тока экрана. Если измерение показывает 0, вставьте большую апертуру C2, чтобы увеличить ток. Затем исправьте, разделив измерение на квадрат отношения диаметров, и, наконец, вернитесь к меньшему отверстию.
  3. Уточните настройки B/C в соответствии с шагом 1.13.3 и, наконец, верните сцену в интересующую область и повторно проверьте прямое выравнивание и астигматизм в условиях визуализации.
  4. Получение тестового изображения.

4. Томография с SerialEM

  1. Запустите сервер SerialEM на компьютере микроскопа (SerialEM обычно устанавливается на другом). Затем откройте SerialEM. STEM отображается в SerialEM как камера, с тем же интерфейсом. Убедитесь, что обмен данными выполняется надлежащим образом для установки. Например, вкладка микроскопа должна отображать правильное увеличение. Если это не сработает, остановитесь здесь и устраните неполадки.
  2. Найдите вкладку «Камера и сценарий» и откройте «Настройка». Убедитесь, что выбрана камера STEM, и для каждого режима выберите подходящее время биннинга и выдержки. Убедитесь, что соответствующий детектор (или детекторы) отображается в поле «каналы для получения» в левом нижнем углу. Нажмите «Приобрести» внизу, чтобы проверить. Опять же, не продолжайте, если ничего не происходит или если луч не разгорается. Остановите и проверьте связь.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Режимы используются аналогично ПЭМ-томографии. Биннинг - это уловка для совместимости с TEM. Важным параметром является количество пикселей; Разные системы микроскопов используют разное биннинг для достижения одного и того же количества.
    1. Просмотр и поиск должны быть быстрыми сканированиями с относительно небольшим количеством пикселей (например, 512 x 512 пикселей при 1 с).
    2. Фокус — это, как правило, небольшая область с быстрой записью. Таким образом, в режиме низкой дозы выберите «Фокус», чтобы увеличить его, отличный от режима записи, что может повысить точность. Размер пятна оставьте без изменений.
    3. Для режима записи используйте параметры, выбранные выше при оценке экспозиции. Если доступно, также выберите «Динамический фокус», который корректирует фокус построчно на наклонном изображении.
    4. Для удобства позже выберите биннинг для предварительного просмотра, чтобы он был идентичен биннингу для просмотра (см. Улучшение #1, шаг 5.5). Размер изображения (количество пикселей) не обязательно должен быть одинаковым.
    5. Используйте пробный режим, чтобы область записи оставалась по центру во время сбора. Он может быть похож на View, но позаботьтесь о том, чтобы в левой части кадра не было видимых искажений при сканировании (см. пример на рисунке 2 ). Опять же, в режиме низкой дозы пробная версия может иметь увеличение, отличное от режима записи.
    6. Сразу же используйте режим монтажа для сканирования сетки. Он должен быть достаточно плотным, чтобы найти области интереса; Рекомендация: 512 x 512 или 1024 x 1024. Убедитесь, что изображение хорошее, с приличным динамическим диапазоном (видимым в элементах управления отображением изображения), так как этот режим используется для поиска областей образца.
    7. Сохраните файл настроек, чтобы эти параметры были сохранены по умолчанию для следующего сеанса (который может произойти в ближайшее время в случае сбоя программы).
  3. Протестируйте калибровку сдвига изображения и сдвига ступени. В режиме микрозонда (или нанозонда) нажмите « Просмотреть изображение», наведите на него курсор мыши, удерживайте кнопку и перетащите по диагонали примерно на четверть поля зрения. Затем возьмите другой вид. Изображения должны идеально перекрываться. Повторите эти действия, перетащив еще раз, удерживая нажатой клавишу Shift (для принудительного движения рабочей области). Изображения должны хорошо перекрываться, хотя, возможно, и менее точно.
  4. Перейдите в режим LM и протестируйте смену сцены. Если эти тесты не пройдены, остановите их и устраните неполадки. Остальное не подойдет.
  5. Сделайте монтажную LM-карту всей сетки. Это можно сделать и в TEM.
    1. Перейдите в режим STEM с наименьшим увеличением, в котором изображение не блокируется диафрагмой, обычно около 185x.
    2. Выберите меню «Навигатор» > «Открыть». Затем нажмите меню «Навигатор» > «Навигатор». Параметры > снимите флажок «Преобразовать карты в байты».
    3. Выберите меню «Навигатор» > «Монтаж и сетки» > «Настроить полный монтаж». Откроется меню. Параметры, которые необходимо проверить: «Переместить рабочую область вместо смещения изображения», «Создать карту из каждого монтажа, если открыт навигатор» и «Использовать монтажное сопоставление, а не записывать параметры». Сетка изображения должна быть примерно 6 x 6 или 7 x 7. Найдите общую площадь, которую нужно записать. Если требуется слишком много изображений, увеличение может быть неправильно прочитано с микроскопа (рис. 3). Остановитесь и проверьте.
    4. Чтобы начать съемку монтажа, нажмите « Пуск » на элементах управления монтажом или « Монтаж» в разделе «Камера и сценарий». Откроется другое меню, в котором можно выбрать параметры файла: mrc, сохранить в виде целых чисел, а в еще одном диалоговом окне выбрать имя файла для хранения. Убедитесь, что вы храните данные в подходящей области данных, а не в собственных пользовательских настройках SerialEM. Не рекомендуется хранить большие данные на диске C, где находится система.
    5. Когда сбор данных будет завершен, монтаж появится в главном окне (рис. 4). Теперь можно перемещаться по сетке с помощью маркера и точек на навигаторе, как и в TEM.
  6. Перепроверьте коррекцию астигматизма. Обычно достаточно быстро отсканировать небольшую область и отрегулировать ее вместе с фокусом, чтобы точечные элементы, такие как наночастицы золота, оставались полностью круглыми, когда они входят и выходят из фокуса (как на SEM) при большом увеличении. Более консервативно, можно повторить прямые выравнивания шагов 1,5-1,8 до фиксации астигматизма.
  7. Совместите изображение с большим увеличением с монтажом LM.
    1. Перейдите к позиции на монтаже LM с какой-нибудь легко узнаваемой функцией. Добавьте точку, нажмите на окно «Навигатор» > «Добавить точки» и нажмите на функцию. Нажмите еще раз (прекратите добавление), чтобы деактивировать.
    2. Сделайте изображение View или Trial с наименьшим увеличением большого магнита (HM) и найдите указанный элемент. Поместите туда маркер (зеленый крестик) и, выделив соответствующую точку в окне Навигатора, в меню Навигатора > Shift to Marker..., в открывшемся диалоговом окне выберите All Maps и Save Shift, как показано на рисунке 5.
    3. Протестируйте, переместив сцену в другие положения и убедившись, что изображение HM центрировано в тех же местах, которые были выбраны в монтаже LM. Если объект не виден на изображении HM, сдвиг между режимами LM и HM может быть слишком большим. В этом случае сделайте полигональный монтаж на большей площади. Нажмите окно «Навигатор» > «Добавить многоугольник», выберите несколько точек, затем снова нажмите «Добавить многоугольник», чтобы закрыть. Выберите меню «Навигатор» > «Монтаж и сетки» > «Настройка многоугольного монтажа» и «Элементы управления монтажом» > «Пуск». Затем найдите соответствующие точки, как указано выше, и нажмите «Перейти к маркеру...».
  8. Установите режим низкой дозы.
    1. Откройте вкладку «Контроль низкой дозы» и установите флажок «Режим низкой дозы».
    2. Установите флажок « Непрерывное обновление » и перейдите в «Просмотр». Выберите увеличение микроскопа для этого режима, обычно самое низкое или близкое к наименьшему. Выберите каждый из следующих режимов и установите соответствующее увеличение. Запись должна быть установлена для достижения желаемого размера пикселя, а увеличение фокуса должно быть достаточно большим, чтобы фидуциальные маркеры или другие высококонтрастные функции фокусировки были четко разрешены. Затем сразу же снимите флажок Непрерывное обновление.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Пробный режим может быть установлен аналогично режиму «Запись», и в этом случае область слежения должна быть смещена из области «Запись», чтобы свести к минимуму экспозицию, либо с малым увеличением, охватывающим большую часть окружающей среды.
    3. Сделайте изображение View и установите положение Trial, используя Define position of area: Trial.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендация #1: Учитывая изменение области и времени отбора проб, дополнительная экспозиция для испытания с низкой магнитомагнитностью может быть минимальной. До тех пор, пока полоса сетки не попадает в поле зрения, этот метод отслеживания, как правило, более надежен. Рекомендация #2: Также можно обновить размер пятна, чтобы скорректировать дозу для разных режимов, таких как Фокус. Для обеспечения стабильности настроек оптики микроскопа мы рекомендуем не делать этого, а оставить размер пятна так, как это уместно для записи, а затем, при необходимости, отрегулировать время экспозиции для более быстрых режимов сканирования.
    4. Перейдите на вкладку «Контроль низкой дозы» > перейдите в раздел «Запись», затем нажмите меню «Навигатор» > «Открыть состояния визуализации» > «Добавить текущее состояние». Дайте ему имя, чтобы его можно было легко вспомнить (например, μP STEM для микрозонда STEM). Для разных задач могут быть определены различные состояния.
  9. Переместите сцену в место, представляющее интерес для томографии (подробнее об использовании навигатора ниже).
    1. Добавьте точку в навигатор, щелкнув окно «Навигатор» > «Добавить точки».
    2. Уточните эуцентрическую высоту, выбрав «Задачи» > «Эвцентриситет» > «Грубый». Окно "Навигатор" > Update Z.
    3. Установите области для «Фокус» и «Пробная версия». Во-первых, сделайте изображение View. Затем на вкладке « Контроль низкой дозы » в разделе « Определить положение области» выберите «Фокус» или «Испытание». Отрегулируйте положение двух областей вдоль оси наклона. Фокус не должен перекрывать область записи.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Имейте в виду, что есть некоторое превышение, особенно на левом краю, поэтому ни один из них не должен быть установлен непосредственно рядом с областью записи. Степень превышения можно оценить на тестовой области, многократно сканируя с увеличением записи, а затем уменьшая увеличение, чтобы получить более широкий обзор.
  10. Для хорошей меры (необязательно с опытом) наклоняйте рабочую область на +60°, а затем на -60°, каждый раз снимая изображение «Просмотр» или «Просмотр», чтобы убедиться, что полоса сетки не попадает в поле зрения области записи, показанное зеленым цветом.
  11. Настройте серию наклонов.
    1. Откройте новый файл, чтобы сохранить данные, нажав « Файл» > «Открыть новый» и выбрав имя файла. Выберите меню Tilt Series > Tilt Series Setup (рисунок 6). Устранение неполадок: если кнопка «Открыть новый » серая, убедитесь, что предыдущая серия наклона была завершена. Если нет, завершите работу, нажав « Наклонная серия» > «Завершить».
    2. Установите крайние углы наклона в полях «Наклон в » и « Конец в », обычно -60° и +60° соответственно, а также приращение, обычно 2°.
    3. Для симметричного режима дозы (рекомендуется - убедитесь, что режим низкой дозы все еще активен) установите флажок Запускать серию в двух направлениях от ___. Заготовка обычно равна 0, но может использоваться для компенсации предварительно наклоненных ламелей FIB (например, под углом 20°).
    4. Для простоты установите флажок Сохраняйте время экспозиции постоянным. Изменение этого требования требует некоторой доработки расчета воздействия, а также может мешать алгебраическим реконструкциям (например, ART/SART/SIRT), которые сравнивают прогнозируемые интенсивности с исходными данными (см. шаг 7.1).
    5. Установите флажок Пропустить автофокусировку. Маленький угол полусходимости, такой как 1 мрад, подразумевает такую большую глубину резкости, что фокусировка может быть ненужной. В качестве теста сфокусируйтесь на 0°, наклоните до 60° или -60° и нажмите кнопку «Запись». Поддержание фокуса — это, прежде всего, вопрос точной эуцентрической высоты. Для большей конвергенции может потребоваться фокусировка во время серии. В этом случае возьмите вид и на вкладке «Контроль низкой дозы» определите положение области и фокуса, а также отрегулируйте область фокусировки.
    6. Начальные и конечные действия: Если эуцентрическая регулировка высоты была выполнена точно, нет необходимости повторять ее. Снимите флажок Закрывайте клапаны колонны в конце серии , если нет веских причин не делать этого.
    7. Для отслеживания параметров управления существует множество вариантов. При автоматическом сборе данных первоочередной задачей является предотвращение остановки программы для ввода данных пользователем. Используйте рекомендуемые настройки: повторите Запись, если процент потерянного поля больше 5. Затем отслеживайте после и установите флажки « Выровнять по предварительному просмотру перед получением новой ссылки на дорожку » и «Получить новую ссылку на дорожку », если выравнивание записи отличается на 2%. Для автоматического сбора данных применяйте более строгие параметры, чтобы избежать риска потери часов инструментального времени.
    8. Когда будете готовы начать, нажмите кнопку GO в нижней части окна. В конце выберите «Наклонная серия» > «Завершить».

5. Пакетный сбор в нескольких точках с помощью навигатора (Улучшение #1)

ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол находится в зачаточном состоянии, поскольку: а) он идентичен ТЕА и б) появляются новые инструменты, которые, вероятно, сделают полное описание устаревшим.

  1. Загрузите полный монтаж сетки в главное окно.
  2. Выберите ряд областей, которые выглядят многообещающе. Нажмите кнопку «Добавить точки » и добавьте к центрам выбранных квадратов сетки. Нажмите «Добавить баллы » еще раз, чтобы отключить режим.
  3. Активировав состояние визуализации с низкой дозой, выберите окно «Навигатор» > установите флажок «Получить и создать файл » в разделе «Элемент» для каждого из выбранных квадратов. Во-первых, откроется диалоговое окно для свойств файла (рисунок 7), а затем имя файла. Выберите «Монтаж изображений», а затем в диалоговом окне « Настройка монтажа » (рисунок 8) установите флажок «Использовать параметры просмотра в режиме низкой дозы » и сделайте сетку достаточно большой, чтобы покрыть квадрат (примерно 100 x 100 мкм).
  4. Нажмите на меню «Навигатор» > «Приобрести в элементах» и выберите параметры для отображения. Самое главное, что в разделе «Основные действия» отметьте « Создать карту навигатора», затем « Грубая эвцентричность » и « Точная евцентричность» и нажмите «Перейти» (рисунок 9). Для сетки размером 200 меш это приведет к отображению примерно всего квадрата (рис. 10)
  5. Подготовьтесь к выбору положения томограммы. Откройте новый файл, нажав кнопку «Файл» > «Открыть новый». Присвойте ему имя файла (например, AnchorMaps.mrc).
    1. При активном режиме «Низкая доза» войдите в « Камера и сценарий» > «Настройка » и убедитесь, что «Просмотр» и «Предварительный просмотр» находятся в одном и том же биннинге (в противном случае они не могут быть сохранены в одном файле).
    2. Посетите точки на квадратных картах, щелкнув окно Навигатор > Перейти к XYZ.
    3. Выберите позицию для первой томограммы маркером. Сделайте предварительный просмотр изображения и уточните положение, перетащив его правой кнопкой мыши. Затем выберите окно « Навигатор» > «Новая карта» и нажмите «Да » в диалоговом окне для сохранения. Затем сделайте вид изображения той же области и снова сохраните как новую карту. Убедитесь, что Карта просмотра выделена, и установите флажок Для состояния привязки в окне Навигатор в правом верхнем углу.
    4. Выберите вторую позицию, снова сделайте предварительный просмотр и уточните местоположение, как указано выше, и на этот раз нажмите Anchor Map в окне Navigator. Это сохранит как предварительный просмотр, так и вид как новые карты в навигаторе.
    5. Повторите шаг 5.5.4 для всех нужных расположений. Переходите от одного квадрата сетки к другому, выделив точку и нажав Перейти к XYZ в окне Навигатора.
  6. Для эталонной фокусировки выберите четкую область сетки и тщательно сфокусируйтесь, вручную или с помощью автофокуса. Нажмите «Сброс», чтобы разфокусироваться на панели микроскопа. Создайте сценарий в SerialEM, щелкнув Script > Edit > Edit 15 (или другой свободный номер) и введите две строки: ScriptName SetDefocus и SetDefocus 0.
  7. В окне «Навигатор» выделите первое местоположение («Просмотр» или «Вид»). Нажмите Shift-T, затем выделите последнее местоположение и снова нажмите Shift-T. Откроется диалоговое окно «Свойства файла». Выберите однокадровые изображения и параметры для сохранения, включая имя файла. Измените имя файла, но оставьте метку элемента в конце.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Имена файлов, оканчивающиеся на цифры, будут обновляться автоматически для последовательных серий наклона. Удобно использовать опцию «Меню навигатора» > «Навигатор». Опции > Использовать метки элементов в именах файлов.
  8. Далее автоматически откроется меню настройки серии Tilt. Заполняйте, как и раньше (рис. 6), но не выбирайте «Уточнить эцентричность». Точки предварительного просмотра в навигаторе теперь будут помечены как TS. Вернуться в это меню можно с помощью кнопки в окне Навигатор над списком элементов.
  9. Выберите меню «Навигатор» > «Приобрести в элементах». На этот раз выберите параметры для окончательных данных. Выберите «Основное действие: получение серии наклонов» и выберите «Управление дьюарами/пылесосом», «Перевыравнивание по элементу», «Точная эвцентричность» и «Запуск сценария перед действием» сS-криптом для запуска: SetDefocus. Выберите общие параметры: нет окна сообщения при возникновении ошибки и закройте клапаны колонны в конце, затем нажмите GO (рисунок 11). Теперь SerialEM посетит все карты Anchor и запишет серию наклонов в каждой позиции (рис. 12).

6. Регистрация карты CLEM (Улучшение #2)

  1. Если это еще не было сделано, загрузите полный монтаж сетки в главное окно, а затем создайте новое окно, щелкнув « Окно» > «Новое окно », и присвойте ему имя. Обратите внимание, что полный монтаж сетки отображается в Регистрации 1.
  2. Импортируйте изображение карты CLEM, щелкнув меню Навигатор > Импортировать карту. Он должен войти в Регистрацию 2. Ему также может быть назначено новое окно, как указано выше.
  3. Проверьте карту CLEM, чтобы определить относительное вращение по отношению к полному монтажу сетки. Проще всего это сделать на карте, на которой появляются полосы сетки. Обратите внимание, что карта также может быть перевернута. Выровняйте его примерно с помощью меню «Навигатор» > «Повернуть карту» и при необходимости перевернуть.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Следующий шаг также может приспособиться к перевороту, но если сделать это заранее, это значительно облегчит следующее. Этот шаг можно повторять до тех пор, пока выравнивание не будет выглядеть удовлетворительным, но это не обязательно.
  4. Введите точки регистрации для точного выравнивания. Разместите ряд соответствующих точек на одном, а затем на другом окне. Для каждой такой точки поставьте галочку напротив пункта Точка регистрации в самом верху окна Навигатора. Соответствующие точки будут помечены восходящим индексом, за которым следует R1 или R2 для монтажа сетки или импортированной карты соответственно.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Использование сеток поиска делает этот шаг очень простым. В противном случае выберите сплошные объекты, такие как центральный маркер или углы квадратов сетки. В принципе, для грубого выравнивания достаточно трех точек, но большее количество точек помогает компенсировать незначительные несоответствия в монтажных конструкциях.
  5. Если требуется несколько каналов карты CLEM, например, разные флуоресцентные цвета или флуоресценция без яркого поля фона, импортируйте их, как показано на шаге 6.2 выше, и измените регистрацию на 2. Таким образом, они унаследуют точки регистрации с первой карты.
  6. Наложите регистрацию по меню «Навигатор» > «Трансформация элементов». Соответствующие точки регистрации теперь появятся на всех картах, которые будут перечислены в Регистрации 1. Чтобы визуально выровнять карту, выберите меню Навигатор > Повернуть карту. Обратите внимание, что когда карта загружается из окна Навигатора, она не поворачивается автоматически, если не установлен флажок Повернуть при загрузке . Его всегда можно повернуть из окна Навигатора.
  7. Теперь должна быть возможность разместить маркер или точку на флуоресцентной карте и переместить сцену в соответствующее место на сетке (рис. 13).

7.3D реконструкция

  1. Это включает в себя те же основные этапы, что и томография ПЭМ: выравнивание серии наклона с последующим, как правило, обратной проекцией. Имеется несколько программных платформ, и данные могут обрабатываться аналогично данным ТЕА, за исключением того, что коррекция CTF должна быть пропущена.
  2. Применяйте нормализацию интенсивности, чтобы увеличить вклад проекций с высоким наклоном или сбалансировать изменение освещенности во время серии, с оговоркой, что это влияет на количественную информацию. Например, IMOD26 работает хорошо, в то время как AreTomo27 очень полезен для безфидуциального выравнивания; там, где присутствуют фидуциальные частицы, ClusterAlign28 может следовать за ними как за кластерами, а не за отдельными пятнами; это особенно полезно для данных STEM, где пятна могут быть потеряны или скрыты высококонтрастными элементами.
  3. Выполните реконструкцию с помощью 3D-деконволюции29 для повышения контрастности и шумоподавления. После восстановления предоставьте данные объема STEM любым из стандартных методов, таких как ортеслизы или изоповерхностная сегментация. Примечательно, что распределение интенсивности является униполярным, без контрастных инверсий или полос Фурье, которые появляются в обычных фазово-контрастных ПЭМ. Интересным средством представления STEM-томограмм в целом является инвертирование светлого поля (рис. 14). Эффект заключается в том, что «рентгеновские глаза» видят плотные объекты, представляющие интерес, через осветленную ячейку30.

Representative Results

Полный монтаж сетки, подготовленный в STEM, показывает области с интересующими ячейками (рис. 4). Обратите внимание, что изображение находится в темном поле, поэтому пустые отверстия кажутся темными. Клетки выглядят частично яркими, где электроны рассеиваются по направлению к детектору HAADF. В самых толстых частях, обычно в центрах или рядом с полосами сетки, контраст снова становится темным. Это происходит из-за многократного рассеяния, при котором электроны достигают углов, не захваченных детектором. На практике эти участки будут слишком толстыми для томографии.

На следующем этапе используются карты промежуточного увеличения (рисунок 10). Их часто называют средними монтажными картами или квадратными картами, относящимися к квадратам сетки, а не к форме. Даже в самом низком микрозондовом режиме STEM они также будут получены в виде монтажных изображений. При нажатии на элемент в окне Навигатор изображение карты загружается в главное окно. В этой области выбираются конкретные точки для получения томограммы. Используйте режим предварительного просмотра, чтобы найти область при увеличении записи. Имейте в виду, что между предварительным просмотром и записью может быть боковой сдвиг в зависимости от скорости сканирования. Здесь может быть записана одна серия наклонов. Митохондрии, например, часто могут быть идентифицированы на изображении предварительного просмотра и записи (рис. 12).

При пакетной томографии стадия будет перемещаться по сетке и может не вернуться в точно такое же место. Карты привязки используются для обеспечения надежной идентификации нужных областей записи путем сопоставления изображения предварительного просмотра с видом с меньшим увеличением, даже если движение рабочей области сместилось. PyEM23,24 предлагает более быструю альтернативу, которая, безусловно, рекомендуется, но еще не является частью стандартной установки.

В подходе CLEM флуоресцентная карта может быть использована для определения областей, представляющих интерес для томографии. Флуоресценция приобретается снаружи и должна быть зарегистрирована на полном монтаже сетки. Полезно, чтобы полосы сетки и отверстия были видны, поэтому перед импортом можно подготовить объединенный композит флуоресценция + светлое поле, например, в программном обеспечении GIMP (https://www.gimp.org) или ImageJ31 (следите за тем, чтобы ImageJ инвертировал вертикальную ось). Когда динамический диапазон флуоресценции велик, может быть трудно создать такое слияние без насыщения. В этом случае две карты могут быть импортированы отдельно, а затем зарегистрированы вместе, как описано (рисунок 13). Таким образом, точка на флуоресцентной карте в окне навигатора, за которой следует «Перейти к XY», переводит сцену в соответствующее положение на сетке, установленную в TEM. Позаботьтесь о том, чтобы небольшие несоответствия при создании монтажа (или флуоресцентной карты, если это тоже монтаж) привели к небольшим смещениям; Поэтому для оптимальной точности флуоресценцию следует перерегистрировать именно на квадратную карту. Часто бывает достаточно сделать эту регистрацию на глаз, на основе отверстий в опорной пленке или элементов, общих с изображением яркого поля.

Реконструкция серии наклонов приводит к 3D-объему (рис. 14). Этот пример имеет размер пикселя 2.042 нм, что приводит к полю зрения ~4 мкм. Отложения фосфата кальция (оранжевые наконечники стрелок) выделяются из-за более высокого атомного номера по сравнению с окружающими. Микротрубочки (красные наконечники стрелок) прослеживаются по всему полю зрения. Кроме того, хорошо видны внутренняя и внешняя митохондриальные мембраны (зеленые наконечники стрелок). Актин можно наблюдать в виде пучков или отдельных нитей. Для достижения более изотропного разрешения реконструкция может быть обработана деконволюцией.

Figure 1
Рисунок 1: Сравнение ТЕА и STEM. В ПЭМ поле зрения освещается почти параллельным лучом, и объектив формирует увеличенное изображение на камере. Для крио-ПЭМ апертура объектива открывается для пропуска рассеянных электронных волн (пунктирная красная линия), которые при расфокусировке создают фазовый контраст за счет интерференции с нерассеянными (зелеными) волнами. STEM, с другой стороны, направляет сфокусированный луч через образец и собирает рассеянные электроны попиксельно. Несколько детекторов могут собирать электроны, рассеянные под разными углами. Эта цифра была изменена с30. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: Пример искажения изображения с левой стороны из-за высокой скорости сканирования. Обратите внимание на искажения, отмеченные желтыми наконечниками стрелок, а также на искаженные отверстия овальной формы в квантифойле. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3: Диалог настройки монтажа для всего монтажа сетки. Выберите увеличение и количество частей в X и Y так, чтобы общая площадь достигала около 2,000 мкм, чтобы получить карту для большей части сетки. Кроме того, выберите «Переместить рабочую область вместо смещения изображения» и «Использовать монтажное сопоставление», а не «Запись параметров». Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 4
Рисунок 4: Полная карта GridMap с малым увеличением, записанная в режиме STEM. Сломанные области кажутся полностью черными на изображении в темном поле. Темно-серые участки, вероятно, слишком толстые и плохо остеклованы. Хорошими областями-кандидатами для томографии являются белые или светло-серые в этом сканировании. Масштабная линейка = 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 5
Рисунок 5: Переход к процессу маркера. Узнаваемый объект отмечен на карте с низким разрешением с помощью Add Points (38 на этом изображении). Обратите внимание на сдвиг между картой с низким разрешением (зеленый кружок) и картой среднего разрешения (оранжевый кружок). Затем объект помечается маркером (зеленый крестик, красный кружок) и запускается диалоговое окно «Переход к маркеру». Выбранная опция перемещает все карты в 245x на одинаковую величину. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 6
Рисунок 6: Диалог настройки серии наклона для серии наклона STEM. Используется дозосимметричная схема от -60° до +60° с шагом 2°. Автофокус пропускается из-за большой глубины резкости при использовании малого угла схождения. Не нужно уточнять эйцентричность, как это делалось раньше. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 7
Рисунок 7: Диалог свойств файла для карт среднего разрешения. Сохраните как файл стека MRC, выберите целые числа и сохраните дополнительную информацию в файле метаданных .mdoc. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 8
Рисунок 8: Диалог настройки монтажа для сохранения карт среднего разрешения. Для квадрата на сетке 200 меш, ширина которой составляет 90 мкм, рекомендуется общая площадь не менее 90 мкм х 90 мкм. Выберите «Переместить сцену» вместо «Смещение изображения» и «Использовать параметры просмотра в режиме низкой дозы». Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 9
Рисунок 9: Карта записи среднего разрешения. Диалоговое окно «Получить в элементах» для записи карт среднего разрешения. Выберите «Картографирование», «Получить и сохранить изображение» или «Монтаж» и установите флажок «Создать карту навигатора». В разделе «Задачи до или после первоначального общества» выберите «Грубая и тонкая эвцентричность». При отсутствии посторонней помощи при необходимости выберите «Нет окна сообщения при возникновении ошибки» и «Закрыть клапаны колонки в конце». Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 10
Рисунок 10: Изображение карты среднего разрешения. Карта среднего разрешения (Square Map), записанная в режиме STEM путем монтажа 3 x 3. Две карты привязки среднего разрешения для сбора данных обозначены синими квадратами. Масштабная линейка = 10 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 11
Рисунок 11: Данные серии пакетного наклона. Приобретите в диалоговом окне «Предметы» для сбора серий наклона пакетов. Для сбора данных наклонных рядов выберите «Окончательные данные» и «Получить наклонные ряды». В разделе «Задачи до или после основного» установите флажки «Управление дьюарами/вакуумом» (выберите соответствующие настройки в меню «Настройка»), «Перенастроить на элемент», «Точная эвцентричность» и «Запустить сценарий перед действием». В параметрах «Общие» установите флажок «Нет сообщения при возникновении ошибки» и «Закрыть клапаны колонны в конце» (см. 5.14). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 12
Рисунок 12: наклон серии наклона STEM митохондрии на 0°. Оранжевые наконечники стрелок указывают на отложения фосфата кальция (матричные гранулы), зеленые наконечники стрелок - на кристы, а красные наконечники стрелок - на фидуциальные маркеры золота 15 нм. Масштабная линейка = 500 нм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 13
Рисунок 13: Зарегистрированные карты крио-CLEM. (A) Карта STEM среднего разрешения (квадратная карта, 26-A) регистрируется в (B) карте STEM с низким разрешением, (C) крио-FM-карте канала BF и (D) крио-FM-карте канала GFP. Девять регистрационных точек (метки 4-21) показаны в навигаторе (E). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 14
Рисунок 14: Объемный рендеринг. Объемный рендеринг срезов толщиной (A) 60 нм и (B) толщиной 40 нм через SIRT-подобную (30 циклов) фильтрованную томограмму на разной глубине. Размер пикселя составляет 2,048 нм, что приводит к полю зрения примерно 4 мкм. Обратите внимание на инвертированную плотность по сравнению с рисунком 12, что означает, что объекты высокой интенсивности яркие. Оранжевые, белые, красные, зеленые и светло-голубые наконечники стрелок указывают на отложения фосфата кальция, рибосомы, микротрубочки, внутреннюю и внешнюю митохондриальную мембрану и актиновые филаменты соответственно. Масштабная линейка = 500 нм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Discussion

Протокол должен помочь специалистам по микроскопам в области медико-биологических наук, которые заинтересованы в получении 3D-изображения внутриклеточных органелл в областях клетки, недоступных для обычной томографии ПЭМ. Тот же протокол может быть использован и для STEM-томографии пластических срезов с ослабленными ограничениями на экспозицию. Протокол следует рассматривать как отправную точку, а не как набор жестких правил. Действительно, сила STEM заключается в его гибкости; Не существует единственно правильного способа его эксплуатации.

Подчеркнем, что STEM сам по себе относится только к сканируемому зонду и не определяет формирование изображения. Контрастность зависит, прежде всего, от конфигурации детекторов. В более простых методах используются детекторы с осевой симметрией, либо диск, центрированный на оптической оси, либо кольцевое кольцо, окружающее его. Как правило, когда освещение воздействует непосредственно на детектор, мы записываем изображение BF, на котором образец (рассеивающий электроны) кажется темным; И наоборот, когда детектор собирает только рассеянные электроны, мы записываем DF-изображение, на котором плотный образец кажется ярким. При наличии подходящего оборудования SerialEM может получать и записывать оба этих сигнала одновременно. Доступны еще более сложные конфигурации, начиная от детекторов с несколькими сегментами и заканчивая полностью пиксельными камерами. Фазово-контрастная визуализация может быть достигнута, например, путем оценки разницы между внеосевыми детекторными элементами32,33. Сбор всей картины 2D-рассеяния (дифракции) на пиксель определяет метод, известный как 4D STEM34, который позволяет реконструировать несколько контрастов изображения из одних и тех же исходных данных. Четырехмерная STEM позволяет проводить электронную птихографию, которая обеспечивает еще один способ получения фазового контраста35.

Мы сосредоточились на конкретном методе STEM, который мы считаем наиболее полезным для изучения органелл и интактных клеток или срезов клеток толщиной в микрон. Это влечет за собой, в частности, использование BF-изображений с небольшим углом полусходимости в освещении и относительно большим углом сбора на детекторе. Малая сходимость обеспечивает большую глубину резкости, так что весь образец остается в фокусе на протяжении всей сериинаклона 19. На практике, при хорошем столике микроскопа, это также может устранить необходимость регулировки фокуса во время съемки. Цена является компромиссом в разрешении, как описано в разделе 3 протокола. Мы предложили изображения 4k с зондом ~2 нм, который с шагом пикселя 1 нм достигает поля зрения 4 мкм. Тем не менее, читателю настоятельно рекомендуется экспериментировать. Второе соображение находится на стороне детектора. Когда диск осветки недополняет осевой детектор БФ, фазовый контраст подавляется и преобладает рассеивающий (амплитудный) контраст; Это состояние было названо некогерентным контрастом яркого поля36. Вопрос в том, какой фракцией недоливать, и ответ зависит от пробы. Очень тонкий образец покажет наилучший контраст с полностью заполненным детектором (т. е. угол сбора совпадает с углом освещения), но более толстый образец рассеет всю интенсивность, оставляя зашумленный сигнал с плохим контрастом. Полезное эмпирическое правило заключается в том, что чем толще образец, тем больший внешний угол среза детектора BF должен бытьравен 21. Размер и положение детектора, конечно, фиксированы, поэтому размер дифракционного диска регулируется с помощью длины камеры, как описано в разделе 1. Если настройки усилителя детектора таковы, что сигнал заполняет динамический диапазон, но не насыщается при прямом освещении (1.12.3), то длину камеры можно увеличивать до тех пор, пока не будет достигнута разумная интенсивность и контрастность сигнала. Опять же, читателю предлагается экспериментировать. Искусство, так сказать, в углах.

Еще одним параметром, не рассматриваемым в протоколе, является напряжение ускорения микроскопа. Взаимодействие освещающих электронов с образцом будет сильнее при более низком напряжении. При прочих равных условиях мы можем ожидать более высокой контрастности при более низком напряжении. С другой стороны, именно начало многократного рассеяния в образце ограничивает полезную толщину образца, поэтому более высокое напряжение позволяет использовать более толстые образцы. Однако эти эффекты довольно тонкие. Наш опыт на сегодняшний день с ускорениями 200 кВ и 300 кВ аналогичен.

Учитывая, что можно ожидать от STEM с точки зрения разрешения, это опять же зависит от образца и конфигурации детектора. Используя подход к анализу с одной частицей, ионы металлов на ферритине могут быть локализованы кольцевым темным полем STEM с точностью до нескольких ангстрем37. Совсем недавно субнанометровое разрешение было достигнуто для образцов вирусов и белков с использованием изображений, полученных с помощью интегрированного дифференциального фазового контраста (iDPC) STEM32 , а также птихографии35. Для уникальных объектов в толстоклеточных образцах и при описанных здесь методах такое высокое разрешение нереально. Оптимальным разрешением является диаметр зонда, который относится к описанному углу полусходимости. Другие факторы ухудшают разрешение, в частности, грубая выборка пикселей для достижения большого поля зрения, смещения в серии наклона и распространение луча зонда при передаче. Снимки хорошо сравниваются с томографией пластического сечения. Например, с помощью описанной здесь установки должно быть легко увидеть полое ядро микротрубочек, но не отдельные протофиламенты.

Подводя итог, можно сказать, что методы STEM и аппаратное обеспечение находятся на стадии разработки. Мы можем ожидать, что инновации в области визуализации также повлияют на томографию, что приведет STEM к областям, которые не были доступны другим методам. Мы ожидаем, что конвергенция с корреляционной криогенной флуоресцентной визуализацией, основанной на современных оптических методах сверхразрешения, будет особенно плодотворной. Масштаб органелл, 100-1000 нм, является идеальной мишенью для этих новых методов.

Disclosures

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Acknowledgments

Мы чрезвычайно благодарны за постоянную и постоянную поддержку со стороны автора и сопровождающего программного пакета SerialEM Дэвида Мастронаде и Гюнтера Реша. P.K. финансировался Австрийским научным фондом (FWF) через стипендию Шредингера J4449-B. В целях открытого доступа авторы применили публичную лицензию CC-BY об авторском праве к любой версии рукописи, принятой автором, вытекающей из этого представления. М.Е. и С.Г.В. признают финансирование Израильского научного фонда, грант No 1696/18, и твиннинг-проекта Европейского Союза «Горизонт 2020», ImpaCT (грант No 857203). M.E. признает финансирование со стороны ERC в проекте CryoSTEM (грант No 101055413). М.Е. является действующим профессором кафедры Сэма и Айялы Закс и главой Центра нано- и био-нановизуализации Ирвинга и Черны Московиц. Лаборатория М.Е. извлекла выгоду из исторической щедрости семьи Гарольда Перлмана. Мы также признаем финансирование со стороны Европейского союза. Однако выраженные взгляды и мнения принадлежат только автору (авторам) и не обязательно отражают взгляды и мнения Европейского Союза или Исполнительного агентства Европейского исследовательского совета. Ни Европейский Союз, ни орган, предоставляющий гранты, не могут нести за них ответственность.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
 SerialEM University of Colorado Veriosn 4.0 SerialEM is a free software platform for microscope control and data acquisition. 
STEM-capable transmission electron microscope The protocol was written based on experience with several microscopes of Thermo Fisher Scientific: Titan Krios, Talos Arctica, and Tecnai T20-F. In principle it should be applicable to other manufacturers as well.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Elbaum, M. Expanding horizons of cryo-tomography to larger volumes. Current Opinion in Microbiology. 43, 155-161 (2018).
  2. Schertel, A., et al. Cryo FIB-SEM: Volume imaging of cellular ultrastructure in native frozen specimens. Journal of Structural Biology. 184 (2), 355-360 (2013).
  3. Do, M., Isaacson, S. A., McDermott, G., Le Gros, M. A., Larabell, C. A. Imaging and characterizing cells using tomography. Archives of Biochemistry and Biophysics. 581, 111-121 (2015).
  4. Groen, J., Conesa, J. J., Valcárcel, R., Pereiro, E. The cellular landscape by cryo soft X-ray tomography. Biophysical Reviews. 11 (4), 611-619 (2019).
  5. Kapishnikov, S., et al. Oriented nucleation of hemozoin at the digestive vacuole membrane in Plasmodium falciparum. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (28), 11188-11193 (2012).
  6. Kapishnikov, S., et al. Unraveling heme detoxification in the malaria parasite by in situ correlative X-ray fluorescence microscopy and soft X-ray tomography. Scientific Reports. 7 (1), (2017).
  7. Sviben, S., et al. A vacuole-like compartment concentrates a disordered calcium phase in a key coccolithophorid alga. Nature Communications. 7, 11228 (2016).
  8. Wan, W., Briggs, J. A. Cryo-electron tomography and subtomogram averaging. Methods in Enzymology. , 329-367 (2016).
  9. Zhang, P. Advances in cryo-electron tomography and subtomogram averaging and classification. Current Opinion in Structural Biology. 58, 249-258 (2019).
  10. Bäuerlein, F. J. B., Baumeister, W. Towards visual proteomics at high resolution. Journal of Molecular Biology. 433 (20), 167187 (2021).
  11. Elbaum, M., Seifer, S., Houben, L., Wolf, S. G., Rez, P. Toward compositional contrast by cryo-STEM. Accounts of Chemical Research. 54 (19), 3621-3631 (2021).
  12. Elbaum, M., Wolf, S. G., Houben, L. Cryo-scanning transmission electron tomography of biological cells. MRS Bulletin. 41 (7), 542-548 (2016).
  13. Wolf, S. G., Houben, L., Elbaum, M. Cryo-scanning transmission electron tomography of vitrified cells. Nature Methods. 11 (4), 423-428 (2014).
  14. Houben, L., Weissman, H., Wolf, S. G., Rybtchinski, B. A mechanism of ferritin crystallization revealed by cryo-STEM tomography. Nature. 579 (7800), 540-543 (2020).
  15. Li, Y., Huang, W., Li, Y., Chiu, W., Cui, Y. Opportunities for cryogenic electron microscopy in materials science and nanoscience. ACS Nano. 14 (8), 9263-9276 (2020).
  16. Hohmann-Marriott, M. F., et al. Nanoscale 3D cellular imaging by axial scanning transmission electron tomography. Nature Methods. 6 (10), 729-731 (2009).
  17. Engel, A. Scanning transmission electron microscopy: biological applications. Advances in Imaging and Electron Physics. 159, 357-386 (2009).
  18. Wolf, S. G., Elbaum, M. CryoSTEM tomography in biology. Methods in Cell Biology. 152, 197-215 (2019).
  19. Biskupek, J., Leschner, J., Walther, P., Kaiser, U. Optimization of STEM tomography acquisition-A comparison of convergent beam and parallel beam STEM tomography. Ultramicroscopy. 110 (9), 1231-1237 (2010).
  20. Trepout, S., Messaoudi, C., Perrot, S., Bastin, P., Marco, S. Scanning transmission electron microscopy through-focal tilt-series on biological specimens. Micron. 77, 9-15 (2015).
  21. Rez, P., Larsen, T., Elbaum, M. Exploring the theoretical basis and limitations of cryo-STEM tomography for thick biological specimens. Journal of Structural Biology. 196 (3), 466-478 (2016).
  22. Mastronarde, D. N. Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements. Journal of Structural Biology. 152 (1), 36-51 (2005).
  23. Schorb, M., Haberbosch, I., Hagen, W. J. H., Schwab, Y., Mastronarde, D. N. Software tools for automated transmission electron microscopy. Nature Methods. 16 (6), 471-477 (2019).
  24. Sheng, Y., Morris, K., Radecke, J., Zhang, P. Cryo-electron tomography remote data collection and subtomogram averaging. Journal of Visualized Experiments. (185), e63923 (2022).
  25. Weis, F., Hagen, W. J. H., Schorb, M., Mattei, S. Strategies for optimization of cryogenic electron tomography data acquisition. Journal of Visualized Experiments. (169), e62383 (2021).
  26. O'Toole, E., vander Heide, P., McIntosh, J. R., Mastronarde, D. Large-scale electron tomography of cells using SerialEM and IMOD. Cellular Imaging: Electron Tomography and Related Techniques. , 95-116 (2018).
  27. Zheng, S., et al. AreTOMO: An integrated software package for automated marker-free, motion-corrected cryo-electron tomographic alignment and reconstruction. Journal of Structural Biology. (6), 100068 (2022).
  28. Seifer, S., Elbaum, M. ClusterAlign: A fiducial tracking and tilt series alignment tool for thick sample tomography. Biological Imaging. 2, 7 (2022).
  29. Waugh, B., et al. Three-dimensional deconvolution processing for STEM cryotomography. Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (44), 27374-27380 (2020).
  30. Kirchenbuechler, D., et al. Cryo-STEM tomography of intact vitrified fibroblasts. AIMS Biophysics. 2 (3), 259-273 (2015).
  31. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  32. Lazić, I., et al. Single-particle cryo-EM structures from iDPC-STEM at near-atomic resolution. Nature Methods. 19 (9), 1126-1136 (2022).
  33. Seifer, S., Houben, L., Elbaum, M. Flexible STEM with simultaneous phase and depth contrast. Microscopy and Microanalysis. , 1-12 (2021).
  34. Ophus, C. Four-dimensional scanning transmission electron microscopy (4D-STEM): from scanning nanodiffraction to ptychography and beyond. Microscopy and Microanalysis. 25 (3), 563-582 (2019).
  35. Zhou, L., et al. Low-dose phase retrieval of biological specimens using cryo-electron ptychography. Nature Communications. 11 (1), 2773 (2020).
  36. Nellist, P. D. The principles of STEM imaging. Scanning Transmission Electron Microscopy: Imaging and Analysis. , 91-115 (2011).
  37. Elad, N., Bellapadrona, G., Houben, L., Sagi, I., Elbaum, M. Detection of isolated protein-bound metal ions by single-particle cryo-STEM. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (42), 11139-11144 (2017).

Tags

Биология выпуск 196
Визуализация органелл <em>in situ</em> с помощью крио-STEM-томографии
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kirchweger, P., Mullick, D., Wolf,… More

Kirchweger, P., Mullick, D., Wolf, S. G., Elbaum, M. Visualization of Organelles In Situ by Cryo-STEM Tomography. J. Vis. Exp. (196), e65052, doi:10.3791/65052 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter