Summary
ここでは、チベット医学における複雑な天然物製剤(マトリックス)中の微量および微量成分を特定するために適用できる一般的なプロトコルと設計について説明します。
Abstract
チベットの医薬品は複雑で、未知の化合物を多数含んでいるため、その分子構造に関する詳細な研究が不可欠です。液体クロマトグラフィー-エレクトロスプレーイオン化飛行時間型質量分析(LC-ESI-TOF-MS)は、チベット医学の抽出に一般的に使用されます。しかし、スペクトルデータベースを使用した後、多くの予測不可能な未知の化合物が残っています。本稿では、イオントラップ質量分析(IT-MS)を用いてチベット医学の成分を同定するための普遍的な方法を開発しました。この方法には、サンプル調製、MS設定、LCプリラン、メソッド確立、MS取得、多段階MS操作、および手動データ分析のための標準化およびプログラムされたプロトコルが含まれます。チベット医学 Abelmoschus manihot 種子中の2つの代表的な化合物は、典型的な化合物構造の詳細な分析とともに、多段階の断片化を使用して同定されました。さらに、イオンモードの選択、移動相調整、スキャン範囲の最適化、衝突エネルギー制御、衝突モードの切り替え、フラグメンテーション要因、および方法の制限などの側面について説明します。開発された標準化された分析法は普遍的であり、チベット医学の未知の化合物に適用することができます。
Introduction
伝統的な漢方薬(TCM)における微量成分の定性的分析は、研究の重要なトピックになっています。TCMには化合物の数が多いため、核磁気共鳴分光計(NMR)やX線回折装置(XRD)分析のためにそれらを分離することは困難であり、少量のサンプルしか必要としない質量分析(MS)ベースの方法がますます普及しています。さらに、MSと組み合わせた液体クロマトグラフィー(LC)は、複雑なサンプルの分離の改善と化合物の定性分析のために、近年TCM研究で広く使用されています1。一般的な方法の1つは、液体クロマトグラフィー-エレクトロスプレーイオン化飛行時間型質量分析(LC-ESI-TOF-MS)であり、チベット医学の質的研究で広く使用されています2。この方法では、複雑な成分をLCカラムで濃縮および分離し、MS検出器を使用して付加体イオンの質量電荷比(m/z)を観察します。タンデム MS(MS/MS または MS2)データベースの検索は、現在、四重極飛行時間型 (Q-TOF) MS および Orbitrap MS3 を使用した低分子分析において、信頼性の高い化合物アノテーションを得るための最速のアプローチです。しかしながら、データベースの質の低さと様々な異性体の存在は未知の化合物の同定を妨げる。さらに、MS/MSデータベースによって提供される情報は制限されています4,5,6,7。他のTCMに広く適用できる一般的なプロトコルを使用して、各TCMの化合物を調査することは重要です。
IT-MSは、リング電極8に異なる無線周波数(RF)電圧を印加することにより、広範囲のイオンを捕捉する。IT-MSは、さまざまな時系列で時系列の多段階MSスキャンを実行でき、成分の多段階MS(MS n)フラグメンテーションを提供します(nはプロダクトイオンステージの数9)。リニアIT-MSは、シーケンシャルMSn実験に使用できるため、構造同定に最適と考えられています10。標的イオンは、リニアIT-MS1で単離および蓄積できます。IT-MSのMSn(n ≥ 3)は、Q-TOF-MSのMS/MSよりも多くのフラグメント情報を提供します。IT-MSは標的イオンとそのフラグメントイオンをロックできないため、異性体1を含む未知化合物の構造解明のための強力なツールです。MSn技術は、未知のタンパク質、ペプチド、および多糖類の構造解析に広く適用されています11,12。MSnのフラグメントイオンの存在量は、Q-TOF-MSのMS/MSよりも複雑なサンプル中の標的化合物に関するより多くの分子フラグメント情報を提供します。したがって、TCMの構造同定にMSn技術を適用することが不可欠です。
チベット医学はTCM13の重要な要素であり、これらの薬は主に高原地域で見つかった動物、植物、鉱物に由来します14。チベット薬のアベルモスカス・マニホット種子(AMS)は、アベルモスカス・マニホット(リン)メディカスの種子です。AMSは、アトピー性皮膚炎、リウマチ、ハンセン病などの症状を治療するために使用される伝統的な漢方薬です。抗菌、抗真菌、抗癌、抗酸化、抗炎症効果を持つカルコンが含まれています15。本研究では、MS nの手順を改善し、IT-MSとMSnを使用してチベット医学AMSの化合物構造を特定するための詳細な方法を開発した。イオンモード、スキャン範囲、衝突モードなどの特定のMSパラメータは、微量化合物の同定における問題を克服するために最適化されました。この研究は、TCMにおける微量化合物の標準化された構造同定を促進することを目的としています。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. サンプル調製
- AMSサンプル1 gを正確に計量し、30 mLの80%メタノールを入れた円錐フラスコに入れます。混合物を超音波浴超音波処理器に移し、25°Cで30分間抽出する。 サンプルを14,000 x g で5分間遠心分離します。
注:超音波浴超音波処理器の周波数は40KHzです。 - 注射器と微多孔膜フィルター(0.22 μm、有機のみ)を準備します。上清をろ過して2 mLサンプルボトルに入れます。
2. MS設定
- 真空ポンプのスイッチをオンにします。アルゴンシリンダーのメインバルブと分圧バルブを開き、圧力を約0.3MPaに調整します。窒素バルブを開きます。
注意: 実験条件に十分な真空度を確保するために、少なくとも8時間待ちます。分析前に、アルゴンと窒素のガス圧が十分に高いことを確認してください。 - MS制御ソフトウェアを起動します。ソフトウェアパネルの 加熱SEIソース をクリックし、ヒーター温度(350°C)、シースガス流量(35 arb)、補助ガス流量(15 arb)、スプレー電圧(正モードの場合は3.8 KV、負モードの場合は-2.5 KV)、キャピラリー温度(275 °C)などのMSパラメータを入力します。[ 適用 ]ボタンをクリックして、イオン源をアクティブにします。
3. LCプレラン、メソッド確立、MS取得
- 移動相Aおよび移動相Bをそれぞれ0.1%ギ酸水溶液および純粋なアセトニトリルを用いて調製する。超音波浴超音波処理器で少なくとも15分間脱気する。溶液をそれぞれAとBの流体通路に接続します(図1A)。メタノール-水(1:9 v / v)溶液を準備し、ポンプとインジェクターの洗浄液ボトルに手で充填します。
注:超音波浴超音波処理器の周波数は40KHzです。 - LC-MS制御ソフトウェアを起動します。
- ダイレクトコントロールボタンをクリックして、LCコントロールパネルを開きます。ポンプモジュールのパージバルブを反時計回りに開きます(図1B)。
- [その他のオプション]ボタンをクリックしてポンプ設定を開き、パージパラメータを5 mLmin−1で3分間設定します。[パージ]ボタンをクリックして、バブルの除去を開始します。続いて、パージバルブを閉じます。
- プライムシリンジ、洗浄バッファーループ、およびニードル外部洗浄ボタンをクリックして、シリンジをそれぞれ3サイクル、ループを1サイクル、ニードルを1サイクルすすぎます。サンプルボトルをサンプラーに入れます(図1C)。
- 計測器設定ボタンをクリックして、メソッド編集ウィンドウを開きます。新規ボタンをクリックして、新しいLC-MS装置メソッドを作成します。
- LC メソッドの合計実行時間を設定します。次に、メソッド編集ウィンドウで圧力限界、総流量、流量勾配、サンプル温度、カラム温度、および準備温度デルタを設定する値を入力します。
注:移動相のデフォルトの総流量は、クロマトグラフィーカラムがない場合、カラム温度なしで、50%Aおよび50%Bで0.3 mL/minで一定です。サンプル温度と準備温度デルタのデフォルト値は、それぞれ15°Cと0.1°Cです。その他の設定は、使用する液体クロマトグラフィーカラムのタイプによって異なります。 - MSメソッドの 実験 タイプとして一般MSまたは MSn を選択します。値を入力して、アクイジション時間、極性、質量範囲、迂回値番号、および迂回値期間を設定します。 [保存 ]ボタンをクリックして、インストゥルメントメソッドとして設定を構成します。
注:クロマトグラフィーカラムなしのデフォルト設定は次のとおりです:取得時間、2分;極性、正または負。質量範囲、100〜1,200;転用値番号、2。値の長さを流用する、1.99分。
4.多段階質量分析の操作
- シーケンス設定ボタンをクリックして、 シーケンス テーブルを開きます。
- 表に、サンプルタイプ、ファイル名、パス、サンプルID、装置メソッド、位置、注入量を入力します。
- 保存ボタンをクリックしてシーケンステーブルを記録し、次に[分析の開始]ボタンをクリックして設定を実装し、MS取得を開始します。
注: デフォルトのサンプルタイプは不明として選択されています。インストゥルメントメソッドは、ステップ3.6で保存したメソッドです。サンプルボトルは、サンプルルーム内の固有の場所に配置されます。たとえば、 RA1 はサンプル ルームの赤い領域の最初の行の最初の場所です。デフォルトの注入量は通常2μLで、これはサンプルの濃度によって異なります。
- エクスプローラーで生のファイルをダブルクリックして、MSデータをデータ処理ソフトウェアにロードします。ベースピーククロマトグラム(BPI)で、マウスをクリックしてドラッグすることにより、曲線下面積(AUC)が最大になる領域を選択します。対応するMSスペクトルが同じウィンドウに表示されます。
- 次のMS/MS分析のターゲットイオンを選択します。
- メソッド編集ウィンドウを再度開きます。 MSn 設定 表で、ターゲットイオンのm/zを 親質量 列の小数点以下1桁に設定します。
- [衝突モード]を選択し、 衝突 エネルギー(CE)値を入力します。MS/MS スキャン範囲を設定します。 [保存 ]ボタンをクリックしてMSメソッドを記録し、シーケンステーブルに新しいファイル名を入力します。 [スタート ]ボタンをクリックして、MS/MSアクイジションを開始します。
注:MS / MSスキャン範囲は、ターゲット親イオンの40%〜130%でした。衝突誘起解離(CID)モードのデフォルトのCE値は35%です。
- エクスプローラーでRAWファイルをダブルクリックして、MS / MS RAWファイルをデータ処理ソフトウェアにロードします。
- MS/MSスペクトルの中で最も強いフラグメントイオンを特定し、そのm/z値をMSnメソッドリストに入力します。MS n設定テーブルで、衝突モード、CE値、スキャン範囲などのMS3パラメータを設定します。
- [保存]ボタンをクリックしてMSメソッドを記録し、シーケンステーブルに新しいファイル名を入力します。[スタート]ボタンをクリックして、MS3の取得を開始します。
- エクスプローラーでRAWファイルをダブルクリックして、MS3 RAWファイルをデータ処理ソフトウェアにロードします。手順4.4を繰り返して、MS4 スペクトルを取得します。
- スペクトルに安定なフラグメントイオンが観察されない場合は、MSn 実験を完了します。
5. 手動MSn データ解析
- 生のファイルをダブルクリックして、MSからMSnまでのすべてのマススペクトルを開きます。イオンと対応するフラグメントイオンの間のm/z差値を手動で計算します。
注:たとえば、イオン(m / z 617.25)と対応するフラグメントイオン(m / z 571.28)のm / z差値はMS / MSで45.97であり、イオン(m / z 571.28)と対応するフラグメントイオン(m / z 525.38)の間のm / z差値はMS3で45.90であり、イオン(m / z 525.38)と対応するフラグメントイオン(m / z 344.93および273.16)の間のm / z差値は180.45であり、MS4ではそれぞれ252.22です。 - MS4 の結果(MSnの最後のレベル)に従って「コア」構造を手動で描画します。m/z差値に基づいて官能基または分子セグメントを使用して、元の構造を手動で導き出します。MSnの各分子構造に従って分子切断経路を手動で描画します。手動による分子誘導の例は、代表的な結果のセクションで詳しく説明されています。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
セロビオースは、正イオンモードでのMSnの実現可能性を検証するためのモデルとして使用されました。図2Aに示すように、セロビオース[C 12 H22O11]+のESI-MS(正イオンモード)は、m/z 365でプロトン化された分子[M + H]+を生成しました。m/z 365での[M+H]+のプロダクトイオンスキャン(CID-MS/MS)により、m/z 305で2番目のフラグメントイオンが得られ(図2B)、MS3およびMS4分析を使用してさらに分析されました(図2C、D)。MS3分析ではm/z 254に3番目のフラグメントイオンが、MS4分析ではm/z 185に4番目のフラグメントイオンが得られた。MS/MS分析(図2E)では、m/z 60で失われたフラグメントイオンが、m/z 365でイオンフラグメンテーションのシーケンス、すなわち開環加水分解(青色でマーク)、C-C結合切断(赤色でマーク)、および脱水(緑色でマーク)を示していることが明らかになりました。同様に、MS3分析では、m/z 60で失われたフラグメントイオンが、m/z 305でのイオンのC-C結合切断(赤でマーク)を示していることが明らかになりました。MS4分析では、m/z 60で失われたフラグメントイオンは加水分解(青色でマーク)と脱水(緑色でマーク)を意味し、m/z 245のイオンがm/z 185のイオンに切断されることが示されました。MSn解析におけるステップフラクチャーは、この方法が炭水化物の構造を調べるために実行可能であることを示した。
LC-Q-TOF-MSを用いたAMSの予備定性分析により、多数の未知化合物の存在が明らかになりました。これらの1つであるm/z 617のイオンは、ネガティブモードでのMSn分析用に選択されました。AMSのm/z 617での[M-H]-のプロダクトイオンスキャン(CID-MS/MS)は、m/z 571で2番目のフラグメントイオンを生成しました。このフラグメントイオンのMS3分析では、m/z 525に3番目のフラグメントイオンが生成され、MS4分析では、m/z 345および273に4番目のフラグメントイオンが生成されました(図3A-D)。m/z 571のMS3は、メタノールとしてのCH2OH部分(−32 Da)と水としてのOH部分(−18 Da)の損失によって、m/z 525でフラグメントイオンを得た。これらのMS4結果は、化合物の「コア」構造の手動同定に使用され、その元の構造は、イオンとそのフラグメントイオンのm / z値を比較することによって決定されました。m/z 617における化合物の分子構造とMSnにおけるその切断経路を図3Eに示す。m/z 365における別の未知化合物をMSnを用いてポジティブモードで分析した。AMSのm/z 365における[M+H]+イオンのプロダクトイオンスキャン(CID-MS/MS)は、m/z 299、m/z 329、およびm/z 347で2番目のフラグメントイオンを生成した。これらのフラグメントイオンのMS3分析では、m/z 231に3番目のフラグメントイオンが生成されました(図4A-C)。m/z 365における化合物の分子構造と切断機構を図4Eに示す。
図1:IT-MSと多段階質量分析を用いたチベット医学における未知の化合物構造の同定 。 (A)液体クロマトグラフィー用の移動相。(b)液体クロマトグラフィーポンプ。(C)サンプルルーム。(D)MSのイオン源。 (E)MSにおけるイオントラップモジュールの内部構造。 (F)MS4 スペクトル。(g)MS4 結果からの分子構造情報。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:ポジティブイオンモードでのIT-MS を介した セロビオースの多段階フラグメンテーション 。 (A)セロビオースの元のマススペクトル。(B) MS/MSスペクトル中のフラグメントイオン。(c)MS3 スペクトル中のフラグメントイオン。(d)MS4 スペクトル中のフラグメントイオン。(E)セロビオースの切断機構と分子構造。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:負イオンモードのIT-MS による m/z 617における未知AMS化合物イオンの多段階フラグメンテーションと構造解析 。 (A)AMSの部分マススペクトル。(B) MS/MSスペクトル中のフラグメントイオン。(c)MS3 スペクトル中のフラグメントイオン。(d)MS4 スペクトル中のフラグメントイオン。(E)m/z 617におけるAMS化合物イオンの開裂機構と分子構造。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:正イオンモードのIT-MS による m/z 365における未知AMS化合物イオンの多段階フラグメンテーション構造解析 。 (A)AMSの部分マススペクトル。(B) MS/MSスペクトル中のフラグメントイオン。(c)MS3 スペクトル中のフラグメントイオン。(D)m/z 365におけるAMS化合物イオンの開裂機構と分子構造。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
IT-MSとそのMSn技術は、微量TCM化合物の構造を特定するための新しいアプローチを提供します。フラグメントイオンを深く同定できなかったQ-TOF-MSとは異なり、MSn技術を用いたIT-MSは、イオンを単離・蓄積する能力に優れています。この記事では、IT-MSおよびMSn技術を使用してチベット医学の微量化合物を同定する方法について概説します。この方法は、MSNにおけるn値を利用して、提供されるフラグメントイオン情報の量を決定する。この方法の重要なステップには、適切なスキャン範囲の選択とCE値の調整が含まれ、貴重なフラグメントの識別につながります。
一般に、糖類のMSn分析は正イオンモード16で最もよく実行され、フェノール酸とアルカロイドは負イオンモードで最もよく分析されます。ESI源における化合物の応答は、ギ酸、酢酸、酢酸アンモニウム17などの添加剤を用いて移動相を調整することによって改善することができる。極性の弱い化合物には大気圧化学イオン化源が考えられます。適切なスキャン範囲を選択すると、フラグメントイオンの強度を高めることができ、各MS nのエネルギー減衰が避けられないため、MSnの次の段階に有益です。フラグメントイオンのm / zは、対応する最良の強度を得るために、スキャン範囲の中央領域に配置する必要があります。イオンが二重または複数の電荷を有する場合、フラグメンテーション中に電荷数を減らすことによって、より高いm/z値を有するフラグメントイオンを得ることができる。この場合、スキャン範囲の端m/zを大きく設定する必要があります。CIDモードは、MSn分析18のほとんどの化合物に適しています。フラグメントイオンの強度が不十分な場合は、CE値を一度に5%増加させることができます。MSnに複数の複雑なフラグメントイオンがある場合、イオン解離を制御するためにより低いCE値が必要です。低分子に適したパルスQ衝突誘起解離モードは、CIDモード19よりも低分子量フラグメントイオンに関するより詳細な情報を提供します。電子伝達解離(ETD)モデルは、ペプチドフラクチャーおよびタンパク質同定において支配的であるが、TCM成分20の同定に使用されることはめったにない。ETDモードは、ジスルフィド結合21を含む未知の化合物を調べるために使用することができる。
MSn 法は、他のMS技術と比較して構造同定において多くの利点がありますが、それでもいくつかの制限があります。まず、どの衝突モードもすべてのTCM化合物に適しているわけではありません。衝突モードの合理的な選択と衝突エネルギーの手動調整は、フラグメントイオンを改善することができます。また、MSn 法では、複雑な異性体を持つ大きな分子中の官能基の位置を区別することは困難です。官能基部位の特定は、経験豊富な研究者を必要とする困難な作業です。手動による後分析と長いMSn データ処理時間も、研究者がこの技術を利用することを思いとどまらせる大きな障壁です。Q-TOF-MSは、その高い測定精度、分解能、およびデータベースの使いやすさにより、研究者の間で人気があります。ただし、IT-MSは、イオンを分離および蓄積し、複数の段階の分析を実行できるため、未同定イオンおよび微量イオンに適したソリューションです。Q-TOFとIT-MSの統合は、TCMサンプルの完全な定性分析に最適なソリューションを提供できます。MSn 技術は、食品、環境科学、医療などの分野で広く利用されており、IT-MS機器の改良に伴い、さまざまな分野での普及と使用の増加が期待されています。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
著者は、競合する金銭的利益を宣言していません。
Acknowledgments
この研究は、成都TCM大学のXinglinタレントプログラム(No.030058191)、四川省自然科学財団(2022NSFSC1470)、および中国国家自然科学基金会(82204765)によって資金提供されました。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Acetonitrile | Thermo Scientific | CAS 75-05-8 | LC-MS grade |
Formic Acid | Knowles | CAS 64-18-6 | HPLC grade |
Linear ion trap mass spectrometer | Thermo Scientific | LTQ XL | |
liquid chromatograph | Thermo Scientific | U3000 | |
LTQ Tune | Thermo Scientific | version 2.8.0 | MS control software |
Methanol | Thermo Scientific | CAS 67-56-1 | LC-MS grade |
Pure water | Thermo Scientific | CAS 7732-18-5 | LC-MS grade |
Xcalibur | Thermo Scientific | version 2.0 | LC-IT-MS operational software |
References
- Chen, X. -F., Wu, H. -T., Tan, G. -G., Zhu, Z. -Y., Chai, Y. -F. Liquid chromatography coupled with time-of-flight and ion trap mass spectrometry for qualitative analysis of herbal medicines. Journal of Pharmaceutical Analysis. 1 (4), 235-245 (2011).
- Ou, C., et al. Systematically investigating the pharmacological mechanism of Dazhu Hongjingtian in the prevention and treatment of acute mountain sickness by integrating UPLC/Q-TOF-MS/MS analysis and network pharmacology. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 179, 113028 (2020).
- Kind, T., et al. Identification of small molecules using accurate mass MS/MS search. Mass Spectrometry Reviews. 37 (4), 513-532 (2018).
- Phetsanthad, A., Vu, N. Q., Li, L. Multi-faceted mass spectrometric investigation of neuropeptides in Callinectes sapidus. Journal of Visualized Experiments. (183), e63322 (2022).
- Seetaloo, N., Phillips, J. J. Millisecond hydrogen/deuterium-exchange mass spectrometry for the study of alpha-synuclein structural dynamics under physiological conditions. Journal of Visualized Experiments. (184), e64050 (2022).
- Karas, B. F., et al. Dose uptake of platinum-and ruthenium-based compound exposure in zebrafish by inductively coupled plasma mass spectrometry with broader applications. Journal of Visualized Experiments. (182), e6358 (2022).
- Chang, H. -L., et al. Uracil-DNA glycosylase assay by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry analysis. Journal of Visualized Experiments. (182), e63089 (2022).
- Wang, S., et al. Structural characterization and identification of major constituents in Jitai tablets by high-performance liquid chromatography/diode-array detection coupled with electrospray ionization tandem mass spectrometry. Molecules. 17 (9), 10470-10493 (2012).
- Pang, B., Zhu, Y., Lu, L., Gu, F., Chen, H. The applications and features of liquid chromatography-mass spectrometry in the analysis of traditional Chinese medicine. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine. 2016, 3837270 (2016).
- Ichou, F., et al. Comparison of the activation time effects and the internal energy distributions for the CID, PQD and HCD excitation modes. Journal of Mass Spectrometry. 49 (6), 498-508 (2014).
- Fu, X., et al. Suppression of oligomer formation in glucose dehydration by CO2 and tetrahydrofuran. Green Chemistry. 19 (14), 3334-3343 (2017).
- Fu, X., et al. Solvent effects on degradative condensation side reactions of fructose in its initial conversion to 5-Hydroxymethylfurfural. ChemSusChem. 13 (3), 501-512 (2020).
- Yang, S., Wang, Z., Zhao, H., Ren, X.
Modern research of Tibetan medicine. World Journal of Traditional Chinese Medicine. 5 (2), 131-138 (2019). - Shang, X., et al. Ethno-veterinary survey of medicinal plants in Ruoergai region, Sichuan province, China. Journal of Ethnopharmacology. 142 (2), Sichuan province, China. 390-400 (2012).
- Su, J., et al. Chalcone derivatives from Abelmoschus manihot seeds restrain NLRP3 inflammasome assembly by inhibiting ASC oligomerization. Frontiers in Pharmacology. 13, 932198 (2022).
- Fu, X., et al. Mapping out the reaction network of humin formation at the initial stage of fructose dehydration in water. Green Energy & Environment. , In Press (2022).
- Hua, Y., Jenke, D. Increasing the sensitivity of an LC-MS method for screening material extracts for organic extractables via mobile phase optimization. Journal of Chromatographic Science. 50 (3), 213-227 (2012).
- Kumar, S., Singh, A., Bajpai, V., Kumar, B. Identification characterization and distribution of monoterpene indole alkaloids in Rauwolfia species by Orbitrap Velos Pro mass spectrometer. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 118, 183-194 (2016).
- Bayat, P., Lesage, D., Cole, R. B. Tutorial: Ion activation in tandem mass spectrometry using ultra-high resolution instrumentation. Mass Spectrometry Reviews. 39 (5-6), 680-702 (2020).
- Wu, S. -L., et al. Mass spectrometric determination of disulfide linkages in recombinant therapeutic proteins using online LC−MS with electron-transfer dissociation. Analytical Chemistry. 81 (1), 112-122 (2009).
- Echterbille, J., Quinton, L., Gilles, N., De Pauw, E. Ion mobility mass spectrometry as a potential tool to assign disulfide bonds arrangements in peptides with multiple disulfide bridges. Analytical Chemistry. 85 (9), 4405-4413 (2013).