Messung der Embryonalviabilität und Brutgröße bei Caenorhabditis elegans

Summary

In dieser Arbeit stellen wir eine allgemeine Methode vor, um die embryonale Lebensfähigkeit und die Gesamtzahl der produzierten Embryonen (Brut) mit dem Modellorganismus C. elegans zu bestimmen.

Abstract

Caenorhabditis elegans ist ein hervorragender Modellorganismus für die Untersuchung von Meiose, Befruchtung und Embryonalentwicklung. C. elegans existieren als selbstbefruchtende Hermaphroditen, die große Bruten von Nachkommen produzieren - wenn Männchen vorhanden sind, können sie noch größere Bruten von Kreuzungsnachkommen produzieren. Fehler in Meiose, Befruchtung und Embryogenese können schnell als Phänotypen von Sterilität, verminderter Fruchtbarkeit oder embryonaler Letalität bewertet werden. Dieser Artikel beschreibt eine Methode zur Bestimmung der embryonalen Lebensfähigkeit und Brutgröße bei C. elegans. Wir zeigen, wie man diesen Assay aufbaut, indem wir einen Wurm auf eine individuelle MYOB-Platte (Modified Youngren's, Only Bacto-Pepton) setzen, den geeigneten Zeitrahmen für die Zählung lebensfähiger Nachkommen und nicht lebensfähiger Embryonen festlegen und erklären, wie man lebende Wurmproben genau zählt. Diese Technik kann sowohl zur Bestimmung der Lebensfähigkeit bei selbstbefruchtenden Hermaphroditen als auch zur Kreuzbefruchtung durch Paarungspaare verwendet werden. Diese relativ einfachen Experimente sind für neue Forscher, wie Studenten im Grundstudium und Doktoranden im ersten Jahr, leicht anwendbar.

Introduction

Die sexuelle Fortpflanzung in eukaryotischen Organismen erfordert die Produktion funktioneller Gameten, die durch den Prozess der Befruchtung zu einem Embryo verschmelzen. Mütterliche und väterliche Gameten, Eizellen und Spermien entstehen durch die spezialisierten Zellteilungs- und Differenzierungsprozesse der Meiose und Gametogenese¹. Die Meiose beginnt mit einer einzelnen diploiden Zelle und endet mit der Bildung von Tochterzellen, die die Hälfte der Chromosomenzahl der ursprünglichen Elternzelle enthalten. Von der Reduktion der Ploidie bis hin zum Mischen von genetischem Material durch unabhängige Sortierung und Crossover-Rekombination erfüllt die Meiose mehrere wichtige Funktionen¹. Fehler in der Meiose können zu einer Aneuploidie führen, bei der zu viele oder zu wenige Chromosomen in einer Gamete vorhanden sind. Das Auftreten von Aneuploidie hat enorme Auswirkungen auf die menschliche Gesundheit, da Chromosomenungleichgewichte eine Hauptursache für Fehlgeburten und Entwicklungsstörungen wie das Down-Syndrom und das Edwards-Syndrom^{sind 2}.

Die Befruchtung ist der Prozess, bei dem die mütterlichen und väterlichen Gameten verschmelzen, um einen neuen Organismus zu erzeugen³. Die Gameten-Gameten-Erkennung wird durch Proteine auf der Gametenoberfläche erleichtert³. Fehler in der Gametenkompatibilität führen zu Unfruchtbarkeit, da die Fusion von Spermien und Eizellen nicht fortgesetzt werden kann. Die Verschmelzung von Spermien mit einer Eizelle löst eine Vielzahl von Ereignissen aus, die zur richtigen Bildung eines aktiven Embryos führen, der über mitotische Teilungen die Entwicklungsreise von einem einzelligen Embryo zu einem voll funktionsfähigen mehrzelligen Organismus beginnen kann⁴. Während der gesamten Embryogenese müssen molekulare Ereignisse, die die Entwicklung regulieren, streng reguliert und zeitlich genau abgestimmt werden, um ein ordnungsgemäßes Wachstum des Organismus zu ermöglichen⁵. Die richtige zelluläre Differenzierung während der frühen Entwicklung ist entscheidend, da der Organismus von einem pluripotenten Embryo zu einem vollwertigen Organismus übergeht. Aufgrund der Komplexität dieser Ereignisse können Störungen zu Entwicklungsstörungen führen, die zur embryonalen Letalität führen.

Caenorhabditis elegans ist ein ausgezeichneter Modellorganismus zur Untersuchung von Meiose, Befruchtung und Embryonalentwicklung. C. elegans ist ein durchsichtiger Fadenwurm, der zwei Geschlechter hat, Männchen und Hermaphroditen. C. elegans-Hermaphroditen, die zur Selbstbefruchtung fähig sind, sind das vorherrschende Geschlecht ^6,7. Die hermaphroditische Keimdrüse produziert erst im vierten Larvenstadium (L4) Spermien, die in der Spermatheka gespeichert werden. Beim Übergang von L4 ins Erwachsenenalter schaltet die Keimbahn auf die Produktion von Eizellen um, die dann über die eingelagerten Spermien befruchtet werden. Männchen, die bei Hermaphroditen mit einer Rate von weniger als 0,2 % entstehen, produzieren nur Spermien und können sich mit Hermaphroditen paaren. Bei der Kreuzbefruchtung verdrängen männliche Spermien die hermaphroditischen Spermien bei der Befruchtung von Eizellen⁸. Dies ermöglicht die relativ einfache Haltung von homozygoten Mutanten durch selbstbefruchtende Stämme und genetische Manipulationen durch genetische Kreuzungen. Die beiden Geschlechter ermöglichen Studien, die die Unterschiede zwischen der Meiose in der männlichen und der weiblichen Keimbahn untersuchen. Darüber hinaus können aufgrund der transparenten Natur von C. elegans und seinen Eiern die Prozesse der Meiose, Gametogenese, Befruchtung und Embryogenese in lebenden, intakten Tieren mit Hilfe von Fluoreszenzbildgebungsverfahren untersucht werden.

Bei der Analyse neuer Mutationen in Genen, die bei der Meiose, Befruchtung und/oder Embryonalentwicklung von C. elegans eine Rolle spielen könnten, ist ein entscheidender erster Schritt die Bestimmung der Lebensfähigkeit des Embryos und der Brutgröße, da Fehler in diesen Prozessen oft zu einem Ausfall oder einer Verringerung der Produktion lebensfähiger Nachkommen führen. In dieser Arbeit wird ein Protokoll zur Beurteilung der Fruchtbarkeit, der Lebensfähigkeit des Embryos und der Brutgröße von selbstbefruchtenden Hermaphroditen oder Kreuzungen zwischen Hermaphroditen und Männchen beschrieben. Obwohl dieser klassische Assay in vielen C. elegans-Studien verwendet wurde, bieten wir ein standardisiertes Protokoll für den Aufbau und die genaue Quantifizierung an. Bei diesem Protokoll werden einzelne Würmer oder männliche/zwittrige Paare isoliert, um die Paarung und Nachkommenproduktion zu ermöglichen. Die Produktion und Lebensfähigkeit der Nachkommen wird über eine Reihe von Tagen beobachtet, um die Anzahl der lebensfähigen und nicht lebensfähigen Embryonen zu bestimmen. Am Ende des Experiments werden die einzelnen Bruten analysiert, um den Prozentsatz der embryonalen Lebensfähigkeit und die Gesamtbrutgröße zu berechnen.

Protocol

HINWEIS: In der Materialtabelle finden Sie Details zu allen Materialien, die in diesem Protokoll verwendet werden.

1. Experimentelle Platten vorbereiten

1. Bereiten Sie Petrischalen mit einem Durchmesser von 35 mm mit Modified Youngren's, Only Bacto-peptone (MYOB) Medien vor. Um MYOB-Platten herzustellen, fügen Sie 20 g Bacto-Agar, 2 g NaCl, 0,55 g Trizma-HCl, 0,24 g Trizma-OH, 3,1 g Bacto-Pepton und 1,6 ml Cholesterin zu 1 l ddH₂O hinzu und autoklavieren Sie sie 40 Minuten lang bei 121 °C. Lassen Sie es auf 55 °C abkühlen und gießen Sie mit steriler Technik 4 ml des geschmolzenen Mediums in jede 35-mm-Petrischale.
   HINWEIS: Ein Liter MYOB ergibt ~250 Platten, die bei 4 °C bis zu 6 Monate gelagert werden können. Wir empfehlen mindestens 10 Individuen pro Replikat mit drei Replikatsets für jeden Stamm.
2. Besiedeln Sie die Platten mit einer sterilen Technik mit einem kleinen Fleck (ca. 50 μl) OP50-Bakterien in der Mitte der Platte.
   HINWEIS: Kleine Rasenflächen sind besonders wichtig für die Beurteilung der Kreuzbefruchtung, da die kleinere Stelle zu vermehrten Begegnungen zwischen Männchen und Hermaphroditen führt und somit die Paarungschance erhöht.

2. Embryonale Viabilitätstests (Hermaphroditen-Selbstbefruchtung)

1. Tag 1
   1. Beschriften Sie die Rückseite jedes Tellers. Achten Sie darauf, jede Platte und ihre jeweiligen Würmer während des gesamten Experiments im Auge zu behalten.
      HINWEIS: Bevorzugte Kennzeichnungstechnik - Tag 1: Wurm 1, Tag 1: Wurm 2, ... etc.
   2. Übertragen Sie einen einzelnen Hermaphroditen im L4-Stadium auf jede Platte. Stellen Sie sicher, dass keine Embryonen oder andere Würmer auf die Platte übertragen werden. Lassen Sie die Würmer sich zu erwachsenen Tieren entwickeln und legen Sie 24 Stunden lang bei der Standard-Kulturtemperatur von 20 °C Selbstnachkommen. Bewerten Sie diese Platten an Tag 3.
      HINWEIS: Die Temperatur von Experimenten kann bei temperaturempfindlichen Mutationen verändert werden. Bei temperaturempfindlichen Mutationen sollten embryonale Viabilitätstests sowohl bei permissiven (15-16 °C) als auch bei nicht-permissiven Temperaturen (24-26 °C) durchgeführt werden.
2. Tag 2
   1. Beschriften Sie einen Satz neuer Platten - Tag 2: Wurm 1, Tag 2: Wurm 2, ... etc.
   2. Übertragen Sie die einzelnen Würmer von Tag 1 auf die neuen Platten.
      HINWEIS: Diese Würmer sollten das Erwachsenenalter erreicht haben, und Wildtyp-Würmer sollten bereits mit der Embryonenablage begonnen haben.
   3. Lassen Sie die Würmer 24 Stunden lang bei 20 °C oder einer anderen geeigneten Temperatur Embryonen legen. Bewerten Sie diese Platten an Tag 4.
3. Tag 3
   1. Beschriften Sie einen Satz neuer Platten. Tag 3: Wurm 1, Tag 3: Wurm 2, ... etc.
   2. Übertragen Sie die einzelnen Würmer von Tag 2 auf neue Platten. Lassen Sie die Nachkommen 24 Stunden lang bei 20 °C oder einer anderen geeigneten Temperatur legen. Bewerten Sie diese Platten an Tag 5.
      HINWEIS: Bei niedrigeren Temperaturen werden die Schlupfzeiten verlängert. Passen Sie sich entsprechend an.
   3. Zeichnen Sie mit einem feinen Marker ein Gittermuster auf einen 35-mm-Deckel. Legen Sie den Gitterdeckel zum Zählen unter die Testplatte, um den Überblick über die zuvor gezählten Würmer zu behalten (Abbildung 1A-B).
      1. Bewerten Sie mit einem Differentialzellzähler die Tag-1-Platten für das Vorhandensein oder Fehlen von Nachkommen. Zählen Sie die lebenden Larven und die ungeschlüpften Embryonen.
         HINWEIS: Zu diesem Zeitpunkt ist eine ausreichende Zeit verstrichen, so dass alle lebensfähigen Embryonen geschlüpft sein sollten. Alle nicht geschlüpften Embryonen gelten als tot.
      2. Zählen Sie innerhalb eines einzelnen Quadrats die ungeschlüpften Embryonen und lebenden Larven, die sich vollständig innerhalb des Quadrats befinden (Abbildung 1C-F).
      3. Zählen Sie bei Würmern, die sich an den quadratischen Rändern befinden, basierend auf der Position des Wurmkopfes. Zähle Würmer mit Köpfen, die den oberen und linken Rand des Quadrats berühren (zähle nicht diejenigen, die den unteren oder rechten Rand berühren; Abbildung 1D). Zählen Sie keine unbefruchteten Eizellen für diesen Test (Abbildung 1F).
   4. Halten Sie die Anzahl der lebenden Larven und ungeschlüpften Embryonen in einem Laborbuch fest.
4. Tag 4
   1. Ritzen Sie die Platten des Tages 2 ein, indem Sie die lebenden Larven und die nicht geschlüpften Embryonen zählen, wie in Schritt 2.3.3.1 beschrieben. Halten Sie die Anzahl der lebenden Larven und ungeschlüpften Embryonen in einem Laborbuch fest.
5. Tag 5
   1. Ritzen Sie die Platten des Tages 3, indem Sie die lebenden Larven und die ungeschlüpften Embryonen zählen, wie in Schritt 2.3.3.1 beschrieben. Halten Sie die Anzahl der lebenden Larven und ungeschlüpften Embryonen in einem Laborbuch fest. Analysieren Sie die erhaltenen Daten mit der in der Datenanalyse beschriebenen Methode.
      HINWEIS: Einige genetische Mutanten können entweder einen verzögerten oder einen verlängerten Fortpflanzungszyklus haben. Überwachen Sie die einzelnen Stämme auf die weitere Ablage von Embryonen über die Platten des 3. Tages hinaus. Wenn die Embryonenproduktion bis zum 4. Tag nicht aufgehört hat, setzen Sie die Erwachsenen weiterhin auf neue Platten um.

3. Embryonale Viabilitätstests (männliche/hermaphroditische Kreuzbefruchtung)

1. Tag 1
   1. Beschriften Sie die Rückseite jedes Tellers. Achten Sie darauf, jede Platte und ihre jeweiligen Würmer während des gesamten Experiments im Auge zu behalten.
   2. Übertragen Sie einen einzelnen L4-Zwitterwurm auf jede Platte. Stellen Sie sicher, dass keine Embryonen oder andere Würmer auf die Platte übertragen werden.
      HINWEIS: Feminisierte Sorten, wie z. B. Fog-2-Loss-of-Function-Mutanten , die keine Spermien produzieren, können anstelle von Hermaphroditen verwendet werden.
   3. Übertragen Sie einen einzelnen männlichen L4-Wurm auf jede beschriftete Platte, die einen L4-Hermaphroditen enthält. Stellen Sie sicher, dass keine Embryonen oder andere Würmer auf die Platte übertragen werden.
      HINWEIS: Stämme wie Männchen der PLG-1-Variante können verwendet werden, um festzustellen, ob eine Paarung stattgefunden hat, da diese Männchen nach der Paarung einen Kopulationspfropfen auf der zwittrigen Vulva ablegen.
   4. Lassen Sie die Würmer 24 Stunden lang bei 20 °C oder einer anderen geeigneten Temperatur paaren und Nachkommen legen. Bewerten Sie diese Platten an Tag 3 für lebende Larven im Vergleich zu ungeschlüpften Embryonen.
2. Tag 2
   1. Beschriften Sie einen Satz neuer Platten und übertragen Sie die Würmer, wie in Tag 2 oben. Achten Sie in diesem Fall darauf, sowohl den Hermaphroditen als auch das Männchen auf neue Platten zu übertragen. Stellen Sie sicher, dass der Hermaphrodit das Erwachsenenalter erreicht hat.
   2. Lassen Sie die Hermaphroditen ihre Nachkommen 24 Stunden lang bei 20 °C oder einer anderen geeigneten Temperatur legen. Bewerten Sie diese Platten an Tag 4 für lebende Larven im Vergleich zu ungeschlüpften Embryonen.
3. Tag 3
   1. Beschriften Sie einen Satz neuer Platten und übertragen Sie die Würmer wie in Tag 3 oben. Stellen Sie sicher, dass Sie sowohl den Hermaphroditen als auch das Männchen auf neue Platten übertragen.
   2. Lassen Sie die Nachkommen 24 h bei 20 °C oder einer anderen geeigneten Temperatur liegen. Bewerten Sie diese Platten für lebende und nicht geschlüpfte Embryonen an Tag 5.
   3. Zählen Sie mit einem Differentialzellzähler die lebenden Larven und ungeschlüpften Embryonen der Tag-1-Platten, wie in Schritt 2.3.3.1 beschrieben.
      Anmerkungen: Entsorgen Sie die Platten nicht, da sie für Tag 4 erforderlich sind.
   4. Halten Sie die Anzahl der lebenden Larven und ungeschlüpften Embryonen in einem Laborbuch fest.
4. Tag 4
   1. Zählen Sie die lebenden Nachkommen und die ungeschlüpften Embryonen der Tag-2-Platten, wie in Schritt 2.3.3.1 beschrieben. Halten Sie die Anzahl der lebenden Larven und ungeschlüpften Embryonen in einem Laborbuch fest.
   2. Überprüfen Sie die Teller von Tag 1 für Männer. Wenn eine Paarung stattgefunden hat, sollte das erwartete genetische Verhältnis von Hermaphroditen zu Männchen 50:50 betragen. Wenn die Platten von Tag 1 keine Männchen enthalten, kam es nicht zu einer Paarung zwischen Männchen und Hermaphrodit. Verwerfen Sie dieses Paarungspaar und halten Sie diese Beobachtung im Laborbuch fest.
5. Tag 5
   1. Zählen Sie die lebenden Larven und ungeschlüpften Embryonen der Tag-3-Platten, wie in Schritt 2.3.3.1 beschrieben. Halten Sie die Anzahl der lebenden Larven und ungeschlüpften Embryonen in einem Laborbuch fest. Analysieren Sie die erhaltenen Daten mit den in der Datenanalyse beschriebenen Methoden.

4. Datenanalyse

1. Berechnen Sie den Prozentsatz der embryonalen Lebensfähigkeit eines bestimmten biologischen Replikats eines Stammes mit Gleichung (1).
   HINWEIS: Die Anzahl der lebenden Nachkommen und der ungeschlüpften Embryonen ergibt sich aus der Summe der täglichen Zählung über den Versuchszeitraum.
   (1)
2. Berechnen Sie die Brutgröße pro Wurm eines bestimmten Stammes, indem Sie die Anzahl der Nachkommen (ungeschlüpfte Embryonen und Larven) des Elternzwitters summieren. Berechnen Sie die durchschnittliche Brutgröße mit Gleichung (2).
   (2)
3. Geben Sie den Prozentsatz der embryonalen Lebensfähigkeit und die durchschnittliche Brutgröße mit dem Durchschnitt und der Standardabweichung zwischen biologischen Replikaten an. Führen Sie den Student-t-Test durch, indem Sie die Kontroll- und experimentellen Daten vergleichen.

Representative Results

Wir führten Embryonalviabilitäts- und Brutgrößentests an N2 (Wildtyp) und an zwei Stämmen durch, die Mutationen in Genen aufweisen, die an der Meiose beteiligt sind, him-5(e1490) und spo-11(ok79). Da sowohl him-5 als auch spo-11 eine Rolle bei der meiotischen Crossover-Bildung spielen, führen Mutationen in diesen beiden Genen zur Bildung von aneuploiden Gameten. Dieser embryonale Viabilitätstest für N2 ergab einen Viabilitätsprozentsatz von 98,9 %, während sowohl him-5 (e1490) als auch spo-11 (ok79) eine Verringerung der Lebensfähigkeit der Nachkommen mit einem Prozentsatz von 74,9 % bzw. 0,8 % zeigten (Abbildung 2A; p < 0,0005). Diese Ergebnisse stimmen mit den zuvor veröffentlichten Ergebnissen^{überein 7,9}. Die durchschnittliche Brutgröße von N2, him-5 (e1490) und spo-11 (ok79) wurde mit 217, 105 bzw. 219 bestimmt (Abbildung 2B). In Übereinstimmung mit früheren Veröffentlichungen hat him-5(e1490) im Vergleich zum Wildtyp eine deutlich reduzierte Brutgröße, während spo-11(ok79) dies nicht tut ^7,9.

Abbildung 1: Demonstration des Zählaufbaus und der Embryomorphologie auf Platten . (A) Bild eines Deckels mit einem schraffierten Gittermuster, das mit einem feinen Filzstift gezeichnet wurde. (B) Eine 35-mm-MYOB-Platte mit dem gemusterten Deckel darunter zum Zählen. (C) Bild, das ein Sichtfeld mit geringer Vergrößerung (10x) zeigt, das mehrere Kästchen des Gitters zeigt. Weiße Pfeilspitzen weisen auf mehrere Larven in diesem Sichtfeld hin. Die Zählung sollte mit einer höheren Vergrößerung (nur ein Quadrat im Feld) durchgeführt werden, um sowohl Larven als auch Embryonen zu beobachten. Maßstabsbalken = 1.000 μm. (D) Karikatur des Deckels mit dem Gittermuster unter einer 35-mm-Platte. Der Einschub bezeichnet die richtige Technik, um zu bestimmen, welche Larven in einem bestimmten Quadrat gezählt werden. Zähle von oben nach unten, von links nach rechts. Zähle alle Würmer, die sich vollständig innerhalb des Quadrats befinden. Würmer, die die Grenze berühren, sollten anhand der Position des Wurmkopfes und nicht des Schwanzes gezählt werden. Zähle Würmer, die dem aktuellen Raster oder den Rastern zugewandt sind, die zuvor gezählt wurden (d. h. obere und linke Kante). Zählen Sie keine Würmer mit Köpfen, die den unteren oder rechten Rand berühren. Von Anfang an werden blaue Würmer gezählt, rote Würmer nicht. (E) Repräsentatives Bild gesunder N2 L1 geschlüpfter Larven (weiße Pfeilspitze). (F) Repräsentatives Bild einer unbefruchteten Eizelle (schwarze Pfeilspitze) und eines ungeschlüpften Embryos (rote Pfeilspitze). Unbefruchtete Eizellen sollten für diesen Test nicht gezählt werden. Maßstabsbalken (E,F) = (100 μm). Hinweis: Die Bilder in C, E und F wurden mit einem Zeiss AxioZoom-Mikroskop aufgenommen, an dem eine Kamera angebracht war, um das Aussehen von Larven, Embryonen und Eizellen auf Wurmplatten zu demonstrieren. Bei der embryonalen Viabilität werden die Zählungen durchgeführt, während die Platten mit einem Stereomikroskop (keine Kamera) beobachtet werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 2: Repräsentative Grafiken, die die Ergebnisse von Embryonalviabilitätstests und Brutgrößen darstellen. (A) Prozentsatz der embryonalen Lebensfähigkeit von N2, him-5 (e1490) und spo-11 (ok79) bei 20 °C. (B) Brutgrößen von N2, him-5 (e1490) und spo-11 (ok79) bei 20 °C . Für jeden Stamm wurden die Nachkommen von mindestens 28 Hermaphroditen bewertet. Die Gesamtzahl der ungeschlüpften Embryonen plus Larven betrug N2 = 6302, him-5(e1490) = 2.945 und spo-11(ok79) = 7.230. Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung für drei separate einzelne Replikationen an. Statistik berechnet mit dem Student-t-Test, n.s. = nicht signifikant, *p < 0,0005. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Discussion

Die Vermehrung sexuell reproduzierender Arten erfordert die Bildung von haploiden Gameten (d. h. Eizellen und Spermien) durch Meiose, die dann bei der Befruchtung vereinigt werden, wodurch die diploide Chromosomenzahl wiederhergestellt und die Embryonalentwicklung eingeleitet wird. Fehler in einem dieser Prozesse können zu Unfruchtbarkeit, embryonaler Letalität und/oder Geburtsfehlern führen. C. elegans ist ein leistungsfähiges Modellsystem zur Untersuchung der sexuellen Fortpflanzung. Die Auswirkungen von Genmutationen oder Genexpressions-Knockdown (z.B. RNA-Interferenz) können mit den oben beschriebenen Embryonalviabilitäts- und Brutgrößen-Assays relativ schnell und einfach beurteilt werden. Wir haben diese Methoden für die erste Charakterisierung von Genen verwendet, die an der meiotischen Chromosomensegregation und Befruchtung/Eizellaktivierung beteiligt sind^10,11,12. Eine beobachtete Verringerung der embryonalen Lebensfähigkeit oder Brutgröße deutet auf eine Störung der Meiose, Gametogenese, Befruchtung oder Embryogenese hin.

Da die Lebensfähigkeit der Embryonen und die Brutgröße durch die Zählung der Nachkommen und eine einfache mathematische Berechnung relativ einfach beurteilt werden können, sind dies optimale Einführungsexperimente für Forschungsanfänger im Labor oder im Klassenzimmer. Die einfache Haltung von C. elegans und die wirtschaftlichen Vorteile machen sie besonders geeignet für den experimentellen Biologieunterricht. Die Studierenden sammeln wertvolle Forschungserfahrung durch die Haltung von C. elegans , erlernen den Umgang mit Präpariermikroskopen und können biologische Fragestellungen in einem Entwicklungssystem stellen, die in relativ kurzer Zeit (ca. 5 Tage mit dem in dieser Arbeit beschriebenen Protokoll) beantwortet werden können.

Der Zeitpunkt der Zählung der Nachkommen ist sehr wichtig für embryonale Viabilitätstests. Bei 20 °C dauert die Embryogenese etwa 16 Stunden, und fortpflanzungsreife Erwachsene beginnen etwa 60 Stunden nach dem Schlüpfen als L1-Larven mit der Eiablage. Da der Lebenszyklus schnell ist, ist es wichtig, die Nachkommen innerhalb des entsprechenden Zeitfensters zu zählen, um genügend Zeit für das Schlüpfen der Embryonen zu haben, aber bevor die Nachkommen selbst mit der Eiablage beginnen. Es ist auch wichtig zu beachten, dass die Wachstumsperioden je nach Temperatur variieren. Das Wachstum ist bei 24-25 °C etwa 2,1-mal schneller als bei 15-16 °C und bei 20 °C etwa 1,3-mal schneller als bei 15-16 °C¹³. In diesem Protokoll empfehlen wir, dass die Zählung 48 Stunden nach dem Legen der Erwachsenen auf einen frischen Teller erfolgt. Dieser Zeitrahmen stellt sicher, dass alle Embryonen mit Wildtyp-Entwicklung genügend Zeit zum Schlüpfen haben (>16 h), aber nicht bis zur Fortpflanzungsfähigkeit altern. Assays, die bei Temperaturen unter 20 °C durchgeführt werden, müssen möglicherweise verlängert werden (Transfer der Tiere für 4 Tage), damit die Embryonen schlüpfen und die geschlüpften Nachkommen Larvenstadien erreichen, die unter den Bakterien auf den MYOB-Platten leichter zu beobachten sind (L3-L4-Stadien).

Eine Einschränkung der embryonalen Viabilitätstests und der Brutgröße besteht darin, dass der spezifische Entwicklungsprozess, der gestört wird, nicht ohne weiteres ersichtlich ist. Diese ersten Assays können jedoch mit zytologischen Techniken nachverfolgt werden, um festzustellen, welcher Prozess betroffen ist. Zum Beispiel kann die Sektion der erwachsenen Würmer zur Freisetzung der Gonade mit anschließender 4',6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI)-Färbung und eine sorgfältige Analyse der DNA-Morphologie innerhalb der Keimbahn zeigen, ob meiotische Prozesse gestört sind. Darüber hinaus kann die DAPI-Färbung von Embryonen Aufschluss darüber geben, in welchem Stadium die Embryogenese zum Stillstand kommt.

Abschließend haben wir ein Protokoll beschrieben, um die Anzahl der produzierten Embryonen (Brut) und den Prozentsatz der Embryonen, die für verschiedene C. elegans-Mutanten lebensfähig sind, zu untersuchen. Dieser Assay kann sowohl für selbstbefruchtende Hermaphroditen als auch für männliche/hermaphroditische Kreuzungen verwendet werden. Mit dem kurzen Lebenszyklus von C. elegans kann dieses Protokoll in weniger als 1 Woche abgeschlossen werden. Embryonale Viabilitätstests und Brutgrößen können als erste Analysen von Genen verwendet werden, die an Meiose, Befruchtung oder Embryonalentwicklung beteiligt sind, und sind geeignete Protokolle für fortgeschrittene Forscher und Forschungsanfänger (Studenten und Doktoranden im ersten Jahr) gleichermaßen.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Materials
35 mm Petri dishes	Tritech research	T3501	Semi-stackable, non-vented.
Bacto Agar	Becton, Dickinson and Company	214010	For MYOB
Bacto-Peptone	Gibco	211677	For MYOB
Cholestrol	Sigma	C8503	For MYOB
Sodium Chloride	J.T. Baker	FW 58.440	For MYOB
Trizma Base	Sigma	T1503	For MYOB
Trizma hydrochloride	Sigma	T3253	For MYOB
Strains
C. elegans wild type strain	Caenorhabditis Genetics Center	N2
Escherichia coli	Caenorhabditis Genetics Center	OP50
him-5(e1490)	Caenorhabditis Genetics Center	DR466
spo-11(ok79)	Caenorhabditis Genetics Center	AV106
Equipment/software
Differential cell counter	Fischer Scientific	02-670-12
MicroSoft Excel or Prism	MicroSoft or GraphPad		For recording and creating graphical representations of data.
platinum wire	Tritech research	PT9901	For making worm picks. 99.5% Platinum, 0.5% Iridium. This comes as 3 ft/pack, which is sufficient for making 36 worm picks (~1 inch platinum wire per pick).
Stereomicroscope	Nikon	SMZ-745	Diascopic base with focus mount, integrated LED module, power cord, 6.7x to 50x Zoom range [WD 115 mm], Widefield Eyepiece C-15x/17 (Note: equivalent stereomicroscopes are available from other manufacturers.)
worm pick handle	Tritech research	TWPH1	For making worm picks. Mount ~1 in platinum wire into worm pick handle. Alternatively, worm picks can be made by mounting platinum wire in a glass Pasteur pipette.