Måling av embryonal levedyktighet og brødstørrelse i Caenorhabditis elegans

Summary

Her presenterer vi en generell metode for å bestemme embryonal levedyktighet og totalt antall embryoer produsert (brød) ved hjelp av modellorganismen C. elegans.

Abstract

Caenorhabditis elegans er en utmerket modellorganisme for studier av meiose, befruktning og embryonal utvikling. C. elegans eksisterer som selvgjødslende hermafroditter, som produserer store brød av avkom - når hanner er til stede, kan de produsere enda større brød av kryssavkom. Feil i meiose, befruktning og embryogenese kan raskt vurderes som fenotyper av sterilitet, redusert fruktbarhet eller embryonal dødelighet. Denne artikkelen beskriver en metode for å bestemme embryonal levedyktighet og brødstørrelse i C. elegans. Vi demonstrerer hvordan du setter opp denne analysen ved å plukke en orm på en individuell Modified Youngren's, Only Bacto-peptone (MYOB) plate, etablere riktig tidsramme for å telle levedyktige avkom og ikke-levedyktige embryoer, og forklare hvordan du nøyaktig teller levende ormprøver. Denne teknikken kan brukes til å bestemme levedyktigheten i selvgjødslende hermafroditter, samt kryssbefruktning ved parringspar. Disse relativt enkle eksperimentene er lett adoptable for nye forskere, for eksempel studenter og førsteårsstudenter.

Introduction

Seksuell reproduksjon i eukaryote organismer krever produksjon av funksjonelle gameter som fusjonerer for å danne et embryo gjennom prosessen med befruktning. Maternelle og faderlige kjønnsceller, egg (egg) og sæd er opprettet gjennom spesialiserte celledeling og differensieringsprosesser av meiose og gametogenese¹. Meiose starter med en enkelt diploid celle og slutter med dannelsen av datterceller som inneholder halvparten av antall kromosomer av den opprinnelige foreldrecellen. Fra reduksjon av ploidi til stokking av genetisk materiale via uavhengig utvalg og crossover-rekombinasjon, tjener meiose flere viktige funksjoner¹. Feil innen meiose kan resultere i aneuploidi, der det er for mange eller for få kromosomer i en gamete. Forekomster av aneuploidi har enorm innvirkning på menneskers helse, da kromosomale ubalanser er en viktig årsak til spontanaborter og utviklingsforstyrrelser som Downs syndrom og Edwards syndrom².

Befruktning er prosessen der moder- og faderlige gameter smelter sammen for å generere en ny organisme³. Gamete-gametegjenkjenning forenkles av proteiner på gameteoverflaten³. Feil med kjønnscellekompatibilitet fører til infertilitet da sæd- og eggfusjon ikke kan fortsette. Fusjonen av sæd med en oocyt utløser en rekke hendelser som fører til riktig dannelse av et aktivt embryo som kan begynne utviklingsreisen fra et encellet embryo til en fullt funksjonell flercellet organisme via mitotiske divisjoner⁴. Gjennom embryogenese må molekylære hendelser som regulerer utviklingen være tett regulert og nøyaktig tidsbestemt for å muliggjøre riktig vekst av organismen⁵. Riktig cellulær differensiering under tidlig utvikling er avgjørende når organismen overgår fra et pluripotent embryo til en fullverdig organisme. På grunn av kompleksiteten i disse hendelsene, kan forstyrrelser føre til utviklingsdefekter som resulterer i embryonal dødelighet.

Caenorhabditis elegans er en utmerket modellorganisme for å studere meiose, befruktning og embryonal utvikling. C. elegans er en gjennomsiktig nematode som har to kjønn, menn og hermafroditter. C. elegans hermafroditter, som er i stand til selvbefruktning, er det dominerende kjønn ^6,7. Hermafrodittgonaden produserer først sæd under fjerde larvestadium (L4), som lagres i spermatheca. Ved overgangen L4 til voksen alder bytter kimlinjen til å produsere oocytter, som deretter befruktes via den lagrede sæden. Hanner, som oppstår i hermafroditter med en hastighet på mindre enn 0,2%, produserer bare sæd og kan parre seg med hermafroditter. Ved kryssbefruktning utkonkurrerer mannlige sædceller hermafrodittsæd i befruktningen av oocytter⁸. Dette muliggjør relativt enkelt vedlikehold av homozygote mutanter gjennom selvbefruktende bestander og for genetiske manipulasjoner gjennom genetiske kryss. De to kjønnene tillater studier som undersøker forskjeller mellom meiose i mannlige og kvinnelige kimlinjer. Videre, på grunn av den gjennomsiktige naturen til C. elegans og eggene, kan prosessene for meiose, gametogenese, befruktning og embryogenese studeres i levende, intakte dyr ved hjelp av fluorescensavbildningsteknikker.

Når man analyserer nye mutasjoner i gener som kan spille en rolle i meiose, befruktning og / eller embryonal utvikling i C. elegans, er et avgjørende første skritt å bestemme embryonal levedyktighet og brødstørrelse siden feil i disse prosessene ofte fører til en feil eller reduksjon i produksjonen av levedyktig avkom. Dette papiret beskriver en protokoll for å vurdere fruktbarhet, embryonal levedyktighet og brødstørrelse fra enten selvbefruktende hermafroditter eller kryss mellom hermafroditter og hanner. Selv om denne klassiske analysen har blitt brukt i mange C. elegans-studier , tilbyr vi en standardisert protokoll for oppsett og nøyaktig kvantifisering. I denne protokollen isoleres individuelle ormer eller mannlige / hermafrodittpar for å tillate parring og avkomproduksjon. Avkomproduksjon og levedyktighet observeres over en rekke dager for å bestemme antall levedyktige avkom og ikke-levedyktige embryoer. Ved avslutningen av forsøket analyseres individuelle brød for å beregne embryonal levedyktighetsprosent og total brødstørrelse.

Protocol

MERK: Se materialfortegnelsen for detaljer om alle materialer som brukes i denne protokollen.

1. Forbereder eksperimentelle plater

1. Forbered petriskåler med 35 mm diameter med modifiserte Youngrens, Only Bacto-peptone (MYOB) medier. For å lage MYOB-plater, tilsett 20 g Bacto agar, 2 g NaCl, 0,55 g Trizma-HCl, 0,24 g Trizma-OH, 3,1 g Bacto-pepton og 1,6 ml kolesterol til 1 liter ddH₂O og autoklav i 40 minutter ved 121 °C. La det avkjøles til 55 °C, og bruk steril teknikk til å helle 4 ml smeltet media i hver 35 mm petriskål.
   MERK: En liter MYOB lager ~250 plater, som kan oppbevares ved 4 °C i opptil 6 måneder. Vi anbefaler minimum 10 individer per replikat med tre replikasjonssett for hver stamme.
2. Ved hjelp av steril teknikk frø platene med en liten flekk (ca. 50 μL) OP50-bakterier i midten av platen.
   MERK: Små plener er spesielt viktige for å vurdere kryssbefruktning, da det mindre stedet fører til økte møter mellom hanner og hermafroditter, og dermed øker sjansen for parring.

2. Embryonale levedyktighetsanalyser (hermafroditt selvbefruktning)

1. Dag 1
   1. Merk baksiden av hver tallerken. Sørg for å holde styr på hver plate og deres respektive ormer gjennom hele eksperimentet.
      MERK: Foretrukket merking teknikk-Dag 1: orm 1, Dag 1: orm 2, ... etc.
   2. Overfør en individuell L4-trinns hermafroditt til hver plate. Pass på at ingen embryoer eller andre ormer overføres til platen. La ormene utvikle seg til voksne og legg avkommet i 24 timer ved standard dyrkingstemperatur på 20 °C. Score disse platene på dag 3.
      MERK: Temperaturen på eksperimenter kan endres ved temperaturfølsomme mutasjoner. For temperaturfølsomme mutasjoner bør embryonale levedyktighetsanalyser utføres ved både tillatte (15-16 °C) og ikke-tillatte temperaturer (24-26 °C).
2. Dag 2
   1. Merk et sett med nye plater-Dag 2: orm 1, Dag 2: orm 2, ... etc.
   2. Overfør dag 1 individuelle ormer på de nye platene.
      MERK: Disse ormene skal ha nådd voksen alder, og villtype ormer burde allerede ha begynt å legge embryoer.
   3. La ormene legge embryoer i 24 timer ved 20 °C eller annen passende temperatur. Score disse platene på dag 4.
3. Dag 3
   1. Merk et sett med nye plater. Dag 3: orm 1, dag 3: orm 2, ... etc.
   2. Overfør dag 2 individuelle ormer til nye plater. La dem ligge avkom i 24 timer ved 20 °C eller annen passende temperatur. Score disse platene på dag 5.
      MERK: Ved lavere temperaturer vil klekketidene økes. Juster deretter.
   3. Tegn et rutemønster på et 35 mm lokk med en fin markør. Plasser rutelokket under testplaten for telling for å holde oversikt over ormer som tidligere er talt (figur 1A-B).
      1. Ved hjelp av en differensialcelleteller, score dagen 1 plater for tilstedeværelse eller fravær av avkom. Tell levende larver og uklekkede embryoer.
         MERK: På dette tidspunktet har det gått tilstrekkelig tid til at eventuelle levedyktige embryoer burde ha klekket. Eventuelle uklekkede embryoer antas å være døde.
      2. Innenfor en enkelt firkant teller du de uklekkede embryoene og levende larver som er helt innenfor kvadratet (figur 1C-F).
      3. For ormer som er på kvadratkantlinjene, teller du basert på plasseringen av ormehodet. Telle ormer med hoder som berører øvre og venstre kant av firkanten (ikke telle de som berører nedre eller høyre kant; Figur 1D). Ikke tell ubefruktede oocytter for denne analysen (figur 1F).
   4. Registrer antall levende larver og uklekkede embryoer i en laboratorienotatbok.
4. Dag 4
   1. Skår dag 2-platene ved å telle levende larver og uklekkede embryoer, som beskrevet i trinn 2.3.3.1. Registrer antall levende larver og uklekkede embryoer i en laboratorienotatbok.
5. Dag 5
   1. Skår dag 3 plater ved å telle levende larver og uklekkede embryoer, som beskrevet i trinn 2.3.3.1. Registrer antall levende larver og uklekkede embryoer i en laboratorienotatbok. Analyser dataene som er oppnådd ved hjelp av metoden beskrevet i dataanalysen.
      MERK: Noen genetiske mutanter kan ha enten en forsinket eller utvidet reproduksjonssyklus. Overvåk individuelle stammer for fortsatt legging av embryoer utover dag 3-platene. Hvis embryoproduksjonen ikke har opphørt innen dag 4, fortsett å overføre voksne til nye plater.

3. Embryonale levedyktighetsanalyser (mannlig / hermafroditt kryssbefruktning)

1. Dag 1
   1. Merk baksiden av hver tallerken. Sørg for å holde styr på hver plate og deres respektive ormer gjennom hele eksperimentet.
   2. Overfør en individuell L4 hermafrodittorm til hver plate. Pass på at ingen embryoer eller andre ormer overføres til platen.
      MERK: Feminiserte stammer, som fog-2 tap av funksjon mutanter, som ikke produserer sæd, kan brukes i stedet for hermafroditter.
   3. Overfør en enkelt L4 mannlig orm på hver merket plate som inneholder en L4 hermafroditt. Pass på at ingen embryoer eller andre ormer overføres til platen.
      MERK: Stammer som plg-1 variant hanner kan brukes til å identifisere om parring har skjedd, da disse hannene legger en kopulerende plugg på hermafroditt vulva etter parring.
   4. La ormene pare seg og legge avkom i 24 timer ved 20 °C, eller en annen passende temperatur. Skår disse platene for levende larver versus uklekkede embryoer på dag 3.
2. Dag 2
   1. Merk et sett med nye plater og overfør ormene, som i dag 2 ovenfor. I dette tilfellet må du sørge for å overføre både hermafroditt og mann til nye plater. Sørg for at hermafroditten har nådd voksen alder.
   2. La hermafrodittene ligge avkom i 24 timer ved 20 °C, eller en annen passende temperatur. Skår disse platene for levende larver versus uklekkede embryoer på dag 4.
3. Dag 3
   1. Merk et sett med nye plater og overfør ormene, som i dag 3 ovenfor. Sørg for å overføre både hermafroditt og mann på nye plater.
   2. La det ligge avkom i 24 timer ved 20 °C, eller en annen passende temperatur. Skår disse platene for levende versus uklekkede embryoer på dag 5.
   3. Bruk en differensialcelleteller til å telle levende larver og uklekkede embryoer fra dag 1-platene, som beskrevet i trinn 2.3.3.1.
      MERK: Ikke kast platene, da de er nødvendige for dag 4.
   4. Registrer antall levende larver og uklekkede embryoer i en laboratorienotatbok.
4. Dag 4
   1. Tell levende avkom og uklekkede embryoer fra dag 2-platene, som beskrevet i trinn 2.3.3.1. Registrer antall levende larver og uklekkede embryoer i en laboratorienotatbok.
   2. Sjekk dag 1 tallerkener for menn. Hvis parring har skjedd, bør det forventede genetiske forholdet mellom hermafroditter og menn være 50:50. Hvis dag 1-platene ikke inneholder noen hanner, skjedde det ikke parring mellom hannen og hermafroditten. Kast dette parringsparet og registrer denne observasjonen i laboratorienotatboken.
5. Dag 5
   1. Tell levende larver og uklekkede embryoer fra dag 3-platene, som beskrevet i trinn 2.3.3.1. Registrer antall levende larver og uklekkede embryoer i en laboratorienotatbok. Analyser dataene som er oppnådd ved hjelp av metodene beskrevet i dataanalysen.

4. Dataanalyse

1. Beregn embryonal levedyktighetsprosent av en gitt biologisk replikat av en stamme ved hjelp av ligning (1).
   MERK: Antall levende avkom og uklekkede embryoer oppnås ved å summere den daglige tellingen over den eksperimentelle perioden.
   (1)
2. Beregn brødstørrelsen per orm av en gitt stamme ved å summere antall avkom (uklekkede embryoer og larver) produsert av foreldrehermafroditten. Beregn gjennomsnittlig yngelstørrelse ved hjelp av ligning (2).
   (2)
3. Rapporter embryonal levedyktighetsprosent og gjennomsnittlig brødstørrelse med gjennomsnitt og standardavvik mellom biologiske replikater. Utfør Student t-test som sammenligner kontroll- og eksperimentelle data.

Representative Results

Vi utførte embryonal levedyktighet og brødstørrelsesanalyser på N2 (vill type) og på to stammer som har mutasjoner i gener involvert i meiose, him-5 (e1490) og spo-11 (ok79). Siden både him-5 og spo-11 spiller en rolle i meiotisk crossover-dannelse, resulterer mutasjoner i disse to genene i dannelsen av aneuploide kjønnsceller. Denne embryonale levedyktighetsanalysen for N2 ga en levedyktighetsprosent på 98,9%, mens både him-5(e1490) og spo-11(ok79) viste en reduksjon i avkoms levedyktighet med en prosentandel på henholdsvis 74,9% og 0,8% (figur 2A; p < 0,0005). Disse resultatene samsvarer med tidligere publiserte resultater ^7,9. Den gjennomsnittlige yngelstørrelsen på N2, him-5(e1490) og spo-11(ok79) ble bestemt til henholdsvis 217, 105 og 219 (figur 2B). I samsvar med tidligere publikasjoner har him-5(e1490) en betydelig redusert yngelstørrelse sammenlignet med villtype, mens spo-11(ok79) ikke^{har 7,9}.

Figur 1: Demonstrasjon av telleoppsett og embryomorfologi på plater . (A) Bilde av et lokk med et kryssskravert rutenettmønster tegnet med en fin skarphet. (B) En 35 mm MYOB plate med det mønstrede lokket under for telling. (C) Bilde som viser et synsfelt med lav forstørrelse (10x) som viser flere bokser i rutenettet. Hvite pilspisser peker ut flere larver innenfor dette synsfeltet. Telling bør gjøres ved en høyere forstørrelse (bare en kvadrat i feltet) for å observere både larver og embryoer. Skalastang = 1000 μm. (D) Tegneserie av lokket med rutemønsteret plassert under en 35 mm plate. Innsatsen angir riktig teknikk for å bestemme hvilke larver som telles i en gitt firkant. Tell fra topp til bunn, venstre mot høyre. Tell eventuelle ormer som er helt innenfor firkanten. Ormer som berører grensen skal telles basert på posisjonen til ormhodet, ikke halen. Telle ormer som vender mot gjeldende rutenett eller rutenett som tidligere er talt (dvs. øvre og venstre kant). Ikke telle ormer med hoder som berører bunn eller høyre kant. Fra innsiden vil blå ormer telles mens røde ormer ikke vil. (E) Representativt bilde av friske N2 L1 klekkede larver (hvit pilspiss). (F) Representativt bilde av en ubefruktet oocytt (svart pilspiss) og et uklekkket embryo (rød pilspiss). Unfertilized oocytter bør ikke telles for denne analysen. Skalastenger (E,F) = (100 μm). Merk: Bildene i C, E og F ble tatt med et Zeiss AxioZoom-mikroskop, med et kamera festet for å demonstrere utseendet til larver, embryoer og oocytter på ormplater. For embryonale levedyktighetsanalyser gjøres tellinger mens man observerer platene ved hjelp av et stereomikroskop (ingen kamera). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 2: Representative grafer som viser resultatene fra embryonale levedyktighetsanalyser og yngelstørrelser. (A) Embryonal levedyktighetsprosent av N2, him-5 (e1490) og spo-11 (ok79) ved 20 ° C. (B) Brødstørrelser på N2, him-5 (e1490) og spo-11 (ok79) ved 20 ° C. Avkommet til minst 28 hermafroditter ble scoret for hver stamme. Totalt antall uklekkede embryoer pluss larver som ble skåret var N2 = 6302, him-5(e1490) = 2 945 og spo-11(ok79) = 7 230. Feilfelt angir standardavviket på tvers av tre separate individuelle replikater. Statistikk beregnet ved hjelp av Student t-test, n.s. = ikke signifikant, *p < 0,0005. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Discussion

Forplantning av seksuelle reproduserende arter krever dannelse av haploide gameter (dvs. egg og sæd) gjennom meiose, som deretter forenes ved befruktning, gjenoppretter det diploide kromosomnummeret og initierer embryonal utvikling. Feil i noen av disse prosessene kan føre til infertilitet, embryonal dødelighet og / eller fødselsskader. C. elegans er et kraftig modellsystem for å studere seksuell reproduksjon. Effektene av genmutasjoner eller genuttrykksfall (f.eks. RNA-interferens) kan vurderes relativt raskt og enkelt ved hjelp av embryonale levedyktighets- og brødstørrelsesanalyser beskrevet ovenfor. Vi har brukt disse metodene for initial karakterisering av gener involvert i meiotisk kromosomsegregering og befruktning/eggaktivering^10,11,12. En observert reduksjon i embryonal levedyktighet eller brødstørrelse indikerer en forstyrrelse i meiose, gametogenese, befruktning eller embryogenese.

Siden embryonal levedyktighet og yngelstørrelse vurderes relativt enkelt gjennom telling av avkom og en enkel matematisk beregning, er dette optimale introduksjonseksperimenter for nybegynnere enten i laboratoriet eller klasserommet. Den enkle C. elegans husdyrhold og økonomiske fordeler gjør dem spesielt egnet til eksperimentelle biologi klasser. Studentene får verdifull forskningserfaring gjennom C. elegans husdyrhold, lærer å bruke dissekerende mikroskop, og kan stille biologiske spørsmål i et utviklingssystem som kan besvares på relativt kort tid (ca. 5 dager med protokollen beskrevet i denne artikkelen).

Tidspunktet for antall avkom er svært viktig for embryonale levedyktighetsanalyser. Ved 20 °C tar embryogenesen ca. 16 timer, og reproduktivt modne voksne begynner å legge egg ca. 60 timer etter klekking som L1-larver. Siden livssyklusen er rask, er det viktig å telle avkom innenfor riktig vindu, noe som gir tilstrekkelig tid for embryoer å klekke, men før avkommet selv begynner å legge egg. Det er også viktig å merke seg at vekstperioder varierer avhengig av temperatur. Veksten er ca. 2,1 ganger raskere ved 24-25 °C enn ved 15-16 °C, og ca. 1,3 ganger raskere ved 20 °C enn ved 15-16 °C¹³. I denne protokollen anbefaler vi at tellingen skjer 48 timer etter at de voksne er plassert på en ny tallerken. Denne tidsrammen sikrer at alle embryoer med villtypeutvikling har tilstrekkelig tid til å klekkes (>16 timer), men ikke eldes til reproduksjonsevnen. Analyser utført ved temperaturer lavere enn 20 °C må kanskje forlenges (overføringsdyr i 4 dager) for at embryoer skal klekkes og for klekket avkom for å nå larvestadier som er lettere å observere blant bakteriene på MYOB-platene (L3-L4 stadier).

En begrensning for embryonale levedyktighetsanalyser og brødstørrelse er at den spesifikke utviklingsprosessen som forstyrres, ikke er lett synlig. Imidlertid kan disse innledende analysene følges opp med cytologiske teknikker for å bestemme hvilken prosess som påvirkes. For eksempel kan disseksjon av de voksne ormene for å frigjøre gonaden etterfulgt av 4',6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) farging og nøye analyse av DNA-morfologi i kimlinjen avsløre om meiotiske prosesser forstyrres. I tillegg kan DAPI-farging av embryoer avsløre på hvilket stadium embryogenesearrestasjoner.

Avslutningsvis har vi beskrevet en protokoll for å analysere antall produserte embryoer (brød) og prosentandelen embryoer som er levedyktige for ulike C. elegans mutanter. Denne analysen kan brukes til både selvbefruktende hermafroditter og for mannlige / hermafrodittkryss. Med den korte livssyklusen til C. elegans kan denne protokollen fullføres på mindre enn 1 uke. Embryonale levedyktighetsanalyser og brødstørrelser kan brukes som første analyser av gener involvert i meiose, befruktning eller embryonal utvikling, og er passende protokoller for mer avanserte forskere og forskningsnybegynnere (både studenter og førsteårsstudenter).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Materials
35 mm Petri dishes	Tritech research	T3501	Semi-stackable, non-vented.
Bacto Agar	Becton, Dickinson and Company	214010	For MYOB
Bacto-Peptone	Gibco	211677	For MYOB
Cholestrol	Sigma	C8503	For MYOB
Sodium Chloride	J.T. Baker	FW 58.440	For MYOB
Trizma Base	Sigma	T1503	For MYOB
Trizma hydrochloride	Sigma	T3253	For MYOB
Strains
C. elegans wild type strain	Caenorhabditis Genetics Center	N2
Escherichia coli	Caenorhabditis Genetics Center	OP50
him-5(e1490)	Caenorhabditis Genetics Center	DR466
spo-11(ok79)	Caenorhabditis Genetics Center	AV106
Equipment/software
Differential cell counter	Fischer Scientific	02-670-12
MicroSoft Excel or Prism	MicroSoft or GraphPad		For recording and creating graphical representations of data.
platinum wire	Tritech research	PT9901	For making worm picks. 99.5% Platinum, 0.5% Iridium. This comes as 3 ft/pack, which is sufficient for making 36 worm picks (~1 inch platinum wire per pick).
Stereomicroscope	Nikon	SMZ-745	Diascopic base with focus mount, integrated LED module, power cord, 6.7x to 50x Zoom range [WD 115 mm], Widefield Eyepiece C-15x/17 (Note: equivalent stereomicroscopes are available from other manufacturers.)
worm pick handle	Tritech research	TWPH1	For making worm picks. Mount ~1 in platinum wire into worm pick handle. Alternatively, worm picks can be made by mounting platinum wire in a glass Pasteur pipette.