Summary
马具有非凡的有氧运动能力，使马骨骼肌成为研究马运动生理学和哺乳动物线粒体生理学的重要组织。本文介绍了全面评估马骨骼肌线粒体功能的技术。
Abstract
线粒体功能——氧化磷酸化和活性氧的产生——对健康和疾病都至关重要。因此，测量线粒体功能是生物医学研究的基础。骨骼肌是线粒体的强大来源，特别是在具有非常高有氧能力的动物中，例如马，使其成为研究线粒体生理学的理想对象。本文演示了使用高分辨率呼吸测量法与同步荧光测定法，以及新鲜收获的骨骼肌线粒体，以量化不同线粒体状态下氧化底物的能力，并确定线粒体呼吸不同元素的相对能力。四甲基罗丹明甲酯用于证明由底物氧化产生的线粒体膜电位的产生，包括通过计算每单位并发氧通量产生的相对膜电位来计算线粒体的相对效率。由于腺苷酸对镁的亲和力不同，ADP转化为ATP导致反应室中镁浓度的变化。因此，镁绿可用于测量ATP合成速率，从而可以进一步计算氧化磷酸化效率（磷酸化与氧化的比率[P / O]）。最后，使用Amplex UltraRed与过氧化氢结合时产生荧光产物（试卤灵），可以量化线粒体呼吸过程中活性氧的产生，以及ROS产生与同时呼吸之间的关系。这些技术允许在各种不同的模拟条件下对线粒体生理学进行稳健的量化，从而揭示了这种关键细胞成分对健康和疾病的贡献。
Introduction
真核细胞的线粒体产生细胞用于工作和维持的大部分ATP1。ATP线粒体产生的关键步骤是将氧气转化为水，因此线粒体和相关细胞的代谢能力经常通过测量氧气消耗量来量化2。然而，线粒体生理学比简单的耗氧过程更复杂，并且仅依赖该终点提供了对线粒体功能和功能障碍对细胞健康影响的不完整评估。线粒体功能的全面表征不仅需要评估耗氧量，还需要评估ATP的产生以及活性氧（ROS）。
关键线粒体功能的额外测量可以与通过使用特定荧光团测量呼吸同时完成。四甲基罗丹明甲酯（TMRM）是一种阳离子荧光团，其在线粒体基质中与线粒体跨膜电压电位成比例地积累，导致由于这种积累而降低荧光强度3。TMRM可用作线粒体膜电位相对变化的指标，或可用于量化跨膜电压的精确变化，并进行额外的实验以确定允许将荧光信号转换为mV的常数。镁绿（MgG）是一种荧光团，与Mg2+结合时会发出荧光，用于根据ADP和ATP对镁二价阳离子4的差异亲和力测量ATP合成。研究人员必须确定在特定分析条件下ADP和ATP的特定亲和力/解离常数（Kd），以将MgG荧光的变化转化为ATP浓度的变化。Amplex UltraRed （AmR） 是用于测量线粒体呼吸过程中过氧化氢和其他 ROS 产生的荧光团5。H2O2 和AmR（由辣根过氧化物酶催化）之间的反应产生试卤灵，可通过530nM的荧光检测到。这些测定中的每一个都可以单独添加到实时线粒体呼吸测定中，以同时测量线粒体生理学的各个方面，从而提供呼吸和线粒体输出之间的直接联系。
马能够产生非常高的质量比氧消耗率，部分原因是马骨骼肌的线粒体含量非常高，这使得这种组织与研究线粒体生理学高度相关。随着高分辨率呼吸测量法的发展，使用这种新技术的研究有助于确定马骨骼肌线粒体对马显着运动能力和骨骼肌疾病的病理生理学的贡献6，7，8，9，10，11，12，13，14.对马骨骼肌线粒体功能的研究特别有利，因为获得大量的这种组织是非终末性的。因此，马受试者不仅可以为线粒体功能的完整表征提供足够的组织，还可以作为线粒体生理学高质量机械研究的纵向对照。出于这个原因，已经开发了额外的测定来量化线粒体膜电位，ATP合成和ROS的产生，以补充该组织中氧气消耗量的测量，以便提供更可靠的线粒体生理学表征马骨骼肌。
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Protocol
这项研究得到了俄克拉荷马州立大学机构动物护理和使用委员会的批准。本研究使用4匹纯种阉马（17.5±1.3岁，593±45公斤）产生代表性结果。
1.获取骨骼肌活检标本
- 在轻度镇静下，使用 12 G 大学学院医院 （UCH） 活检针（见 材料表）从半腱肌（或其他感兴趣的肌肉）中心获取骨骼肌活检（遵循无菌技术），并根据先前发表的报告使用局部麻醉11.
- 将活检标本立即转移到带有冰冷活检运输介质溶液（2.77 mM CaK 2-EGTA、7.23 mM K 2-EGTA、20 mM 咪唑、20 mM 牛磺酸、50 mM K-MES、0.5 mM 二硫苏糖醇、6.56 mM MgCl2、5.77 mM ATP 和 15 mM 磷酸肌酸，调节至 pH 7.1;参见材料表）的小瓶中。运送到实验室进行分析。
注意：有关制备活检运输培养基的具体说明，请参阅Doerrier等人15。 - 根据制造商的说明，使用商业试剂盒从活检样本中分离线粒体（见 材料表）。最终的储存缓冲液不应含有ADP、ATP和琥珀酸盐等底物，这些底物是呼吸测定的一部分。
- 使用每 100 mg 用于线粒体分离的肌肉使用 80 μL 悬浮培养基（225 mM 甘露醇、75 mM 蔗糖和 1 mM EGTA;参见 材料表）重悬分离线粒体的最终沉淀。
- 尽量减少从活检程序到分离线粒体的间隔，并在整个处理步骤中将样品保持在0-4°C，直到添加到高分辨率呼吸计中。
注意：初步研究发现，当保持在0-4°C时，分离线粒体的悬浮液在大约2小时后开始失去功能能力。
2. 高分辨率呼吸计的设置
- 高分辨率呼吸计用于量化线粒体呼吸和相关过程。使用制造商提供的软件控制程序（见 材料表）来控制呼吸计，校准传感器并收集原始数据。分析每个测试条件的一式两份样本。
注意：在所有情况下，本协议中描述的推荐滴定和最终试剂浓度均基于2 mL呼吸测定室。 - 按照制造商的说明，通过连二亚硫酸盐的连续滴定，每2-4周确定O 2电极的背景O2通量和零点。保留这些校准常数以供后续分析，直到重复校准。
注意：与以前发表的使用透化肌纤维11，12，13，16的程序相比，其中需要高氧（250-500μM）以避免O 2向线粒体的扩散限制，分离的线粒体可以使用50-200μM O2的范围进行评估.这可以通过在添加线粒体悬浮液之前（即，在每日单点校准之后）让呼吸介质与室内空气平衡来实现。同样，呼吸室的复氧可以通过简单地打开室来完成，直到足够的环境氧气溶解到呼吸测量介质中，将氧气浓度提高到所需水平。 - 用无镁培养基（0.5 mM EGTA、60 mM K-乳糖酸、20 mM 牛磺酸、10 mM KH2PO4、20 mM HEPES、110 mM 蔗糖和 1 g/L 牛血清白蛋白 [BSA] 基本上不含脂肪酸，调节至 pH 7.1;参见 材料表）填充呼吸计室。
注意：有关制备呼吸介质的具体说明，请参阅Komlodi等人17 。- 将仪器孵育温度设置为38°C以表示马骨骼肌的基础温度，并使用在呼吸计室底部转动的磁力搅拌器将呼吸介质的混合设置为800rpm。
- 关闭腔室照明以避免干扰荧光传感器。
- 用800 mV极化电压为氧电极通电，并以增益设置为1放大产生的信号。
- 每2秒记录一次氧浓度，将氧通量计算为前40秒（20个数据点）氧测量的负斜率，并报告为PMOL x s-1 x mL的孵育溶液。
- 通过让介质与室内空气平衡来校准氧传感器。根据高分辨率呼吸计测量的气压和标准大气氧浓度计算参考氧分压。
3. 使用TMRM测量线粒体膜电位
- 使用“绿色”荧光传感器（530 nm主波长）量化来自呼吸室的荧光信号。在 400-500 mV 下为传感器通电;产生的信号以1：1，000的增益被放大。
注意： 必须针对单个仪器优化特定设置，以捕获传感器线性范围内的预期信号。 - 加入TMRM（4μL的1mM溶液，最终浓度为2μM;参见 材料表）在加入线粒体之前。
- 在添加线粒体之前，使用荧光信号（电压）与添加荧光团（mM）的量进行简单的两点校准来校准荧光信号。
注意： 使用机器控制软件中的荧光信号校准功能来校准此信号。来自荧光探针的原始信号可能需要30分钟或更长时间才能稳定下来，以便记录校准的第二个点。 - 完成呼吸测定滴定方案后，通过多次滴定解偶联剂（羰基氰间氯苯基腙;每次滴定 2 μL）进行 TMRM 信号的最终校准，直到没有观察到 TMRM 荧光信号进一步增加，表明线粒体膜电位完全崩溃（图 1）。
注意：该荧光信号值被认为等于0 mV跨膜电位，并用作呼吸测定滴定方案期间记录的相对膜电位值的参考点。
4. 使用镁绿 （MgG） 测量 ATP 产量
- 使用“蓝色”荧光传感器（465 nm主波长）量化来自呼吸室的荧光信号。为各个仪器的这些传感器通电，以捕获传感器线性范围内的预期信号。
- 在线粒体添加后但在添加任何底物之前，执行 MgG 荧光信号的化学设置和校准。向呼吸测定室中加入 8 μL 2 mM 乙二胺四乙酸 （EDTA），以螯合与 Mg 2+ 竞争与 MgG 结合的阳离子（特别是 Ca2+），然后向呼吸室中加入 4 μL 1 mM MgG （1.1 μM）。
- 用 10 x 2 μL 100 mM MgCl 2 的顺序滴定校准原始荧光信号，滴定间隔 1 分钟以稳定荧光信号（图 2）。
注意：该过程在完成测定后离线完成，并使用机器制造商和相关软件提供的模板，产生镁浓度到荧光信号的二阶曲线（预期r2 > 0.98），该曲线将与已知量的ADP一起添加到呼吸测量室和先前确定的Kd 值以确定ATP11的相应浓度。 - 确定ATP合成速率，即整个协议中ATP浓度随时间推移的斜率（图3）。
5. 使用 Amplex UltraRed （AmR） 测量线粒体产生 ROS
- 使用“绿色”荧光传感器（530 nm主波长）量化来自呼吸室的荧光信号。在 300-400 mV 下为传感器通电;产生的信号以1：1，000的增益被放大。优化单个仪器的特定设置，以捕获传感器线性范围内的预期信号。
注意：如果使用不含 MgCl 2 的呼吸培养基，则应在添加用于 AmR 测定的试剂之前添加（20-60 μL 100 mM MgCl 2 以产生 1-3 μM MgCl2）。 - 在添加线粒体之前，执行AmR测定的化学设置和初始校准。加入 30 μmol DTPA（6 μL 5 mM 溶液）以螯合可能干扰反应的阳离子，然后加入超氧化物歧化酶（2 μL 的 5，000 U/mL 储备溶液，将超氧阴离子转化为 H 2 O2，以便更全面地检测活性氧的生成）、辣根过氧化物酶（5 μL 的 500 U/mL 储备溶液）， 和Amplex UltraRed（2 μL 10 mM储备溶液）（参见材料表），分别在呼吸测定室中产生5 U / mL，1 U / mL和10 μM。
- 让荧光信号稳定，然后加入 0.2 μmol 过氧化氢（5 μL 每天新鲜制作的 40 μM 溶液）两次，间隔约 5 分钟。
注意：H2O 2 两次滴定前后的荧光信号提供了系统的三点线性校准曲线（预期r 2>0.95），其斜率反映了系统在报告荧光信号与H 2 O 2 O 2产生（或添加）之间的关系时的整体响应性。使用机器控制软件中的荧光信号校准功能来校准该信号。 - 在整个测定过程中执行额外的两点校准（每天新鲜的5μL40μM溶液），以允许在整个测定过程中随着呼吸测定的化学变化调整测定的反应性，这些校准点的具体时间由研究者决定（图4）。
6. 线粒体呼吸的测量
- 向每个 2 mL 孵育室中加入 15 μL 分离的线粒体悬浮液（步骤 1.4），使结果代表 18.75 mg 肌肉的线粒体产量。密封培养室。在每次滴定之间涡旋样品，以保持样品的均匀悬浮液。
- 在添加任何底物之前测量残余氧消耗量（ROX）。完成方案后，从底物/解偶联剂/抑制剂滴定（SUIT）方案11中每个步骤的耗氧量值中减去该值（通常小于0.2 pmol O2 x s-1 x mL-1）。
注意：至关重要的是，来自氧传感器和荧光传感器的信号至少稳定1分钟（通过主要传感器信号的稳定计算斜率评估），因为滴定会改变呼吸的整体状态以获得可靠的结果。这适用于所有滴定步骤。 - 使用通用 SUIT，用于初步表征马骨骼肌线粒体功能。首先依次滴定丙酮酸（5 μL 2 M 水溶液）、谷氨酸（10 μL 2 M 水溶液）和苹果酸盐（10 μL 0.4 M 水溶液）（参见 材料表）进入每个腔室以产生烟酰胺腺嘌呤二核苷酸 （NADH） 并刺激由通过复合物 I （LN） 氧化的 NADH 支持的非磷酸化（泄漏）呼吸（图 1， 图 3 和 图 4）。
- 加入ADP（20μL的500mM水溶液;参见 材料表）以刺激通过复合物I（PN）磷酸化呼吸。
- 加入琥珀酸盐（20 μL 1 M 水溶液;参见 材料表），通过复合物 I 和复合物 II 的组合产生磷酸化呼吸 （PN + S）。
注意：通过复合物I和复合物II的呼吸组合，耗氧量可能高到足以消耗溶解在孵育培养基中的大部分氧气。如果O 2浓度降至50μM以下，则通过打开孵育室来重新复氧培养基，直到测量的O 2浓度增加到150μM以上。 根据需要重复此步骤以保持足够的O2用于线粒体呼吸。 - 加入鱼藤酮（2 μL 0.1 mM 乙醇溶液;参见材料表）以阻断复合物 I。由此产生的氧通量代表复合物II通过单独氧化琥珀酸（PS）支持线粒体耗氧的能力。
注意：鱼藤酮是一种有毒物质。使用标准的实验室安全性，避免摄入或吸入。 - 计算包含单次活检等分试样的各个呼吸测量室中给定实验条件的平均值。
注意：推导的计算，如通量控制比（FCR），对于识别不同途径的相对变化很有价值，包括FCR泄漏（L N / P N），FCR N（P N / P N + S）和FCR S（P S / P N + S）。计算的氧化磷酸化效率 （1-LN/PN+S） 提供了根据总呼吸能力调整的渗漏呼吸的总体影响的估计值。
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Representative Results
建议的参考状态是健康的久坐纯种马（由于强制运动而没有增加健康）和从姿势肌中心收集的新鲜肌肉样本，含有高百分比的富含线粒体的I型骨骼肌纤维，并在接近静息代谢的条件下孵育（即38°C和pH 7.0）。在这些条件下，研究者可以预期L N值为2.71±0.90，P N值为62.40±26.22，PN + S值为93.67±34.76，PS值为46.93±14.58 pmol O2 x s-1 x mL-1（图3和图4）。由于该荧光团的抑制作用，与TMRM一起孵育的线粒体的呼吸值较低（图1）。FCR泄漏、FCRN 和 FCRS 分别为 0.05 ± 0.01、0.66 ± 0.07 和 0.51 ± 0.07。计算的氧化磷酸化效率为0.97±0.01。这些呼吸状态的绝对值因个体受试者和组织氧化能力而异，但这些值的相对模式与透化马骨骼肌纤维的已发表结果一致（即，通过添加特定底物的呼吸增加，由于电子转移系统的饱和，通过复合物I和复合物II的呼吸组合分别小于这些电子源中的每一个[ETS] 下游产能）。分离的马骨骼肌线粒体的计算效率与透化马骨骼肌纤维11的相应值一致。
用于分离线粒体的源组织，P N 呼吸的 ATP 合成速率预计为 438.59 ± 397.10 pM x s-1，PN + S 呼吸为 383.18 ± 397.19，PS 呼吸为 172.07 ± 125.60。添加琥珀酸盐后ATP合成的减少可能是由于两个电子馈电在ETS的醌连接处的竞争，来自复合物II的馈电（不直接有助于线粒体膜电位）减少了通过复合物I的电子流动（通过质子泵送穿过线粒体膜直接有助于线粒体膜电位）。
对于用于分离线粒体的源组织，H2O2的产生速率预计为0.079±0.095 nmol.s-1，P N呼吸为0.021 ± 0.043，PN + S呼吸为0.026 ± 0.056，PS呼吸为0.237 ± 0.248（图4）。ROS产生的相对速率与线粒体膜电位的预测大小以及高膜电位与ROS产生之间的关联一致。这种关系的例外是，当呼吸仅通过复合物II发生时，由于电子从醌结向复合物I的反向流动，当它被鱼藤酮阻挡时，ROS产生非常高。
图 1：马骨骼肌线粒体呼吸和相对膜电位的代表性高分辨率呼吸测定图。顶部窗口是腔室氧浓度（左Y轴）和氧通量（右Y轴）随时间的变化（X轴）;底部窗口是腔室TMRM荧光（左Y轴）和荧光信号随时间变化的速率（右Y轴）（X轴）。垂直标记表示向腔室中添加特定底物（mt：线粒体悬浮液;P：丙酮酸;G：谷氨酸;M：苹果酸盐;D：ADP;S：琥珀酸盐;R：鱼藤酮;CCCP：羰基氰间氯苯基腙）。请点击此处查看此图的大图。
图 2：校准镁绿的腔室荧光信号以及测定镁和腺苷酸盐的 Kd 的代表性高分辨率呼吸测量迹线。 腔室 MgG 荧光（左 Y 轴）和荧光信号随时间变化速率（右 Y 轴）（X 轴）。最初的垂直标记表示向腔室中添加了特定的底物（MgG：镁绿; mt：线粒体悬浮液;P：丙酮酸;G：谷氨酸;M：苹果酸盐;S：琥珀酸盐;EDTA：乙二胺四乙酸）。随后使用自动滴定泵（TIP）连续滴定MgCl 2 ，增加荧光信号，然后连续滴定腺苷酸（在本例中为ATP）以降低荧光信号。MgCl2 的滴定也用于每次测定开始时以校准MgG信号，但在添加线粒体和呼吸测定底物（如P，G，M和S）之前 进行。
图 3：马骨骼肌线粒体呼吸和 ATP 合成的代表性高分辨率呼吸测定痕迹。 顶部窗口是腔室氧浓度（左Y轴）和氧通量（右Y轴）随时间的变化（X轴）;底部窗口是腔室MgG荧光（左Y轴）和荧光信号随时间变化的速率（右Y轴）（X轴）。垂直标记表示向腔室中添加特定底物（mt：线粒体悬浮液;P：丙酮酸;G：谷氨酸;M：苹果酸盐;D：ADP;S：琥珀酸盐;R：鱼藤酮）。 请点击此处查看此图的大图。
图 4：马骨骼肌线粒体呼吸和 H 2 O2产生的代表性高分辨率呼吸测定痕迹。顶部窗口是腔室氧浓度（左Y轴）和氧通量（右Y轴）随时间的变化（X轴）;底部窗口是室试卤灵荧光（左Y轴）和荧光信号随时间变化的速率（右Y轴）（X轴）。垂直标记表示向腔室中添加特定底物（mt：线粒体悬浮液;P：丙酮酸;G：谷氨酸;M：苹果酸盐;D：ADP;S：琥珀酸盐;R：鱼藤酮）。还包括使用 H 2 O2对荧光信号进行三次测定内两点校准。请点击此处查看此图的大图。
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Discussion
在高分辨率呼吸计的标准输出中添加荧光信号可提供有关线粒体生理学的宝贵信息，但对荧光信号进行细致校准对于高质量数据至关重要。使用MgG的原始方案表明，计算镁-腺苷酸解离常数时产生的校准曲线可以应用于后续测定4;然而，对于这种方法，来自MgG的荧光信号在测定之间可能没有足够的重现性。因此，每次测定都使用自动 MgCl2 滴定进行校准，以及用于计算该单独测定的 ATP 合成的所得校准曲线。此外，必须针对测定的特定条件计算镁以及ADP和ATP的Kd（解离常数），包括特定组织，孵育条件和产生磷酸化呼吸的底物，以确保ATP合成速率的推导准确。AmR测定的变异性得到更广泛的认可15，17，并且在方案期间，通常由研究者自行决定在方案中插入几个离散的重新校准点。使用马骨骼肌的历史数据表明，在第一个校准点（添加样品之前），测定的典型响应性约为 H2O2 的 0.646 V/mM，并且在测定期间可能降低 8%-15%。因此，为了检测ROS生产中相对较小的变化，需要频繁地重新校准AmR测定，并且应为每个滴定方案确定方案内点校准的时间。
研究人员必须在整个分析过程中进行仔细判断，以确定何时进入下一个滴定步骤。理想情况下，实时产生的相关信号（O2 通量，TMRM的荧光以及MgG和试卤灵荧光信号的变化率）应该是稳定的，表明腔室内处于稳定状态，但这是研究者对什么是可接受的稳定性的判断。目前，这一决定还没有广泛持有的标准;然而，研究人员必须敏锐地认识到未能等待足够长的时间以建立稳定状态（导致数据不完全表征预期的呼吸状态）和等待太久以致底物耗尽的风险，并且测定不再可靠。根据作者的经验，在任何底物滴定后30分钟内未能获得稳定的信号是样品（或机器）以非生物学方式行为的证据，必须丢弃该测定。
使用这种方法量化线粒体生理学的结果显示出相当大的受试者间变异性，典型变异系数（CV）为30%-40%。相比之下，透化的马骨骼肌纤维分析导致CV为19%-20%11，这表明分离线粒体的过程除了明显的受试者间变异性外，还对后续分析施加了实质性的变异性。尽管后者的影响可以通过尽可能使用受试者作为自己的对照来减轻，但前者只能通过仔细注意隔离技术来最小化。如果实验设计不允许从单次活检中进行实验重复，则研究者可以选择相对于反映不同样本中线粒体含量差异的校正因子表达呼吸测量数据。最常见的校正因子是样品的蛋白质含量和柠檬酸盐合酶活性。然而，正如活跃在该领域的科学家最近发表的共识声明中所概述的那样，没有一种单一的方法可以执行这种调整，这是普遍同意的18。校正蛋白质含量和/或柠檬酸盐合酶活性是用于马骨骼肌组织的两种最常见的方法12，13，但两者都有其缺点。不同的实验设计可能需要通过内部（即通量控制比）和外部（蛋白质、酶活性、其他线粒体标志物）表达数据，以解释线粒体功能。
所描述的方案建立在透化肌纤维的使用之上，有几个重要的区别。透化纤维测定需要较小的活检，因为马骨骼肌透化纤维的高分辨率呼吸测定通常在每个腔室中仅使用~2mg样品质量6，7，8，9，10，11进行。相比之下，这里描述的协议在每个腔室中的纤维质量相当于近 10 倍。这种差异凸显了从新鲜组织中分离线粒体的效率低下。这种低效率的一个可能原因是难以恢复位于收缩蛋白网络中的骨骼肌线粒体。该方案中使用的线粒体分离商业试剂盒包括用蛋白酶处理和使用离子培养基来帮助分解收缩纤维，但很可能大部分肌原纤维线粒体没有被恢复。该方案的这一特征不仅与确定所需的活检材料量有关，而且与结果的解释有关。与透化纤维相比，由于扩散限制，分离的线粒体不太容易受到氧依赖的影响15;因此，分离的线粒体不需要高氧，并且只需打开腔室进入室内空气即可充分氧合（并在测定过程中重新氧化）。在测量H2O2和其他ROS的产生时，氧气输送的这一方面特别有用，因为在高氧孵育期间ROS的产生以非生理方式增加19。最后，由于与使用具有透化肌纤维的荧光团相比，荧光团的非特异性蛋白质结合减少，因此使用分离的线粒体提供了更稳定和可重复的荧光信号。每种样品制备都有优点和缺点，并且熟练使用透化纤维和分离的线粒体为研究人员提供了一套强大的检测方法，用于解决与线粒体生理学相关的各种问题。
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Disclosures
作者与本手稿没有利益冲突。
Acknowledgments
作者要感谢约翰和黛比奥克斯利马运动医学捐赠主席和格雷森赛马会研究基金会的慷慨支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ADP | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | A5285 | |
| Amplex UltraRed | Life Technologies | A36006 | |
| ATP | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | A2383 | |
| BSA | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | A6003 | |
| Calcium carbonate | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | C4830 | |
| CCCP | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | C2759 | |
| DatLab 7.0 | Oroboros Inc | Software to operate O2K fluororespirometer | |
| Dithiothreitol | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | D0632 | |
| DTPA | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | D1133 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | E4378 | |
| Glutamate | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | G1626 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | H7523 | |
| Horseradish peroxidase | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | P8250 | |
| Hydrogen peroxide | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | 516813 | Must be made fresh daily prior to assay |
| Imidazole | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | I2399 | |
| K-MES | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | M8250 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | M9272 | |
| Magnesium Green | Thermo Fisher Scientific | M3733 | |
| Malate | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | M1000 | |
| Mannitol | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | M9647 | |
| Mitochondrial isolation kit | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | MITOISO1 | |
| O2K fluororespirometer | Oroboros Inc | Multiple units required to run full spectrum of assays concurrently. | |
| Phosphocreatine | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | P7936 | |
| Potassium hydroxide | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | P1767 | |
| Potassium lactobionate | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | L2398 | |
| Potassium phosphate | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | P0662 | |
| Pyruvate | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | P2256 | Must be made fresh daily prior to assay |
| Rotenone | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | R8875 | |
| Succinate | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | S2378 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | 84097 | |
| Superoxide dismutase | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | S8160 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | T0625 | |
| Titration pump | Oroboros Inc | ||
| Titration syringes | Oroboros Inc | ||
| TMRM | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | T5428 | |
| UCH biopsy needle | Millenium Surgical Corp | 72-238067 | Available in a range of sizes |
References
- Wilson, D. F. Energy metabolism in muscle approaching maximal rates of oxygen utilization. Medicine and Science in Sports and Exercise. 27 (1), 54-59 (1995).
- Gnaiger, E. Mitochondrial Pathways and Respiratory Control. An Introduction to OXPHOS Analysis. 4th edn. , Oroboros MiPNet Publications. Innsbruck. (2014).
- Ehrenberg, B., Montana, V., Wei, M. D., Wuskell, J. P., Loew, L. M. Membrane potential can be determined in individual cells from the nernstian distribution of cationic dyes. Biophysical Journal. 53 (5), 785-794 (1988).
- Chinopoulos, C., Kiss, G., Kawamata, H., Starkov, A. A. Measurement of ADP-ATP exchange in relation to mitochondrial transmembrane potential and oxygen consumption. Methods in Enzymology. 542, 333-348 (2014).
- Krumschnabel, G., et al. Simultaneous high-resolution measurement of mitochondrial respiration and hydrogen peroxide production. Methods in Molecular Biology. 1264, 245-261 (2015).
- Lemieux, H., et al. Mitochondrial function is altered in horse atypical myopathy. Mitochondrion. 30, 35-41 (2016).
- Houben, R., Leleu, C., Fraipont, A., Serteyn, D., Votion, D. M. Determination of muscle mitochondrial respiratory capacity in Standardbred racehorses as an aid to predicting exertional rhabdomyolysis. Mitochondrion. 24, 99-104 (2015).
- Votion, D. M., Gnaiger, E., Lemieux, H., Mouithys-Mickalad, A., Serteyn, D. Physical fitness and mitochondrial respiratory capacity in horse skeletal muscle. PLoS One. 7 (4), 34890 (2012).
- Votion, D. M., et al. Alterations in mitochondrial respiratory function in response to endurance training and endurance racing. Equine Veterinary Journal Supplement. (38), 268-274 (2010).
- Tosi, I., et al. Altered mitochondrial oxidative phosphorylation capacity in horses suffering from polysaccharide storage myopathy. Journal of Bioenergetics and Biomembranes. 50 (5), 379-390 (2018).
- Davis, M. S., Fulton, M. R., Popken, A. A. Effect of hyperthermia and acidosis on equine skeletal muscle mitochondrial oxygen consumption. Comparative Exercise Physiology. 17 (2), 171-179 (2021).
- Latham, C. M., Fenger, C. K., White, S. H. RAPID COMMUNICATION: Differential skeletal muscle mitochondrial characteristics of weanling racing-bred horses1. Journal of Animal Science. , (2019).
- White, S. H., Warren, L. K., Li, C., Wohlgemuth, S. E. Submaximal exercise training improves mitochondrial efficiency in the gluteus medius but not in the triceps brachii of young equine athletes. Scientific Reports. 7 (1), 14389 (2017).
- White, S. H., Wohlgemuth, S., Li, C., Warren, L. K. Rapid communication: Dietary selenium improves skeletal muscle mitochondrial biogenesis in young equine athletes. Journal of Animal Science. 95 (9), 4078-4084 (2017).
- Doerrier, C., et al. High-resolution FluoRespirometry and OXPHOS protocols for human cells, permeabilized fibers from small biopsies of muscle, and isolated mitochondria. Methods in Molecular Biology. 1782, 31-70 (2018).
- Li, C., White, S. H., Warren, L. K., Wohlgemuth, S. E. Effects of aging on mitochondrial function in skeletal muscle of American American Quarter Horses. Journal of Applied Physiology. 121 (1), 299-311 (2016).
- Komlodi, T., et al. Comparison of mitochondrial incubation media for measurement of respiration and hydrogen peroxide production. Methods in Molecular Biology. 1782, 137-155 (2018).
- Gnaiger, E.
- Li Puma, L. C., et al. Experimental oxygen concentration influences rates of mitochondrial hydrogen peroxide release from cardiac and skeletal muscle preparations. American Journal of Physiology: Regulatory, Integrated, and Comparative Physiology. 318 (5), 972-980 (2020).
