Summary
Paarden hebben een uitzonderlijke aërobe inspanningscapaciteit, waardoor paardenskeletspieren een belangrijk weefsel zijn voor zowel de studie van paardeninspanningsfysiologie als de mitochondriale fysiologie van zoogdieren. Dit artikel beschrijft technieken voor de uitgebreide beoordeling van de mitochondriale functie in de skeletspieren van paarden.
Abstract
Mitochondriale functie - oxidatieve fosforylering en het genereren van reactieve zuurstofsoorten - is van cruciaal belang voor zowel gezondheid als ziekte. Het meten van de mitochondriale functie is dus fundamenteel in biomedisch onderzoek. Skeletspieren zijn een robuuste bron van mitochondriën, vooral bij dieren met een zeer hoge aerobe capaciteit, zoals paarden, waardoor ze ideale onderwerpen zijn voor het bestuderen van mitochondriale fysiologie. Dit artikel demonstreert het gebruik van hoge-resolutie respirometrie met gelijktijdige fluorometrie, met vers geoogste skeletspier mitochondriën, om het vermogen om substraten te oxideren onder verschillende mitochondriale toestanden te kwantificeren en de relatieve capaciteiten van verschillende elementen van mitochondriale ademhaling te bepalen. Tetramethylrhodaminemethylester wordt gebruikt om de productie van mitochondriaal membraanpotentiaal als gevolg van substraatoxidatie aan te tonen, inclusief berekening van de relatieve efficiëntie van de mitochondriën door het relatieve membraanpotentiaal gegenereerd per eenheid gelijktijdige zuurstofflux te berekenen. De omzetting van ADP naar ATP resulteert in een verandering in de concentratie van magnesium in de reactiekamer, als gevolg van verschillende affiniteiten van de adenylaten voor magnesium. Daarom kan magnesiumgroen worden gebruikt om de snelheid van ATP-synthese te meten, waardoor de oxidatieve fosforyleringsefficiëntie (verhouding van fosforylering tot oxidatie [P / O]) verder kan worden berekend. Ten slotte maakt het gebruik van Amplex UltraRed, dat een fluorescerend product (resorufin) produceert in combinatie met waterstofperoxide, de kwantificering mogelijk van de productie van reactieve zuurstofsoorten tijdens mitochondriale ademhaling, evenals de relatie tussen ROS-productie en gelijktijdige ademhaling. Deze technieken maken de robuuste kwantificering van mitochondriale fysiologie onder een verscheidenheid aan verschillende gesimuleerde omstandigheden mogelijk, waardoor licht wordt geworpen op de bijdrage van deze kritieke cellulaire component aan zowel gezondheid als ziekte.
Introduction
De mitochondriën van eukaryote cellen produceren het grootste deel van de ATP die door de cellen wordt gebruikt voor werk en onderhoud1. Een belangrijke stap in de mitochondriale productie van ATP is de omzetting van zuurstof in water, en dus wordt de metabolische capaciteit van mitochondriën en de bijbehorende cellen vaak gekwantificeerd door de meting van het zuurstofverbruik2. Mitochondriale fysiologie is echter complexer dan het eenvoudige proces van zuurstofverbruik, en vertrouwen op dit eindpunt biedt uitsluitend een onvolledige beoordeling van de impact van mitochondriale functie en disfunctie op cellulaire gezondheid. Volledige karakterisering van de mitochondriale functie vereist de beoordeling van niet alleen het zuurstofverbruik, maar ook de productie van ATP en reactieve zuurstofsoorten (ROS).
Aanvullende metingen van belangrijke mitochondriale functies kunnen gelijktijdig worden uitgevoerd met de meting van de ademhaling door het gebruik van specifieke fluoroforen. Tetramethylrhodaminemethylester (TMRM) is een kationische fluorofoor die zich ophoopt in de mitochondriale matrix in verhouding tot de mitochondriale transmembraanspanningspotentiaal, wat resulteert in een afname van de fluorescerende intensiteit als gevolg van deze accumulatie3. TMRM kan worden gebruikt als een indicator van relatieve veranderingen in mitochondriale membraanpotentiaal, of kan worden gebruikt om nauwkeurige veranderingen in transmembraanspanning te kwantificeren met aanvullende experimenten om constanten te bepalen die conversie van het fluorescerende signaal naar mV mogelijk maken. Magnesiumgroen (MgG) is een fluorofoor die fluoresceert wanneer gebonden met Mg2+, en wordt gebruikt voor metingen van ATP-synthese op basis van de differentiële affiniteit van ADP en ATP voor magnesium tweewaardig kation4. Onderzoekers moeten de specifieke affiniteits-/dissociatieconstanten (Kd) voor zowel ADP als ATP onder specifieke analytische omstandigheden bepalen om de veranderingen in MgG-fluorescentie om te zetten in een verandering in ATP-concentratie. Amplex UltraRed (AmR) is de fluorofoor die wordt gebruikt om de productie van waterstofperoxide en andere ROS tijdens mitochondriale ademhalingte meten 5. De reactie tussen H2 O2 en AmR (die wordt gekatalyseerd door mierikswortelperoxidase) produceert resorufine, dat detecteerbaar is door fluorescentie bij 530 nM. Elk van deze testen kan afzonderlijk worden toegevoegd aan assays van real-time mitochondriale ademhaling, om gelijktijdige metingen van de respectieve aspecten van mitochondriale fysiologie te bieden, waardoor een direct verband wordt gelegd tussen ademhaling en mitochondriale output.
Paarden zijn in staat tot zeer hoge snelheden van massaspecifiek zuurstofverbruik, deels als gevolg van het zeer hoge mitochondriale gehalte van paardenskeletspieren, waardoor dit weefsel zeer relevant is voor het bestuderen van mitochondriale fysiologie. Met de ontwikkeling van hoge-resolutie respirometrie hebben studies met behulp van deze nieuwe technologie bijgedragen aan het definiëren van de bijdragen van mitochondriën van paardenskeletspieren aan zowel de opmerkelijke inspanningscapaciteit van paarden als de pathofysiologie van skeletspierziekten 6,7,8,9,10,11,12,13,14 . Studies van de mitochondriale functie van de skeletspieren van paarden zijn bijzonder voordelig, omdat het verkrijgen van grote hoeveelheden van dit weefsel niet-terminaal is. Zo kunnen paardenpatiënten niet alleen voldoende weefsel leveren voor de volledige karakterisering van de mitochondriale functie, maar ook dienen als longitudinale controles voor hoogwaardige, mechanistische studies naar mitochondriale fysiologie. Om deze reden zijn aanvullende testen ontwikkeld om mitochondriale membraanpotentiaal, ATP-synthese en de productie van ROS te kwantificeren die de meting van zuurstofverbruik in dit weefsel aanvullen, om een robuustere karakterisering van mitochondriale fysiologie in skeletspieren van paarden te bieden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Deze studie werd goedgekeurd door de Oklahoma State University Institutional Animal Care and Use Committee. Vier Volbloed ruinen (17,5 ± 1,3 jaar, 593 ± 45 kg) werden in dit onderzoek gebruikt om de representatieve resultaten te genereren.
1. Het verkrijgen van skeletspierbiopsiemonster
- Verkrijg skeletspierbiopten (volg steriele techniek) uit het midden van de semitendinosusspier (of een andere spier van belang), met behulp van een 12 G University College Hospital (UCH) biopsienaald (zie tabel met materialen) terwijl u onder lichte sedatie bent en met behulp van lokale anesthesie na een eerder gepubliceerd rapport11.
- Breng de biopsiemonsters onmiddellijk over in injectieflacons met ijskoude biopsietransportmediaoplossing (2,77 mM CaK 2-EGTA, 7,23 mM K 2-EGTA, 20 mM imidazool, 20 mM taurine, 50 mM K-MES, 0,5 mM dithiothreitol, 6,56 mM MgCl2, 5,77 mM ATP en 15 mM fosfocreatine, aangepast aan pH 7,1; zie materiaaltabel). Transport naar het laboratorium voor analyse.
OPMERKING: Raadpleeg Doerrier et al.15 voor specifieke instructies over het voorbereiden van de biopsietransportmedia. - Isoleer mitochondriën uit de biopsiemonsters met behulp van een commerciële kit, volgens de instructies van de fabrikant (zie materiaaltabel). De uiteindelijke opslagbuffer mag geen substraten zoals ADP, ATP en succinaat bevatten die deel uitmaken van de respirometrietest.
- Resuspensie van de laatste pellet van de geïsoleerde mitochondriën met behulp van 80 μL suspensiemedia (225 mM mannitol, 75 mM sucrose en 1 mM EGTA; zie tabel met materialen) per 100 mg spier die wordt gebruikt voor mitochondriale isolatie.
- Minimaliseer het interval vanaf het moment van de biopsieprocedure tot de isolatie van mitochondriën en houd de monsters op 0-4 °C gedurende de verwerkingsstappen totdat ze aan de ademhalingsmeters met hoge resolutie worden toegevoegd.
OPMERKING: Voorlopige studies hebben aangetoond dat suspensies van geïsoleerde mitochondriën na ongeveer 2 uur functionele capaciteit beginnen te verliezen wanneer ze bij 0-4 ° C worden gehouden.
2. Instellen van de hoge-resolutie respirometer
- Respirometers met hoge resolutie worden gebruikt om mitochondriale ademhaling en bijbehorende processen te kwantificeren. Gebruik het softwarebesturingsprogramma van de fabrikant (zie Materiaaltabel) om de respirometer te bedienen, de sensoren te kalibreren en onbewerkte gegevens te verzamelen. Analyseer de monsters in tweevoud voor elke testconditie.
OPMERKING: In alle gevallen zijn de aanbevolen titraties en uiteindelijke reagensconcentraties beschreven in dit protocol gebaseerd op een ademhalingskamer van 2 ml. - Bepaal de achtergrond O 2-flux en het nulpunt van de O 2-sensor elke2-4 weken door de seriële titratie van dithioniet, volgens de instructies van de fabrikant. Bewaar deze kalibratieconstanten voor volgende tests totdat de kalibratie wordt herhaald.
OPMERKING: In tegenstelling tot eerder gepubliceerde procedures met behulp van gepermeabiliseerde spiervezels11,12,13,16, waarbij hyperoxie (250-500 μM) noodzakelijk is om diffusiebeperking van O 2 naar de mitochondriën te voorkomen, kunnen geïsoleerde mitochondriën worden geëvalueerd met behulp van een bereik van 50-200 μM O2. Dit kan eenvoudig worden bereikt door de ademhalingsmedia in evenwicht te laten komen met de ruimtelucht voordat de mitochondriale suspensie wordt toegevoegd (d.w.z. na dagelijkse eenpuntskalibratie). Op dezelfde manier kan reoxygenatie van de ademhalingskamer worden bereikt door eenvoudig de kamer te openen totdat voldoende omgevingszuurstof is opgelost in de ademhalingsmedia om de zuurstofconcentratie tot het gewenste niveau te verhogen. - Vul de respirometerkamers met magnesiumvrije media (0,5 mM EGTA, 60 mM K-lactobionaat, 20 mM taurine, 10 mM KH2PO4, 20 mM HEPES, 110 mM sucrose en 1 g/L runderserumalbumine [BSA] in wezen vetzuurvrij, aangepast aan pH 7,1; zie materiaaltabel).
OPMERKING: Raadpleeg Komlodi et al.17 voor specifieke instructies over het bereiden van de ademhalingsmedia.- Stel de incubatietemperatuur van het instrument in op 38 °C om de basale temperatuur van de skeletspieren van paarden weer te geven en stel het mengen van de ademhalingsmedia in op 800 tpm met behulp van een magnetische roerder die in de bodem van de ademhalingskamer draait.
- Schakel de kamerverlichting uit om interferentie met fluorescentiesensoren te voorkomen.
- Activeer de zuurstofelektrode met een polarisatiespanning van 800 mV en versterk het resulterende signaal met een versterkingsinstelling van 1.
- Noteer de zuurstofconcentratie om de 2 s, bereken de zuurstofflux als de negatieve helling van de zuurstofmeting over de voorgaande 40 s (20 gegevenspunten) en rapporteer als pmol x s-1 x ml incubatieoplossing.
- Kalibreer de zuurstofsensor door de media in evenwicht te laten komen met de lucht in de ruimte. Bereken de partiële referentiezuurstofdruk op basis van de barometerdruk gemeten met de hoge-resolutie respirometer en de standaard atmosferische zuurstofconcentratie.
3. Meting van mitochondriaal membraanpotentiaal met behulp van TMRM
- Gebruik "groene" fluorescerende sensoren (530 nm dominante golflengte) om het fluorescerende signaal van de ademhalingskamer te kwantificeren. Energize de sensoren op 400-500 mV; Het resulterende signaal wordt versterkt met een versterking van 1:1.000.
OPMERKING: Specifieke instellingen moeten worden geoptimaliseerd voor afzonderlijke instrumenten om het verwachte signaal binnen het lineaire bereik van de sensor op te vangen. - Voeg TMRM (4 μL 1 mM oplossing voor een eindconcentratie van 2 μM; zie materiaaltabel) toe voordat mitochondriën worden toegevoegd.
- Kalibreer het fluorescerende signaal met behulp van een eenvoudige tweepuntskalibratie van het fluorescerende signaal (spanning) versus de hoeveelheid toegevoegde fluorofoor (mM), voorafgaand aan de toevoeging van de mitochondriën.
OPMERKING: Gebruik de kalibratiefunctie voor fluorescerende signalen in de machinebesturingssoftware om dit signaal te kalibreren. Het ruwe signaal van de fluorescerende sonde kan 30 minuten of meer nodig hebben om te stabiliseren om het tweede punt van de kalibratie vast te leggen. - Voer de definitieve kalibratie van het TMRM-signaal uit na voltooiing van het respirometrietitratieprotocol door verschillende titraties van ontkoppelingsmiddel (carbonylcyanide m-chloorfenylhydrazone; 2 μL per titratie) te leveren totdat er geen verdere toename van het TMRM-fluorescerende signaal wordt waargenomen, wat wijst op de volledige ineenstorting van de mitochondriale membraanpotentiaal (figuur 1).
OPMERKING: Deze fluorescerende signaalwaarde wordt beschouwd als gelijk aan 0 mV transmembraanpotentiaal en wordt gebruikt als referentiepunt voor relatieve membraanpotentiaalwaarden die zijn geregistreerd tijdens het respirometrietitratieprotocol.
4. Meting van ATP-productie met magnesiumgroen (MgG)
- Gebruik "Blauwe" fluorescerende sensoren (465 nm dominante golflengte) om het fluorescerende signaal van de ademhalingskamer te kwantificeren. Activeer deze sensoren voor individuele instrumenten om het verwachte signaal binnen het lineaire bereik van de sensor op te vangen.
- Voer de chemische opstelling en kalibratie van het MgG fluorescerende signaal uit na de toevoeging van de mitochondriën, maar vóór de toevoeging van eventuele substraten. Voeg 8 μL van 2 mM ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA) toe aan de respirometriekamer om kationen (met name Ca 2+) te cheleren die zouden concurreren met Mg2+ voor binding aan MgG, en voeg vervolgens 4 μL van 1 mM MgG (1,1 μM) toe aan de ademhalingskamer.
- Kalibreer het ruwe fluorescentiesignaal met 10 x 2 μL sequentiële titraties van 100 mM MgCl 2, waarbij 1 minuut tussen de titraties zit voor stabilisatie van het fluorescerende signaal (figuur 2).
OPMERKING: Dit proces, dat offline wordt voltooid na voltooiing van de test en met behulp van sjablonen die door de fabrikant van de machine en de bijbehorende software worden verstrekt, produceert een tweede-ordecurve van magnesiumconcentratie tot fluorescerend signaal (verwachte r2 > 0,98), die zal worden gebruikt met een bekende hoeveelheid ADP toegevoegd aan de respirometriekamer en de eerder bepaalde Kd-waarden om de overeenkomstige concentratie van ATP11 te bepalen. - Bepaal de snelheid van ATP-synthese, wat de helling is van de concentratie van ATP in de loop van de tijd gedurende het protocol (figuur 3).
5. Meting van mitochondriale productie van ROS met behulp van Amplex UltraRed (AmR)
- Gebruik "groene" fluorescerende sensoren (530 nm dominante golflengte) om het fluorescerende signaal van de ademhalingskamer te kwantificeren. Energize de sensoren op 300-400 mV; Het resulterende signaal wordt versterkt met een versterking van 1:1.000. Optimaliseer specifieke instellingen voor individuele instrumenten om het verwachte signaal binnen het lineaire bereik van de sensor op te vangen.
OPMERKING: Als u ademhalingsmedia zonder MgCl 2 gebruikt, moet dit worden toegevoegd (20-60 μL van 100 mM MgCl 2 om 1-3 μM MgCl2 te produceren) voordat reagentia voor de AmR-test worden toegevoegd. - Voer de chemische opstelling en initiële kalibratie van de AmR-test uit voorafgaand aan de toevoeging van de mitochondriën. Voeg 30 μmol DTPA (6 μL 5 mM-oplossing) toe aan chelaatkationen die de reactie kunnen verstoren en voeg vervolgens superoxide dismutase toe (2 μL van een 5.000 U/ml stamoplossing om superoxide-anionen om te zetten in H 2 O2voor een uitgebreidere detectie van reactieve zuurstofgeneratie), mierikswortelperoxidase (5 μL van een 500 U/ml stamoplossing), en Amplex UltraRed (2 μL van een stockoplossing van 10 mM) (zie materiaaltabel) om respectievelijk 5 U/ml, 1 U/ml en 10 μM in de respirometriekamer te produceren.
- Laat het fluorescerende signaal stabiliseren en voeg vervolgens tweemaal 0,2 μmol waterstofperoxide (5 μL van een 40 μM-oplossing die dagelijks vers wordt gemaakt) toe, met een tussenpoos van ongeveer 5 minuten.
OPMERKING: Het fluorescerende signaal voor en na de twee titraties van H 2 O 2 biedt een driepunts lineaire kalibratiecurve van het systeem (verwachte r 2 > 0,95), waarvan de helling de algehele responsiviteit van het systeem weerspiegelt bij het rapporteren van de relatie tussen het fluorescerende signaal en de productie (of toevoeging) van H 2 O 2. Gebruik de kalibratiefunctie voor fluorescerende signalen in de machinebesturingssoftware om dit signaal te kalibreren. - Voer aanvullende tweepuntskalibraties (5 μl van een 40 μM-oplossing die dagelijks vers wordt gemaakt) uit gedurende de test, om de responsiviteit van de test aan te passen naarmate de chemie van de respirometrie gedurende de test verandert, met de specifieke timing van deze kalibratiepunten naar goeddunken van de onderzoeker (figuur 4).
6. Meting van mitochondriale ademhaling
- Voeg 15 μL geïsoleerde mitochondriale suspensie (stap 1.4) toe aan elke incubatiekamer van 2 ml, zodat de resultaten de mitochondriale opbrengst van 18,75 mg spieren vertegenwoordigen. Sluit de incubatiekamer af. Vortex het monster tussen elke titratie om een uniforme suspensie van het monster te behouden.
- Meet het resterende zuurstofverbruik (ROX) voorafgaand aan de toevoeging van eventuele substraten. Trek deze waarde (meestal minder dan 0,2 pmol O2 x s-1 x ml-1) af van de zuurstofverbruikswaarden van elke stap in het substraat/ontkoppelaar/remmer titratie (SUIT) protocol11 na voltooiing van het protocol.
OPMERKING: Het is van cruciaal belang dat de signalen van zowel de zuurstofsensor als de fluorescentiesensor gedurende ten minste 1 minuut kunnen stabiliseren (zoals beoordeeld door de stabiele berekende helling van de primaire sensorsignalen), omdat de algehele toestand van ademhaling wordt veranderd door de titraties om betrouwbare resultaten te verkrijgen. Dit geldt voor alle titratiestappen. - Gebruik een SUIT voor algemeen gebruik die de initiële karakterisering van de mitochondriale functie van de skeletspieren van paarden mogelijk maakt. Begin met sequentiële titraties van pyruvaat (5 μL van 2 M waterige oplossing), glutamaat (10 μL van 2 M waterige oplossing) en malaat (10 μL van 0,4 M waterige oplossing) in elke kamer om Nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) te produceren en stimuleer niet-fosforylerende (lek) ademhaling ondersteund door NADH geoxideerd door Complex I (LN) (Figuur 1, Figuur 3 en figuur 4).
- Voeg ADP (20 μL waterige oplossing van 500 mM; zie tabel met materialen) toe om de fosforylerende ademhaling via complex I (PN) te stimuleren.
- Voeg succinaat (20 μL waterige oplossing van 1 M toe; zie materiaaltabel) om fosforylerende ademhaling te produceren door de combinatie van complex I en complex II (PN+S).
OPMERKING: Met de combinatie van ademhaling door zowel Complex I als Complex II, kan het zuurstofverbruik hoog genoeg zijn om het grootste deel van de zuurstof opgelost in de incubatiemedia te verbruiken. Als de O 2-concentratie onder 50 μM daalt, reoxygeneert u de incubatiemedia door de incubatiekamer los te maken totdat de gemeten O 2-concentratie boven 150 μM is gestegen. Herhaal deze stap indien nodig om voldoende O2 voor mitochondriale ademhaling te behouden. - Voeg rotenon (2 μL ethanoloplossing van 0,1 mM; zie materiaaltabel) toe om complex I te blokkeren. De resulterende zuurstofflux vertegenwoordigt de capaciteit van Complex II om mitochondriaal zuurstofverbruik te ondersteunen via de oxidatie van succinaat alleen (PS).
LET OP: Rotenon is een giftige stof. Gebruik standaard laboratoriumveiligheid en vermijd inname of inademing. - Bereken de gemiddelde waarde voor een bepaalde experimentele toestand over individuele respirometriekamers die aliquots van een enkele biopsie bevatten.
OPMERKING: Afgeleide berekeningen, zoals fluxcontroleverhoudingen (FCR's), zijn waardevol bij het identificeren van relatieve veranderingen in verschillende routes en omvattenFCR-lek (L N / P N), FCR N (P N / P N + S) en FCR S (P S / P N + S). De berekende oxidatieve fosforyleringsefficiëntie (1-LN/PN+S) geeft een schatting van de totale impact van lekademhaling gecorrigeerd voor de totale ademhalingscapaciteit.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De voorgestelde referentietoestand is die van een gezonde sedentaire volbloed (geen verhoogde fitheid als gevolg van verplichte lichaamsbeweging) en een vers spiermonster verzameld uit het midden van een houdingsspier, met een hoog percentage mitochondriënrijke type I skeletspiervezels en geïncubeerd onder omstandigheden die het rustmetabolisme benaderen (d.w.z. 38 ° C en pH 7,0). Onder deze omstandigheden kan de onderzoeker L N-waarden verwachten van 2,71 ± 0,90, P N-waarden van 62,40 ± 26,22, PN + S-waarden van 93,67 ± 34,76 en P S-waarden van 46,93 ± 14,58 pmol O2 x s-1 x ml-1 (figuur 3 en figuur 4). De ademhalingswaarden van mitochondriën geïncubeerd met TMRM zijn lager vanwege een remmend effect van die fluorofoor (figuur 1). FCRLeak, FCRN en FCRS zijn respectievelijk 0,05 ± 0,01, 0,66 ± 0,07 en 0,51 ± 0,07. De berekende oxidatieve fosforyleringsefficiëntie is 0,97 ± 0,01. De absolute waarden voor deze respiratoire toestanden variëren als gevolg van de oxidatieve capaciteit van het individuele subject en weefsel, maar het relatieve patroon van deze waarden is consistent met gepubliceerde resultaten van gepermeabiliseerde skeletspiervezels van paarden (d.w.z. toename van de ademhaling met de toevoeging van specifieke substraten, waarbij de combinatie van ademhaling door Complex I en Complex II minder is dan elk van deze elektronenbronnen afzonderlijk als gevolg van verzadiging van het elektronenoverdrachtssysteem [ETS] stroomafwaartse capaciteit). De berekende efficiëntie van geïsoleerde mitochondriën van de skeletspieren van paarden komt overeen met de overeenkomstige waarden die zijn gerapporteerd voor gepermeabiliseerde skeletspiervezelsvan paarden 11.
De snelheid van ATP-synthese zal naar verwachting 438,59 ± 397,10 pM x s-1 zijn voor P N-ademhaling, 383,18 ± 397,19 voor PN + S-ademhaling en 172,07 ± 125,60 voor PS-ademhaling, per mg bronweefsel dat wordt gebruikt om mitochondriën te isoleren. De afname van de ATP-synthese met de toevoeging van succinaat is waarschijnlijk te wijten aan concurrentie op de chinonovergang van de ETS door de twee elektronenvoedingen, waarbij de voeding van Complex II (die niet direct bijdraagt aan mitochondriale membraanpotentiaal) de stroom van elektronen door Complex I vermindert (wat direct bijdraagt aan de mitochondriale membraanpotentiaal door het pompen van protonen over het binnenste mitochondriale membraan).
De productiesnelheid vanH 2 O2 zal naar verwachting 0,079 ± 0,095 nmol.s-1 zijn voor L N-ademhaling, 0,021 ± 0,043 voor P N-ademhaling, 0,026 ± 0,056 voor PN + S-ademhaling en 0,237 ± 0,248 voor P S-ademhaling, per mg bronweefsel dat wordt gebruikt om mitochondriën te isoleren (figuur 4). De relatieve snelheid van ROS-productie is consistent met de voorspelde omvang van het mitochondriale membraanpotentiaal en de associatie tussen hoog membraanpotentiaal en ROS-productie. De uitzondering op deze relatie is de zeer hoge ROS-productie wanneer ademhaling alleen door Complex II plaatsvindt, als gevolg van de achterwaartse stroom van elektronen van de chinonovergang naar Complex I wanneer deze wordt geblokkeerd door rotenon.
Figuur 1: Representatief respirometriespoor met hoge resolutie van mitochondriale ademhaling van de skeletspieren van paarden en relatieve membraanpotentiaal. Het bovenste venster is de zuurstofconcentratie van de kamer (linker Y-as) en zuurstofflux (rechter Y-as) in de loop van de tijd (X-as); het onderste venster is kamer TMRM-fluorescentie (linker Y-as) en snelheid van fluorescentiesignaalverandering (rechter Y-as) in de loop van de tijd (X-as). Verticale markeringen geven de toevoeging van specifieke substraten aan de kamer aan (mt: mitochondriale suspensie; P: pyruvaat; G: glutamaat; M: malaat; D: ADP; S: succinaat; R: rotenon; CCCP: Carbonylcyanide m-chloorfenylhydrazon). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Representatief respirometriespoor met hoge resolutie van kalibratie van kamerfluorescentiesignaal voor magnesiumgroen en bepaling van Kd voor magnesium en adenylaten. Kamer MgG fluorescentie (linker Y-as) en snelheid van fluorescentie signaal verandering (rechter Y-as) in de loop van de tijd (X-as). De initiële verticale markeringen geven de toevoeging van specifieke substraten aan de kamer aan (MgG: Magnesiumgroen; mt: mitochondriale suspensie; P: pyruvaat; G: glutamaat; M: malaat; S: succinaat; EDTA: ethyleendiaminetetra-azijnzuur). Dit wordt gevolgd door seriële titratie van MgCl2 met behulp van een geautomatiseerde titratiepomp (TIP) die het fluorescerende signaal verhoogt, vervolgens seriële titratie van een adenylaat (in dit geval ATP) die het fluorescerende signaal verlaagt. De titratie van MgCl2 wordt ook gebruikt aan het begin van elke test om het MgG-signaal te kalibreren, maar wordt uitgevoerd voorafgaand aan de toevoeging van mitochondriën en respirometriesubstraten zoals P, G, M en S. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Representatief respirometriespoor met hoge resolutie van mitochondriale ademhaling van de skeletspieren van paarden en ATP-synthese. Het bovenste venster is de zuurstofconcentratie van de kamer (linker Y-as) en zuurstofflux (rechter Y-as) in de loop van de tijd (X-as); het onderste venster is kamer MgG fluorescentie (linker Y-as) en snelheid van fluorescentiesignaalverandering (rechter Y-as) in de loop van de tijd (X-as). Verticale markeringen geven de toevoeging van specifieke substraten aan de kamer aan (mt: mitochondriale suspensie; P: pyruvaat; G: glutamaat; M: malaat; D: ADP; S: succinaat; R: rotenon). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Representatief respirometriespoor met hoge resolutie van mitochondriale ademhaling van de skeletspieren van paarden en productie van H 2 O2. Het bovenste venster is de zuurstofconcentratie van de kamer (linker Y-as) en zuurstofflux (rechter Y-as) in de loop van de tijd (X-as); het onderste venster is kamerresorufinfluorescentie (linker Y-as) en snelheid van fluorescentiesignaalverandering (rechter Y-as) in de loop van de tijd (X-as). Verticale markeringen geven de toevoeging van specifieke substraten aan de kamer aan (mt: mitochondriale suspensie; P: pyruvaat; G: glutamaat; M: malaat; D: ADP; S: succinaat; R: rotenon). Ook inbegrepen zijn drie intra-assay tweepuntskalibraties van het fluorescerende signaal met behulp van H 2 O2. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De toevoeging van fluorescerende signalen aan de standaarduitgang van de hoge-resolutie respirometer biedt waardevolle informatie over mitochondriale fysiologie, maar zorgvuldige kalibratie van het fluorescerende signaal is van cruciaal belang voor kwaliteitsgegevens. De oorspronkelijke protocollen voor het gebruik van MgG suggereren dat de kalibratiecurven die worden gegenereerd tijdens het berekenen van magnesium-adenylaatdissociatieconstanten kunnen worden toegepast op volgende assays4; het is echter mogelijk dat het fluorescerende signaal van het MgG niet voldoende reproduceerbaar is van test tot test voor deze benadering. Daarom wordt elke test gekalibreerd met een geautomatiseerde MgCl 2-titratie en de resulterende kalibratiecurve voor het berekenen van ATP-synthese voor die individuele test. Bovendien moeten de Kd (dissociatieconstanten) voor magnesium en zowel ADP als ATP worden berekend voor de specifieke omstandigheden van de test, inclusief het specifieke weefsel, de incubatieomstandigheden en substraten die fosforylerende ademhaling produceren, om ervoor te zorgen dat de afleiding van de ATP-synthesesnelheid nauwkeurig is. De variabiliteit in de AmR-test wordt breder erkend15,17, en het is gebruikelijk om tijdens het protocol naar goeddunken van de onderzoeker verschillende discrete herkalibratiepunten in het protocol in te voegen. Historische gegevens met behulp van skeletspieren van paarden geven aan dat de typische responsiviteit van de test ongeveer 0,646 V / mM van H 2 O2is op het eerste kalibratiepunt (voorafgaand aan de toevoeging van het monster) en 8% -15% kan afnemen over de periode van de test. Daarom is frequente herkalibratie van de AmR-test noodzakelijk voor de detectie van relatief kleine veranderingen in de productie van ROS, en de timing van de puntkalibraties binnen het protocol moet voor elk titratieprotocol worden bepaald.
Onderzoekers moeten tijdens de testuitvoering een zorgvuldig oordeel vellen bij het bepalen wanneer ze naar de volgende titratiestap moeten gaan. Idealiter zouden de relevante signalen die in real-time worden gegenereerd (O2-flux , fluorescentie van TMRM en de snelheid van verandering in MgG en resorufin fluorescerend signaal) stabiel moeten zijn, wat wijst op een steady state in de kamer, maar het is een oordeel van de onderzoeker over wat aanvaardbare stabiliteit is. Op dit moment is er geen algemeen aanvaarde standaard voor deze beslissing; onderzoekers moeten zich echter acuut bewust zijn van de risico's van zowel het niet lang genoeg wachten tot een steady state is vastgesteld (resulterend in gegevens die de beoogde ademhalingstoestand onvolmaakt karakteriseren) als zo lang wachten dat substraten uitgeput raken en de test niet langer betrouwbaar is. In de ervaring van de auteur is het niet bereiken van een stabiel signaal binnen 30 minuten van een substraattitratie het bewijs van een monster (of machine) dat zich op een niet-biologische manier gedraagt en moet de test worden weggegooid.
De resultaten die deze benadering gebruiken om de mitochondriale fysiologie te kwantificeren, tonen een aanzienlijke intersubjectvariabiliteit, met een typische variatiecoëfficiënt (CV) van 30% -40%. Daarentegen resulteert analyse van gepermeabiliseerde skeletspiervezels van paarden in een CV van 19% -20%11, wat suggereert dat het proces van het isoleren van mitochondriën aanzienlijke variabiliteit oplegt aan de daaropvolgende analyse naast de gemarkeerde intersubjectvariabiliteit. Hoewel het effect van de laatste kan worden verzacht door onderwerpen waar mogelijk als hun eigen controles te gebruiken, kan de eerste alleen worden geminimaliseerd door zorgvuldige aandacht voor de isolatietechniek. Als het experimentele ontwerp geen experimentele replicaties van een enkele biopsie toestaat, kan de onderzoeker ervoor kiezen om de respirometriegegevens uit te drukken ten opzichte van een correctiefactor die verschillen in mitochondriale inhoud in verschillende monsters weerspiegelt. De meest voorkomende correctiefactoren zijn het eiwitgehalte van het monster en de citraatsynthase-activiteit van het monster. Zoals uiteengezet in een recente consensusverklaring van wetenschappers die actief zijn op dit gebied, is er echter geen enkele methode voor het uitvoeren van deze aanpassing waarover iedereen het eens is18. Corrigeren voor eiwitgehalte en/of citraatsynthase-activiteit zijn de twee meest voorkomende benaderingen die worden gebruikt voor skeletspierweefsel van paarden12,13, maar beide hebben hun tekortkomingen. Het kan nodig zijn voor verschillende experimentele ontwerpen om gegevens uit te drukken via zowel interne (d.w.z. fluxcontroleverhoudingen) als externe (eiwit, enzymactiviteit, andere mitochondriale markers) om de mitochondriale functie te interpreteren.
Het beschreven protocol bouwt voort op het gebruik van gepermeabiliseerde spiervezels, met verschillende belangrijke verschillen. Permeabilized fiber assays vereisen kleinere biopsieën, omdat hoge-resolutie respirometrie van equine skeletspier permeabilized vezels meestal wordt uitgevoerd met slechts ~ 2 mg monstermassa in elke kamer 6,7,8,9,10,11. Daarentegen heeft het hier beschreven protocol het equivalent van bijna 10x zoveel vezelmassa in elke kamer. Dit verschil benadrukt de inefficiëntie van mitochondriale isolatie van vers weefsel. Een mogelijke reden voor deze inefficiëntie is de moeilijkheid om de mitochondriën van de skeletspieren te herstellen die zich in het contractiele eiwitnetwerk bevinden. De commerciële kit voor mitochondriale isolatie die in dit protocol wordt gebruikt, omvat behandeling met een protease en het gebruik van ionische media om de contractiele vezels af te breken, maar het is waarschijnlijk dat een aanzienlijk deel van de intermyofibrillaire mitochondriën niet wordt hersteld. Dit kenmerk van het protocol is niet alleen relevant voor het bepalen van de benodigde hoeveelheid biopsiemateriaal, maar ook met betrekking tot de interpretatie van de resultaten. Geïsoleerde mitochondriën zijn minder gevoelig voor zuurstofafhankelijkheid, vanwege diffusiebeperking in vergelijking met gepermeabiliseerde vezels15; Hyperoxie is dus niet nodig met geïsoleerde mitochondriën en de ademhalingsmedia kunnen voldoende zuurstofrijk worden (en opnieuw van zuurstof worden voorzien tijdens de test) door simpelweg de kamer te openen voor kamerlucht. Dit aspect van zuurstofafgifte is vooral nuttig bij het meten van de productie van H 2 O2en andere ROS, omdat de ROS-productie op een niet-fysiologische manier wordt verhoogd tijdens hyperoxische incubatie19. Ten slotte biedt het gebruik van geïsoleerde mitochondriën een stabieler en reproduceerbaar fluorescerend signaal, vanwege de verminderde niet-specifieke eiwitbinding van fluoroforen in vergelijking met het gebruik van fluoroforen met gepermeabiliseerde spiervezels. Elk monsterpreparaat heeft voor- en nadelen, en vaardigheid met zowel gepermeabiliseerde vezels als geïsoleerde mitochondriën biedt de onderzoeker een robuuste reeks testen voor het aanpakken van een verscheidenheid aan vragen met betrekking tot mitochondriale fysiologie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen belangenconflicten met betrekking tot dit manuscript.
Acknowledgments
De auteurs willen graag de genereuze steun van de John and Debbie Oxley Endowed Chair for Equine Sports Medicine en de Grayson Jockey Club Research Foundation erkennen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ADP | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | A5285 | |
| Amplex UltraRed | Life Technologies | A36006 | |
| ATP | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | A2383 | |
| BSA | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | A6003 | |
| Calcium carbonate | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | C4830 | |
| CCCP | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | C2759 | |
| DatLab 7.0 | Oroboros Inc | Software to operate O2K fluororespirometer | |
| Dithiothreitol | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | D0632 | |
| DTPA | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | D1133 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | E4378 | |
| Glutamate | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | G1626 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | H7523 | |
| Horseradish peroxidase | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | P8250 | |
| Hydrogen peroxide | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | 516813 | Must be made fresh daily prior to assay |
| Imidazole | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | I2399 | |
| K-MES | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | M8250 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | M9272 | |
| Magnesium Green | Thermo Fisher Scientific | M3733 | |
| Malate | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | M1000 | |
| Mannitol | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | M9647 | |
| Mitochondrial isolation kit | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | MITOISO1 | |
| O2K fluororespirometer | Oroboros Inc | Multiple units required to run full spectrum of assays concurrently. | |
| Phosphocreatine | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | P7936 | |
| Potassium hydroxide | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | P1767 | |
| Potassium lactobionate | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | L2398 | |
| Potassium phosphate | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | P0662 | |
| Pyruvate | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | P2256 | Must be made fresh daily prior to assay |
| Rotenone | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | R8875 | |
| Succinate | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | S2378 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | 84097 | |
| Superoxide dismutase | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | S8160 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | T0625 | |
| Titration pump | Oroboros Inc | ||
| Titration syringes | Oroboros Inc | ||
| TMRM | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | T5428 | |
| UCH biopsy needle | Millenium Surgical Corp | 72-238067 | Available in a range of sizes |
References
- Wilson, D. F. Energy metabolism in muscle approaching maximal rates of oxygen utilization. Medicine and Science in Sports and Exercise. 27 (1), 54-59 (1995).
- Gnaiger, E. Mitochondrial Pathways and Respiratory Control. An Introduction to OXPHOS Analysis. 4th edn. , Oroboros MiPNet Publications. Innsbruck. (2014).
- Ehrenberg, B., Montana, V., Wei, M. D., Wuskell, J. P., Loew, L. M. Membrane potential can be determined in individual cells from the nernstian distribution of cationic dyes. Biophysical Journal. 53 (5), 785-794 (1988).
- Chinopoulos, C., Kiss, G., Kawamata, H., Starkov, A. A. Measurement of ADP-ATP exchange in relation to mitochondrial transmembrane potential and oxygen consumption. Methods in Enzymology. 542, 333-348 (2014).
- Krumschnabel, G., et al. Simultaneous high-resolution measurement of mitochondrial respiration and hydrogen peroxide production. Methods in Molecular Biology. 1264, 245-261 (2015).
- Lemieux, H., et al. Mitochondrial function is altered in horse atypical myopathy. Mitochondrion. 30, 35-41 (2016).
- Houben, R., Leleu, C., Fraipont, A., Serteyn, D., Votion, D. M. Determination of muscle mitochondrial respiratory capacity in Standardbred racehorses as an aid to predicting exertional rhabdomyolysis. Mitochondrion. 24, 99-104 (2015).
- Votion, D. M., Gnaiger, E., Lemieux, H., Mouithys-Mickalad, A., Serteyn, D. Physical fitness and mitochondrial respiratory capacity in horse skeletal muscle. PLoS One. 7 (4), 34890 (2012).
- Votion, D. M., et al. Alterations in mitochondrial respiratory function in response to endurance training and endurance racing. Equine Veterinary Journal Supplement. (38), 268-274 (2010).
- Tosi, I., et al. Altered mitochondrial oxidative phosphorylation capacity in horses suffering from polysaccharide storage myopathy. Journal of Bioenergetics and Biomembranes. 50 (5), 379-390 (2018).
- Davis, M. S., Fulton, M. R., Popken, A. A. Effect of hyperthermia and acidosis on equine skeletal muscle mitochondrial oxygen consumption. Comparative Exercise Physiology. 17 (2), 171-179 (2021).
- Latham, C. M., Fenger, C. K., White, S. H. RAPID COMMUNICATION: Differential skeletal muscle mitochondrial characteristics of weanling racing-bred horses1. Journal of Animal Science. , (2019).
- White, S. H., Warren, L. K., Li, C., Wohlgemuth, S. E. Submaximal exercise training improves mitochondrial efficiency in the gluteus medius but not in the triceps brachii of young equine athletes. Scientific Reports. 7 (1), 14389 (2017).
- White, S. H., Wohlgemuth, S., Li, C., Warren, L. K. Rapid communication: Dietary selenium improves skeletal muscle mitochondrial biogenesis in young equine athletes. Journal of Animal Science. 95 (9), 4078-4084 (2017).
- Doerrier, C., et al. High-resolution FluoRespirometry and OXPHOS protocols for human cells, permeabilized fibers from small biopsies of muscle, and isolated mitochondria. Methods in Molecular Biology. 1782, 31-70 (2018).
- Li, C., White, S. H., Warren, L. K., Wohlgemuth, S. E. Effects of aging on mitochondrial function in skeletal muscle of American American Quarter Horses. Journal of Applied Physiology. 121 (1), 299-311 (2016).
- Komlodi, T., et al. Comparison of mitochondrial incubation media for measurement of respiration and hydrogen peroxide production. Methods in Molecular Biology. 1782, 137-155 (2018).
- Gnaiger, E.
- Li Puma, L. C., et al. Experimental oxygen concentration influences rates of mitochondrial hydrogen peroxide release from cardiac and skeletal muscle preparations. American Journal of Physiology: Regulatory, Integrated, and Comparative Physiology. 318 (5), 972-980 (2020).
