Summary
I cavalli hanno un'eccezionale capacità di esercizio aerobico, rendendo il muscolo scheletrico equino un tessuto importante sia per lo studio della fisiologia dell'esercizio equino che per la fisiologia mitocondriale dei mammiferi. Questo articolo descrive le tecniche per la valutazione completa della funzione mitocondriale nel muscolo scheletrico equino.
Abstract
La funzione mitocondriale - fosforilazione ossidativa e generazione di specie reattive dell'ossigeno - è fondamentale sia per la salute che per la malattia. Pertanto, misurare la funzione mitocondriale è fondamentale nella ricerca biomedica. Il muscolo scheletrico è una robusta fonte di mitocondri, in particolare negli animali con una capacità aerobica molto elevata, come i cavalli, rendendoli soggetti ideali per lo studio della fisiologia mitocondriale. Questo articolo dimostra l'uso della respirometria ad alta risoluzione con fluorometria concomitante, con mitocondri muscolari scheletrici appena raccolti, per quantificare la capacità di ossidare i substrati in diversi stati mitocondriali e determinare le capacità relative di elementi distinti della respirazione mitocondriale. L'estere metilestrale tetrametilrodamina viene utilizzato per dimostrare la produzione di potenziale di membrana mitocondriale derivante dall'ossidazione del substrato, compreso il calcolo dell'efficienza relativa dei mitocondri calcolando il potenziale di membrana relativo generato per unità di flusso concomitante di ossigeno. La conversione di ADP in ATP provoca un cambiamento nella concentrazione di magnesio nella camera di reazione, a causa delle diverse affinità degli adenilati per il magnesio. Pertanto, il verde magnesio può essere utilizzato per misurare la velocità di sintesi dell'ATP, consentendo l'ulteriore calcolo dell'efficienza di fosforilazione ossidativa (rapporto tra fosforilazione e ossidazione [P/O]). Infine, l'uso di Amplex UltraRed, che produce un prodotto fluorescente (resorufin) quando combinato con perossido di idrogeno, consente la quantificazione della produzione di specie reattive dell'ossigeno durante la respirazione mitocondriale, nonché la relazione tra produzione di ROS e respirazione concomitante. Queste tecniche consentono la robusta quantificazione della fisiologia mitocondriale in una varietà di diverse condizioni simulate, facendo così luce sul contributo di questa componente cellulare critica sia alla salute che alla malattia.
Introduction
I mitocondri delle cellule eucariotiche producono la maggior parte dell'ATP utilizzato dalle cellule per il lavoro e il mantenimento1. Un passo chiave nella produzione mitocondriale di ATP è la conversione dell'ossigeno in acqua, e quindi la capacità metabolica dei mitocondri e delle cellule associate è spesso quantificata attraverso la misurazione del consumo di ossigeno2. Tuttavia, la fisiologia mitocondriale è più complessa del semplice processo di consumo di ossigeno e la dipendenza da questo endpoint fornisce esclusivamente una valutazione incompleta dell'impatto della funzione e della disfunzione mitocondriale sulla salute cellulare. La caratterizzazione completa della funzione mitocondriale richiede la valutazione non solo del consumo di ossigeno, ma anche della produzione di ATP e delle specie reattive dell'ossigeno (ROS).
Ulteriori misure delle funzioni mitocondriali chiave possono essere eseguite in concomitanza con la misurazione della respirazione attraverso l'uso di fluorofori specifici. Il tetrametilrodamina metilestere (TMRM) è un fluoroforo cationico che si accumula nella matrice mitocondriale in proporzione al potenziale di tensione transmembrana mitocondriale, con conseguente diminuzione dell'intensità fluorescente dovuta a questo accumulo3. La TMRM può essere utilizzata come indicatore dei cambiamenti relativi nel potenziale di membrana mitocondriale o può essere utilizzata per quantificare cambiamenti precisi nella tensione transmembrana con ulteriori esperimenti per determinare costanti che consentano la conversione del segnale fluorescente in mV. Il verde di magnesio (MgG) è un fluoroforo che fluoresce quando si lega con Mg2+ e viene utilizzato per misurazioni della sintesi di ATP basate sull'affinità differenziale di ADP e ATP per il catione bivalente di magnesio4. I ricercatori devono determinare le costanti di affinità/dissociazione specifiche (Kd) sia per ADP che per ATP in specifiche condizioni analitiche per convertire le variazioni della fluorescenza di MgG in una variazione della concentrazione di ATP. Amplex UltraRed (AmR) è il fluoroforo utilizzato per misurare la produzione di perossido di idrogeno e altri ROS durante la respirazione mitocondriale5. La reazione tra H2 O2 e AmR (che è catalizzata dalla perossidasi di rafano) produce resorufina, che è rilevabile attraverso la fluorescenza a 530 nM. Ciascuno di questi test può essere aggiunto individualmente ai saggi di respirazione mitocondriale in tempo reale, per fornire misurazioni simultanee dei rispettivi aspetti della fisiologia mitocondriale, fornendo così un collegamento diretto tra respirazione e output mitocondriale.
I cavalli sono capaci di tassi molto elevati di consumo di ossigeno specifico per massa, dovuto in parte all'altissimo contenuto mitocondriale del muscolo scheletrico equino, rendendo questo tessuto altamente rilevante per lo studio della fisiologia mitocondriale. Con lo sviluppo della respirometria ad alta risoluzione, gli studi che utilizzano questa nuova tecnologia hanno contribuito a definire i contributi dei mitocondri del muscolo scheletrico equino sia alla notevole capacità di esercizio dei cavalli che alla fisiopatologia delle malattie del muscolo scheletrico 6,7,8,9,10,11,12,13,14 . Gli studi sulla funzione mitocondriale del muscolo scheletrico equino sono particolarmente vantaggiosi, in quanto l'ottenimento di grandi quantità di questo tessuto non è terminale. Pertanto, i soggetti equini possono non solo fornire tessuto sufficiente per la caratterizzazione completa della funzione mitocondriale, ma anche servire come controlli longitudinali per studi meccanicistici di alta qualità sulla fisiologia mitocondriale. Per questo motivo, sono stati sviluppati ulteriori saggi per quantificare il potenziale di membrana mitocondriale, la sintesi di ATP e la produzione di ROS che completano la misurazione del consumo di ossigeno in questo tessuto, al fine di fornire una caratterizzazione più robusta della fisiologia mitocondriale nel muscolo scheletrico equino.
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Protocol
Questo studio è stato approvato dall'Oklahoma State University Institutional Animal Care and Use Committee. Quattro castoni purosangue (17,5 ± 1,3 anni, 593 ± 45 kg) sono stati utilizzati in questo studio per generare i risultati rappresentativi.
1. Ottenere un campione di biopsia del muscolo scheletrico
- Ottenere biopsie muscolari scheletriche (seguire la tecnica sterile) dal centro del muscolo semitendinoso (o altro muscolo di interesse), utilizzando un ago da biopsia 12 G University College Hospital (UCH) (vedi tabella dei materiali) mentre si è sotto sedazione leggera e utilizzando l'anestesia locale a seguito di un rapporto precedentemente pubblicato11.
- Trasferire immediatamente i campioni bioptici in flaconcini con soluzione di mezzo di trasporto per biopsia ghiacciata (2,77 mM CaK 2-EGTA, 7,23 mM K 2-EGTA, 20 mM imidazolo, 20 mM taurina, 50 mM K-MES, 0,5 mM ditiotreitolo, 6,56 mM MgCl 2, 5,77 mM ATP e 15 mM fosfocreatina, regolati a pH 7,1; vedere Tabella dei materiali). Trasporto al laboratorio per le analisi.
NOTA: Fare riferimento a Doerrier et al.15 per istruzioni specifiche sulla preparazione dei mezzi di trasporto della biopsia. - Isolare i mitocondri dai campioni bioptici utilizzando un kit commerciale, secondo le istruzioni del produttore (vedere la tabella dei materiali). Il buffer di stoccaggio finale non deve contenere substrati come ADP, ATP e succinato, che fanno parte del saggio respirometrico.
- Risospendere il pellet finale dei mitocondri isolati utilizzando 80 μL di mezzi di sospensione (225 mM di mannitolo, 75 mM di saccarosio e 1 mM di EGTA; vedere Tabella dei materiali) per 100 mg di muscolo utilizzato per l'isolamento dei mitocondri.
- Ridurre al minimo l'intervallo dal momento della procedura di biopsia all'isolamento dei mitocondri e mantenere i campioni a 0-4 °C durante le fasi di lavorazione fino ad aggiungerli ai respirometri ad alta risoluzione.
NOTA: Studi preliminari hanno rilevato che le sospensioni di mitocondri isolati iniziano a perdere capacità funzionale dopo circa 2 ore quando mantenute a 0-4 °C.
2. Messa a punto del respirometro ad alta risoluzione
- I respirometri ad alta risoluzione vengono utilizzati per quantificare la respirazione mitocondriale e i processi associati. Utilizzare il programma di controllo software fornito dal produttore (vedere Tabella dei materiali) per controllare il respirometro, calibrare i sensori e raccogliere dati grezzi. Analizzare i campioni in duplicato per ogni condizione di test.
NOTA: In tutti i casi, le titolazioni raccomandate e le concentrazioni finali di reagenti descritte in questo protocollo si basano su una camera respirometrica da 2 ml. - Determinare il flusso di fondo O 2 e il punto zero del sensore O 2 ogni2-4 settimane attraverso la titolazione seriale della ditionite, seguendo le istruzioni del produttore. Conservare queste costanti di calibrazione per i test successivi fino a quando la calibrazione non viene ripetuta.
NOTA: A differenza delle procedure precedentemente pubblicate che utilizzano fibre muscolari permeabilizzate11,12,13,16, in cui è necessaria iperossia (250-500 μM) per evitare la limitazione della diffusione di O 2 ai mitocondri, i mitocondri isolati possono essere valutati utilizzando un intervallo di 50-200 μM O 2. Ciò può essere ottenuto semplicemente consentendo al mezzo respiratorio di equilibrarsi con l'aria ambiente prima di aggiungere la sospensione mitocondriale (cioè, dopo la calibrazione giornaliera a punto singolo). Allo stesso modo, la riossigenazione della camera respiratoria può essere effettuata semplicemente aprendo la camera fino a quando sufficiente ossigeno ambientale si è dissolto nel mezzo respirometrico per aumentare la concentrazione di ossigeno al livello desiderato. - Riempire le camere respirometriche con mezzi privi di magnesio (0,5 mM EGTA, 60 mM K-lattobionato, 20 mM taurina, 10 mM KH2PO4, 20 mM HEPES, 110 mM saccarosio e 1 g/L di albumina sierica bovina [BSA] essenzialmente priva di acidi grassi, regolata a pH 7,1; vedi tabella dei materiali).
NOTA: Fare riferimento a Komlodi et al.17 per istruzioni specifiche sulla preparazione dei mezzi di respirazione.- Impostare la temperatura di incubazione dello strumento a 38 °C per rappresentare la temperatura basale del muscolo scheletrico equino e impostare la miscelazione dei mezzi respiratori a 800 giri / min utilizzando un agitatore magnetico che ruota sul fondo della camera respirometrica.
- Spegnere l'illuminazione della camera per evitare interferenze con i sensori fluorescenti.
- Energizzare l'elettrodo di ossigeno con una tensione di polarizzazione di 800 mV e amplificare il segnale risultante con un'impostazione di guadagno di 1.
- Registrare la concentrazione di ossigeno ogni 2 s, calcolare il flusso di ossigeno come pendenza negativa della misurazione dell'ossigeno nei 40 s precedenti (20 punti dati) e riferire come pmol x s-1 x mL di soluzione di incubazione.
- Calibrare il sensore di ossigeno consentendo al fluido di equilibrarsi con l'aria ambiente. Calcolare la pressione parziale dell'ossigeno di riferimento, in base alla pressione barometrica misurata dal respirometro ad alta risoluzione e alla concentrazione standard di ossigeno atmosferico.
3. Misurazione del potenziale di membrana mitocondriale mediante TMRM
- Utilizzare sensori fluorescenti "verdi" (lunghezza d'onda dominante di 530 nm) per quantificare il segnale fluorescente proveniente dalla camera respiratoria. Energizzare i sensori a 400-500 mV; Il segnale risultante viene amplificato con un guadagno di 1:1.000.
NOTA: le impostazioni specifiche devono essere ottimizzate per i singoli strumenti per acquisire il segnale previsto all'interno della gamma lineare del sensore. - Aggiungere TMRM (4 μL di soluzione da 1 mM per una concentrazione finale di 2 μM; vedere Tabella dei materiali) prima dell'aggiunta di mitocondri.
- Calibrare il segnale fluorescente utilizzando una semplice calibrazione a due punti del segnale fluorescente (tensione) rispetto alla quantità di fluoroforo aggiunto (mM), prima dell'aggiunta dei mitocondri.
NOTA: utilizzare la funzione di calibrazione del segnale fluorescente nel software di controllo della macchina per calibrare questo segnale. Il segnale grezzo della sonda fluorescente può richiedere 30 minuti o più per stabilizzarsi al fine di registrare il secondo punto della calibrazione. - Eseguire la calibrazione finale del segnale TMRM dopo il completamento del protocollo di titolazione respirometrica erogando diverse titolazioni dell'agente disaccoppiante (cianuro di carbonile m-clorofenil idrazone; 2 μL per titolazione) fino a quando non si osservano ulteriori aumenti del segnale fluorescente TMRM, indicando il completo collasso del potenziale di membrana mitocondriale (Figura 1).
NOTA: Questo valore del segnale fluorescente è considerato uguale al potenziale transmembrana di 0 mV e utilizzato come punto di riferimento per i valori di potenziale di membrana relativi registrati durante il protocollo di titolazione respirometrica.
4. Misurazione della produzione di ATP utilizzando il verde magnesio (MgG)
- Utilizzare sensori fluorescenti "blu" (lunghezza d'onda dominante 465 nm) per quantificare il segnale fluorescente dalla camera respiratoria. Energizza questi sensori per i singoli strumenti per catturare il segnale previsto all'interno della gamma lineare del sensore.
- Eseguire la configurazione chimica e la calibrazione del segnale fluorescente MgG dopo l'aggiunta dei mitocondri, ma prima dell'aggiunta di qualsiasi substrato. Aggiungere 8 μL di acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) 2 mM alla camera respirometrica per chelare cationi (in particolare Ca 2+) che competerebbero con Mg2+ per legarsi a MgG, quindi aggiungere 4 μL di 1 mM MgG (1,1 μM) alla camera di respirazione.
- Calibrare il segnale di fluorescenza grezzo con titolazioni sequenziali 10 x 2 μL di 100 mM MgCl 2, consentendo 1 minuto tra le titolazioni per la stabilizzazione del segnale fluorescente (Figura 2).
NOTA: Questo processo, che viene completato offline dopo il completamento del test e utilizzando i modelli forniti dal produttore della macchina e dal software associato, produce una curva di secondo ordine della concentrazione di magnesio al segnale fluorescente (previsto r2 > 0,98), che verrà utilizzato con una quantità nota di ADP aggiunta alla camera respirometrica e i valori Kd precedentemente determinati per determinare la concentrazione corrispondente di ATP11. - Determinare il tasso di sintesi di ATP, che è la pendenza della concentrazione di ATP nel tempo in tutto il protocollo (Figura 3).
5. Misurazione della produzione mitocondriale di ROS utilizzando Amplex UltraRed (AmR)
- Utilizzare sensori fluorescenti "verdi" (lunghezza d'onda dominante di 530 nm) per quantificare il segnale fluorescente proveniente dalla camera respiratoria. Energizzare i sensori a 300-400 mV; Il segnale risultante viene amplificato con un guadagno di 1:1.000. Ottimizza impostazioni specifiche per i singoli strumenti per acquisire il segnale previsto all'interno della gamma lineare del sensore.
NOTA: Se si utilizza un mezzo respiratorio senza MgCl 2, questo deve essere aggiunto (20-60 μL di 100 mM MgCl 2 per produrre 1-3 μM MgCl2) prima di aggiungere reagenti per il test AmR. - Eseguire la configurazione chimica e la calibrazione iniziale del test AmR prima dell'aggiunta dei mitocondri. Aggiungere 30 μmoli di DTPA (6 μL di soluzione da 5 mM) ai cationi chelati che potrebbero interferire con la reazione, quindi aggiungere superossido dismutasi (2 μL di una soluzione madre da 5.000 U/mL per convertire gli anioni superossido in H 2 O2per una rilevazione più completa della generazione di ossigeno reattivo), perossidasi di rafano (5 μL di una soluzione madre di 500 U/mL), e Amplex UltraRed (2 μL di una soluzione madre da 10 mM) (vedere Tabella dei materiali) per produrre rispettivamente 5 U/mL, 1 U/mL e 10 μM nella camera respirometrica.
- Lasciare stabilizzare il segnale fluorescente, quindi aggiungere 0,2 μmoli di perossido di idrogeno (5 μL di una soluzione da 40 μM fatta fresca ogni giorno) due volte, a circa 5 minuti di distanza.
NOTA: Il segnale fluorescente prima e dopo le due titolazioni di H 2 O 2 fornisce una curva di calibrazione lineare a tre punti del sistema (prevista r 2 > 0,95), la cui pendenza riflette la reattività complessiva del sistema nel riportare la relazione tra il segnale fluorescente e la produzione (o aggiunta) di H 2 O 2. Utilizzare la funzione di calibrazione del segnale fluorescente nel software di controllo della macchina per calibrare questo segnale. - Eseguire ulteriori calibrazioni a due punti (5 μL di una soluzione da 40 μM fatta fresca ogni giorno) durante il test, per consentire la regolazione della reattività del saggio man mano che la chimica della respirometria cambia durante il test, con la tempistica specifica di questi punti di calibrazione a discrezione dello sperimentatore (Figura 4).
6. Misurazione della respirazione mitocondriale
- Aggiungere 15 μL di sospensione mitocondriale isolata (fase 1.4) a ciascuna camera di incubazione da 2 ml, in modo che i risultati rappresentino la resa mitocondriale di 18,75 mg di muscolo. Sigillare la camera di incubazione. Vortice del campione tra ogni titolazione per mantenere una sospensione uniforme del campione.
- Misurare il consumo di ossigeno residuo (ROX) prima dell'aggiunta di qualsiasi substrato. Sottrarre questo valore (tipicamente inferiore a 0,2 pmol O2 x s-1 x mL-1) dai valori di consumo di ossigeno di ciascuna fase del protocollo di titolazione substrato/disaccoppiatore/inibitore (SUIT) dopo il completamento del protocollo.
NOTA: È fondamentale che i segnali provenienti sia dal sensore di ossigeno che dal sensore di fluorescenza possano stabilizzarsi per almeno 1 minuto (come valutato dalla pendenza calcolata stabile dei segnali del sensore primario), poiché lo stato generale della respirazione viene modificato dalle titolazioni per ottenere risultati affidabili. Questo vale per tutte le fasi di titolazione. - Utilizzare una SUIT generica che consenta la caratterizzazione iniziale della funzione mitocondriale del muscolo scheletrico equino. Iniziare con titolazioni sequenziali di piruvato (5 μL di soluzione acquosa 2 M), glutammato (10 μL di soluzione acquosa 2 M) e malato (10 μL di soluzione acquosa 0,4 M) (vedere Tabella dei materiali) in ciascuna camera per produrre nicotinammide adenina dinucleotide (NADH) e stimolare la respirazione non fosforilante (perdita) supportata dal NADH ossidato attraverso il complesso I (LN) (Figura 1, Figura 3 e Figura 4).
- Aggiungere ADP (20 μL di soluzione acquosa da 500 mM; vedi Tabella dei materiali) per stimolare la respirazione fosforilante attraverso il Complesso I (PN).
- Aggiungere succinato (20 μL di soluzione acquosa 1 M; vedi Tabella dei materiali) per produrre la respirazione fosforilante attraverso la combinazione del complesso I e del complesso II (PN+S).
NOTA: Con la combinazione della respirazione attraverso il Complesso I e il Complesso II, il consumo di ossigeno può essere abbastanza elevato da consumare la maggior parte dell'ossigeno disciolto nei mezzi di incubazione. Se la concentrazione di O 2 scende al di sotto di 50 μM, riossigenare il mezzo di incubazione togliendo la camera di incubazione fino a quando la concentrazione di O 2 misurata è aumentata oltre 150 μM. Ripetere questo passaggio se necessario per mantenere sufficiente O2 per la respirazione mitocondriale. - Aggiungere rotenone (2 μL di soluzione di etanolo 0,1 mM; vedere Tabella dei materiali) per bloccare il complesso I. Il flusso di ossigeno risultante rappresenta la capacità del Complesso II di supportare il consumo di ossigeno mitocondriale attraverso l'ossidazione del solo succinato (PS).
ATTENZIONE: Il rotenone è una sostanza velenosa. Utilizzare la sicurezza di laboratorio standard ed evitare l'ingestione o l'inalazione. - Calcolare il valore medio per una data condizione sperimentale attraverso singole camere respirometriche contenenti aliquote di una singola biopsia.
NOTA: I calcoli derivati, come i rapporti di controllo del flusso (FCR), sono preziosi per identificare i cambiamenti relativi nei diversi percorsi e includono FCRLeak (L N/P N), FCR N (P N/P N+S) e FCR S (PS/P N+S). L'efficienza di fosforilazione ossidativa calcolata (1-LN/PN+S) fornisce una stima dell'impatto complessivo della respirazione a perdita aggiustata per la capacità respiratoria totale.
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Representative Results
Lo stato di riferimento proposto è quello di un purosangue sedentario sano (nessun aumento della forma fisica dovuto all'esercizio fisico obbligatorio) e di un campione muscolare fresco raccolto dal centro di un muscolo posturale, contenente un'alta percentuale di fibre muscolari scheletriche di tipo I ricche di mitocondri e incubato in condizioni che si avvicinano al metabolismo a riposo (cioè 38 °C e pH 7,0). In queste condizioni, lo sperimentatore può aspettarsi valori di L N di 2,71 ± 0,90, valori di P N di 62,40 ± 26,22, valori di PN + S di 93,67 ± 34,76 e valori di PS di 46,93 ± 14,58 pmol O2 x s-1 x mL-1 (Figura 3 e Figura 4). I valori respiratori dei mitocondri incubati con TMRM sono più bassi a causa di un effetto inibitorio di quel fluoroforo (Figura 1). FCRLeak, FCRN e FCRS sono rispettivamente 0,05 ± 0,01, 0,66 ± 0,07 e 0,51 ± 0,07. L'efficienza di fosforilazione ossidativa calcolata è 0,97 ± 0,01. I valori assoluti per questi stati respiratori variano a seconda del singolo soggetto e della capacità ossidativa tissutale, ma il modello relativo di questi valori è coerente con i risultati pubblicati da fibre muscolari scheletriche equine permeabilizzate (cioè, aumenti della respirazione con l'aggiunta di substrati specifici, la combinazione della respirazione attraverso il complesso I e il complesso II è inferiore a ciascuna di queste fonti di elettroni individualmente a causa della saturazione del sistema di trasferimento di elettroni [ETS] capacità a valle). L'efficienza calcolata dei mitocondri isolati del muscolo scheletrico equino è coerente con i valori corrispondenti riportati per le fibre muscolari scheletriche equine permeabilizzate11.
Il tasso di sintesi di ATP dovrebbe essere 438,59 ± 397,10 pM x s-1 per la respirazione P N, 383,18 ± 397,19 per la respirazione PN + S e 172,07 ± 125,60 per la respirazione PS, per mg di tessuto sorgente utilizzato per isolare i mitocondri. La diminuzione della sintesi di ATP con l'aggiunta di succinato è probabilmente dovuta alla competizione alla giunzione chinone dell'ETS da parte dei due alimentatori di elettroni, con l'alimentazione del Complesso II (che non contribuisce direttamente al potenziale di membrana mitocondriale) che riduce il flusso di elettroni attraverso il Complesso I (che contribuisce direttamente al potenziale della membrana mitocondriale attraverso il pompaggio di protoni attraverso la membrana mitocondriale interna).
Il tasso di produzionedi H 2 O2 dovrebbe essere 0,079 ± 0,095 nmol.s-1 per la respirazione L N, 0,021 ± 0,043 per la respirazione P N, 0,026 ± 0,056 per la respirazione P N + S e 0,237 ± 0,248 per la respirazione PS, per mg di tessuto sorgente utilizzato per isolare i mitocondri (Figura 4). Il tasso relativo di produzione di ROS è coerente con l'entità prevista del potenziale di membrana mitocondriale e l'associazione tra alto potenziale di membrana e produzione di ROS. L'eccezione a questa relazione è l'altissima produzione di ROS quando la respirazione avviene attraverso il solo Complesso II, a causa del flusso inverso di elettroni dalla giunzione chinone al Complesso I quando è bloccato dal rotenone.
Figura 1: Traccia respirometrica rappresentativa ad alta risoluzione della respirazione mitocondriale del muscolo scheletrico equino e relativo potenziale di membrana. La finestra superiore è la concentrazione di ossigeno della camera (asse Y sinistro) e il flusso di ossigeno (asse Y destro) nel tempo (asse X); la finestra inferiore è la fluorescenza TMRM della camera (asse Y sinistro) e la velocità di variazione del segnale di fluorescenza (asse Y destro) nel tempo (asse X). I segni verticali indicano l'aggiunta di substrati specifici alla camera (mt: sospensione mitocondriale; P: piruvato; G: glutammato; M: malato; D: ADP; S: succinato; R: rotenone; CCCP: Cianuro di carbonile m-clorofenil idrazone). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Traccia respirometrica rappresentativa ad alta risoluzione della calibrazione del segnale di fluorescenza della camera per il verde di magnesio e determinazione del Kd per magnesio e adenilati. Fluorescenza della camera MgG (asse Y sinistro) e velocità di variazione del segnale di fluorescenza (asse Y destro) nel tempo (asse X). I segni verticali iniziali indicano l'aggiunta di substrati specifici alla camera (MgG: verde magnesio; mt: sospensione mitocondriale; P: piruvato; G: glutammato; M: malato; S: succinato; EDTA: acido etilendiamminotetraacetico). Questo è seguito dalla titolazione seriale di MgCl2 utilizzando una pompa di titolazione automatica (TIP) che aumenta il segnale fluorescente, quindi la titolazione seriale di un adenilato (in questo caso ATP) che diminuisce il segnale fluorescente. La titolazione di MgCl2 viene utilizzata anche all'inizio di ogni test per calibrare il segnale MgG, ma viene effettuata prima dell'aggiunta di substrati mitocondriali e respirometrici come P, G, M e S. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Traccia rappresentativa di respirometria ad alta risoluzione della respirazione mitocondriale del muscolo scheletrico equino e della sintesi di ATP. La finestra superiore è la concentrazione di ossigeno della camera (asse Y sinistro) e il flusso di ossigeno (asse Y destro) nel tempo (asse X); la finestra inferiore è la fluorescenza MgG della camera (asse Y sinistro) e la velocità di variazione del segnale di fluorescenza (asse Y destro) nel tempo (asse X). I segni verticali indicano l'aggiunta di substrati specifici alla camera (mt: sospensione mitocondriale; P: piruvato; G: glutammato; M: malato; D: ADP; S: succinato; R: rotenone). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 4: Traccia respirometrica rappresentativa ad alta risoluzione della respirazione mitocondriale del muscolo scheletrico equino e produzione di H2 O2. La finestra superiore è la concentrazione di ossigeno della camera (asse Y sinistro) e il flusso di ossigeno (asse Y destro) nel tempo (asse X); la finestra inferiore è la fluorescenza della resorufina della camera (asse Y sinistro) e la velocità di variazione del segnale di fluorescenza (asse Y destro) nel tempo (asse X). I segni verticali indicano l'aggiunta di substrati specifici alla camera (mt: sospensione mitocondriale; P: piruvato; G: glutammato; M: malato; D: ADP; S: succinato; R: rotenone). Sono incluse anche tre calibrazioni intra-test a due punti del segnale fluorescente utilizzando H 2 O2. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
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Discussion
L'aggiunta di segnali fluorescenti all'uscita standard del respirometro ad alta risoluzione fornisce preziose informazioni sulla fisiologia mitocondriale, ma una calibrazione meticolosa del segnale fluorescente è fondamentale per i dati di qualità. I protocolli originali per l'uso di MgG suggeriscono che le curve di calibrazione generate durante il calcolo delle costanti di dissociazione magnesio-adenilato potrebbero essere applicate ai saggi successivi4; tuttavia, il segnale fluorescente proveniente dall'MgG potrebbe non essere sufficientemente riproducibile da un saggio all'altro per questo approccio. Pertanto, ogni test viene calibrato con una titolazione automatica di MgCl2 e la curva di calibrazione risultante per il calcolo della sintesi di ATP per quel singolo test. Inoltre, le Kd (costanti di dissociazione) per il magnesio e sia ADP che ATP devono essere calcolate per le condizioni specifiche del test, compresi i tessuti specifici, le condizioni di incubazione e i substrati che producono la respirazione fosforilante, al fine di garantire che la derivazione della velocità di sintesi dell'ATP sia accurata. La variabilità nel saggio AmR è più ampiamente riconosciuta15,17, ed è comune inserire diversi punti di ricalibrazione discreti nel protocollo a discrezione dello sperimentatore durante il protocollo. I dati storici che utilizzano il muscolo scheletrico equino indicano che la risposta tipica del test è di circa 0,646 V/mM di H 2 O2al primo punto di calibrazione (prima dell'aggiunta del campione) e può diminuire dell'8%-15% nell'arco del test. Pertanto, è necessaria una frequente ricalibrazione del saggio AmR per rilevare cambiamenti relativamente piccoli nella produzione di ROS e la tempistica delle calibrazioni puntuali all'interno del protocollo deve essere determinata per ciascun protocollo di titolazione.
Gli sperimentatori devono impiegare un attento giudizio durante l'esecuzione del test per determinare quando passare alla fase di titolazione successiva. Idealmente, i segnali rilevanti generati in tempo reale (flusso di O2 , fluorescenza del TMRM e velocità di variazione del segnale fluorescente MgG e resorufin) dovrebbero essere stabili, indicando uno stato stazionario all'interno della camera, ma è una richiesta di giudizio da parte dello sperimentatore su ciò che costituisce una stabilità accettabile. In questo momento, non esiste uno standard ampiamente condiviso per questa decisione; Tuttavia, i ricercatori devono essere acutamente consapevoli dei rischi derivanti sia dal non riuscire ad aspettare abbastanza a lungo per stabilire uno stato stazionario (con conseguenti dati che caratterizzano in modo imperfetto lo stato respiratorio previsto) sia dall'attesa così a lungo che i substrati si esauriscano e il test non sia più affidabile. Nell'esperienza dell'autore, non riuscire a raggiungere un segnale stabile entro 30 minuti da qualsiasi titolazione del substrato è la prova di un campione (o macchina) che si comporta in modo non biologico e il test deve essere scartato.
I risultati che utilizzano questo approccio per quantificare la fisiologia mitocondriale dimostrano una notevole variabilità intersoggetto, con un tipico coefficiente di variazione (CV) del 30% -40%. Al contrario, l'analisi delle fibre muscolari scheletriche equine permeabilizzate risulta in un CV del 19%-20%11, suggerendo che il processo di isolamento dei mitocondri impone una sostanziale variabilità all'analisi successiva oltre alla marcata variabilità intersoggetto. Sebbene l'effetto di quest'ultimo possa essere mitigato utilizzando i soggetti come propri controlli quando possibile, il primo può essere minimizzato solo attraverso un'attenta attenzione alla tecnica di isolamento. Se il disegno sperimentale non consente repliche sperimentali da una singola biopsia, allora lo sperimentatore può scegliere di esprimere i dati respirometrici relativi a un fattore di correzione che riflette le differenze nel contenuto mitocondriale in diversi campioni. I fattori di correzione più comuni sono il contenuto proteico del campione e l'attività della citrato sintasi del campione. Tuttavia, come sottolineato in una recente dichiarazione di consenso degli scienziati attivi in questo campo, non esiste un unico metodo per eseguire questo aggiustamento che sia universalmente concordato18. La correzione del contenuto proteico e/o dell'attività della citrato sintasi sono i due approcci più comuni utilizzati per il tessuto muscolare scheletrico equino12,13, ma entrambi hanno i loro difetti. Potrebbe essere necessario che diversi disegni sperimentali esprimano dati sia interni (cioè rapporti di controllo del flusso) che esterni (proteine, attività enzimatica, altri marcatori mitocondriali) per interpretare la funzione mitocondriale.
Il protocollo descritto si basa sull'uso di fibre muscolari permeabilizzate, con diverse importanti differenze. I saggi delle fibre permeabilizzate richiedono biopsie più piccole, poiché la respirometria ad alta risoluzione delle fibre permeabilizzate del muscolo scheletrico equino viene tipicamente eseguita con solo ~ 2 mg di massa del campione in ciascuna camera 6,7,8,9,10,11. Al contrario, il protocollo qui descritto ha l'equivalente di quasi 10 volte la massa di fibre in ogni camera. Questa differenza evidenzia l'inefficienza dell'isolamento mitocondriale dal tessuto fresco. Una possibile ragione di questa inefficienza è la difficoltà nel recuperare i mitocondri del muscolo scheletrico che si trovano all'interno della rete proteica contrattile. Il kit commerciale per l'isolamento mitocondriale utilizzato in questo protocollo include il trattamento con una proteasi e l'uso di mezzi ionici per aiutare ad abbattere le fibre contrattili, ma è probabile che una parte sostanziale dei mitocondri intermiofibrillari non venga recuperata. Questa caratteristica del protocollo non è rilevante solo per determinare la quantità di materiale bioptico necessario, ma anche per quanto riguarda l'interpretazione dei risultati. I mitocondri isolati sono meno suscettibili alla dipendenza dall'ossigeno, a causa della limitazione della diffusione rispetto alle fibre permeabilizzate15; Pertanto, l'iperossia non è necessaria con i mitocondri isolati e il mezzo respiratorio può essere sufficientemente ossigenato (e riossigenato durante il test) semplicemente aprendo la camera all'aria ambiente. Questo aspetto dell'apporto di ossigeno è particolarmente utile quando si misura la produzione di H 2 O2e altri ROS, poiché la produzione di ROS è aumentata in modo non fisiologico durante l'incubazione iperossica19. Infine, l'uso di mitocondri isolati fornisce un segnale fluorescente più stabile e riproducibile, a causa del diminuito legame proteico non specifico dei fluorofori rispetto all'uso di fluorofori con fibre muscolari permeabilizzate. Ogni preparazione del campione presenta vantaggi e svantaggi, e la competenza sia con fibre permeabilizzate che con mitocondri isolati fornisce allo sperimentatore una solida serie di saggi per affrontare una varietà di domande relative alla fisiologia mitocondriale.
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Disclosures
Gli autori non hanno conflitti di interesse relativi a questo manoscritto.
Acknowledgments
Gli autori desiderano riconoscere il generoso sostegno della John and Debbie Oxley Endowed Chair for Equine Sports Medicine e della Grayson Jockey Club Research Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ADP | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | A5285 | |
| Amplex UltraRed | Life Technologies | A36006 | |
| ATP | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | A2383 | |
| BSA | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | A6003 | |
| Calcium carbonate | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | C4830 | |
| CCCP | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | C2759 | |
| DatLab 7.0 | Oroboros Inc | Software to operate O2K fluororespirometer | |
| Dithiothreitol | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | D0632 | |
| DTPA | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | D1133 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | E4378 | |
| Glutamate | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | G1626 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | H7523 | |
| Horseradish peroxidase | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | P8250 | |
| Hydrogen peroxide | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | 516813 | Must be made fresh daily prior to assay |
| Imidazole | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | I2399 | |
| K-MES | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | M8250 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | M9272 | |
| Magnesium Green | Thermo Fisher Scientific | M3733 | |
| Malate | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | M1000 | |
| Mannitol | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | M9647 | |
| Mitochondrial isolation kit | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | MITOISO1 | |
| O2K fluororespirometer | Oroboros Inc | Multiple units required to run full spectrum of assays concurrently. | |
| Phosphocreatine | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | P7936 | |
| Potassium hydroxide | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | P1767 | |
| Potassium lactobionate | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | L2398 | |
| Potassium phosphate | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | P0662 | |
| Pyruvate | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | P2256 | Must be made fresh daily prior to assay |
| Rotenone | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | R8875 | |
| Succinate | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | S2378 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | 84097 | |
| Superoxide dismutase | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | S8160 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | T0625 | |
| Titration pump | Oroboros Inc | ||
| Titration syringes | Oroboros Inc | ||
| TMRM | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | T5428 | |
| UCH biopsy needle | Millenium Surgical Corp | 72-238067 | Available in a range of sizes |
References
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