Summary
말은 뛰어난 유산소 운동 능력을 가지고 있어 말 골격근을 말 운동 생리학 연구와 포유류 미토콘드리아 생리학 연구 모두에 중요한 조직으로 만듭니다. 이 기사에서는 말 골격근의 미토콘드리아 기능을 종합적으로 평가하는 기술을 설명합니다.
Abstract
미토콘드리아 기능(산화적 인산화 및 활성 산소 종의 생성)은 건강과 질병 모두에 중요합니다. 따라서 미토콘드리아 기능을 측정하는 것은 생물 의학 연구의 기본입니다. 골격근은 특히 말과 같이 유산소 능력이 매우 높은 동물에서 미토콘드리아의 강력한 공급원이므로 미토콘드리아 생리학을 연구하는 데 이상적인 과목입니다. 이 기사는 갓 수확한 골격근 미토콘드리아와 함께 동시 형광 측정법과 함께 고해상도 호흡 측정법을 사용하여 다양한 미토콘드리아 상태에서 기질을 산화시키는 능력을 정량화하고 미토콘드리아 호흡의 고유한 요소의 상대적 용량을 결정하는 방법을 보여줍니다. 테트라메틸로다민 메틸에스테르는 동시 산소 플럭스 단위당 생성된 상대적 막 전위를 계산하여 미토콘드리아의 상대적 효율 계산을 포함하여 기질 산화로 인한 미토콘드리아 막 전위의 생성을 입증하는 데 사용됩니다. ADP를 ATP로 전환하면 마그네슘에 대한 아데닐레이트의 친화도가 다르기 때문에 반응 챔버에서 마그네슘 농도가 변경됩니다. 따라서 마그네슘 그린은 ATP 합성 속도를 측정하는 데 사용할 수 있으므로 산화 인산화 효율(산화에 대한 인산화의 비율[P/O])을 추가로 계산할 수 있습니다. 마지막으로, 과산화수소와 결합하면 형광 생성물(레소루핀)을 생성하는 Amplex UltraRed를 사용하면 미토콘드리아 호흡 중 활성 산소 종 생성의 정량화와 ROS 생성과 동시 호흡 간의 관계를 정량화할 수 있습니다. 이러한 기술을 통해 다양한 시뮬레이션 조건에서 미토콘드리아 생리학을 강력하게 정량화할 수 있으므로 이 중요한 세포 구성 요소가 건강과 질병 모두에 기여하는 바를 밝힐 수 있습니다.
Introduction
진핵 세포의 미토콘드리아는 세포가 일과 유지를 위해 사용하는 ATP의 대부분을 생산한다1. ATP의 미토콘드리아 생산의 핵심 단계는 산소를 물로 전환하는 것이므로, 미토콘드리아와 관련 세포의 대사 능력은 산소 소비량 측정을 통해 자주 정량화된다2. 그러나 미토콘드리아 생리학은 단순한 산소 소비 과정보다 더 복잡하며 이 종점에 대한 의존은 미토콘드리아 기능과 기능 장애가 세포 건강에 미치는 영향에 대한 불완전한 평가를 독점적으로 제공합니다. 미토콘드리아 기능의 완전한 특성화는 산소 소비뿐만 아니라 ATP 및 활성 산소 종(ROS)의 생성에 대한 평가도 필요로 합니다.
주요 미토콘드리아 기능의 추가 측정은 특정 형광단의 사용을 통한 호흡 측정과 동시에 수행될 수 있습니다. 테트라메틸로다민 메틸에스테르(Tetramethylrhodamine methylester, TMRM)는 미토콘드리아 막횡단 전압 전위에 비례하여 미토콘드리아 기질에 축적되는 양이온성 형광단으로, 이 축적으로 인해 형광 강도가 감소한다3. TMRM은 미토콘드리아 막 전위의 상대적 변화를 나타내는 지표로 사용되거나, 형광 신호를 mV로 변환할 수 있는 상수를 결정하기 위한 추가 실험을 통해 막횡단 전압의 정확한 변화를 정량화하는 데 사용할 수 있습니다. 마그네슘 그린(MgG)은 Mg2+와 결합할 때 형광을 발하는 형광단으로, 마그네슘 2가 양이온4에 대한 ADP와 ATP의 미분 친화도를 기반으로 ATP 합성 측정에 사용됩니다. 조사관은 MgG 형광의 변화를 ATP 농도의 변화로 변환하기 위해 특정 분석 조건에서 ADP와 ATP 모두에 대한 특정 친화도/해리 상수(Kd)를 결정해야 합니다. Amplex UltraRed(AmR)는 미토콘드리아 호흡 중 과산화수소 및 기타 ROS의 생성을 측정하는 데 사용되는 형광단이다5. H 2 O2와 AmR (양 고추 냉이 과산화 효소에 의해 촉매 됨) 사이의 반응은 530 nM에서 형광을 통해 검출 가능한 레소 루핀을 생성합니다. 이러한 각 분석은 실시간 미토콘드리아 호흡 분석에 개별적으로 추가되어 미토콘드리아 생리학의 각 측면에 대한 동시 측정을 제공하여 호흡과 미토콘드리아 출력 사이의 직접적인 연결을 제공할 수 있습니다.
말은 부분적으로 말 골격근의 미토콘드리아 함량이 매우 높기 때문에 질량별 산소 소비율이 매우 높기 때문에 이 조직은 미토콘드리아 생리학 연구와 매우 관련이 있습니다. 고해상도 호흡 측정법의 개발과 함께 이 새로운 기술을 사용한 연구는 말의 놀라운 운동 능력과 골격근 질환의 병태생리학 모두에 대한 말 골격근 미토콘드리아의 기여를 정의하는 데 도움이 되었습니다 6,7,8,9,10,11,12,13,14 . 말 골격근 미토콘드리아 기능에 대한 연구는 이 조직을 다량 얻는 것이 말단이 아니기 때문에 특히 유리합니다. 따라서 말 피험자는 미토콘드리아 기능의 완전한 특성화를 위한 충분한 조직을 제공할 수 있을 뿐만 아니라 미토콘드리아 생리학에 대한 고품질의 기계론적 연구를 위한 종단 제어 역할도 할 수 있습니다. 이러한 이유로 말 골격근에서 미토콘드리아 생리학의 보다 강력한 특성을 제공하기 위해 미토콘드리아 막 전위, ATP 합성 및 이 조직의 산소 소비 측정을 보완하는 ROS 생성을 정량화하기 위한 추가 분석이 개발되었습니다.
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Protocol
이 연구는 오클라호마 주립 대학 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 승인을 받았습니다. 이 연구에서는 4개의 서러브레드 겔딩(17.5 ± 1.3년, 593 ± 45kg)을 사용하여 대표적인 결과를 생성했습니다.
1. 골격근 생검 표본 얻기
- 반건공룡근(또는 다른 관심 근육)의 중심에서 골격근 생검(멸균 기술 따름)을 얻고, 가벼운 진정 상태에서 12G UCH(University College Hospital) 생검 바늘( 재료 표 참조)을 사용하고, 이전에 발표된 보고서11에 따라 국소 마취를 사용합니다.
- 생검 표본을 즉시 빙냉 생검 수송 배지 용액(2.77mM CaK 2-EGTA, 7.23mM K2-EGTA, 20mM 이미다졸, 20mM 타우린, 50mM K-MES, 0.5mM 디티오트레이톨, 6.56mMMgCl2, 5.77mM ATP 및 15mM 포스포크레아틴, pH 7.1로 조정됨; 재료 표 참조)으로 바이알에 옮깁니다. 분석을 위해 실험실로 이송합니다.
참고: 생검 수송 배지 준비에 대한 구체적인 지침은 Doerrier et al.15를 참조하십시오. - 생검 샘플에서 미토콘드리아를 분리합니다.amp제조업체의 지침에 따라 상업용 키트를 사용합니다( 재료 표 참조). 최종 저장 완충액에는 호흡 측정 분석의 일부인 ADP, ATP 및 숙시네이트와 같은 기질이 포함되어서는 안 됩니다.
- 미토콘드리아 분리에 사용되는 근육 100mg당 80μL의 현탁액 배지(225mM 만니톨, 75mM 자당 및 1mM EGTA, 재료 표 참조)를 사용하여 분리된 미토콘드리아의 최종 펠릿을 재현탁합니다.
- 생검 절차에서 미토콘드리아 분리까지의 간격을 최소화하고 고해상도 호흡계에 추가될 때까지 처리 단계 전반에 걸쳐 샘플을 0-4°C로 유지합니다.
참고: 예비 연구에 따르면 분리된 미토콘드리아의 현탁액은 0-4°C로 유지될 때 약 2시간 후에 기능 능력을 잃기 시작합니다.
2. 고해상도 호흡기 설정
- 고해상도 호흡계는 미토콘드리아 호흡 및 관련 과정을 정량화하는 데 사용됩니다. 제조업체에서 제공하는 소프트웨어 제어 프로그램( 재료 표 참조)을 사용하여 호흡계를 제어하고, 센서를 보정하고, 원시 데이터를 수집합니다. 각 테스트 조건에 대해 중복된 샘플을 분석합니다.
참고: 모든 경우에 이 프로토콜에 설명된 권장 적정 및 최종 시약 농도는 2mL 호흡 측정 챔버를 기준으로 합니다. - 제조업체의 지침에 따라 디티오나이트의 연속 적정을 통해 2-4주마다O2 센서의배경 O2 플럭스와 영점을 결정합니다. 보정이 반복될 때까지 후속 분석을 위해 이러한 보정 상수를 유지합니다.
참고: 미토콘드리아에 대한 O2의 확산 제한을 피하기 위해 과산소(250-500μM)가 필요한 투과화된 근육 섬유11,12,13,16을 사용하여 이전에 발표된 절차와 대조 적으로, 분리된 미토콘드리아는 50-200μM O2 범위를 사용하여 평가할 수 있습니다. 이것은 미토콘드리아 현탁액을 추가하기 전에(즉, 매일 단일 지점 교정 후) 호흡 매체가 실내 공기와 평형을 이루도록 함으로써 간단히 달성할 수 있습니다. 유사하게, 호흡 챔버의 재산소화는 산소 농도를 원하는 수준으로 상승시키기 위해 충분한 주변 산소가 호흡 측정 매체에 용해될 때까지 챔버를 단순히 개방함으로써 달성될 수 있다. - 호흡계 챔버를 마그네슘이 없는 배지(0.5mM EGTA, 60mM K-락토비오네이트, 20mM 타우린, 10mM KH 2PO4, 20mM HEPES,110mM 자당 및 1g/L 소 혈청 알부민[BSA]는 본질적으로 지방산이 없고 pH 7.1로 조정됨, 재료 표 참조)로 채웁니다.
알림: 호흡 매체 준비에 대한 구체적인 지침은 Komlodi et al.17 을 참조하십시오.- 말 골격근의 기저 온도를 나타내기 위해 기구 배양 온도를 38°C로 설정하고, 호흡계 챔버의 바닥에서 회전하는 자기 교반기를 사용하여 호흡 매체의 혼합을 800rpm으로 설정한다.
- 형광 센서와의 간섭을 피하기 위해 챔버 조명을 끕니다.
- 800mV 분극 전압으로 산소 전극에 전원을 공급하고 이득 설정 1로 결과 신호를 증폭합니다.
- 2초마다 산소 농도를 기록하고, 이전 40초(20개 데이터 포인트)에 대한 산소 측정의 음의 기울기로 산소 플럭스를 계산하고, 배양 용액의 pmol x s-1 x mL로 보고합니다.
- 매체가 실내 공기와 평형을 이루도록 하여 산소 센서를 보정합니다. 고해상도 호흡계로 측정한 기압과 표준 대기 산소 농도를 기준으로 기준 산소 분압을 계산합니다.
3. TMRM을 이용한 미토콘드리아 막 전위 측정
- "녹색" 형광 센서(530nm 주 파장)를 사용하여 호흡실의 형광 신호를 정량화합니다. 400-500mV에서 센서에 전원을 공급합니다. 결과 신호는 1:1,000의 이득으로 증폭됩니다.
알림: 센서의 선형 범위 내에서 예상되는 신호를 캡처하려면 개별 기기에 대해 특정 설정을 최적화해야 합니다. - 미토콘드리아를 첨가하기 전에 TMRM(최종 농도 2μM에 대한 1mM 용액 4μL, 재료 표 참조)을 추가합니다.
- 미토콘드리아를 첨가하기 전에 형광 신호(전압)와 첨가된 형광단의 양(mM)에 대한 간단한 2점 교정을 사용하여 형광 신호를 보정합니다.
알림: 기계 제어 소프트웨어의 형광 신호 보정 기능을 사용하여 이 신호를 보정하십시오. 형광 프로브의 원시 신호는 보정의 두 번째 지점을 기록하기 위해 안정화하는 데 30분 이상이 필요할 수 있습니다. - TMRM 형광 신호가 더 이상 증가하지 않을 때까지 분리제(카르보닐 시안화물 m-클로로페닐 히드라존, 적정당 2μL)를 여러 번 전달하여 호흡 측정 적정 프로토콜이 완료된 후 TMRM 신호의 최종 보정을 수행하여 미토콘드리아 막 전위의 완전한 붕괴를 나타냅니다(그림 1).
참고: 이 형광 신호 값은 0mV 막횡단 전위와 동일한 것으로 간주되며 호흡 측정 적정 프로토콜 중에 기록된 상대 막 전위 값의 기준점으로 사용됩니다.
4. 마그네슘 그린(MgG)을 이용한 ATP 생산량 측정
- "청색" 형광 센서(465nm 주 파장)를 사용하여 호흡실의 형광 신호를 정량화합니다. 개별 계측기에 대해 이러한 센서에 전원을 공급하여 센서의 선형 범위 내에서 예상되는 신호를 캡처합니다.
- 미토콘드리아를 첨가한 후, 그러나 임의의 기질을 첨가하기 전에 MgG 형광 신호의 화학적 설정 및 보정을 수행합니다. 8 μL의 2 mM 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA)을 호흡 측정 챔버에 첨가하여 MgG에 결합하기 위해 Mg 2+와 경쟁하는 양이온 (특히 Ca2+)을 킬레이트화 한 다음 4 μL의 1 mM MgG (1.1 μM)를 호흡 챔버에 첨가한다.
- 100mMMgCl2의 10 x 2μL 순차 적정으로 원시 형광 신호를 보정하고 형광 신호의 안정화를 위해 적정 사이에 1분의 시간을 허용합니다(그림 2).
참고: 분석 완료 후 오프라인으로 완료되고 기계 및 관련 소프트웨어 제조업체에서 제공한 템플릿을 사용하여 완료되는 이 프로세스는 형광 신호에 대한 마그네슘 농도의 2차 곡선을 생성합니다(예상 r2 > 0.98), 이는 호흡 측정 챔버에 추가된 알려진 양의 ADP 및 ATP11의 해당 농도를 결정하기 위해 이전에 결정된 Kd 값과 함께 사용됩니다. - 프로토콜 전반에 걸쳐 시간 경과에 따른 ATP 농도의 기울기인 ATP 합성 속도를 결정합니다(그림 3).
5. Amplex UltraRed(AmR)를 이용한 ROS의 미토콘드리아 생성 측정
- "녹색" 형광 센서(530nm 주 파장)를 사용하여 호흡실의 형광 신호를 정량화합니다. 300-400mV에서 센서에 전원을 공급합니다. 결과 신호는 1:1,000의 이득으로 증폭됩니다. 개별 계측기에 대한 특정 설정을 최적화하여 센서의 선형 범위 내에서 예상 신호를 캡처합니다.
참고: MgCl2 없이 호흡 매체를 사용하는 경우 AmR 분석용 시약을 추가하기 전에 이를 추가해야 합니다(1-3μM MgCl 2를 생성하기 위해 100mM MgCl2 20-60μL). - 미토콘드리아를 첨가하기 전에 AmR 분석의 화학적 설정 및 초기 보정을 수행합니다. 반응을 방해할 수 있는 양이온을 킬레이트화하기 위해 30μmole의 DTPA(5mM 용액 6μL)를 추가한 다음 슈퍼옥사이드 디스뮤타제(5,000U/mL 원액 2μL를 추가하여 슈퍼옥사이드 음이온을H2O2로 전환하여 활성 산소 생성의 보다 포괄적인 검출), 양 고추 냉이 과산화효소(500U/mL 원액 5μL), 및 Amplex UltraRed(10mM 원액 2μL)(재료 표 참조)를 사용하여 호흡 측정 챔버에서 각각 5U/mL, 1U/mL 및 10μM을 생성합니다.
- 형광 신호가 안정화될 때까지 기다린 다음 0.2μmole의 과산화수소(매일 새로 만든 5μM 용액 40μL)를 약 5분 간격으로 두 번 추가합니다.
주: H2O2의 2회 적정 전후의 형광 신호는 시스템의 3점 선형 검량선(예상 r2 > 0.95)을 제공하며, 그 기울기는 형광 신호와H2O2의 생성(또는 첨가) 사이의 관계를 보고함에 있어서 시스템의 전체 응답성을 반영한다. 기계 제어 소프트웨어의 형광 신호 보정 기능을 사용하여 이 신호를 보정합니다. - 분석 전반에 걸쳐 추가 2점 보정(매일 새로 만든 40μM 용액 5μL)을 수행하여 분석 전반에 걸쳐 호흡 측정의 화학적 성질이 변함에 따라 분석의 반응성을 조정할 수 있도록 하고 이러한 보정 지점의 특정 타이밍은 조사자의 재량에 따릅니다(그림 4).
6. 미토콘드리아 호흡 측정
- 분리된 미토콘드리아 현탁액 15μL(단계 1.4)를 각 2mL 배양 챔버에 추가하여 결과가 근육 18.75mg의 미토콘드리아 수율을 나타내도록 합니다. 배양 챔버를 밀봉하십시오. 샘플의 균일한 현탁액을 유지하기 위해 각 적정 사이에 샘플을 와동시킵니다.
- 기질을 추가하기 전에 잔류 산소 소비량(ROX)을 측정합니다. 프로토콜 완료 후 기질/언커플러/억제제 적정(SUIT) 프로토콜11에서 각 단계의 산소 소비량 값에서 이 값(일반적으로 0.2 pmol O2 x s-1 x mL-1 미만)을 뺍니다.
알림: 산소 센서와 형광 센서의 신호는 신뢰할 수 있는 결과를 얻기 위해 적정에 의해 전체 호흡 상태가 변경되므로 최소 1분 동안 안정화되는 것이 중요합니다(1차 센서 신호의 안정적으로 계산된 기울기로 평가). 이는 모든 적정 단계에 적용됩니다. - 말 골격근 미토콘드리아 기능의 초기 특성화를 허용하는 범용 SUIT를 사용합니다. 피루브산(2M 수용액 5μL), 글루타메이트(2M 수용액 10μL) 및 말산염(0.4M 수용액 10μL)( 재료 표 참조)을 각 챔버에 순차적으로 적정하여 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드(NADH)를 생성하고 복합체 I(LN)을 통해 산화된 NADH에 의해 지원되는 비인산화(누출) 호흡을 자극합니다(그림 1, 그림 3 및 그림 4).
- ADP(500mM 수용액 20μL, 재료 표 참조)를 추가하여 복합체 I(PN)을 통해 인산화 호흡을 자극합니다.
- 숙시네이트(1M 수용액 20μL, 재료 표 참조)를 추가하여 복합체 I과 복합체 II(PN+S)의 조합을 통해 인산화 호흡을 생성합니다.
참고: 복합체 I과 복합체 II를 통한 호흡의 조합으로 산소 소비량은 배양 배지에 용해된 대부분의 산소를 소비할 만큼 충분히 높을 수 있습니다. O2 농도가 50μM 미만으로 감소하면, 측정된 O2 농도가 150μM 이상으로 증가할 때까지 배양 챔버를 개봉하여 배양 배지를 재산소화한다. 미토콘드리아 호흡을 위해 충분한O2를 유지하기 위해 필요에 따라 이 단계를 반복한다. - 로테논(0.1mM 에탄올 용액 2μL, 재료 표 참조)을 첨가하여 복합체 I을 차단합니다. 생성된 산소 플럭스는 숙시네이트 단독의 산화를 통해 미토콘드리아 산소 소비를 지원하는 복합체 II의 능력을 나타냅니다(PS).
주의 : 로테논은 독성 물질입니다. 표준 실험실 안전을 사용하고 섭취 또는 흡입을 피하십시오. - 단일 생검의 분취량을 포함하는 개별 호흡 측정 챔버에서 주어진 실험 조건에 대한 평균값을 계산합니다.
참고: 플럭스 제어 비율(FCR)과 같은 파생 계산은 다양한 경로의 상대적 변화를 식별하는 데 유용하며 FCR누출(LN/PN), FCRN(PN/PN+S) 및 FCR S(PS / PN + S). 계산된 산화 인산화 효율(1-LN/PN+S)은 총 호흡 용량에 맞게 조정된 누출 호흡의 전반적인 영향에 대한 추정치를 제공합니다.
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Representative Results
제안된 기준 상태는 건강한 좌식 서러브레드(의무 운동으로 인한 체력 증가 없음)와 자세 근육의 중심에서 수집된 신선한 근육 샘플로, 높은 비율의 미토콘드리아가 풍부한 I형 골격근 섬유를 함유하고 휴식 신진대사에 가까운 조건(즉, 38°C 및 pH 7.0). 이러한 조건에서 연구자는 2.71 ± 0.90의 LN 값, 62.40 ± 26.22의 PN 값, 93.67 ± 34.76의PN+S 값 및 46.93 ± 14.58 pmol O2 x s-1 x mL-1의 PS 값을 예상할 수 있습니다(그림 3 및 그림 4). TMRM과 함께 배양된 미토콘드리아의 호흡 값은 형광단의 억제 효과로 인해 더 낮습니다(그림 1). FCR누출, FCRN 및 FCRS는 각각 0.05 ± 0.01, 0.66 ± 0.07 및 0.51 ± 0.07입니다. 계산된 산화적 인산화 효율은 0.01± 0.97이다. 이러한 호흡 상태에 대한 절대값은 개별 피험자 및 조직 산화 능력에 따라 다르지만, 이러한 값의 상대적 패턴은 투과화된 말 골격근 섬유로부터 발표된 결과와 일치합니다(즉, 특정 기질의 첨가에 따른 호흡의 증가, 복합체 I 및 복합체 II를 통한 호흡의 조합은 전자 전달 시스템[ETS]의 포화로 인해 이들 전자 소스 각각보다 개별적으로 적음 다운스트림 용량). 분리된 말 골격근 미토콘드리아의 계산된 효율은 투과화된 말 골격근 섬유(11)에 대해 보고된 해당 값과 일치한다.
ATP 합성속도는 미토콘드리아를 분리하는 데 사용되는 소스 조직의 mg당 PN 호흡의 경우 438.59 ± 397.10 pM x s-1,PN+S 호흡의 경우 383.18 ± 397.19, PS 호흡의 경우 172.07 ± 125.60이 될 것으로 예상됩니다. 숙시네이트의 첨가에 따른 ATP 합성의 감소는 복합체 II(미토콘드리아 막 전위에 직접 기여하지 않음)를 통한 전자의 흐름을 감소시키는 복합체 II(미토콘드리아 막 전위에 직접 기여하지 않음)에 의한 ETS의 퀴논 접합에서의 경쟁으로 인한 것일 수 있습니다.
미토콘드리아를 분리하는 데 사용되는 소스 조직의 mg당 H2O2 생산율은 LN 호흡의 경우 0.079 ± 0.095 nmol.s-1, PN 호흡의 경우 0.021 ± 0.043,PN+S 호흡의 경우 0.026 ± 0.056, 및 PS 호흡의 경우 0.237 ± 0.248이 될 것으로 예상된다(도 4). ROS 생산의 상대적 속도는 미토콘드리아 막 전위의 예측된 크기 및 높은 막 전위와 ROS 생산 사이의 연관성과 일치합니다. 이 관계의 예외는 로테 논에 의해 차단 될 때 퀴논 접합에서 복합체 I로 전자의 역류로 인해 복합체 II 단독을 통해 호흡이 발생할 때 매우 높은 ROS 생성입니다.
그림 1: 말 골격근 미토콘드리아 호흡 및 상대적 막 전위의 대표적인 고해상도 호흡 측정 추적. 상단 창은 시간 경과에 따른 챔버 산소 농도(왼쪽 Y축)와 산소 플럭스(오른쪽 Y축)입니다(X축). 하단 창은 챔버 TMRM 형광(왼쪽 Y축)과 시간 경과에 따른 형광 신호 변화율(오른쪽 Y축)입니다(X축). 수직 표시는 챔버에 특정 기질의 첨가를 나타냅니다(mt: 미토콘드리아 현탁액; P: 피루브산; G: 글루타메이트; M: 말레이트; D: ADP; S: 숙시네이트; R: 로테논; CCCP: 카르보닐 시안화물 m-클로로페닐 히드라존). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 마그네슘 그린에 대한 챔버 형광 신호 보정 및 마그네슘 및 아데닐레이트에 대한 Kd 측정의 대표적인 고분해능 호흡 측정 추적. 챔버 MgG 형광(왼쪽 Y축) 및 시간 경과에 따른 형광 신호 변화율(오른쪽 Y축)(X축). 초기 수직 표시는 챔버에 특정 기질의 첨가를 나타냅니다(MgG: 마그네슘 그린; mt: 미토콘드리아 현탁액; P: 피루브산; G: 글루타메이트; M: 말레이트; S: 숙시네이트; EDTA: 에틸렌디아민테트라아세트산). 그런 다음 형광 신호를 증가시키는 자동 적정 펌프(TIP)를 사용하여MgCl2 를 연속 적정한 다음 형광 신호를 감소시키는 아데닐레이트(이 경우 ATP)를 연속 적정합니다. MgCl2 의 적정은 또한 MgG 신호를 보정하기 위해 각 분석의 시작 부분에 사용되지만, 미토콘드리아 및 P, G, M, 및 S와 같은 호흡 측정 기질을 첨가하기 전에 수행된다 .
그림 3: 말 골격근 미토콘드리아 호흡 및 ATP 합성의 대표적인 고해상도 호흡 측정 추적. 상단 창은 시간 경과에 따른 챔버 산소 농도(왼쪽 Y축)와 산소 플럭스(오른쪽 Y축)입니다(X축). 하단 창은 챔버 MgG 형광(왼쪽 Y축)과 시간 경과에 따른 형광 신호 변화율(오른쪽 Y축)입니다(X축). 수직 표시는 챔버에 특정 기질의 첨가를 나타냅니다(mt: 미토콘드리아 현탁액; P: 피루브산; G: 글루타메이트; M: 말레이트; D: ADP; S: 숙시네이트; R: 로테논). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 말 골격근 미토콘드리아 호흡 및H2O2생성의 대표적인 고해상도 호흡 측정 추적. 상단 창은 시간 경과에 따른 챔버 산소 농도(왼쪽 Y축)와 산소 플럭스(오른쪽 Y축)입니다(X축). 하단 창은 챔버 레조루핀 형광(왼쪽 Y축)과 시간 경과에 따른 형광 신호 변화율(오른쪽 Y축)입니다(X축). 수직 표시는 챔버에 특정 기질의 첨가를 나타냅니다(mt: 미토콘드리아 현탁액; P: 피루브산; G: 글루타메이트; M: 말레이트; D: ADP; S: 숙시네이트; R: 로테논). 또한H2O2를 사용한 형광 신호의 3가지 인트라 어세이 2점 보정이 포함된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
고분해능 호흡기의 표준 출력에 형광 신호를 추가하면 미토콘드리아 생리학에 관한 귀중한 정보를 얻을 수 있지만, 형광 신호의 세심한 보정은 양질의 데이터를 위해 매우 중요합니다. MgG 사용에 대한 원래의 프로토콜은 마그네슘-아데닐레이트 해리 상수를 계산하는 동안 생성된 검량선이 후속 분석에 적용될 수 있음을 시사한다4; 그러나 MgG의 형광 신호는 이 접근법에 대한 분석에서 분석으로 충분히 재현되지 않을 수 있습니다. 따라서 각 분석은 자동화된MgCl2 적정으로 보정되고 해당 개별 분석에 대한 ATP 합성을 계산하기 위한 결과 보정 곡선이 표시됩니다. 또한, 마그네슘과 ADP 및 ATP에 대한Kd (해리 상수)는 ATP 합성 속도의 유도가 정확한지 확인하기 위해 특정 조직, 배양 조건 및 인산화 호흡을 생성하는 기질을 포함한 분석의 특정 조건에 대해 계산되어야합니다. AmR 분석의 가변성은 더 널리 인식되고 있으며(15,17), 프로토콜 동안 조사자의 재량에 따라 프로토콜에 여러 개의 개별 재보정 지점을 삽입하는 것이 일반적입니다. 말 골격근을 사용한 과거 데이터는 분석의 일반적인 반응성이 첫 번째 보정 지점(샘플 추가 전)에서 약 0.646V/mM의 H2O2이며 분석 기간 동안 8%-15% 감소할 수 있음을 나타냅니다. 따라서 ROS 생성의 상대적으로 작은 변화를 감지하기 위해서는 AmR 분석의 빈번한 재보정이 필요하며, 프로토콜 내의 포인트 보정 시기는 각 적정 프로토콜에 대해 결정되어야 합니다.
조사자는 다음 적정 단계로 이동할 시기를 결정할 때 분석 수행 전반에 걸쳐 신중한 판단을 내려야 합니다. 이상적으로, 실시간으로 생성되는 관련 신호(O2 플럭스, TMRM의 형광, MgG 및 레소루핀 형광 신호의 변화율)는 안정적이어야 하며, 챔버 내에서 정상 상태를 나타내야 하지만, 무엇이 허용 가능한 안정성을 구성하는지에 대한 조사자 측의 판단 요청입니다. 현재로서는 이 결정에 대한 널리 알려진 기준이 없습니다. 그러나 조사관은 정상 상태가 확립될 때까지 충분히 오래 기다리지 않고(의도한 호흡 상태를 불완전하게 특성화하는 데이터가 생성됨) 기질이 고갈되어 분석이 더 이상 신뢰할 수 없을 정도로 오래 기다리는 위험을 예리하게 인식해야 합니다. 저자의 경험에 비추어 볼 때, 기질 적정 후 30분 이내에 안정적인 신호를 얻지 못하는 것은 샘플(또는 기계)이 비생물학적 방식으로 작동하고 있다는 증거이며, 분석은 폐기되어야 합니다.
미토콘드리아 생리학을 정량화하기 위해 이 접근법을 사용한 결과는 30%-40%의 일반적인 변동 계수(CV)로 상당한 피험자 간 변동성을 보여줍니다. 대조적으로, 투과화된 말 골격근 섬유의 분석은 19%-20%11의 CV를 산출하며, 이는 미토콘드리아를 분리하는 과정이 현저한 피험자 간 가변성 외에도 후속 분석에 상당한 가변성을 부과함을 시사합니다. 후자의 영향은 가능하면 피험자를 자신의 대조군으로 사용하여 완화할 수 있지만 전자는 격리 기술에 세심한 주의를 기울여야만 최소화할 수 있습니다. 실험 설계가 단일 생검의 실험적 복제를 허용하지 않는 경우 조사자는 다른 샘플에서 미토콘드리아 함량의 차이를 반영하는 보정 인자와 관련하여 호흡 측정 데이터를 표현하도록 선택할 수 있습니다. 가장 일반적인 보정 인자는 시료의 단백질 함량과 구연산염 합성효소 활성입니다. 그러나, 이 분야에서 활동하는 과학자들의 최근 합의 성명서에 요약된 바와 같이, 이러한 조정을 수행하는 데 있어 보편적으로 합의된 단일 방법은 없다18. 단백질 함량 및/또는 구연산염 합성효소 활성에 대한 교정은 말 골격근 조직에 사용되는 가장 일반적인 두 가지 접근법이지만(12,13), 둘 다 단점이 있다. 미토콘드리아 기능을 해석하기 위해 내부(즉, 플럭스 제어 비율) 및 외부(단백질, 효소 활성, 기타 미토콘드리아 마커)를 통해 데이터를 표현하는 것이 다른 실험 설계에서 필요할 수 있습니다.
설명된 프로토콜은 몇 가지 중요한 차이점이 있는 투과화된 근육 섬유의 사용을 기반으로 합니다. 투과화 섬유 분석은 말 골격근 투과화 섬유의 고해상도 호흡 측정 법이 일반적으로 각 챔버 6,7,8,9,10,11에서 샘플 질량의 ~2mg으로 수행되기 때문에 더 작은 생검을 필요로 합니다. 대조적으로, 여기에 설명된 프로토콜은 각 챔버에서 거의 10배에 해당하는 섬유 질량을 갖습니다. 이 차이는 신선한 조직으로부터 미토콘드리아를 분리하는 것의 비효율성을 강조합니다. 이러한 비효율성의 가능한 이유는 수축성 단백질 네트워크 내에 위치한 골격근 미토콘드리아를 회복하는 데 어려움이 있기 때문입니다. 이 프로토콜에 사용된 미토콘드리아 분리를 위한 상용 키트에는 프로테아제 치료와 수축성 섬유를 분해하는 데 도움이 되는 이온 매질의 사용이 포함되지만 근섬유 간 미토콘드리아의 상당 부분이 회복되지 않을 가능성이 있습니다. 프로토콜의 이러한 특징은 필요한 생검 물질의 양을 결정하는 것뿐만 아니라 결과 해석과도 관련이 있습니다. 분리된 미토콘드리아는 투과화된 섬유에 비해 확산 제한으로 인해 산소 의존성에 덜 민감하다(15); 따라서, 분리된 미토콘드리아에는 과산소증이 필요하지 않으며, 호흡 매체는 단순히 챔버를 실내 공기에 개방함으로써 충분히 산소화(및 분석 중에 재산소화)될 수 있습니다. 산소 전달의 이러한 양태는H2O2및 다른 ROS의 생산을 측정할 때 특히 유용한데, 이는 ROS 생산이 고산소 인큐베이션 동안 비생리학적 방식으로 증가하기 때문이다19. 마지막으로, 분리된 미토콘드리아의 사용은 투과화된 근육 섬유를 가진 형광단의 사용에 비해 형광단의 비특이적 단백질 결합이 감소하기 때문에 보다 안정적이고 재현 가능한 형광 신호를 제공합니다. 각 샘플 준비에는 장점과 단점이 있으며, 투과화된 섬유와 분리된 미토콘드리아에 대한 숙련도는 연구자에게 미토콘드리아 생리학과 관련된 다양한 질문을 해결하기 위한 강력한 분석 세트를 제공합니다.
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Disclosures
저자는 이 원고와 관련된 이해 상충이 없습니다.
Acknowledgments
저자는 John and Debbie Oxley Endowed Chair for Equine Sports Medicine과 Grayson Jockey Club Research Foundation의 아낌없는 지원에 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ADP | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | A5285 | |
| Amplex UltraRed | Life Technologies | A36006 | |
| ATP | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | A2383 | |
| BSA | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | A6003 | |
| Calcium carbonate | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | C4830 | |
| CCCP | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | C2759 | |
| DatLab 7.0 | Oroboros Inc | Software to operate O2K fluororespirometer | |
| Dithiothreitol | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | D0632 | |
| DTPA | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | D1133 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | E4378 | |
| Glutamate | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | G1626 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | H7523 | |
| Horseradish peroxidase | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | P8250 | |
| Hydrogen peroxide | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | 516813 | Must be made fresh daily prior to assay |
| Imidazole | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | I2399 | |
| K-MES | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | M8250 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | M9272 | |
| Magnesium Green | Thermo Fisher Scientific | M3733 | |
| Malate | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | M1000 | |
| Mannitol | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | M9647 | |
| Mitochondrial isolation kit | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | MITOISO1 | |
| O2K fluororespirometer | Oroboros Inc | Multiple units required to run full spectrum of assays concurrently. | |
| Phosphocreatine | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | P7936 | |
| Potassium hydroxide | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | P1767 | |
| Potassium lactobionate | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | L2398 | |
| Potassium phosphate | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | P0662 | |
| Pyruvate | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | P2256 | Must be made fresh daily prior to assay |
| Rotenone | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | R8875 | |
| Succinate | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | S2378 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | 84097 | |
| Superoxide dismutase | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | S8160 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | T0625 | |
| Titration pump | Oroboros Inc | ||
| Titration syringes | Oroboros Inc | ||
| TMRM | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | T5428 | |
| UCH biopsy needle | Millenium Surgical Corp | 72-238067 | Available in a range of sizes |
References
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