Summary
Hester har en eksepsjonell aerob treningskapasitet, noe som gjør hesteskjelettmuskulatur til et viktig vev for både studiet av hestetreningsfysiologi og pattedyrs mitokondriefysiologi. Denne artikkelen beskriver teknikker for omfattende vurdering av mitokondriefunksjon i skjelettmuskulatur hos hest.
Abstract
Mitokondriell funksjon - oksidativ fosforylering og generering av reaktive oksygenarter - er kritisk i både helse og sykdom. Dermed er måling av mitokondriell funksjon grunnleggende i biomedisinsk forskning. Skjelettmuskulatur er en robust kilde til mitokondrier, spesielt hos dyr med svært høy aerob kapasitet, som hester, noe som gjør dem ideelle for å studere mitokondriell fysiologi. Denne artikkelen demonstrerer bruken av høyoppløselig respirometri med samtidig fluorometri, med nyhøstet skjelettmuskulaturmitokondrier, for å kvantifisere kapasiteten til å oksidere substrater under forskjellige mitokondrielle tilstander og bestemme den relative kapasiteten til forskjellige elementer av mitokondriell respirasjon. Tetrametylrhodaminmetylester brukes til å demonstrere produksjonen av mitokondriemembranpotensial som følge av substratoksidasjon, inkludert beregning av mitokondrienes relative effektivitet ved å beregne det relative membranpotensialet som genereres per enhet samtidig oksygenfluks. Omdannelsen av ADP til ATP resulterer i en endring i konsentrasjonen av magnesium i reaksjonskammeret, på grunn av forskjellige affiniteter av adenylatene for magnesium. Derfor kan magnesiumgrønn brukes til å måle hastigheten på ATP-syntese, noe som tillater videre beregning av oksidativ fosforyleringseffektivitet (forholdet mellom fosforylering og oksidasjon [P / O]). Endelig tillater bruken av Amplex UltraRed, som produserer et fluorescerende produkt (resorufin) i kombinasjon med hydrogenperoksid, kvantifisering av reaktiv oksygenartsproduksjon under mitokondriell respirasjon, samt forholdet mellom ROS-produksjon og samtidig respirasjon. Disse teknikkene tillater robust kvantifisering av mitokondriell fysiologi under en rekke forskjellige simulerte forhold, og kaster dermed lys over bidraget fra denne kritiske cellulære komponenten til både helse og sykdom.
Introduction
Mitokondriene av eukaryote celler produserer flertallet av ATP som brukes av cellene til arbeid og vedlikehold1. Et sentralt trinn i mitokondrieproduksjonen av ATP er omdannelsen av oksygen til vann, og dermed blir den metabolske kapasiteten til mitokondrier og de tilknyttede cellene ofte kvantifisert gjennom måling av oksygenforbruk2. Mitokondriefysiologi er imidlertid mer kompleks enn den enkle prosessen med oksygenforbruk, og avhengighet av dette endepunktet gir utelukkende en ufullstendig vurdering av virkningen av mitokondriell funksjon og dysfunksjon på cellulær helse. Full karakterisering av mitokondriell funksjon krever vurdering av ikke bare oksygenforbruk, men også produksjon av ATP samt reaktive oksygenarter (ROS).
Ytterligere målinger av viktige mitokondrielle funksjoner kan oppnås samtidig med måling av respirasjon ved bruk av spesifikke fluoroforer. Tetrametylrhodaminmetylester (TMRM) er en kationisk fluorofor som akkumuleres i mitokondriematrisen i forhold til mitokondriell transmembranspenningspotensial, noe som resulterer i en reduksjon i fluorescerende intensitet på grunn av denne akkumuleringen3. TMRM kan brukes som en indikator på relative endringer i mitokondriemembranpotensial, eller kan brukes til å kvantifisere presise endringer i transmembranspenning med ytterligere eksperimenter for å bestemme konstanter som tillater konvertering av det fluorescerende signalet til mV. Magnesiumgrønn (MgG) er en fluorofor som fluoresces når den er bundet med Mg2+, og brukes til målinger av ATP-syntese basert på differensialaffiniteten til ADP og ATP for magnesiumdivalent kation4. Etterforskere må bestemme de spesifikke affinitets- / dissosiasjonskonstantene (Kd) for både ADP og ATP under spesifikke analytiske forhold for å konvertere endringene i MgG-fluorescens til en endring i ATP-konsentrasjon. Amplex UltraRed (AmR) er fluoroforen som brukes til å måle produksjonen av hydrogenperoksid og annen ROS under mitokondriell respirasjon5. Reaksjonen mellomH2O2og AmR (som katalyseres av pepperrotperoksidase) produserer resorufin, som kan påvises gjennom fluorescens ved 530 nM. Hver av disse analysene kan legges individuelt til analyser av sanntids mitokondriell respirasjon, for å gi samtidige målinger av de respektive aspektene av mitokondriell fysiologi, og dermed gi en direkte sammenheng mellom respirasjon og mitokondriell utgang.
Hester er i stand til svært høye nivåer av massespesifikt oksygenforbruk, delvis på grunn av det svært høye mitokondrielle innholdet i hestens skjelettmuskulatur, noe som gjør dette vevet svært relevant for å studere mitokondriell fysiologi. Med utviklingen av høyoppløselig respirometri har studier ved hjelp av denne nye teknologien bidratt til å definere bidragene fra hesteskjelettmuskulaturmitokondrier til både hestens bemerkelsesverdige treningskapasitet og patofysiologien til skjelettmuskelsykdommer 6,7,8,9,10,11,12,13,14 . Studier av hesteskjelettmuskulaturens mitokondriefunksjon er spesielt fordelaktige, da det å skaffe store mengder av dette vevet ikke er terminalt. Dermed kan hestefag ikke bare gi tilstrekkelig vev for fullstendig karakterisering av mitokondriell funksjon, men også tjene som langsgående kontroller for høykvalitets, mekanistiske studier i mitokondriell fysiologi. Av denne grunn er det utviklet ytterligere analyser for å kvantifisere mitokondriemembranpotensial, ATP-syntese og produksjon av ROS som utfyller måling av oksygenforbruk i dette vevet, for å gi en mer robust karakterisering av mitokondriefysiologi i hesteskjelettmuskulatur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne studien ble godkjent av Oklahoma State University Institutional Animal Care and Use Committee. Fire fullblodsvallaker (17,5 ± 1,3 år, 593 ± 45 kg) ble brukt i denne studien for å generere de representative resultatene.
1. Innhenting av skjelettmuskulaturbiopsiprøve
- Hent skjelettmuskelbiopsier (følg steril teknikk) fra midten av semitendinosusmuskelen (eller annen muskel av interesse), ved hjelp av en 12 G University College Hospital (UCH) biopsinål (se materialfortegnelse) under lett sedasjon, og bruk lokalbedøvelse etter en tidligere publisert rapport11.
- Biopsiprøvene overføres umiddelbart til hetteglass med iskald biopsi transportmedieoppløsning (2,77 mM CaK 2-EGTA, 7,23 mM K 2-EGTA, 20 mM imidazol, 20 mM taurin, 50 mM K-MES, 0,5 mM dithiothreitol, 6,56 mM MgCl 2, 5,77 mM ATP og 15 mM fosfokreatin, justert til pH 7,1; se materialfortegnelse). Transport til laboratoriet for analyse.
MERK: Se Doerrier et al.15 for spesifikke instruksjoner om fremstilling av biopsitransportmediet. - Isoler mitokondrier fra biopsiprøvene ved hjelp av et kommersielt sett, i henhold til produsentens instruksjoner (se materialfortegnelse). Den endelige lagringsbufferen skal ikke inneholde substrater som ADP, ATP og succinat, som er en del av respirometrianalysen.
- Resuspender den endelige pelleten av de isolerte mitokondriene ved bruk av 80 mikrol suspensjonsmedier (225 mM mannitol, 75 mM sukrose og 1 mM EGTA; se materialtabell) per 100 mg muskel brukt til mitokondrieisolering.
- Minimer intervallet fra tidspunktet for biopsiprosedyren til isolering av mitokondrier, og hold prøvene ved 0-4 °C gjennom hele behandlingstrinnene til de tilsettes høyoppløselige respirometre.
MERK: Foreløpige studier har funnet at suspensjoner av isolerte mitokondrier begynner å miste funksjonsevne etter ca. 2 timer når de opprettholdes ved 0-4 °C.
2. Oppsett av høyoppløselig respirometer
- Respirometre med høy oppløsning brukes til å kvantifisere mitokondriell respirasjon og tilhørende prosesser. Bruk programvarekontrollprogrammet fra produsenten (se Materialfortegnelse) til å styre respirometeret, kalibrere sensorene og samle inn rådata. Analyser prøvene i duplikat for hver testbetingelse.
MERK: I alle tilfeller er anbefalte titreringer og endelige reagenskonsentrasjoner beskrevet i denne protokollen basert på et 2 ml respirometrikammer. - Bestem bakgrunnen O 2-fluks og nullpunktet til O 2-sensoren hver2-4 uke gjennom seriell titrering av dithionite, i henhold til produsentens instruksjoner. Behold disse kalibreringskonstantene for påfølgende analyser til kalibreringen gjentas.
MERK: I motsetning til tidligere publiserte prosedyrer ved bruk av permeabiliserte muskelfibre11,12,13,16, hvor hyperoksi (250-500 μM) er nødvendig for å unngå diffusjonsbegrensning av O2 til mitokondriene, kan isolerte mitokondrier evalueres ved bruk av et område på 50-200 μM O2. Dette kan oppnås ganske enkelt ved å la respirasjonsmediet balansere med romluft før mitokondriesuspensjonen tilsettes (dvs. etter daglig enkeltpunktskalibrering). På samme måte kan reoksygenering av respirasjonskammeret oppnås ved ganske enkelt å åpne kammeret til tilstrekkelig omgivende oksygen er oppløst i respirometrimediet for å øke oksygenkonsentrasjonen til ønsket nivå. - Fyll respirometerkamrene med magnesiumfrie medier (0,5 mM EGTA, 60 mM K-laktobionat, 20 mM taurin, 10 mM KH2PO4, 20 mM HEPES, 110 mM sukrose og 1 g / l bovint serumalbumin [BSA] hovedsakelig fettsyrefritt, justert til pH 7,1; se materialfortegnelse).
MERK: Se Komlodi et al.17 for spesifikke instruksjoner om klargjøring av respirasjonsmediet.- Sett instrumentets inkubasjonstemperatur til 38 °C for å representere basaltemperaturen i hestens skjelettmuskulatur, og sett blandingen av respirasjonsmediet til 800 o / min ved hjelp av en magnetomrører som dreier i bunnen av respirometerkammeret.
- Slå av kammerbelysningen for å unngå interferens med fluorescerende sensorer.
- Aktiver oksygenelektroden med en 800 mV polarisasjonsspenning, og forsterk det resulterende signalet med en forsterkningsinnstilling på 1.
- Registrer oksygenkonsentrasjonen hver 2. s, beregn oksygenfluksen som den negative helningen til oksygenmålingen i løpet av de foregående 40 s (20 datapunkter), og rapporter som pmol x s-1 x ml inkubasjonsløsning.
- Kalibrer oksygensensoren ved å la mediet balansere med romluft. Beregn referanseoksygenpartialtrykket, basert på barometertrykk målt med høyoppløselig respirometer og standard atmosfærisk oksygenkonsentrasjon.
3. Måling av mitokondriemembranpotensial ved bruk av TMRM
- Bruk "grønne" fluorescerende sensorer (530 nm dominerende bølgelengde) for å kvantifisere det fluorescerende signalet fra respirasjonskammeret. Aktiver sensorene ved 400-500 mV; Det resulterende signalet blir forsterket med en forsterkning på 1: 1,000.
MERK: Spesifikke innstillinger må optimaliseres for individuelle instrumenter for å fange opp det forventede signalet innenfor sensorens lineære område. - Tilsett TMRM (4 μL 1 mM oppløsning for en endelig konsentrasjon på 2 μM; se materialfortegnelse) før tilsetning av mitokondrier.
- Kalibrer det fluorescerende signalet ved hjelp av en enkel topunktskalibrering av fluorescerende signal (spenning) versus mengden tilsatt fluorofor (mM), før tilsetning av mitokondriene.
MERK: Bruk den fluorescerende signalkalibreringsfunksjonen i maskinstyringsprogramvaren til å kalibrere dette signalet. Råsignalet fra den fluorescerende sonden kan kreve 30 minutter eller mer å stabilisere for å registrere det andre punktet i kalibreringen. - Utfør den endelige kalibreringen av TMRM-signalet etter fullføring av respirometrititreringsprotokollen ved å levere flere titreringer av frakoblingsmiddel (karbonylcyanid m-klorfenylhydrazon; 2 μL per titrering) til det ikke observeres ytterligere økninger i TMRM-fluorescerende signal, noe som indikerer fullstendig kollaps av mitokondriemembranpotensialet (figur 1).
MERK: Denne fluorescerende signalverdien anses å være lik 0 mV transmembranpotensial, og brukes som referansepunkt for relative membranpotensialverdier registrert under respirometrititreringsprotokollen.
4. Måling av ATP-produksjon ved bruk av magnesiumgrønn (MgG)
- Bruk "blå" fluorescerende sensorer (465 nm dominerende bølgelengde) for å kvantifisere det fluorescerende signalet fra respirasjonskammeret. Aktiver disse sensorene for individuelle instrumenter for å fange det forventede signalet innenfor sensorens lineære område.
- Utfør kjemisk oppsett og kalibrering av MgG-fluorescerende signal etter tilsetning av mitokondriene, men før tilsetning av eventuelle underlag. Tilsett 8 μL 2 mM etylendiamintetraeddiksyre (EDTA) til respirometrikammeret for å chelate kationer (spesielt Ca 2+) som vil konkurrere med Mg2+ for binding til MgG, og tilsett deretter 4 μL av 1 mM MgG (1,1 μM) til respirasjonskammeret.
- Kalibrer råfluorescenssignalet med 10 x 2 μL sekvensielle titreringer på 100 mM MgCl 2, slik at det kan gå 1 minutt mellom titreringene for stabilisering av det fluorescerende signalet (figur 2).
MERK: Denne prosessen, som fullføres offline etter fullføring av analysen og ved hjelp av maler levert av produsenten av maskinen og tilhørende programvare, produserer en andreordens kurve for magnesiumkonsentrasjon til fluorescerende signal (forventet r2 > 0,98), som vil bli brukt med en kjent mengde ADP tilsatt til respirometrikammeret og de tidligere bestemteK-d-verdiene for å bestemme den tilsvarende konsentrasjonen av ATP11. - Bestem frekvensen av ATP-syntese, som er hellingen av konsentrasjonen av ATP over tid gjennom hele protokollen (figur 3).
5. Måling av mitokondriell produksjon av ROS ved bruk av Amplex UltraRed (AmR)
- Bruk "grønne" fluorescerende sensorer (530 nm dominerende bølgelengde) for å kvantifisere det fluorescerende signalet fra respirasjonskammeret. Aktiver sensorene ved 300-400 mV; Det resulterende signalet blir forsterket med en forsterkning på 1: 1,000. Optimaliser spesifikke innstillinger for individuelle instrumenter for å fange det forventede signalet innenfor sensorens lineære område.
MERK: Hvis du bruker respirasjonsmedier uten MgCl 2, bør dette tilsettes (20-60 μL på 100 mM MgCl 2 for å produsere 1-3 μM MgCl2) før tilsetning av reagenser for AmR-analysen. - Utfør kjemisk oppsett og innledende kalibrering av AmR-analysen før tilsetning av mitokondriene. Tilsett 30 μmol DTPA (6 μL 5 mM løsning) til chelatkationer som kan forstyrre reaksjonen, og tilsett deretter superoksiddismutase (2 μL av en 5000 U/ml stamløsning for å omdanne superoksidanioner tilH2O2for en mer omfattende påvisning av reaktiv oksygengenerering), pepperrotperoksidase (5 μL av en 500 U/ml stamløsning), og Amplex UltraRed (2 μL av en 10 mM stamløsning) (se materialfortegnelse) for å produsere henholdsvis 5 U/ml, 1 U/ml og 10 μM i respirometrikammeret.
- La det fluorescerende signalet stabilisere seg, og tilsett deretter 0,2 μmol hydrogenperoksid (5 μL av en 40 μM-løsning som gjøres fersk daglig) to ganger, med ca. 5 minutters mellomrom.
MERK: Det fluorescerende signalet før og etter de to titreringene av H 2 O 2 gir en trepunkts lineær kalibreringskurve for systemet (forventet r 2 > 0,95), hvis helling gjenspeiler systemets generelle respons ved rapportering av forholdet mellom fluorescerende signal og produksjon (eller tillegg) av H 2 O 2. Bruk den fluorescerende signalkalibreringsfunksjonen i maskinstyringsprogramvaren til å kalibrere dette signalet. - Utfør ytterligere topunktskalibreringer (5 μL av en 40 μM-løsning som gjøres fersk daglig) gjennom hele analysen, for å tillate justering av responsen til analysen ettersom kjemien til respirometrien endres gjennom analysen, med den spesifikke timingen av disse kalibreringspunktene etter utprøverens skjønn (figur 4).
6. Måling av mitokondriell respirasjon
- Legg til 15 μL isolert mitokondriesuspensjon (trinn 1,4) til hvert 2 ml inkubasjonskammer, slik at resultatene representerer mitokondrieutbyttet på 18,75 mg muskel. Forsegl inkubasjonskammeret. Virvel prøven mellom hver titrering for å opprettholde en jevn suspensjon av prøven.
- Mål gjenværende oksygenforbruk (ROX) før tilsetning av eventuelle substrater. Trekk denne verdien (vanligvis mindre enn 0,2 pmolO2 x s-1 x ml-1) fra oksygenforbruksverdiene for hvert trinn i protokollen substrat/uncoupler/inhibitor titration (SUIT)11 etter at protokollen er fullført.
MERK: Det er avgjørende at signalene fra både oksygensensoren og fluorescenssensoren får stabilisere seg i minst 1 min (vurdert av den stabile beregnede hellingen til de primære sensorsignalene), ettersom den generelle respirasjonstilstanden endres av titreringene for å oppnå pålitelige resultater. Dette gjelder alle titreringstrinn. - Bruk en generell SUIT som muliggjør den første karakteriseringen av hestens skjelettmuskel mitokondriefunksjon. Start med sekvensielle titreringer av pyruvat (5 μL av 2 M vandig løsning), glutamat (10 μL av 2 M vandig løsning) og malat (10 μL 0,4 M vandig løsning) (se materialfortegnelse) i hvert kammer for å produsere nikotinamid-adenindinukleotid (NADH) og stimulere ikke-fosforylerende (lekkasje) respirasjon støttet av NADH oksidert gjennom kompleks I (LN) (figur 1, figur 3 og figur 4).
- Tilsett ADP (20 μL 500 mM vandig løsning; se materialfortegnelse) for å stimulere fosforylerende respirasjon gjennom kompleks I (PN).
- Tilsett succinat (20 μL av 1 M vandig løsning; se materialtabell) for å produsere fosforylerende respirasjon gjennom kombinasjonen av kompleks I og kompleks II (PN + S).
MERK: Med kombinasjonen av respirasjon gjennom både kompleks I og kompleks II, kan oksygenforbruket være høyt nok til å forbruke mesteparten av oksygenet oppløst i inkubasjonsmediet. Hvis O2-konsentrasjonen synker under 50 μM, reoksygenerer inkubasjonsmediet ved å forsegle inkubasjonskammeret til den målte O2-konsentrasjonen har økt over 150 μM. Gjenta dette trinnet etter behov for å opprettholde tilstrekkeligO2 for mitokondriell respirasjon. - Tilsett rotenon (2 μL med 0,1 mM etanoloppløsning; se materialfortegnelse) for å blokkere kompleks I. Den resulterende oksygenfluksen representerer kapasiteten til kompleks II til å støtte mitokondrielt oksygenforbruk via oksidasjon av succinat alene (PS).
FORSIKTIG: Rotenon er et giftig stoff. Bruk standard laboratoriesikkerhet og unngå inntak eller innånding. - Beregn middelverdien for en gitt eksperimentell tilstand på tvers av individuelle respirometrikamre som inneholder alikoter av en enkelt biopsi.
MERK: Avledede beregninger, for eksempel flukskontrollforhold (FCR), er verdifulle for å identifisere relative endringer i forskjellige veier, og inkluderer FCR-lekkasje (L N / P N), FCR N (P N / P N + S) og FCR S (P S / PN + S). Beregnet oksidativ fosforyleringseffektivitet (1-LN/PN+S) gir et estimat av den totale effekten av lekkasjerespirasjon justert for total respirasjonskapasitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den foreslåtte referansetilstanden er den for en sunn stillesittende fullblods (ingen økt kondisjon på grunn av obligatorisk trening) og en fersk muskelprøve samlet fra midten av en postural muskel, som inneholder en høy prosentandel av mitokondrierrike type I skjelettmuskelfibre og inkuberes under forhold som tilnærmer hvilemetabolisme (dvs. 38 ° C og pH 7,0). Under disse forholdene kan etterforskeren forvente L-N-verdier på 2,71 ± 0,90, P N-verdier på 62,40 ± 26,22, PN + S-verdier på 93,67 ± 34,76 og PS-verdier på 46,93 ± 14,58 pmolO2 x s-1 xmL-1 (figur 3 og figur 4). Respirasjonsverdiene for mitokondrier inkubert med TMRM er lavere på grunn av en hemmende effekt av fluoroforen (figur 1). FCR-lekkasje, FCRN og FCRS er henholdsvis 0,05 ± 0,01, 0,66 ± 0,07 og 0,51 ± 0,07. Den beregnede oksidative fosforyleringseffektiviteten er 0,97 ± 0,01. De absolutte verdiene for disse respiratoriske tilstandene varierer på grunn av det enkelte subjekt og vevets oksidative kapasitet, men det relative mønsteret av disse verdiene er konsistent med publiserte resultater fra permeabiliserte hesteskjelettmuskelfibre (dvs. økning i respirasjon med tilsetning av spesifikke substrater, kombinasjonen av respirasjon gjennom kompleks I og kompleks II er mindre enn hver av disse elektronkildene individuelt på grunn av metning av elektronoverføringssystemet [ETS] nedstrøms kapasitet). Den beregnede effektiviteten av isolerte hesteskjelettmuskelmitokondrier er i samsvar med tilsvarende verdier rapportert for permeabiliserte skjelettmuskelfibre fra hesteskjelett11.
ATP-syntesehastigheten forventes å være 438,59 ± 397,10 pM x s-1 for P N respirasjon, 383,18 ± 397,19 for PN + S respirasjon og 172,07 ± 125,60 for PS respirasjon, per mg kildevev som brukes til å isolere mitokondrier. Nedgangen i ATP-syntese med tilsetning av succinat skyldes sannsynligvis konkurranse ved kinonkrysset av ETS av de to elektronstrømmene, med fôret fra kompleks II (som ikke bidrar direkte til mitokondriemembranpotensialet) som reduserer strømmen av elektroner gjennom kompleks I (som direkte bidrar til mitokondriemembranpotensialet gjennom pumping av protoner over den indre mitokondriemembranen).
Produksjonshastigheten for H 2O2 forventes å være 0,079 ± 0,095 nmol.s-1 for L N respirasjon, 0,021 ± 0,043 for P N respirasjon, 0,026 ± 0,056 for P N + S respirasjon og 0,237 ± 0,248 for P S respirasjon, per mg kildevev som brukes til å isolere mitokondrier (figur 4). Den relative produksjonshastigheten til ROS er konsistent med den forventede størrelsen på mitokondriemembranpotensialet og sammenhengen mellom høyt membranpotensial og ROS-produksjon. Unntaket til dette forholdet er den svært høye ROS-produksjonen når respirasjon skjer gjennom kompleks II alene, på grunn av bakoverstrømmen av elektroner fra kinonkrysset til kompleks I når det er blokkert av rotenon.
Figur 1: Representativt høyoppløselig respirometrispor av hesteskjelettmuskulatur, mitokondriell respirasjon og relativt membranpotensial. Det øverste vinduet er kammerets oksygenkonsentrasjon (venstre Y-akse) og oksygenfluks (høyre Y-akse) over tid (X-aksen); det nederste vinduet er TMRM-fluorescens (venstre Y-akse) og hastighet på fluorescenssignalendring (høyre Y-akse) over tid (X-akse). Vertikale merker indikerer tilsetning av spesifikke underlag til kammeret (mt: mitokondrier suspensjon; P: pyruvat; G: glutamat; M: malat; D: ADP; S: succinate; R: rotenon; CCCP: Karbonylcyanid m-klorfenylhydrazon). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Representativt høyoppløselig respirometrispor av kalibrering av kammerfluorescenssignal for magnesiumgrønn og bestemmelse av Kd for magnesium og adenylater. Kammer MgG-fluorescens (venstre Y-akse) og hastighet av fluorescenssignalendring (høyre Y-akse) over tid (X-akse). De første vertikale merkene indikerer tilsetning av spesifikke substrater til kammeret (MgG: Magnesiumgrønn; mt: mitokondrier suspensjon; P: pyruvat; G: glutamat; M: malat; S: succinate; EDTA: etylendiamintetraeddiksyre). Dette etterfølges av seriell titrering av MgCl2 ved hjelp av en automatisert titreringspumpe (TIP) som øker det fluorescerende signalet, deretter seriell titrering av et adenylatat (i dette tilfellet ATP) som reduserer det fluorescerende signalet. Titreringen av MgCl2 brukes også i begynnelsen av hver analyse for å kalibrere MgG-signalet, men utføres før tilsetning av mitokondrier og respirometrisubstrater som P, G, M og S. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Representativt høyoppløselig respirometrispor av hesteskjelettmuskulatur, mitokondriell respirasjon og ATP-syntese. Det øverste vinduet er kammerets oksygenkonsentrasjon (venstre Y-akse) og oksygenfluks (høyre Y-akse) over tid (X-aksen); det nederste vinduet er kammer MgG-fluorescens (venstre Y-akse) og hastighet av fluorescenssignalendring (høyre Y-akse) over tid (X-akse). Vertikale merker indikerer tilsetning av spesifikke underlag til kammeret (mt: mitokondrier suspensjon; P: pyruvat; G: glutamat; M: malat; D: ADP; S: succinate; R: rotenon). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Representativt høyoppløselig respirometrispor av hesteskjelettmuskulatur, mitokondriell respirasjon og produksjon av H 2 O2. Det øverste vinduet er kammerets oksygenkonsentrasjon (venstre Y-akse) og oksygenfluks (høyre Y-akse) over tid (X-aksen); det nederste vinduet er kammerresorufinfluorescens (venstre Y-akse) og hastighet av fluorescenssignalendring (høyre Y-akse) over tid (X-akse). Vertikale merker indikerer tilsetning av spesifikke underlag til kammeret (mt: mitokondrier suspensjon; P: pyruvat; G: glutamat; M: malat; D: ADP; S: succinate; R: rotenon). Også inkludert er tre intra-analyse topunktskalibreringer av fluorescerende signal ved bruk av H 2O2. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tilsetningen av fluorescerende signaler til standardutgangen til det høyoppløselige respirometeret gir verdifull informasjon om mitokondriell fysiologi, men omhyggelig kalibrering av det fluorescerende signalet er avgjørende for kvalitetsdata. De opprinnelige protokollene for bruk av MgG antyder at kalibreringskurvene generert under beregning av magnesium-adenylatdissosiasjonskonstanter kan brukes på etterfølgende analyser4; Det fluorescerende signalet fra MgG kan imidlertid ikke være tilstrekkelig reproduserbart fra analysen til analysen for denne tilnærmingen. Derfor kalibreres hver analyse med en automatisert MgCl 2-titrering, og den resulterende kalibreringskurven for beregning av ATP-syntese for den individuelle analysen. Videre må Kd (dissosiasjonskonstanter) for magnesium og både ADP og ATP beregnes for de spesifikke forholdene i analysen, inkludert det spesifikke vevet, inkubasjonsbetingelsene og substratene som produserer fosforylerende respirasjon, for å sikre at derivasjonen av ATP-syntesehastigheten er nøyaktig. Variasjonen i AmR-analysen er mer allment anerkjent15,17, og det er vanlig å sette inn flere diskrete rekalibreringspunkter i protokollen etter utprøvers skjønn under protokollen. Historiske data ved bruk av skjelettmuskulatur hos hester indikerer at analysens typiske respons er ca. 0,646 V/mMH2O2ved første kalibreringspunkt (før prøven tilføyes), og kan reduseres med 8%-15% i løpet av analysen. Hyppig rekalibrering av AmR-analysen er derfor nødvendig for påvisning av relativt små endringer i produksjonen av ROS, og tidspunktet for punktkalibreringene i protokollen bør bestemmes for hver titreringsprotokoll.
Etterforskere må bruke nøye skjønn gjennom hele analysen når de skal bestemme når de skal gå videre til neste titreringstrinn. Ideelt sett bør de relevante signalene som genereres i sanntid (O2-fluks , fluorescens av TMRM og endringshastigheten i MgG og resorufinfluorescerende signal) være stabile, noe som indikerer en stabil tilstand i kammeret, men det er en vurdering fra etterforskerens side om hva som utgjør akseptabel stabilitet. På dette tidspunktet er det ingen utbredt standard for denne avgjørelsen; Etterforskerne må imidlertid være akutt oppmerksomme på risikoen ved at både de ikke venter lenge nok til at en stabil tilstand kan etableres (noe som resulterer i data som ufullstendig karakteriserer den tiltenkte respiratoriske tilstanden) og venter så lenge at substratene blir utarmet, og analysen ikke lenger er pålitelig. Etter forfatterens erfaring er det å ikke oppnå et stabilt signal innen 30 minutter etter en substrattitrering bevis på en prøve (eller maskin) som oppfører seg på en ikke-biologisk måte, og analysen må kasseres.
Resultatene som bruker denne tilnærmingen til å kvantifisere mitokondriell fysiologi viser betydelig interindividuell variabilitet, med en typisk variasjonskoeffisient (CV) på 30% -40%. I motsetning til dette resulterer analyse av permeabiliserte hesteskjelettmuskelfibre i en CV på 19% -20%11, noe som tyder på at prosessen med å isolere mitokondrier pålegger betydelig variabilitet for den etterfølgende analysen i tillegg til den markerte intersubject variabiliteten. Selv om effekten av sistnevnte kan reduseres ved å bruke som egne kontroller når det er mulig, kan førstnevnte bare minimeres gjennom nøye oppmerksomhet til isolasjonsteknikken. Hvis eksperimentell design ikke tillater eksperimentelle replikater fra en enkelt biopsi, kan etterforskeren velge å uttrykke respirometridataene i forhold til en korreksjonsfaktor som gjenspeiler forskjeller i mitokondrielt innhold i forskjellige prøver. De vanligste korreksjonsfaktorene er prøveproteininnholdet og citratsyntaseaktiviteten til prøven. Imidlertid, som skissert i en nylig konsensuserklæring fra forskere som er aktive på dette feltet, er det ingen enkelt metode for å utføre denne justeringen som det er universelt enighet om18. Korrigering for proteininnhold og/eller citratsyntaseaktivitet er de to vanligste tilnærmingene som brukes til skjelettmuskelvev hos hester12,13, men begge har sine mangler. Det kan være nødvendig for forskjellige eksperimentelle design å uttrykke data gjennom både interne (dvs. flukskontrollforhold) og eksterne (protein, enzymaktivitet, andre mitokondrielle markører) for å tolke mitokondriell funksjon.
Den beskrevne protokollen bygger på bruk av permeabiliserte muskelfibre, med flere viktige forskjeller. Permeabiliserte fiberanalyser krever mindre biopsier, da høyoppløselig respirometri av permeabiliserte fibre fra hesteskjelettmuskulatur vanligvis utføres med bare ~ 2 mg prøvemasse i hvert kammer 6,7,8,9,10,11. I kontrast har protokollen beskrevet her tilsvarende nesten 10x så mye fibermasse i hvert kammer. Denne forskjellen fremhever ineffektiviteten av mitokondriell isolasjon fra ferskt vev. En mulig årsak til denne ineffektiviteten er vanskeligheten med å gjenopprette skjelettmuskulaturens mitokondrier som ligger innenfor kontraktilt proteinnettverk. Det kommersielle settet for mitokondriell isolasjon som brukes i denne protokollen, inkluderer behandling med en protease og bruk av ioniske medier for å bryte ned kontraktile fibre, men det er sannsynlig at en betydelig del av de intermyofibrillære mitokondriene ikke blir gjenvunnet. Denne funksjonen i protokollen er ikke bare relevant for å bestemme mengden biopsimateriale som trengs, men også med hensyn til tolkning av resultatene. Isolerte mitokondrier er mindre utsatt for oksygenavhengighet, på grunn av diffusjonsbegrensning sammenlignet med permeabiliserte fibre15; Dermed er hyperoksi ikke nødvendig med isolerte mitokondrier, og respirasjonsmediet kan oksygeneres tilstrekkelig (og oksygeneres under analysen) ved ganske enkelt å åpne kammeret til romluft. Dette aspektet ved oksygentilførsel er spesielt nyttig ved måling av produksjonen av H2 O2 og andre ROS, da ROS-produksjonen økes på en ikke-fysiologisk måte under hyperoksisk inkubasjon19. Endelig gir bruken av isolerte mitokondrier et mer stabilt og reproduserbart fluorescerende signal, på grunn av redusert ikke-spesifikk proteinbinding av fluoroforer sammenlignet med bruk av fluoroforer med permeabiliserte muskelfibre. Hvert prøvepreparat har fordeler og ulemper, og ferdigheter med både permeabiliserte fibre og isolerte mitokondrier gir etterforskeren et robust sett med analyser for å ta opp en rekke spørsmål knyttet til mitokondriefysiologi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter knyttet til dette manuskriptet.
Acknowledgments
Forfatterne ønsker å anerkjenne den sjenerøse støtten fra John og Debbie Oxley Endowed Chair for Equine Sports Medicine og Grayson Jockey Club Research Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ADP | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | A5285 | |
| Amplex UltraRed | Life Technologies | A36006 | |
| ATP | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | A2383 | |
| BSA | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | A6003 | |
| Calcium carbonate | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | C4830 | |
| CCCP | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | C2759 | |
| DatLab 7.0 | Oroboros Inc | Software to operate O2K fluororespirometer | |
| Dithiothreitol | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | D0632 | |
| DTPA | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | D1133 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | E4378 | |
| Glutamate | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | G1626 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | H7523 | |
| Horseradish peroxidase | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | P8250 | |
| Hydrogen peroxide | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | 516813 | Must be made fresh daily prior to assay |
| Imidazole | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | I2399 | |
| K-MES | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | M8250 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | M9272 | |
| Magnesium Green | Thermo Fisher Scientific | M3733 | |
| Malate | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | M1000 | |
| Mannitol | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | M9647 | |
| Mitochondrial isolation kit | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | MITOISO1 | |
| O2K fluororespirometer | Oroboros Inc | Multiple units required to run full spectrum of assays concurrently. | |
| Phosphocreatine | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | P7936 | |
| Potassium hydroxide | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | P1767 | |
| Potassium lactobionate | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | L2398 | |
| Potassium phosphate | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | P0662 | |
| Pyruvate | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | P2256 | Must be made fresh daily prior to assay |
| Rotenone | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | R8875 | |
| Succinate | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | S2378 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | 84097 | |
| Superoxide dismutase | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | S8160 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | T0625 | |
| Titration pump | Oroboros Inc | ||
| Titration syringes | Oroboros Inc | ||
| TMRM | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | T5428 | |
| UCH biopsy needle | Millenium Surgical Corp | 72-238067 | Available in a range of sizes |
References
- Wilson, D. F. Energy metabolism in muscle approaching maximal rates of oxygen utilization. Medicine and Science in Sports and Exercise. 27 (1), 54-59 (1995).
- Gnaiger, E. Mitochondrial Pathways and Respiratory Control. An Introduction to OXPHOS Analysis. 4th edn. , Oroboros MiPNet Publications. Innsbruck. (2014).
- Ehrenberg, B., Montana, V., Wei, M. D., Wuskell, J. P., Loew, L. M. Membrane potential can be determined in individual cells from the nernstian distribution of cationic dyes. Biophysical Journal. 53 (5), 785-794 (1988).
- Chinopoulos, C., Kiss, G., Kawamata, H., Starkov, A. A. Measurement of ADP-ATP exchange in relation to mitochondrial transmembrane potential and oxygen consumption. Methods in Enzymology. 542, 333-348 (2014).
- Krumschnabel, G., et al. Simultaneous high-resolution measurement of mitochondrial respiration and hydrogen peroxide production. Methods in Molecular Biology. 1264, 245-261 (2015).
- Lemieux, H., et al. Mitochondrial function is altered in horse atypical myopathy. Mitochondrion. 30, 35-41 (2016).
- Houben, R., Leleu, C., Fraipont, A., Serteyn, D., Votion, D. M. Determination of muscle mitochondrial respiratory capacity in Standardbred racehorses as an aid to predicting exertional rhabdomyolysis. Mitochondrion. 24, 99-104 (2015).
- Votion, D. M., Gnaiger, E., Lemieux, H., Mouithys-Mickalad, A., Serteyn, D. Physical fitness and mitochondrial respiratory capacity in horse skeletal muscle. PLoS One. 7 (4), 34890 (2012).
- Votion, D. M., et al. Alterations in mitochondrial respiratory function in response to endurance training and endurance racing. Equine Veterinary Journal Supplement. (38), 268-274 (2010).
- Tosi, I., et al. Altered mitochondrial oxidative phosphorylation capacity in horses suffering from polysaccharide storage myopathy. Journal of Bioenergetics and Biomembranes. 50 (5), 379-390 (2018).
- Davis, M. S., Fulton, M. R., Popken, A. A. Effect of hyperthermia and acidosis on equine skeletal muscle mitochondrial oxygen consumption. Comparative Exercise Physiology. 17 (2), 171-179 (2021).
- Latham, C. M., Fenger, C. K., White, S. H. RAPID COMMUNICATION: Differential skeletal muscle mitochondrial characteristics of weanling racing-bred horses1. Journal of Animal Science. , (2019).
- White, S. H., Warren, L. K., Li, C., Wohlgemuth, S. E. Submaximal exercise training improves mitochondrial efficiency in the gluteus medius but not in the triceps brachii of young equine athletes. Scientific Reports. 7 (1), 14389 (2017).
- White, S. H., Wohlgemuth, S., Li, C., Warren, L. K. Rapid communication: Dietary selenium improves skeletal muscle mitochondrial biogenesis in young equine athletes. Journal of Animal Science. 95 (9), 4078-4084 (2017).
- Doerrier, C., et al. High-resolution FluoRespirometry and OXPHOS protocols for human cells, permeabilized fibers from small biopsies of muscle, and isolated mitochondria. Methods in Molecular Biology. 1782, 31-70 (2018).
- Li, C., White, S. H., Warren, L. K., Wohlgemuth, S. E. Effects of aging on mitochondrial function in skeletal muscle of American American Quarter Horses. Journal of Applied Physiology. 121 (1), 299-311 (2016).
- Komlodi, T., et al. Comparison of mitochondrial incubation media for measurement of respiration and hydrogen peroxide production. Methods in Molecular Biology. 1782, 137-155 (2018).
- Gnaiger, E.
- Li Puma, L. C., et al. Experimental oxygen concentration influences rates of mitochondrial hydrogen peroxide release from cardiac and skeletal muscle preparations. American Journal of Physiology: Regulatory, Integrated, and Comparative Physiology. 318 (5), 972-980 (2020).
