Summary
Hästar har en exceptionell aerob träningskapacitet, vilket gör hästens skelettmuskulatur till en viktig vävnad för både studier av hästens träningsfysiologi och mitokondriell fysiologi hos däggdjur. Denna artikel beskriver tekniker för omfattande bedömning av mitokondriell funktion i hästens skelettmuskulatur.
Abstract
Mitokondriell funktion - oxidativ fosforylering och generering av reaktiva syrearter - är avgörande för både hälsa och sjukdom. Således är mätning av mitokondriell funktion grundläggande inom biomedicinsk forskning. Skelettmuskulaturen är en robust källa till mitokondrier, särskilt hos djur med mycket hög aerob kapacitet, såsom hästar, vilket gör dem idealiska ämnen för att studera mitokondriell fysiologi. Denna artikel demonstrerar användningen av högupplöst respirometri med samtidig fluorometri, med nyskördade skelettmuskelmitokondrier, för att kvantifiera kapaciteten att oxidera substrat under olika mitokondriella tillstånd och bestämma den relativa kapaciteten hos distinkta element av mitokondriell andning. Tetrametylrodaminmetylester används för att demonstrera produktionen av mitokondriell membranpotential till följd av substratoxidation, inklusive beräkning av mitokondriernas relativa effektivitet genom beräkning av den relativa membranpotential som genereras per enhet av samtidigt syreflöde. Omvandlingen av ADP till ATP resulterar i en förändring i koncentrationen av magnesium i reaktionskammaren på grund av olika affiniteter hos adenylaterna för magnesium. Därför kan magnesiumgrön användas för att mäta ATP-synteshastigheten, vilket möjliggör ytterligare beräkning av den oxidativa fosforyleringseffektiviteten (förhållandet mellan fosforylering och oxidation [P / O]). Slutligen möjliggör användningen av Amplex UltraRed, som producerar en fluorescerande produkt (resorufin) i kombination med väteperoxid, kvantifiering av reaktiv syreradikalproduktion under mitokondriell andning, liksom förhållandet mellan ROS-produktion och samtidig andning. Dessa tekniker möjliggör robust kvantifiering av mitokondriell fysiologi under en mängd olika simulerade förhållanden, vilket belyser bidraget från denna kritiska cellulära komponent till både hälsa och sjukdom.
Introduction
Mitokondrierna i eukaryota celler producerar majoriteten av ATP som används av cellerna för arbete och underhåll1. Ett viktigt steg i mitokondriell produktion av ATP är omvandlingen av syre till vatten, och därmed kvantifieras ofta den metaboliska kapaciteten hos mitokondrier och de associerade cellerna genom mätning av syreförbrukning2. Mitokondriell fysiologi är dock mer komplex än den enkla processen för syreförbrukning, och beroende av denna slutpunkt ger uteslutande en ofullständig bedömning av effekterna av mitokondriell funktion och dysfunktion på cellulär hälsa. Full karakterisering av mitokondriell funktion kräver bedömning av inte bara syreförbrukning utan även produktion av ATP såväl som reaktiva syreradikaler (ROS).
Ytterligare mätningar av viktiga mitokondriella funktioner kan åstadkommas samtidigt med mätning av andning genom användning av specifika fluoroforer. Tetrametylrodaminmetylester (TMRM) är en katjonisk fluorofor som ackumuleras i mitokondriell matris i proportion till mitokondriell transmembranspänningspotential, vilket resulterar i en minskning av fluorescerande intensitet på grund av denna ackumulering3. TMRM kan användas som en indikator på relativa förändringar i mitokondriell membranpotential, eller kan användas för att kvantifiera exakta förändringar i transmembranspänning med ytterligare experiment för att bestämma konstanter som möjliggör omvandling av den fluorescerande signalen till mV. Magnesiumgrön (MgG) är en fluorofor som fluorescerar när den är bunden med Mg2+ och används för mätningar av ATP-syntes baserat på differentialaffiniteten mellan ADP och ATP för magnesiumtvåvärt katjon4. Prövarna måste bestämma de specifika affinitets-/dissociationskonstanterna (Kd) för både ADP och ATP under specifika analytiska förhållanden för att omvandla förändringarna i MgG-fluorescens till en förändring i ATP-koncentrationen. Amplex UltraRed (AmR) är fluoroforen som används för att mäta produktionen av väteperoxid och annan ROS under mitokondriell andning5. Reaktionen mellanH2O2och AmR (som katalyseras av pepparrotsperoxidas) ger resorufin, vilket kan detekteras genom fluorescens vid 530 nM. Var och en av dessa analyser kan läggas individuellt till analyser av mitokondriell andning i realtid, för att ge samtidiga mätningar av respektive aspekter av mitokondriell fysiologi, vilket ger en direkt koppling mellan andning och mitokondriell produktion.
Hästar är kapabla till mycket höga massspecifika syreförbrukningar, delvis på grund av det mycket höga mitokondriella innehållet i hästens skelettmuskulatur, vilket gör denna vävnad mycket relevant för att studera mitokondriell fysiologi. Med utvecklingen av högupplöst respirometri har studier med denna nya teknik hjälpt till att definiera bidragen från mitokondrier i skelettmuskulaturen till både hästens anmärkningsvärda träningskapacitet och patofysiologin hos skelettmuskelsjukdomar 6,7,8,9,10,11,12,13,14 . Studier av mitokondriell funktion i skelettmuskulaturen är särskilt fördelaktiga, eftersom det inte är terminalt att erhålla stora mängder av denna vävnad. Således kan hästdjur inte bara tillhandahålla tillräcklig vävnad för fullständig karakterisering av mitokondriell funktion, utan också fungera som longitudinella kontroller för högkvalitativa, mekanistiska studier av mitokondriell fysiologi. Av denna anledning har ytterligare analyser för att kvantifiera mitokondriell membranpotential, ATP-syntes och produktion av ROS som kompletterar mätningen av syreförbrukningen i denna vävnad utvecklats för att ge en mer robust karakterisering av mitokondriell fysiologi i hästskelettmuskulatur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denna studie godkändes av Oklahoma State University Institutional Animal Care and Use Committee. Fyra fullblodsvalacker (17,5 ± 1,3 år, 593 ± 45 kg) användes i denna studie för att generera representativa resultat.
1. Skaffa skelettmuskelbiopsiprov
- Skaffa skelettmuskelbiopsier (följ steril teknik) från mitten av semitendinosusmuskeln (eller annan muskel av intresse), med hjälp av en 12 G University College Hospital (UCH) biopsinål (se materialförteckning) under lätt sedering och med lokalbedövning enligt en tidigare publicerad rapport11.
- Överför biopsiproverna omedelbart till injektionsflaskor med iskall biopsitransportmedielösning (2,77 mM CaK 2-EGTA, 7,23 mM K 2-EGTA, 20 mM imidazol, 20 mM taurin, 50 mM K-MES, 0,5 mM ditiotreitol, 6,56 mM MgCl2, 5,77 mM ATP och 15 mM fosfokreatin, justerat till pH 7,1; se materialtabell). Transport till laboratoriet för analys.
OBS: Se Doerrier et al.15 för specifika instruktioner om förberedelse av biopsitransportmediet. - Isolera mitokondrier från biopsiproverna med hjälp av ett kommersiellt kit, enligt tillverkarens instruktioner (se materialförteckning). Slutlagringsbufferten bör inte innehålla substrat som ADP, ATP och succinat, som ingår i respirometrianalysen.
- Återsuspendera den slutliga pelleten av de isolerade mitokondrierna med 80 μl suspensionsmedium (225 mM mannitol, 75 mM sackaros och 1 mM EGTA; se Materialtabell) per 100 mg muskel som används för isolering av mitokondrier.
- Minimera intervallet från tidpunkten för biopsiproceduren till isoleringen av mitokondrier och håll proverna vid 0-4 °C under hela bearbetningsstegen tills de tillsätts de högupplösta respirometrarna.
OBS: Preliminära studier har visat att suspensioner av isolerade mitokondrier börjar förlora funktionell kapacitet efter cirka 2 timmar när de hålls vid 0-4 °C.
2. Inställning av den högupplösta respirometern
- Högupplösta respirometrar används för att kvantifiera mitokondriell andning och tillhörande processer. Använd programvarukontrollprogrammet från tillverkaren (se materialförteckning) för att styra andningsmätaren, kalibrera sensorerna och samla in rådata. Analysera proverna i två exemplar för varje testförhållande.
OBS: I samtliga fall är de rekommenderade titreringar och slutliga reagenskoncentrationer som beskrivs i detta protokoll baserade på en 2 ml respirometrikammare. - Bestäm bakgrundsflödet O 2 och nollpunkten förO2-sensorn var2-4: e vecka genom serietitrering av ditionit, enligt tillverkarens instruktioner. Behåll dessa kalibreringskonstanter för efterföljande analyser tills kalibreringen upprepas.
OBS: I motsats till tidigare publicerade procedurer med permeabiliserade muskelfibrer11,12,13,16, där hyperoxi (250-500 μM) är nödvändig för att undvika diffusionsbegränsning av O2 till mitokondrierna, kan isolerade mitokondrier utvärderas med ett intervall på 50-200 μM O2. Detta kan uppnås helt enkelt genom att låta andningsmediet balansera med rumsluften innan mitokondriell suspension tillsätts (dvs. efter daglig enpunktskalibrering). På liknande sätt kan reoxygenering av andningskammaren åstadkommas genom att helt enkelt öppna kammaren tills tillräckligt med omgivande syre har lösts upp i andningsmediet för att höja syrekoncentrationen till önskad nivå. - Fyll respirometerkamrarna med magnesiumfria medier (0,5 mM EGTA, 60 mM K-laktobionat, 20 mM taurin, 10 mM KH2PO4, 20 mM HEPES, 110 mM sackaros och 1 g/L bovint serumalbumin [BSA] väsentligen fettsyrafritt, justerat till pH 7,1; se materialtabell).
OBS: Se Komlodi et al.17 för specifika instruktioner om beredning av andningsmedia.- Ställ in instrumentets inkubationstemperatur på 38 °C för att representera grundtemperaturen hos hästens skelettmuskulatur och ställ in blandningen av andningsmediet på 800 varv per minut med hjälp av en magnetomrörare som vrids i botten av respirometerkammaren.
- Stäng av kammarbelysningen för att undvika störningar med lysrör.
- Aktivera syreelektroden med en polarisationsspänning på 800 mV och förstärk den resulterande signalen med en förstärkningsinställning på 1.
- Anteckna syrekoncentrationen varannan sekund, beräkna syreflödet som den negativa lutningen för syremätningen under de föregående 40 sekunderna (20 datapunkter) och rapportera som pmol x s-1 x ml inkubationslösning.
- Kalibrera syresensorn genom att låta mediet balansera med rumsluften. Beräkna referenssyrepartialtrycket, baserat på barometertrycket uppmätt med högupplöst respirometer och standard atmosfärisk syrekoncentration.
3. Mätning av mitokondriell membranpotential med TMRM
- Använd "gröna" fluorescerande sensorer (530 nm dominerande våglängd) för att kvantifiera den fluorescerande signalen från andningskammaren. Aktivera sensorerna vid 400-500 mV; Den resulterande signalen förstärks med en förstärkning på 1: 1 000.
OBS: Specifika inställningar måste optimeras för enskilda instrument för att fånga den förväntade signalen inom sensorns linjära område. - Tillsätt TMRM (4 μl 1 mM lösning för en slutlig koncentration på 2 μM; se materialförteckning) före tillsats av mitokondrier.
- Kalibrera den fluorescerande signalen med en enkel tvåpunktskalibrering av fluorescerande signal (spänning) kontra mängden tillsatt fluorofor (mM), före tillsats av mitokondrierna.
OBS: Använd kalibreringsfunktionen fluorescerande signal i maskinstyrningsprogramvaran för att kalibrera denna signal. Den råa signalen från den fluorescerande sonden kan kräva 30 minuter eller mer för att stabiliseras för att registrera kalibreringens andra punkt. - Utför den slutliga kalibreringen av TMRM-signalen efter slutförandet av respirometrititreringsprotokollet genom att leverera flera titreringar av frikopplingsmedlet (karbonylcyanid m-klorfenylhydrazon; 2 μL per titrering) tills inga ytterligare ökningar av TMRM-fluorescerande signal observeras, vilket indikerar fullständig kollaps av mitokondriell membranpotential (figur 1).
OBS: Detta fluorescerande signalvärde anses vara lika med 0 mV transmembranpotential och används som referenspunkt för relativa membranpotentialvärden registrerade under respirometrititreringsprotokollet.
4. Mätning av ATP-produktion med magnesiumgrön (MgG)
- Använd "blå" fluorescerande sensorer (465 nm dominerande våglängd) för att kvantifiera den fluorescerande signalen från andningskammaren. Aktivera dessa sensorer för enskilda instrument för att fånga den förväntade signalen inom sensorns linjära område.
- Utför den kemiska installationen och kalibreringen av MgG-fluorescerande signal efter tillsats av mitokondrierna, men före tillsats av några substrat. Tillsätt 8 μL 2 mM etylendiamintetraättiksyra (EDTA) till respirometrikammaren till kelatkatjoner (särskilt Ca 2+) som skulle konkurrera med Mg2+ om bindning till MgG, tillsätt sedan 4 μL 1 mM MgG (1,1 μM) till andningskammaren.
- Kalibrera den råa fluorescenssignalen med 10 x 2 μL sekventiella titreringar på 100 mMMgCl2, med 1 min mellan titreringarna för stabilisering av den fluorescerande signalen (figur 2).
OBS: Denna process, som slutförs offline efter avslutad analys och med hjälp av mallar som tillhandahålls av tillverkaren av maskinen och tillhörande programvara, ger en andra ordningens kurva för magnesiumkoncentration till fluorescerande signal (förväntad r2 > 0,98), som kommer att användas med en känd mängd ADP tillsatt till respirometrikammaren och de tidigare bestämda Kd-värdena för att bestämma motsvarande koncentration av ATP11. - Bestäm hastigheten för ATP-syntes, vilket är lutningen för koncentrationen av ATP över tiden genom hela protokollet (figur 3).
5. Mätning av mitokondriell produktion av ROS med Amplex UltraRed (AmR)
- Använd "gröna" fluorescerande sensorer (530 nm dominerande våglängd) för att kvantifiera den fluorescerande signalen från andningskammaren. Aktivera sensorerna vid 300-400 mV; Den resulterande signalen förstärks med en förstärkning på 1: 1 000. Optimera specifika inställningar för enskilda instrument för att fånga den förväntade signalen inom sensorns linjära område.
OBS: Om andningsmedia utan MgCl 2 används, bör detta tillsättas (20-60 μL 100 mMMgCl2 för att producera 1-3 μM MgCl2) innan reagens tillsätts för AmR-testet. - Utför den kemiska installationen och den första kalibreringen av AmR-analysen före tillsats av mitokondrierna. Tillsätt 30 μmol DTPA (6 μl 5 mM lösning) till kelatkatjoner som kan störa reaktionen, tillsätt sedan superoxiddismutas (2 μl av en 5 000 E/ml stamlösning för att omvandla superoxidanjoner tillH2O2för en mer omfattande detektion av reaktiv syregenerering), pepparrotsperoxidas (5 μl 500 E/ml stamlösning), och Amplex UltraRed (2 μL av en 10 mM stamlösning) (se Materialtabell) för att producera 5 E/ml, 1 E/ml respektive 10 μM i respirometrikammaren.
- Låt lysrörssignalen stabiliseras och tillsätt sedan 0,2 μmol väteperoxid (5 μL av en 40 μM lösning som görs färsk dagligen) två gånger, med cirka 5 minuters mellanrum.
Anmärkning: Den fluorescerande signalen före och efter de två titreringarna av H2O2 ger en trepunkts linjär kalibreringskurva för systemet (förväntad r2 > 0,95), vars lutning återspeglar systemets övergripande respons vid rapportering av förhållandet mellan den fluorescerande signalen och produktionen (eller tillsatsen) avH2O2. Använd kalibreringsfunktionen fluorescerande signal i maskinstyrningsprogramvaran för att kalibrera denna signal. - Utför ytterligare tvåpunktskalibreringar (5 μl av en 40 μM-lösning som görs färsk dagligen) under hela testet för att möjliggöra justering av analysens respons när respirometrins kemi ändras under hela testet, med prövarens specifika tidpunkt för dessa kalibreringspunkter enligt prövarens gottfinnande (figur 4).
6. Mätning av mitokondriell andning
- Tillsätt 15 μl isolerad mitokondrisuspension (steg 1.4) till varje 2 ml inkubationskammare, så att resultaten representerar mitokondriellt utbyte av 18,75 mg muskel. Försegla inkubationskammaren. Virvla provet mellan varje titrering för att upprätthålla en enhetlig suspension av provet.
- Mät den återstående syreförbrukningen (ROX) före tillsats av substrat. Subtrahera detta värde (vanligtvis mindre än 0,2 pmolO2 x s-1 x ml-1) från syreförbrukningsvärdena för varje steg i SUIT-protokollet (substrate/uncoupler/inhibitor titration)11 efter att protokollet har slutförts.
OBS: Det är viktigt att signalerna från både syresensorn och fluorescenssensorn tillåts stabiliseras i minst 1 minut (enligt bedömning av den stabila beräknade lutningen för de primära sensorsignalerna), eftersom det totala andningstillståndet ändras av titreringen för att uppnå tillförlitliga resultat. Detta gäller alla titreringssteg. - Använd en generell SUIT som möjliggör den initiala karakteriseringen av mitokondriell funktion för hästskelettmuskulaturen. Börja med sekventiella titreringar av pyruvat (5 μL 2 M vattenlösning), glutamat (10 μL 2 M vattenlösning) och malat (10 μL 0,4 M vattenlösning) (se materialtabell) i varje kammare för att producera nikotinamidadenindinukleotid (NADH) och stimulera icke-fosforylerande (läckage) andning som stöds av NADH oxiderad genom komplex I (LN) (figur 1, Figur 3 och figur 4).
- Tillsätt ADP (20 μL 500 mM vattenlösning, se materialtabell) för att stimulera fosforylerande andning genom komplex I (PN).
- Tillsätt succinat (20 μl 1 M vattenlösning, se Materialförteckning) för att åstadkomma fosforylerande andning genom kombinationen av komplex I och komplex II (PN+S).
OBS: Med kombinationen av andning genom både komplex I och komplex II kan syreförbrukningen vara tillräckligt hög för att konsumera det mesta av syret upplöst i inkubationsmediet. Om O2-koncentrationen sjunker under 50 μM, reoxygenera inkubationsmediet genom att öppna inkubationskammaren tills den uppmätta O2-koncentrationen har ökat över 150 μM. Upprepa detta steg om det behövs för att bibehålla tillräckligt medO2 för mitokondriell andning. - Tillsätt rotenon (2 μL 0,1 mM etanollösning; se materialförteckning) för att blockera komplex I. Det resulterande syreflödet representerar kapaciteten hos komplex II att stödja mitokondriell syreförbrukning via oxidation av enbart succinat (PS).
VARNING: Rotenon är ett giftigt ämne. Använd standard laboratoriesäkerhet och undvik förtäring eller inandning. - Beräkna medelvärdet för ett givet experimentellt tillstånd över enskilda respirometrikammare som innehåller alikvoter av en enda biopsi.
Anm.: Härledda beräkningar, såsom flödeskontrollförhållanden (FCR), är värdefulla för att identifiera relativa förändringar i olika vägar och inkluderarFCR-läckage (L N/P N), FCR N (P N/P N+S) och FCR S (P S/PN+S). Beräknad oxidativ fosforyleringseffektivitet (1-LN/PN+S) ger en uppskattning av den totala effekten av läckageandning justerad för total andningskapacitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Det föreslagna referenstillståndet är ett friskt stillasittande fullblod (ingen ökad kondition på grund av obligatorisk träning) och ett färskt muskelprov som samlats in från mitten av en postural muskel, innehållande en hög andel mitokondririka skelettmuskelfibrer av typ I och inkuberas under förhållanden som närmar sig vilometabolism (dvs. 38 °C och pH 7,0). Under dessa förhållanden kan utredaren förvänta sig LN-värden på 2,71 ± 0,90, PN-värden på 62,40 ± 26,22, PN+S-värden på 93,67 ± 34,76 och PS-värden på 46,93 ± 14,58 pmol O2 x s-1 x ml-1 (figur 3 och figur 4). Andningsvärdena för mitokondrier som inkuberas med TMRM är lägre på grund av en hämmande effekt av den fluoroforen (figur 1). FCRLeak, FCRN och FCRS är 0,05 ± 0,01, 0,66 ± 0,07 respektive 0,51 ± 0,07. Den beräknade oxidativa fosforyleringseffektiviteten är 0,97 ± 0,01. De absoluta värdena för dessa andningstillstånd varierar beroende på det enskilda ämnet och vävnadens oxidativa kapacitet, men det relativa mönstret för dessa värden överensstämmer med publicerade resultat från permeabiliserade skelettmuskelfibrer hos häst (dvs. ökad andning med tillsats av specifika substrat, kombinationen av andning genom komplex I och komplex II är mindre än var och en av dessa elektronkällor individuellt på grund av mättnad av elektronöverföringssystemet [ETS] kapacitet nedströms). Den beräknade effektiviteten hos isolerade mitokondrier i skelettmuskulaturen överensstämmer med motsvarande värden som rapporterats för permeabiliserade skelettmuskelfibrerhos häst 11.
ATP-synteshastigheten förväntas vara 438,59 ± 397,10 pM x s-1 för PN-andning, 383,18 ± 397,19 för PN + S-andning och 172,07 ± 125,60 för P S-andning, per mg källvävnad som används för att isolera mitokondrier. Minskningen av ATP-syntesen med tillsats av succinat beror sannolikt på konkurrens vid kinonkorsningen av ETS av de två elektronmatningarna, med matningen från komplex II (som inte bidrar direkt till mitokondriell membranpotential) vilket minskar flödet av elektroner genom komplex I (vilket direkt bidrar till mitokondriell membranpotential genom pumpning av protoner över det inre mitokondriella membranet).
Produktionshastigheten för H2O2 förväntas bli 0,079 ± 0,095 nmol.s-1för LN-andning, 0,021 ± 0,043 för PN-andning, 0,026 ± 0,056 för PN+S-andning och 0,237 ± 0,248 förP-S-andning, per mg källvävnad som används för att isolera mitokondrier (figur 4). Den relativa produktionstakten för ROS överensstämmer med den förväntade storleken på mitokondriell membranpotential och sambandet mellan hög membranpotential och ROS-produktion. Undantaget från detta förhållande är den mycket höga ROS-produktionen när andning sker genom komplex II ensam, på grund av bakåtflödet av elektroner från kinonkorsningen till komplex I när den blockeras av rotenon.
Figur 1: Representativa högupplösta respirometrispår av mitokondriell andning i hästskelettmuskulaturen och relativ membranpotential. Det övre fönstret är kammarens syrekoncentration (vänster Y-axel) och syreflöde (höger Y-axel) över tiden (X-axeln); det nedre fönstret är kammare TMRM fluorescens (vänster Y-axel) och hastighet för fluorescenssignalförändring (höger Y-axel) över tiden (X-axel). Vertikala märken indikerar tillsats av specifika substrat till kammaren (mt: mitokondrier suspension; P: pyruvat; G: glutamat; M: malat; D: ADP; S: kortfattad; R: rotenon; CCCP: Karbonylcyanid m-klorfenylhydrazon). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Representativt spår av respirometri med hög upplösning av kalibrering av kammarens fluorescenssignal för magnesiumgrönt och bestämning av Kd för magnesium och adenylater. MgG-fluorescens (vänster Y-axel) och hastighet för fluorescenssignalförändring (höger Y-axel) över tid (X-axel). De initiala vertikala markeringarna indikerar tillsats av specifika substrat till kammaren (MgG: magnesiumgrön; mt: mitokondrier suspension; P: pyruvat; G: glutamat; M: malat; S: kortfattad; EDTA: etylendiamintetraättiksyra). Detta följs av serietitrering avMgCl2 med hjälp av en automatiserad titrerpump (TIP) som ökar den fluorescerande signalen, sedan serietitrering av ett adenylat (i detta fall ATP) som minskar den fluorescerande signalen. Titreringen avMgCl2 används också i början av varje analys för att kalibrera MgG-signalen, men utförs före tillsats av mitokondrier och respirometrisubstrat såsom P, G, M och S. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Representativa högupplösta respirometrispår av mitokondriell andning i hästskelettmuskulaturen och ATP-syntes. Det övre fönstret är kammarens syrekoncentration (vänster Y-axel) och syreflöde (höger Y-axel) över tiden (X-axeln); det nedre fönstret är kammare MgG-fluorescens (vänster Y-axel) och hastighet för fluorescenssignalförändring (höger Y-axel) över tiden (X-axel). Vertikala märken indikerar tillsats av specifika substrat till kammaren (mt: mitokondrier suspension; P: pyruvat; G: glutamat; M: malat; D: ADP; S: kortfattad; R: rotenon). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Representativa högupplösta respirometrispår av mitokondriell andning av hästskelettmuskulaturen och produktion avH2O2. Det övre fönstret är kammarens syrekoncentration (vänster Y-axel) och syreflöde (höger Y-axel) över tiden (X-axeln); det nedre fönstret är kammarresorufinfluorescens (vänster Y-axel) och fluorescenssignalförändringshastighet (höger Y-axel) över tid (X-axel). Vertikala märken indikerar tillsats av specifika substrat till kammaren (mt: mitokondrier suspension; P: pyruvat; G: glutamat; M: malat; D: ADP; S: kortfattad; R: rotenon). Dessutom ingår tre tvåpunktskalibreringar inom analysen av den fluorescerande signalen medH2O2. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tillägget av fluorescerande signaler till standardutgången från den högupplösta respirometern ger värdefull information om mitokondriell fysiologi, men noggrann kalibrering av den fluorescerande signalen är avgörande för kvalitetsdata. De ursprungliga protokollen för användning av MgG föreslår att kalibreringskurvorna som genereras vid beräkning av magnesium-adenylatdissociationskonstanter kan tillämpas på efterföljande analyser4; Det är dock inte säkert att den fluorescerande signalen från MgG är tillräckligt reproducerbar från test till test för denna metod. Därför kalibreras varje analys med en automatiserad MgCl2-titrering och den resulterande kalibreringskurvan för beräkning av ATP-syntes för den individuella analysen. Vidare måste Kd (dissociationskonstanter) för magnesium och både ADP och ATP beräknas för de specifika förhållandena för analysen, inklusive specifik vävnad, inkubationsförhållanden och substrat som producerar fosforylerande andning, för att säkerställa att härledningen av ATP-synteshastigheten är korrekt. Variabiliteten i AmR-analysen är mer allmänt erkänd15,17, och det är vanligt att infoga flera diskreta omkalibreringspunkter i protokollet efter utredarens gottfinnande under protokollet. Historiska data med hästskelettmuskulatur indikerar att analysens typiska respons är ungefär 0,646 V/mMH2O2vid den första kalibreringspunkten (före tillsats av provet) och kan minska med 8–15 % under testets längd. Således är frekvent omkalibrering av AmR-testet nödvändigt för detektering av relativt små förändringar i produktionen av ROS, och tidpunkten för punktkalibreringarna inom protokollet bör bestämmas för varje titreringsprotokoll.
Prövarna måste använda noggrant omdöme under hela analysutförandet för att bestämma när de ska gå vidare till nästa titreringssteg. Helst bör de relevanta signalerna som genereras i realtid( O2-flöde, fluorescens av TMRM och förändringshastigheten i MgG och resorufinfluorescerande signal) vara stabila, vilket indikerar ett stabilt tillstånd i kammaren, men det är ett bedömningssamtal från utredarens sida om vad som utgör acceptabel stabilitet. För närvarande finns det ingen allmänt hållen standard för detta beslut; Utredare måste dock vara akut medvetna om riskerna med att både inte vänta tillräckligt länge för att ett stabilt tillstånd ska fastställas (vilket resulterar i data som ofullständigt karakteriserar det avsedda andningstillståndet) och vänta så länge att substrat blir utarmade och analysen inte längre är tillförlitlig. Enligt författarens erfarenhet är misslyckande med att uppnå en stabil signal inom 30 minuter efter någon substrattitrering bevis på ett prov (eller maskin) som beter sig på ett icke-biologiskt sätt, och analysen måste kasseras.
Resultaten som använder denna metod för att kvantifiera mitokondriell fysiologi visar betydande interindividuell variabilitet, med en typisk variationskoefficient (CV) på 30% -40%. Däremot resulterar analys av permeabiliserade hästskelettmuskelfibrer i ett CV på 19%-20%11, vilket tyder på att processen att isolera mitokondrier medför betydande variation i den efterföljande analysen utöver den markanta interindividuella variabiliteten. Även om effekten av den senare kan mildras genom att använda ämnen som sina egna kontroller när det är möjligt, kan den förra endast minimeras genom noggrann uppmärksamhet på isoleringstekniken. Om försöksdesignen inte tillåter experimentella replikat från en enda biopsi, kan prövaren välja att uttrycka respirometridata i förhållande till en korrektionsfaktor som återspeglar skillnader i mitokondriellt innehåll i olika prover. De vanligaste korrektionsfaktorerna är provproteininnehållet och citratsyntasaktiviteten i provet. Men som beskrivs i ett nyligen konsensusuttalande från forskare som är aktiva inom detta område finns det ingen enda metod för att utföra denna justering som är allmänt överens om18. Korrigering för proteininnehåll och/eller citratsyntasaktivitet är de två vanligaste metoderna som används för hästskelettmuskelvävnad12,13, men båda har sina brister. Det kan vara nödvändigt för olika experimentella designer att uttrycka data genom både interna (dvs. flödeskontrollförhållanden) och externa (protein, enzymaktivitet, andra mitokondriella markörer) för att tolka mitokondriell funktion.
Det beskrivna protokollet bygger på användningen av permeabiliserade muskelfibrer, med flera viktiga skillnader. Permeabiliserade fiberanalyser kräver mindre biopsier, eftersom högupplöst respirometri av permeabiliserade fibrer i hästskelettmuskulaturen vanligtvis utförs med endast ~ 2 mg provmassa i varje kammare 6,7,8,9,10,11. Däremot har protokollet som beskrivs här motsvarande nästan 10x så mycket fibermassa i varje kammare. Denna skillnad belyser ineffektiviteten av mitokondriell isolering från färsk vävnad. En möjlig orsak till denna ineffektivitet är svårigheten att återställa skelettmuskelmitokondrierna som ligger inom det kontraktila proteinnätverket. Det kommersiella kit för mitokondriell isolering som används i detta protokoll inkluderar behandling med proteas och användning av joniska medier för att bryta ner kontraktila fibrer, men det är troligt att en betydande del av de intermyofibrillära mitokondrierna inte återvinns. Denna funktion i protokollet är inte bara relevant för att bestämma mängden biopsimaterial som behövs, men också med avseende på tolkning av resultaten. Isolerade mitokondrier är mindre mottagliga för syreberoende på grund av diffusionsbegränsning jämfört med permeabiliserade fibrer15; Således behövs inte hyperoxi med isolerade mitokondrier, och andningsmediet kan syresättas tillräckligt (och syresättas under analysen) genom att helt enkelt öppna kammaren för rumsluft. Denna aspekt av syretillförsel är särskilt användbar vid mätning av produktionen avH2O2och annan ROS, eftersom ROS-produktionen ökar på ett icke-fysiologiskt sätt under hyperoxisk inkubation19. Slutligen ger användningen av isolerade mitokondrier en mer stabil och reproducerbar fluorescerande signal på grund av den minskade icke-specifika proteinbindningen av fluoroforer jämfört med användningen av fluoroforer med permeabiliserade muskelfibrer. Varje provberedning har fördelar och nackdelar, och kunskaper med både permeabiliserade fibrer och isolerade mitokondrier ger utredaren en robust uppsättning analyser för att ta itu med en mängd olika frågor relaterade till mitokondriell fysiologi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter relaterade till detta manuskript.
Acknowledgments
Författarna vill erkänna det generösa stödet från John och Debbie Oxley Endowed Chair for Equine Sports Medicine och Grayson Jockey Club Research Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ADP | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | A5285 | |
| Amplex UltraRed | Life Technologies | A36006 | |
| ATP | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | A2383 | |
| BSA | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | A6003 | |
| Calcium carbonate | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | C4830 | |
| CCCP | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | C2759 | |
| DatLab 7.0 | Oroboros Inc | Software to operate O2K fluororespirometer | |
| Dithiothreitol | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | D0632 | |
| DTPA | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | D1133 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | E4378 | |
| Glutamate | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | G1626 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | H7523 | |
| Horseradish peroxidase | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | P8250 | |
| Hydrogen peroxide | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | 516813 | Must be made fresh daily prior to assay |
| Imidazole | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | I2399 | |
| K-MES | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | M8250 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | M9272 | |
| Magnesium Green | Thermo Fisher Scientific | M3733 | |
| Malate | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | M1000 | |
| Mannitol | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | M9647 | |
| Mitochondrial isolation kit | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | MITOISO1 | |
| O2K fluororespirometer | Oroboros Inc | Multiple units required to run full spectrum of assays concurrently. | |
| Phosphocreatine | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | P7936 | |
| Potassium hydroxide | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | P1767 | |
| Potassium lactobionate | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | L2398 | |
| Potassium phosphate | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | P0662 | |
| Pyruvate | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | P2256 | Must be made fresh daily prior to assay |
| Rotenone | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | R8875 | |
| Succinate | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | S2378 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | 84097 | |
| Superoxide dismutase | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | S8160 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | T0625 | |
| Titration pump | Oroboros Inc | ||
| Titration syringes | Oroboros Inc | ||
| TMRM | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | T5428 | |
| UCH biopsy needle | Millenium Surgical Corp | 72-238067 | Available in a range of sizes |
References
- Wilson, D. F. Energy metabolism in muscle approaching maximal rates of oxygen utilization. Medicine and Science in Sports and Exercise. 27 (1), 54-59 (1995).
- Gnaiger, E. Mitochondrial Pathways and Respiratory Control. An Introduction to OXPHOS Analysis. 4th edn. , Oroboros MiPNet Publications. Innsbruck. (2014).
- Ehrenberg, B., Montana, V., Wei, M. D., Wuskell, J. P., Loew, L. M. Membrane potential can be determined in individual cells from the nernstian distribution of cationic dyes. Biophysical Journal. 53 (5), 785-794 (1988).
- Chinopoulos, C., Kiss, G., Kawamata, H., Starkov, A. A. Measurement of ADP-ATP exchange in relation to mitochondrial transmembrane potential and oxygen consumption. Methods in Enzymology. 542, 333-348 (2014).
- Krumschnabel, G., et al. Simultaneous high-resolution measurement of mitochondrial respiration and hydrogen peroxide production. Methods in Molecular Biology. 1264, 245-261 (2015).
- Lemieux, H., et al. Mitochondrial function is altered in horse atypical myopathy. Mitochondrion. 30, 35-41 (2016).
- Houben, R., Leleu, C., Fraipont, A., Serteyn, D., Votion, D. M. Determination of muscle mitochondrial respiratory capacity in Standardbred racehorses as an aid to predicting exertional rhabdomyolysis. Mitochondrion. 24, 99-104 (2015).
- Votion, D. M., Gnaiger, E., Lemieux, H., Mouithys-Mickalad, A., Serteyn, D. Physical fitness and mitochondrial respiratory capacity in horse skeletal muscle. PLoS One. 7 (4), 34890 (2012).
- Votion, D. M., et al. Alterations in mitochondrial respiratory function in response to endurance training and endurance racing. Equine Veterinary Journal Supplement. (38), 268-274 (2010).
- Tosi, I., et al. Altered mitochondrial oxidative phosphorylation capacity in horses suffering from polysaccharide storage myopathy. Journal of Bioenergetics and Biomembranes. 50 (5), 379-390 (2018).
- Davis, M. S., Fulton, M. R., Popken, A. A. Effect of hyperthermia and acidosis on equine skeletal muscle mitochondrial oxygen consumption. Comparative Exercise Physiology. 17 (2), 171-179 (2021).
- Latham, C. M., Fenger, C. K., White, S. H. RAPID COMMUNICATION: Differential skeletal muscle mitochondrial characteristics of weanling racing-bred horses1. Journal of Animal Science. , (2019).
- White, S. H., Warren, L. K., Li, C., Wohlgemuth, S. E. Submaximal exercise training improves mitochondrial efficiency in the gluteus medius but not in the triceps brachii of young equine athletes. Scientific Reports. 7 (1), 14389 (2017).
- White, S. H., Wohlgemuth, S., Li, C., Warren, L. K. Rapid communication: Dietary selenium improves skeletal muscle mitochondrial biogenesis in young equine athletes. Journal of Animal Science. 95 (9), 4078-4084 (2017).
- Doerrier, C., et al. High-resolution FluoRespirometry and OXPHOS protocols for human cells, permeabilized fibers from small biopsies of muscle, and isolated mitochondria. Methods in Molecular Biology. 1782, 31-70 (2018).
- Li, C., White, S. H., Warren, L. K., Wohlgemuth, S. E. Effects of aging on mitochondrial function in skeletal muscle of American American Quarter Horses. Journal of Applied Physiology. 121 (1), 299-311 (2016).
- Komlodi, T., et al. Comparison of mitochondrial incubation media for measurement of respiration and hydrogen peroxide production. Methods in Molecular Biology. 1782, 137-155 (2018).
- Gnaiger, E.
- Li Puma, L. C., et al. Experimental oxygen concentration influences rates of mitochondrial hydrogen peroxide release from cardiac and skeletal muscle preparations. American Journal of Physiology: Regulatory, Integrated, and Comparative Physiology. 318 (5), 972-980 (2020).
