Summary
Das vorliegende Protokoll beschreibt eine einfache und effiziente Methode zur Identifizierung von 2,4-Dibromphenol-Metaboliten in Pflanzen.
Abstract
Nutzpflanzen können in großem Umfang organischen Schadstoffen ausgesetzt sein, da der Boden eine wichtige Senke für Schadstoffe ist, die in die Umwelt gelangen. Dies führt zu einer potenziellen Exposition des Menschen durch den Verzehr von Lebensmitteln, die mit Schadstoffen angereichert sind. Die Aufklärung der Aufnahme und des Stoffwechsels von Xenobiotika in Nutzpflanzen ist für die Bewertung des ernährungsbedingten Expositionsrisikos beim Menschen von entscheidender Bedeutung. Für solche Experimente erfordert die Verwendung intakter Pflanzen jedoch Langzeitexperimente und komplexe Probenvorbereitungsprotokolle, die von verschiedenen Faktoren beeinflusst werden können. Pflanzenkalluskulturen in Kombination mit hochauflösender Massenspektrometrie (HRMS) können eine Lösung für die genaue und zeitsparende Identifizierung von Metaboliten von Xenobiotika in Pflanzen darstellen, da sie Störungen durch die mikrobielle oder pilzliche Mikroumgebung vermeiden, die Behandlungsdauer verkürzen und den Matrixeffekt intakter Pflanzen vereinfachen können. 2,4-Dibromphenol, ein typisches Flammschutzmittel und endokriner Disruptor, wurde aufgrund seines weit verbreiteten Vorkommens im Boden und seines Aufnahmepotenzials durch Pflanzen als Modellsubstanz ausgewählt. Hierin wurde Pflanzenkallus aus Asepsissamen erzeugt und einem sterilen 2,4-Dibromphenol-haltigen Nährmedium ausgesetzt. Die Ergebnisse zeigten, dass nach 120 h Inkubation acht Metaboliten von 2,4-Dibromphenol im Kallusgewebe der Pflanzen identifiziert wurden. Dies deutet darauf hin, dass 2,4-Dibromphenol in den pflanzlichen Kallusgeweben schnell metabolisiert wurde. Somit ist die Pflanzenkalluskulturplattform eine effektive Methode, um die Aufnahme und den Metabolismus von Xenobiotika in Pflanzen zu bewerten.
Introduction
Immer mehr organische Schadstoffe werden aufgrund anthropogener Aktivitäten in die Umwelt abgegeben 1,2, und der Boden gilt als wichtige Senke für diese Schadstoffe 3,4. Die Schadstoffe im Boden können von Pflanzen aufgenommen und möglicherweise auf Organismen auf höherer trophischer Ebene entlang der Nahrungsketten übertragen werden, indem sie durch den Verzehr von Pflanzen direkt in den menschlichen Körper gelangen, was zu einer unbeabsichtigten Exposition führt 5,6. Pflanzen nutzen verschiedene Wege, um Xenobiotika zur Entgiftung zu verstoffwechseln7; Die Aufklärung des Stoffwechsels von Xenobiotika ist wichtig, da sie den tatsächlichen Verbleib von Schadstoffen in Pflanzen steuert. Da die Metaboliten über die Blätter (in die Atmosphäre) oder die Wurzeln ausgeschieden werden können, bietet die Bestimmung der Metaboliten in den sehr frühen Expositionsphasen die Möglichkeit, eine größere Anzahl von Metaboliten zu testen8. Studien mit intakten Pflanzen erfordern jedoch Langzeitexperimente und komplexe Probenvorbereitungsprotokolle, die von verschiedenen Faktoren beeinflusst werden können.
Pflanzliche Kalluskulturen sind daher eine gute Alternative, um den Stoffwechsel von Xenobiotika in planta zu untersuchen, da sie die Behandlungszeit stark verkürzen können. Diese Kulturen schließen mikrobielle Interferenz und photochemischen Abbau aus, vereinfachen den Matrixeffekt intakter Pflanzen, standardisieren die Kultivierungsbedingungen und erfordern weniger experimentellen Aufwand. Pflanzliche Kalluskulturen wurden erfolgreich als alternativer Ansatz in Stoffwechselstudien von Triclosan9, Nonylphenol10 und Tebuconazol8 eingesetzt. Diese Studien zeigten, dass die Stoffwechselmuster in Kalluskulturen denen in intakten Pflanzen ähnelten. Diese Studie schlägt eine Methode zur effizienten und genauen Identifizierung von Metaboliten von Xenobiotika in Pflanzen ohne komplexe und zeitaufwändige Protokolle vor. Hier verwenden wir pflanzliche Kalluskulturen in Kombination mit hochauflösender Massenspektrometrie für die Analyse von Metaboliten mit Signalen niedriger Intensität11,12.
Zu diesem Zweck wurden Kallussuspensionen aus Karotten (Daucus carota var. sativus) 120 μg/l 2,4-Dibromphenol für 120 h in einem Schüttler bei 130 U/min und 26 °C ausgesetzt. 2,4-Dibromphenol wurde aufgrund seiner störenden endokrinen Aktivität13 und seines weit verbreiteten Vorkommens im Boden14 ausgewählt. Die Metaboliten wurden extrahiert und mittels hochauflösender Massenspektrometrie analysiert. Das hier vorgeschlagene Protokoll kann den In-planta-Metabolismus anderer Arten von organischen Verbindungen, die ionisiert werden können, untersuchen.
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Protocol
1. Differenzierung der Karottenschwiele
HINWEIS: Autoklavieren Sie alle hier verwendeten Geräte und führen Sie alle Vorgänge in einer UV-sterilisierten, ultrareinen Werkbank durch.
- Vernalisieren Sie die Samen, indem Sie die gleichmäßigen Karottensamen (Daucus carota var. sativus) 16 h lang bei 4 °C in deionisiertes Wasser tauchen.
- Sterilisieren Sie die vernalisierten Samen 20 Minuten lang mit 75%igem Ethanol und spülen Sie sie dann dreimal mit sterilem deionisiertem Wasser unter aseptischen Bedingungen ab.
- Die Samen werden 20 Minuten lang mit 20 %H2O2sterilisiert und sechsmal unter aseptischen Bedingungen mit sterilisiertem deionisiertem Wasser gewaschen.
- Die Samen werden aseptisch gekeimt, indem sie auf hormonfreiem MS-Medium (pH 5,8, autoklaviert bei 121 °C für 20 Minuten) mit 1 % Agargel ausgesät und 15 Tage lang bei 26 °C mit einer Photoperiode von 16 Stunden (350 μmol/m2s) inkubiert werden.
- Erhalten Sie die Explantate, indem Sie das Hypokotyl und das Keimblatt der Sämlinge in kleine Stücke (0,5 cm) schneiden.
- Die Explantaten werden unter aseptischen Bedingungen in Petrischalen (zwei bis vier Explantate pro Schale) umgewandelt, die 15-20 ml aseptisches MS-Medium enthalten, das mit Auximon (2,4-Dichlorphenoxyessigsäure; 1 mg/l) und Phytokinin (6-Benzylaminopurin; 0,5 mg/l) ergänzt ist.
- Inkubieren Sie die Explantate im Dunkeln bei 26 °C für 3-4 Wochen, um die Hornhaut zu induzieren.
- Trennen Sie das Kallusgewebe (ca. 1 cm Durchmesser), das sich aus den ursprünglichen Explantaten gebildet hat, mit einem sterilen Skalpell und einer Pinzette.
HINWEIS: Das neu gebildete Kallusgewebe hat eine weiße bis cremegelbe Farbe und haftet lose an den ursprünglichen Explantaten an.
2. 2,4-Dibromphenol-Behandlung
- 1 μg 2,4-Dibromphenol wird in 10 ml aseptischem flüssigem MS-Medium gelöst (die Endkonzentration von 2,4-Dibromphenol beträgt 100 ppb, pH 5,6-7,0).
- 3 g der frischen Karottenkallus (Schritt 1.8) werden unter aseptischen Bedingungen in Glaskolben gegeben, die die zubereitete 2,4-Dibromphenollösung (aus Schritt 2.1) enthalten. Betrachten Sie dies als die 2,4-Dibromphenol-Behandlung.
HINWEIS: Die Glaskolben wurden autoklaviert und mit Paraffinfolie versiegelt. - Eine Mediumkontrolle, die nur die 2,4-Dibromphenollösung enthält (hergestellt in Schritt 2.1), ist zur Beurteilung des abiotischen Abbaus von 2,4-Dibromphenol einzuschließen.
- Fügen Sie eine Blindkontrolle bei, die nur die Karotten-Hornhaut enthält (keine 2,4-Dibromphenol-Lösung), um sie auf eine mögliche Kontamination zu überprüfen.
- Bereiten Sie die Blindkontrolle mit Karotten vor, indem Sie 3 g frisch gesammelte Karottenkallus nur in 10 ml steriles MS-Medium geben.
- Die 2,4-Dibromphenol-Behandlung und die Medium- und Blindkontrollen werden bei 130 U/min und 26 °C im Dunkeln in einem Inkubator für 120 h inkubiert.
- Die Glaskolben werden nach 120 Stunden Inkubation aus dem Inkubator entnommen, um die Proben aus der 2,4-Dibromphenol-Behandlung und -Kontrolle zu entnehmen.
HINWEIS: Alle Proben wurden in dreifacher Ausfertigung hergestellt.
3. Probenvorbereitung
- Trennen Sie die Hornhaut vorsichtig vom MS-Medium durch Filtration mit Glasfaserfiltern (0,45 μm) für die 2,4-Dibromphenol-Behandlung und die Kontrollen. Sammeln Sie die Hornhaut nach dreimaligem Waschen mit Reinstwasser.
- Die gesammelte Hornhaut wird mit flüssigem Stickstoff gefriergetrocknet und anschließend mit einem Hochdurchsatz-Gewebeschleifer bei 70 Hz für 3 min homogenisiert.
- Spicken Sie die homogenisierte Hornhaut, indem Sie 50 μl 25 mg/l Surrogat 4-n-NP-d4 mit einer Glasmikrospritze hinzufügen und anschließend 1 Minute lang vortexen.
- Die Proben werden 30 min lang mit 5 ml Methanol/Wasser (1:1, v/v) in einem mit Eiswasser gefüllten Ultraschallgerät (150 W, 40 kHz) beschallt, um 2,4-Dibromphenol und die Metaboliten zu extrahieren.
- Die Suspensionen werden bei 8.000 x g bei 4 °C für 10 min zentrifugiert und die Überstände durch Pipettieren gesammelt.
- Wiederholen Sie die Extraktionsvorgänge für die Hornhautprobe dreimal und kombinieren Sie die Extrakte.
- Leiten Sie die Extrakte durch hydrophile lipophile balancierte Festphasenextraktionskartuschen (HLB SPE) mit einer Durchflussrate von 1 ml/min.
HINWEIS: Die HLB SPE-Kartuschen wurden nacheinander mit 6 ml Methanol und 6 ml Wasser vorbehandelt, um Interferenzen zu beseitigen. - Eluieren Sie die Analyten, indem Sie 6 ml Methanol durch die HLB SPE-Kartuschen leiten. Anschließend werden die erhaltenen Eluenten unter einem sanften Stickstoffgasstrom für die instrumentelle Analyse auf 1 ml konzentriert.
- Injizieren Sie 10 μl der resultierenden Eluenten in die UPLC-Q-TOF-MS für die Analyse von 2,4-Dibromphenol und ihren Metaboliten15.
- Filtern Sie alle Proben vor der instrumentellen Analyse mit einer 0,22 μm Nylonmembran.
4. Instrumentelle Analyse
ANMERKUNG: Die Analysen von 2,4-Dibromphenol und seinen Metaboliten wurden an einem Ultra-Performance-Flüssigkeitschromatographen (UPLC) in Kombination mit einem micrOTOF-QII-Massenspektrometer durchgeführt, das mit einer Elektrospray-Ionisation (ESI) ausgestattet ist und im positiven und negativen Ionenmodus arbeitet.
- Öffnen Sie die Klappe der Säulenheizung und installieren Sie die UPLC-Säule, indem Sie den Säuleneinlass mit dem Einspritzventil und den Säulenauslass mit dem Einlass des Massenspektrometers verbinden.
HINWEIS: Eine C18-Säule (50 mm x 2,1 mm; 1,7 μm Partikelgröße) wurde für die Trennung der Analyten bei 40 °C verwendet. - Verbinden Sie die mobile Phase A (Reinstwasser) und die mobile Phase B (Methanol in Chromatographiequalität) mit dem Gerät, indem Sie das Ende der Lösungsmittelröhrchen A und B in die entsprechenden Lösungsmittelflaschen einführen.
- Filtern Sie alle mobilen Phasen (jeweils 500 ml) durch einen 0,22-μm-Filter und beschallen Sie sie länger als 30 Minuten.
- Klicken Sie im Softwarefenster auf Instrument | Einlassmethode , um die Bedingungen für das Flüssigkeitschromatogramm zu bearbeiten.
- Stellen Sie die Gradientenbedingungen der mobilen Phase B wie folgt ein: eine Flussrate von 1,0 ml/min; 0-0,5 min, 5%; 0,5-3,5 min, 5 % bis 50 %; 3,5-6,5 min, 50% bis 100%; 6,5-7 min, 100%; 7-10 min, 100% bis 5%.
- Stellen Sie die Injektionsrate der Proben in die UPLC-Q-TOF-MS auf 0,2 ml/min ein.
HINWEIS: Die Injektion der Probe wird mit einem vollautomatischen Probenehmer programmiert.
- Wählen Sie im Softwarefenster MS-Methode und stellen Sie dann die Parameter von Q-TOF-MS ein: eine Durchflussrate des Trocknungsgases (N2) von 8 l/min, eine Temperatur von 300-350 °C; einer Kapillarspannung von 4.500 V; einer Kollisionsenergie von 5-45 V; und einem vollen Scanbereich von 40-800 Da.
- Platzieren Sie die Probenfläschchen an den entsprechenden Stellen der Probenschalen anhand der Seriennummer und setzen Sie die Probenschalen wieder in die Probenkammer ein.
HINWEIS: Halten Sie die Probenschalen flach und stellen Sie sicher, dass die Tür der Probenkammer geschlossen ist. - Wählen Sie im Softwarefenster Datei | Neu beim Erstellen einer Datenbank. Benennen Sie die Datenbank.
- Laden Sie das oben erstellte Beispielprogramm, indem Sie MS File | Inlet-Datei | Volumen injizieren.
- Speichern Sie die Datenbank im Beispielordner des Projekts, indem Sie auf Datei | Speichern.
- Wählen Sie Ausführen | Beginnen Sie im Hauptfenster der Software, wählen Sie dann Beispieldaten erfassen aus, und klicken Sie im Fenster der Ausführung der Beispielliste starten, um Daten zu sammeln, auf OK .
HINWEIS: Das Echtzeit-Chromatogramm kann angezeigt werden, indem Sie auf Chromatogramm | Echtzeit-Aktualisierung während des Datenerfassungsprozesses. - Verarbeiten Sie die Daten in der Software, indem Sie die Zieldatenzeile auswählen und auf das Fenster Chromatogramm klicken, um das MS-Scan-Chromatogramm anzuzeigen.
- Klicken Sie im Fenster Chromatogramm auf Anzeige | TIC | ScanWaveDS | Ablaufverfolgung hinzufügen | OK , um die Massenspektren des Tochterscans zu erhalten.
- Identifizieren Sie die Metaboliten, indem Sie die Chromatogramme der 2,4-Dibromphenol-Behandlung mit denen der Kontrollen vergleichen.
- Aufklärung der Metabolitenkandidaten anhand der Retentionszeit, der Masse und der Fragmentierungsmuster16,17.
ANMERKUNG: Der Fehler der Massengenauigkeit zwischen den experimentellen m/z-Werten der Mutterionen der Metabolitenkandidaten und den entsprechenden theoretischen m/z sollte weniger als 10 ppm betragen.
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Representative Results
Die Schritte des Protokolls sind in Abbildung 1 dargestellt. Dem Protokoll folgend, verglichen wir das Chromatogramm des Karotten-Kallusextrakts aus der 2,4-Dibromphenol-Behandlung mit den Kontrollen und fanden acht verschiedene Peaks, die in der 2,4-Dibromphenol-Behandlung vorhanden sind, aber in den Kontrollen fehlten (Abbildung 2). Dies deutet darauf hin, dass insgesamt acht Metaboliten von 2,4-Dibromphenol (M562, M545, M661, M413, M339, M380, M424 und M187) erfolgreich in der mit 2,4-Dibromphenol behandelten Karottenkallus nachgewiesen wurden. Darüber hinaus wurde der Peak des Ausgangs-2,4-Dibromphenols (Retentionszeit = 0,85 min) im Chromatogramm der 2,4-Dibromphenol-Behandlung nicht gefunden (Abbildung 2), was darauf hindeutet, dass 2,4-Dibromphenol unter den experimentellen Bedingungen im Karottenkallus schnell metabolisiert wurde.
Die chromatographischen und Masseninformationen, die zur Identifizierung der Metaboliten von 2,4-Dibromphenol in der Karottenkallus verwendet werden, sind in Tabelle 1 zusammengefasst. 2,4-Dibromphenol, das in Karottenkallus inkubiert wurde, führte zur Bildung von Metaboliten durch direkte Konjugation mit Glukose (M562, M545, M661 und M413) und Aminosäuren (M339, M380 und M424). Zum Beispiel produzierte M413 Fragmente bei m/z 250,8954 und 163,1485, die Dibutylphthalat (DBP) und Glucose (C6H11O5) entsprechen. M413 wurde weiter metabolisiert, um Disaccharid-Konjugationsmetaboliten M661, M545 und M562 durch Zugabe von Pentose oder Hexose zu bilden. Es wurde spekuliert, dass es sich bei M339, M380 und M424 um 2,4-Dibromphenolalanin, 2,4-Dibromphenolacetylalanin und 2,4-Dibromphenolacetylaspartinsäure handelt, da sie den charakteristischen neutralen Verlust von Aminosäure (C3H6NO2), Acetylalanin (C5H8NO3) und Acetylaspartinsäure(C6H8NO5) aufweisen und dieentsprechenden Fragmente bei m/z89,0932 erzeugen. 129.1140 bzw. 173.123515. Die vorgestellten Ergebnisse deuten darauf hin, dass Pflanzenkalluskulturen als effizientes und zuverlässiges Werkzeug zur Aufklärung des Stoffwechsels von Xenobiotika in Nutzpflanzen eingesetzt werden können.
Abbildung 1: Schematische Darstellung der Methode. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Die Chromatogramme für 2,4-Dibromphenol (das eingefügte Bild) und die Metaboliten von 2,4-Dibromphenol. Diese Abbildung wurde mit Genehmigung von Sun et al.15 angepasst. Copyright (2018) American Chemical Society. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| Metabolit | RT (min) | ESI-Modus | Beobachtet m/z |
Berechnet m/z |
Prädizierte Formel | Fragmente (m/z) | Konfidenzniveau | |||
| M562-KARTON | 0.7 | -H | 562.201 | 562.201 | C18H26Br2O10 | 250,8954(-DBP) | Stufe 2b | |||
| 170.9914(-br) | MS, MS2 | |||||||||
| M545-KARTON | 1.6 | -H | 545.151 | 545.1506 | C17H22Br2O10 | 250,8954(-DBP) | Stufe 2b | |||
| 170.9914(-br) | ||||||||||
| 528.1433(-OH) | MS, MS2 | |||||||||
| M661-KARTON | 2.9 | -H | 661.222 | 661.2228 | C21H26Br2O14 | 250,8954(-DBP) | Stufe 2b | |||
| 410.3274(-C15H23O13) | MS, MS2 | |||||||||
| M413-KARTON | 4.1 | -H | 413.036 | 413.036 | C12H14Br2O6 | 250,8954(-DBP) | Stufe 1 | |||
| 163.1485(-C6H11O5) | ||||||||||
| 207.8938(250-CO2) | Synthetischer Standard, RT, MS, MS2 | |||||||||
| M339-KARTON | 5.2 | +H | 339.994 | 339.9886 | C9 H9Br2NO3 | 250,8954(-DBP) | Stufe 2b | |||
| 87.0773(-C3H6NO2) | MS, MS2 | |||||||||
| M380-KARTON | 5.5 | -H | 380.01 | 380.0094 | C 11 H11Br2NO4 | 250,8954(-DBP) | Stufe 2b | |||
| 129.1140(-C5H8NO3) | MS, MS2 | |||||||||
| M424-KARTON | 5.8 | -H | 424.012 | 424.0189 | C12H11Br2NO6 | 250,8954(-DBP) | Stufe 2b | |||
| 173.1235(-C6H8NO5) | MS, MS2 | |||||||||
| M187-KARTON | 6.1 | -H | 187.995 | 187.9988 | C6H5BrO2 | 109.1027(-Br) | Stufe 1 | |||
| 170.9914(-OH) | Authentic Standard, RT, MS, MS2 | |||||||||
Tabelle 1: Zusammenfassung von 2,4-Dibromphenol und seinen Metaboliten, die in Karotten-Kallusextrakten entdeckt wurden. Diese Tabelle wurde mit Genehmigung von Sun et al.15 angepasst. Copyright (2018) American Chemical Society.
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Discussion
Dieses Protokoll wurde entwickelt, um die Biotransformation von Xenobiotika in Pflanzen effizient zu identifizieren. Der kritische Schritt dieses Protokolls ist die Kultivierung der Pflanzenkallus. Der schwierigste Teil ist die Differenzierung und Pflege des Pflanzenkallus, da der Pflanzenkallus leicht infiziert wird und sich zu Pflanzengewebe entwickelt. Daher ist es wichtig, sicherzustellen, dass alle verwendeten Geräte autoklaviert sind und alle Vorgänge unter aseptischen Bedingungen durchgeführt werden. Die Differenzierung und Pflege der Pflanzenkallus sollte im Dunkeln erfolgen, um autotrophes Wachstum und Überentwicklung zu vermeiden. Darüber hinaus sind die Dosis und die Art der Phytohormone, die dem MS-Medium zugeführt werden, entscheidend für die Differenz des pflanzlichen Kallus, wobei die Pflanzenart berücksichtigt werden sollte. Eine Überdosierung von Phytohormonen führt dazu, dass die Hornhaut ein Gefäßsystem entwickelt, aber unzureichende Phytohormone schränken die Differenzierung der pflanzlichen Hornhautein 18. Das MS-Medium und die Phytohormonvorräte sollten frisch zubereitet werden. Es wird dringend empfohlen, das MS-Medium vor der Einführung der Phytohormone und des aseptischen Hypokotyls zu autoklavieren.
Pigmente wie Chlorophyll in intakten Pflanzen sind ein allgemeines Problem bei LC-HRMS-Messungen19,20. Die Pflanzenkallhaut wird aus aseptischem Hypokotyl gewonnen und ist ohne Chlorophyll transparent. Dies bedeutet, dass die Kalluskultur den Matrixeffekt der intakten Pflanze optimieren kann und eine einfache, aber effiziente Probenvorbereitungstechnik ohne Pigmententfernungsschritte bietet. Die Analyse der Metaboliten von Xenobiotika in pflanzlichen Kallusen wurde mit LC-HRMS auf nicht-zielgerichtete Weise durchgeführt15. Die pflanzliche Kalluskultur in Kombination mit der nicht-gezielten Analyse ermöglicht die effektive Identifizierung eines großflächigen Profilings von Stoffwechselverbindungen. Diese Vorteile machen die Methode ideal für das mechanistische Verständnis des Stoffwechsels von Xenobiotika in Pflanzen. Es gibt jedoch noch einige Einschränkungen für das Protokoll. So kann das Protokoll aufgrund der komplexen Umgebungsbedingungen nur als Referenz für die tatsächliche Situation in Anlagen im Feld verwendet werden. Da verschiedene Pflanzenschwielen unterschiedliche metabolische Fähigkeiten aufweisen, können die identifizierten Metaboliten von Xenobiotika je nach Art der Kallus variieren.
Die Kenntnis der metabolischen Umwandlung von Chemikalien in Pflanzen ist wichtig für ihre sichere Entwicklung und Anwendung. Die hier vorgeschlagene Methode ist effizient und zuverlässig für das Screening der erzeugten Metaboliten in Pflanzen und kann die Bewertung des damit verbundenen Risikos für Ökosysteme und die menschliche Gesundheit durch den Transfer in die Nahrungskette oder die direkte Nahrungsaufnahme von Nutzpflanzen unterstützen. Dieses Protokoll kann die Persistenz von Xenobiotika in Pflanzen untersuchen und dabei helfen, neu auftretende Kontaminanten zu screenen. In Anbetracht ihrer vollen Stoffwechselfähigkeit, mit geringeren Kosten und geringerem Zeit- und Arbeitsaufwand ist die pflanzliche Kalluskultur ein gutes Werkzeug, um das Stoffwechselverhalten vieler Verbindungen zu vergleichen und eine Datenbank für die Vorhersage möglicher Metaboliten von Xenobiotika aufzubauen.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Diese Studie wurde von der National Natural Science Foundation of China (21976160) und dem Zhejiang Province Public Welfare Technology Application Research Project (LGF21B070006) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2,4-dichlorophenoxyacetic acid | WAKO | 1 mg/L | |
| 20% H2O2 | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 10011218-500ML | |
| 4-n-NP, >99% | Dr. Ehrenstorfer GmbH | ||
| 4-n-NP-d4 | Pointe-Claire | ||
| 6-benzylaminopurine | WAKO | 0.5 mg/L | |
| 75% ethanol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 1269101-500ML | |
| 7890A-5975 gas chromatography | Agilent | ||
| ACQULTY ultra-performance liquid chromatography | Waters | ||
| Amber glass vials | Waters | ||
| Artificial climate incubator | Ningbo DongNan Lab Equipment Co.,LTD | RDN-1000A-4 | |
| Autoclaves | STIK | MJ-Series | |
| C18 column | ACQUITY UPLC BEH | ||
| Centrifuge | Thermo Fisher | ||
| DB-5MS capillary column | Agilent | ||
| Dichloromethane | Sigma-Aldrich | 40071190-4L | |
| Freeze dryer | SCIENTZ | ||
| High-throughput tissue grinder | SCIENTZ | ||
| Methanol | Sigma-Aldrich | ||
| MicrOTOF-QII mass spectrometer | Bruker Daltonics | ||
| Milli-Q system | Millipore | MS1922801-4L | |
| Murashige & Skoog medium | HOPEBIO | HB8469-7 | |
| N-hexane | Sigma-Aldrich | H109658-4L | |
| Nitrogen blowing instrument | AOSHENG | MD200-2 | |
| NP isomers, >99% | Dr. Ehrenstorfer GmbH | ||
| Oasis HLB cartridges | Waters | 60 mg/3 mL | |
| Research plus | Eppendorf | 100-1000 µL | |
| Seeds of Little Finger carrot (Daucus carota var. sativus) | Shouguang Seed Industry Co., Ltd | ||
| Shaking Incubators | Shanghai bluepard instruments Co.,ltd. | THZ-98AB | |
| Solid phase extractor | AUTO SCIENCE | ||
| Ultrasound machine | ZKI | UC-6 | |
| UV-sterilized ultra-clean workbench | AIRTECH |
References
- Chakraborty, P., et al. Baseline investigation on plasticizers, bisphenol A, polycyclic aromatic hydrocarbons and heavy metals in the surface soil of the informal electronic waste recycling workshops and nearby open dumpsites in Indian metropolitan cities. Environmental Pollution. 248, 1036-1045 (2019).
- Abril, C., Santos, J. L., Martin, J., Aparicio, I., Alonso, E. Occurrence, fate and environmental risk of anionic surfactants, bisphenol A, perfluorinated compounds and personal care products in sludge stabilization treatments. Science of the Total Environment. 711, 135048 (2020).
- Xu, Y. W., et al. Determination and occurrence of bisphenol A and thirteen structural analogs in soil. Chemosphere. 277, 130232 (2021).
- Cai, Q. Y., et al. Occurrence of nonylphenol and nonylphenol monoethoxylate in soil and vegetables from vegetable farms in the Pearl River Delta, South China. Archives of Environmental Contamination and Toxicology. 63 (1), 22-28 (2012).
- Wang, S. Y., et al. et al Migration and health risks of nonylphenol and bisphenol a in soil-winter wheat systems with long-term reclaimed water irrigation. Ecotoxicology and Environmental Safety. 158, 28-36 (2018).
- Gunther, K., Racker, T., Bohme, R. An isomer-specific approach to endocrine-disrupting nonylphenol in infant food. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 65 (6), 1247-1254 (2017).
- Van Eerd, L. L., Hoagland, R. E., Zablotowicz, R. M., Hall, J. C. Pesticide metabolism in plants and microorganisms. Weed Science. 51 (4), 472-495 (2003).
- Hillebrands, L., Lamshoeft, M., Lagojda, A., Stork, A., Kayser, O. Evaluation of callus cultures to elucidate the metabolism of tebuconazole, flurtamone, fenhexamid, and metalaxyl-M in Brassica napus L., Glycine max (L.) Merr., Zea mays L., and Triticum aestivum L. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 68 (48), 14123-14134 (2020).
- Macherius, A., et al. Metabolization of the bacteriostatic agent triclosan in edible plants and its consequences for plant uptake assessment. Environmental Science & Technology. 46 (19), 10797-10804 (2012).
- Sun, J. Q., et al. Uptake and metabolism of nonylphenol in plants: Isomer selectivity involved with direct conjugation. Environmental Pollution. 270, 116064 (2021).
- Schymanski, E. L., et al. Identifying small molecules via high resolution mass spectrometry: communicating confidence. Environmental Science & Technology. 48 (4), 2097-2098 (2014).
- Moschet, C., Anumol, T., Lew, B. M., Bennett, D. H., Young, T. M. Household dust as a repository of chemical accumulation: new insights from a comprehensive high-resolution mass spectrometric study. Environmental Science & Technology. 52 (5), 2878-2887 (2018).
- Ren, Z., et al. Hydroxylated PBDEs and brominated phenolic compounds in particulate matters emitted during recycling of waste printed circuit boards in a typical e-waste workshop of South China. Environmental Pollution. 177, 71-77 (2013).
- de Wit, C. A. An overview of brominated flame retardants in the environment. Chemosphere. 46 (5), 583-624 (2002).
- Sun, J. Q., Chen, Q., Qian, Z. X., Zheng, Y., Yu, S. A., Zhang, A. P. Plant Uptake and Metabolism of e,4-Dibromophenol in Carrot: In Vitro Enzymatic Direct Conjugation. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 66 (17), 4328-4335 (2018).
- Chibwe, L., Titaley, I. A., Hoh, E., Simonich, S. L. M. Integrated framework for identifying toxic transformation products in complex environmental mixtures. Environmental Science & Technology Letters. 4 (2), 32-43 (2017).
- Hollender, J., Schymanski, E. L., Singer, H. P., Ferguson, P. L. Nontarget screening with high resolution mass spectrometry in the environment: ready to go. Environmental Science & Technology. 51 (20), 11505-11512 (2017).
- Nafisi, M., Fimognari, L., Sakuragi, Y. Interplays between the cell wall and phytohormones in interaction between plants and necrotrophic pathogens. Phytochemistry. 112, 63-71 (2015).
- Zhang, Q., et al. Multiple metabolic pathways of 2,4,6-tribromophenol in rice plants. Environmental Science & Technology. 53 (13), 7473-7482 (2019).
- Hou, X., et al.
