Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Environment
Click here for the English version

Environment

הבהרת חילוף החומרים של 2,4-דיברומופנול בצמחים

Published: February 10, 2023 doi: 10.3791/65089
Automatic Translation
1, 2, 3, 1, 2, 1
1Key Laboratory of Microbial Control Technology for Industrial Pollution in Zhejiang Province, College of Environment, Zhejiang University of Technology, 2International Joint Research Center for Persistent Toxic Substances (IJRC-PTS), College of Environment, Zhejiang University of Technology, 3Research and Teaching Center of Agriculture, Zhejiang Open University

Summary

הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה פשוטה ויעילה לזיהוי מטבוליטים של 2,4-דיברומופנול בצמחים.

Abstract

גידולים חקלאיים עלולים להיחשף באופן נרחב למזהמים אורגניים, שכן הקרקע מהווה שקע מרכזי למזהמים המושלכים לסביבה. כך נוצרת חשיפה פוטנציאלית של בני אדם באמצעות צריכת מזונות שהצטברו במזהמים. הבהרת הספיגה והמטבוליזם של קסנוביוטיקה בגידולים חיונית להערכת הסיכון לחשיפה תזונתית בבני אדם. עם זאת, עבור ניסויים כאלה, השימוש בצמחים שלמים דורש ניסויים ארוכי טווח ופרוטוקולים מורכבים להכנת דגימות שיכולים להיות מושפעים מגורמים שונים. תרביות יבלות צמחיות בשילוב עם ספקטרומטריית מסות ברזולוציה גבוהה (HRMS) עשויות לספק פתרון לזיהוי מדויק וחוסך זמן של מטבוליטים של קסנוביוטיקה בצמחים, שכן הן יכולות למנוע הפרעה מהמיקרו-סביבה המיקרוביאלית או הפטרייתית, לקצר את משך הטיפול ולפשט את אפקט המטריצה של צמחים שלמים. 2,4-dibromophenol, מעכב בעירה טיפוסי ומשבש אנדוקריני, נבחר כחומר המודל בשל הופעתו הנפוצה בקרקע ופוטנציאל ספיגתו על ידי צמחים. כאן, יבלת צמחית הופקה מזרעי אספסיס ונחשף למדיום תרבית סטרילי המכיל 2,4-דיברומופנול. התוצאות הראו כי שמונה מטבוליטים של 2,4-dibromophenol זוהו ברקמות יבלת הצמח לאחר 120 שעות של דגירה. זה מצביע על כך 2,4-dibromophenol היה מטבוליזם במהירות ברקמות יבלת הצמח. לפיכך, פלטפורמת תרבית יבלת הצמחים היא שיטה יעילה להערכת ספיגה ומטבוליזם של קסנוביוטיקה בצמחים.

Introduction

מספר גדל והולך של מזהמים אורגניים הושלכו לסביבה עקב פעילות אנתרופוגנית1,2, והקרקע נחשבת לכיור עיקרי עבור מזהמים אלה 3,4. המזהמים בקרקע יכולים להיקלט על ידי צמחים ולהיות מועברים פוטנציאלית לאורגניזמים ברמה טרופית גבוהה יותר לאורך שרשראות מזון, על ידי כניסה ישירה לגוף האדם באמצעות צריכת יבולים, וכתוצאה מכך להוביל לחשיפה לא מכוונת 5,6. צמחים משתמשים במסלולים שונים כדי לעכל קסנוביוטיקה לניקוי רעלים7; הבהרת חילוף החומרים של קסנוביוטיקה חשובה, שכן היא שולטת בגורלם האמיתי של מזהמים בצמחים. מכיוון שהמטבוליטים יכולים להיות מופרשים על ידי עלים (לאטמוספירה) או שורשים, קביעת המטבוליטים בשלבים המוקדמים מאוד של החשיפה ולכן מספקת את האפשרות לבדוק מספר רב של מטבוליטים8. עם זאת, מחקרים המשתמשים בצמחים שלמים דורשים ניסויים ארוכי טווח ופרוטוקולי הכנת דגימות מורכבים שיכולים להיות מושפעים מגורמים שונים.

תרביות יבלות צמחיות, אם כן, הן חלופה טובה לחקר חילוף החומרים של קסנוביוטיקה בצמח, שכן הן יכולות לקצר מאוד את זמן הטיפול. תרביות אלה שוללות הפרעות מיקרוביאליות ופירוק פוטוכימי, מפשטות את אפקט המטריצה של צמחים שלמים, מתקננות את תנאי הגידול ודורשות פחות מאמץ ניסיוני. תרביות יבלות צמחיות יושמו בהצלחה כגישה חלופית במחקרים מטבוליים של טריקלוזן9, נונילפנול10 וטבוקונזול8. מחקרים אלה הראו כי הדפוסים המטבוליים בתרביות יבלות היו דומים לאלה שבצמחים שלמים. מחקר זה מציע שיטה לזיהוי יעיל ומדויק של מטבוליטים של קסנוביוטיקה בצמחים ללא פרוטוקולים מורכבים וגוזלי זמן. כאן, אנו משתמשים בתרביות יבלות צמחיות בשילוב עם ספקטרומטריית מסות ברזולוציה גבוהה לניתוח מטבוליטים עם אותות בעוצמה נמוכה11,12.

לשם כך, תרחיפים של יבלת גזר (Daucus carota var. sativus) נחשפו ל-100 מיקרוגרם/ליטר של 2,4-דיברומופנול במשך 120 שעות בשייקר ב-130 סל"ד וב-26 מעלות צלזיוס. 2,4-דיברומופנול נבחר בשל פעילותו האנדוקרינית המשבשת13 והופעתו הנרחבת בקרקע14. המטבוליטים חולצו ונותחו על ידי ספקטרומטריית מסות ברזולוציה גבוהה. הפרוטוקול המוצע כאן יכול לחקור את חילוף החומרים בצמח של סוגים אחרים של תרכובות אורגניות שניתן ליונן.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. הבחנה של יבלת גזר

הערה: Autoclave כל הציוד המשמש כאן ולבצע את כל הפעולות בשולחן עבודה מעוקר UV אולטרה נקי.

  1. ורנליזציה של הזרעים על ידי טבילת זרעי גזר אחידים (Daucus carota var. sativus) לתוך מים deionized ב 4 ° C במשך 16 שעות.
  2. יש לעקר את הזרעים הוורנליים עם 75% אתנול למשך 20 דקות, ולאחר מכן לשטוף שלוש פעמים במים סטריליים שעברו דה-יוניזציה בתנאים אספטיים.
  3. עוד לעקר את הזרעים עם 20% H 2 O2במשך 20 דקות, ולשטוף אותם עם מים מעוקרים deionized שש פעמים בתנאים אספטיים.
  4. להנביט את הזרעים על ידי זריעתם על מדיום טרשת נפוצה נטול הורמונים (pH 5.8, autoclaved ב 121 ° C במשך 20 דקות) המכיל 1% אגר-ג'ל, ולדגור ב 26 ° C עם photoperiod 16 שעות (350 μmol / m2s) במשך 15 ימים.
  5. להשיג את explants על ידי חיתוך hypocotyl ו cotyledon של שתילים לחתיכות קטנות (0.5 ס"מ).
  6. הפכו את הצמחים לצלחות פטרי (שניים עד ארבעה צמחים בכל מנה) המכילות 15-20 מ"ל של מדיום טרשת נפוצה אספטית בתוספת אוקסימון (2,4-dichlorophenoxyacetic acid; 1 מ"ג/ליטר) ופיטוקינין (6-בנזילאמינופורין; 0.5 מ"ג/ליטר) בתנאים אספטיים.
  7. לדגור את explants בחושך ב 26 מעלות צלזיוס במשך 3-4 שבועות כדי לגרום את היבלת.
  8. מפרידים את רקמות היבלות (בקוטר של כ-1 ס"מ) שנוצרו מהצמחים הראשוניים באמצעות אזמל סטרילי ומלקחיים.
    הערה: רקמות היבלת החדשות שנוצרו הן בצבע לבן עד צהוב שמנת ומתחברות באופן רופף לצמחים הראשוניים.

2. טיפול 2,4-דיברומופנול

  1. להמיס 1 מיקרוגרם של 2,4-dibromophenol ב 10 מ"ל של נוזל אספטי MS בינוני (הריכוז הסופי של 2,4-dibromophenol הוא 100 ppb, pH 5.6-7.0).
  2. הוסף 3 גרם של יבלת גזר טרי (שלב 1.8) לתוך צלוחיות זכוכית המכילות את תמיסת 2,4-dibromophenol מוכן (משלב 2.1) בתנאים אספטיים. שקול את זה כמו טיפול 2,4-dibromophenol.
    הערה: צלוחיות הזכוכית היו אוטוקלאביות ואטומות באמצעות סרט פרפין.
  3. כלול בקרה בינונית המכילה את תמיסת 2,4-dibromophenol בלבד (שהוכנה בשלב 2.1) כדי להעריך את הפירוק האביוטי של 2,4-dibromophenol.
  4. כלול בקרה ריקה המכילה את יבלת הגזר בלבד (ללא תמיסת 2,4-דיברומופנול) כדי לבדוק אם יש זיהום פוטנציאלי.
    1. הכינו את הבקרה הריקה המכילה גזר על ידי הוספת 3 גרם של יבלת גזר טרייה שנאספה רק לתוך 10 מ"ל של מדיום MS סטרילי.
  5. לדגור על הטיפול 2,4-dibromophenol ואת הפקדים בינוני וריק ב 130 סל"ד ו 26 ° C בחושך באינקובטור במשך 120 שעות.
  6. הסר את צלוחיות הזכוכית מהאינקובטור כדי לאסוף את הדגימות מהטיפול והבקרה של 2,4-dibromophenol לאחר 120 שעות של דגירה.
    הערה: כל הדגימות הוכנו במשולש.

3. הכנת מדגם

  1. יש להפריד בזהירות את היבלת ממדיום הטרשת הנפוצה על ידי סינון עם מסנני סיבי זכוכית (0.45 מיקרומטר) לטיפול ב-2,4-דיברומופנול ולקבוצת הביקורת. לאסוף את היבלת לאחר שטיפה עם מים טהורים במיוחד שלוש פעמים.
  2. יבש בהקפאה את היבלת שנאספה בחנקן נוזלי, ולאחר מכן הומוגניזציה של היבלת שנאספה (0.2 גרם) עם מטחנת רקמות בעלת תפוקה גבוהה ב -70 הרץ למשך 3 דקות.
  3. ספייק את היבלת ההומוגנית על ידי הוספת 50 μL של 25 מ"ג / ליטר פונדקאית 4-n-NP-d4 עם מיקרומזרק זכוכית ולאחר מכן מערבל במשך 1 דקות.
  4. סוניק את הדגימות עם 5 מ"ל של מתנול/מים (1:1, v/v) באולטרה-סוניקטור (150 W, 40 kHz) מלא במי קרח למשך 30 דקות, כדי לחלץ 2,4-dibromophenol ואת המטבוליטים.
  5. צנטריפוגו את המתלים בטמפרטורה של 8,000 x גרם ב-4°C למשך 10 דקות, ואספו את הסופרנאטנטים באמצעות פיפטציה.
    1. חזור על תהליכי המיצוי של דגימת היבלת שלוש פעמים ושלב את התמציות.
  6. העבר את התמציות דרך מחסניות מיצוי שלב מוצק הידרופילי ליפופילי מאוזן (HLB SPE) עם קצב זרימה של 1 מ"ל/דקה.
    הערה: מחסניות HLB SPE טופלו מראש ברצף עם 6 מ"ל מתנול ו-6 מ"ל מים כדי להסיר הפרעות.
  7. להצדיע את analytes על ידי העברת 6 מ"ל של מתנול דרך מחסניות HLB SPE. לאחר מכן, רכז את eluents המתקבל ל 1 מ"ל תחת זרם עדין של גז חנקן לניתוח אינסטרומנטלי.
  8. הזריקו 10 μL של אלואנטים כתוצאה מכך לתוך UPLC-Q-TOF-MS עבור 2,4-dibromophenol וניתוח מטבוליטים שלהם15.
    1. סנן את כל הדגימות עם קרום ניילון 0.22 מיקרומטר לפני ניתוח אינסטרומנטלי.

4. ניתוח אינסטרומנטלי

הערה: 2,4-dibromophenol וניתוחי המטבוליטים שלהם בוצעו על כרומטוגרף נוזלי אולטרה-ביצועי (UPLC) בשילוב עם ספקטרומטר מסות micrOTOF-QII המצויד ביינון אלקטרוספריי (ESI), הפועל במצב יונים חיוביים ושליליים.

  1. פתח את דלת מחמם העמודים והתקן את עמוד UPLC על ידי חיבור כניסת העמוד לשסתום ההזרקה ויציאת העמוד לכניסת ספקטרומטר המסות.
    הערה: עמוד C18 (50 מ"מ x 2.1 מ"מ; גודל חלקיקים 1.7 מיקרומטר) שימש להפרדת אנליטים ב- 40 ° C.
  2. חבר את פאזה A ניידת (מים טהורים במיוחד) ופאזה B ניידת (מתנול ברמת כרומטוגרפיה) למכשיר על ידי הכנסת קצה צינורות הממס A ו- B לבקבוקי הממס המתאימים, בהתאמה.
    1. סנן את כל השלבים הניידים (500 מ"ל עבור כל אחד) דרך מסנן 0.22 מיקרומטר, ובצע סוניזציה במשך יותר מ- 30 דקות.
  3. בחלון התוכנה, לחץ על Instrument | שיטת כניסה לעריכת התנאים עבור הכרומטוגרמה הנוזלית.
    1. הגדר את תנאי השיפוע של שלב B הנייד באופן הבא: קצב זרימה של 1.0 מ"ל/דקה; 0-0.5 דקות, 5%; 0.5-3.5 דקות, 5% עד 50%; 3.5-6.5 דקות, 50% עד 100%; 6.5-7 דקות, 100%; 7-10 דקות, 100% עד 5%.
    2. הגדר את קצב ההזרקה של הדגימות לתוך UPLC-Q-TOF-MS כ- 0.2 מ"ל/דקה.
      הערה: הזרקת הדגימה מתוכנתת באמצעות דוגם אוטומטי לחלוטין.
  4. בחלון התוכנה, בחר MS Method ולאחר מכן הגדר את הפרמטרים של Q-TOF-MS: קצב זרימה של גז ייבוש (N2) של 8 ליטר לדקה, טמפרטורה של 300-350 מעלות צלזיוס; מתח נימי של 4,500 וולט; אנרגיית התנגשות של 5-45 וולט; וטווח סריקה מלא של 40-800 Da.
  5. מקם את בקבוקוני הדגימה במיקומים המתאימים של מגשי הדגימה לפי מספר סידורי, והכנס מחדש את מגשי הדגימה לתא הדגימה.
    הערה: שמור על מגשי הדגימה שטוחים וודא שדלת תא הדגימה סגורה.
  6. בחלון התוכנה, בחר קובץ | חדש כדי ליצור מסד נתונים. תן שם למסד הנתונים.
  7. טען את התוכנית לדוגמה שנוצרה לעיל על-ידי בחירת קובץ MS | קובץ כניסה | הזרקת נפח.
  8. שמור את מסד הנתונים בתיקיה לדוגמה של הפרויקט על-ידי לחיצה על קובץ | שמור.
  9. בחר הפעל | התחל בחלון הראשי של התוכנה ולאחר מכן בחר רכוש נתונים לדוגמה ולחץ על אישור בחלון של הפעלת הרשימה לדוגמה התחל כדי לאסוף נתונים.
    הערה: ניתן להציג את הכרומטוגרמה בזמן אמת על-ידי לחיצה על כרומטוגרמה | עדכון בזמן אמת במהלך תהליך רכישת הנתונים.
  10. עבד את הנתונים בתוכנה על ידי בחירת שורת נתוני היעד ולחיצה על חלון הכרומטוגרמה כדי להציג את כרומטוגרמה הסריקה של MS.
  11. בחלון הכרומטוגרמה , לחץ על תצוגה | טיק | ScanWaveDS | הוספת מעקב | אישור לגרום לבת לסרוק ספקטרום מסה.
  12. זהה את המטבוליטים על ידי השוואת הכרומטוגרמות של הטיפול 2,4-dibromophenol ואת הבקרות.
  13. להבהיר את המועמדים למטבוליט לפי זמן השמירה, המסה ודפוסי הפיצול16,17.
    הערה: השגיאה של דיוק המסה בין ערכי m/z ניסיוניים של יוני האב של המועמדים למטבוליט לבין m/z התיאורטי המתאים להם צריכה להיות קטנה מ- 10 ppm.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

שלבי הפרוטוקול מתוארים באיור 1. בעקבות הפרוטוקול, השווינו את הכרומטוגרמה של תמצית יבלת הגזר מהטיפול ב-2,4-דיברומופנול לקבוצת הביקורת, ומצאנו שמונה פסגות ברורות שנמצאות בטיפול ב-2,4-דיברומופנול אך נעדרות בקבוצת הביקורת (איור 2). זה מצביע על כך שבסך הכל שמונה מטבוליטים של 2,4-דיברומופנול (M562, M545, M661, M413, M339, M380, M424 ו-M187) זוהו בהצלחה ביבלת גזר שטופלה ב-2,4-דיברומופנול. נוסף על כך, השיא של האב 2,4-dibromophenol (זמן שמירה = 0.85 דקות) לא נמצא בכרומטוגרמה של הטיפול ב-2,4-dibromophenol (איור 2), מה שמצביע על כך ש-2,4-dibromophenol עבר מטבוליזם מהיר ביבלת הגזר בתנאי הניסוי.

המידע הכרומטוגרפי והמסה המשמש לזיהוי המטבוליטים של 2,4-דיברומופנול ביבלת הגזר מסוכמים בטבלה 1. 2,4-דיברומופנול שהודגר ביבלת גזר הוביל להיווצרות מטבוליטים על ידי צימוד ישיר עם גלוקוז (M562, M545, M661 ו-M413) וחומצות אמינו (M339, M380 ו-M424). לדוגמה, M413 ייצר מקטעים ב- m/z 250.8954 ו- 163.1485, המתאימים לדיבוטיל פתלאט (DBP) וגלוקוז (C6H11O5). M413 עבר מטבוליזם נוסף ליצירת מטבוליטים של צימוד דו-סוכרים M661, M545 ו-M562, על ידי הוספת פנטוז או הקסוס. M339, M380 ו-M424 הוערכו כ-2,4-דיברומופנול אלנין, 2,4-דיברומופנול אצטילנין ו-2,4-דיברומופנול חומצה אצטילספרטית, שכן יש להם את האובדן הניטרלי האופייני של חומצת אמינו (C 3 H 6 NO2), אצטילנין (C 5 H 8 NO3) וחומצה אצטילספארטית (C6H8NO5), המייצרים את השברים המתאימים ב-m/z 89.0932, 129.1140 ו- 173.1235, בהתאמה15. התוצאות המוצגות מצביעות על כך שניתן להשתמש בתרביות יבלות צמחיות ככלי יעיל ואמין להבהרת חילוף החומרים של קסנוביוטיקה ביבולים.

Figure 1
איור 1: סכמת שיטה. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: הכרומטוגרמות של 2,4-dibromophenol (התמונה המוחדרת) והמטבוליטים של 2,4-dibromophenol. נתון זה הותאם באישור Sun et al.15. זכויות יוצרים (2018) האגודה האמריקאית לכימיה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

מטבוליט RT (מינ') מצב ESI ציין
מ/ז		 מחושב
מ/ז		 נוסחה מבוססת שברים (m/z) רמת ביטחון
M562 0.7 -H 562.201 562.201 ג18ח26בר2O10 250.8954(-DBP) רמה 2b
170.9914(-Br) MS, MS2
M545 1.6 -H 545.151 545.1506 ג17ח22בר2o10 250.8954(-DBP) רמה 2b
170.9914(-Br)
528.1433(-אה) MS, MS2
M661 2.9 -H 661.222 661.2228 ג21ח26בר2o14 250.8954(-DBP) רמה 2b
410.3274(-ג15ח23או13) MS, MS2
M413 4.1 -H 413.036 413.036 ג12ח14בר2O6 250.8954(-DBP) רמה 1
163.1485(-ג6ח11או5)
207.8938(250-CO2) תקן סינתטי, RT, MS, MS2
M339 5.2 +H 339.994 339.9886 ג9ח9בר2לא3 250.8954(-DBP) רמה 2b
87.0773(-ג3ח6לא2) MS, MS2
M380 5.5 -H 380.01 380.0094 ג11ח11בר2לא4 250.8954(-DBP) רמה 2b
129.1140(-ג5ח8לא3) MS, MS2
M424 5.8 -H 424.012 424.0189 ג12ח11בר2לא6 250.8954(-DBP) רמה 2b
173.1235(-ג6ח8לא5) MS, MS2
M187 6.1 -H 187.995 187.9988 ג6ח5ברו2 109.1027(-BR) רמה 1
170.9914(-אה) תקן אותנטי, RT, MS, MS2

טבלה 1: סיכום של 2,4-dibromophenol והמטבוליטים שלו שהתגלו בתמציות יבלת גזר. טבלה זו הותאמה באישור Sun et al.15. זכויות יוצרים (2018) האגודה האמריקאית לכימיה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

פרוטוקול זה פותח כדי לזהות ביעילות את הביוטרנספורמציה של קסנוביוטיקה בצמחים. השלב הקריטי של פרוטוקול זה הוא התרבות של יבלת הצמח. החלק הקשה ביותר הוא התמיינות ותחזוקה של יבלת הצמח, מכיוון שהיבלת הצמחית נגועה בקלות ומתפתחת לרקמות הצמח. לכן, חשוב לוודא כי כל הציוד המשמש הוא autoclaved, וכל הפעולות מבוצעות בתנאים אספטיים. ההבחנה והתחזוקה של יבלת הצמח צריכה להיעשות בחושך כדי למנוע צמיחה אוטוטרופית ופיתוח יתר. בנוסף, המינון והסוגים של פיטוהורמונים המוספים למדיום הטרשת הנפוצה הם קריטיים לדיפרנציאל של יבלת הצמח, אשר צריך לקחת בחשבון את מיני הצמח. מנת יתר של phytohormones גורם יבלת לפתח מערכת כלי הדם, אבל phytohormones מספיק להגביל את ההתמיינות של צמח callus18. יש להכין את מניות MS medium ו- phytohormone טריים. מומלץ מאוד autoclave המדיום MS לפני כניסתה של phytohormones ואת hypocotyl אספטי.

פיגמנטים כגון כלורופיל בצמחים שלמים הם בעיה כללית במדידות LC-HRMS19,20. יבלת הצמח מופקת מהיפוקוטיל אספטי והיא שקופה ללא כלורופיל. משמעות הדבר היא שתרבית יבלות צמחיות יכולה לייעל את אפקט המטריקס של הצמח השלם ולהציע טכניקת הכנת דגימה קלה אך יעילה ללא שלבי הסרת פיגמנטים. הניתוח של מטבוליטים של קסנוביוטיקה ביבלות צמחיות הושג עם LC-HRMS בדרך לא ממוקדת15. תרבית היבלות הצמחית בשילוב עם ניתוח לא ממוקד מאפשרת זיהוי יעיל של פרופיל בקנה מידה גדול של תרכובות מטבוליות. יתרונות אלה הופכים את השיטה לאידיאלית להבנה מכניסטית של חילוף החומרים של קסנוביוטיקה בצמחים. עם זאת, עדיין קיימות מספר מגבלות לפרוטוקול. לדוגמה, ניתן ליישם את הפרוטוקול רק כהתייחסות למצב האמיתי המתרחש בצמחים בשדה, בשל התנאים הסביבתיים המורכבים. בנוסף, מאחר שיבלות צמחיות שונות מציגות יכולות מטבוליות שונות, המטבוליטים המזוהים של קסנוביוטיקה עשויים להשתנות בהתאם לסוג היבלות.

הכרת השינוי המטבולי של כימיקלים בצמחים חשובה להתפתחותם וליישומם הבטוחים. השיטה המוצעת כאן יעילה ואמינה לסינון המטבוליטים הנוצרים בצמחים, ויכולה לתמוך בהערכת הסיכון הנלווה למערכות אקולוגיות ולבריאות האדם באמצעות העברת שרשרת המזון או צריכה תזונתית ישירה של יבולים. פרוטוקול זה יכול לחקור את ההתמדה של קסנוביוטיקה בצמחים ולעזור לסנן מזהמים חדשים. בהתחשב ביכולת המטבולית המלאה שלה, עם פחות עלויות ופחות זמן ומאמץ, תרבית היבלות הצמחית היא כלי טוב להשוות את ההתנהגויות המטבוליות של תרכובות רבות ולבנות מסד נתונים לחיזוי מטבוליטים אפשריים של קסנוביוטים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgments

מחקר זה נתמך על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (21976160) ופרויקט מחקר יישומי טכנולוגיית רווחה ציבורית במחוז ג'ג'יאנג (LGF21B070006).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2,4-dichlorophenoxyacetic acid WAKO 1 mg/L
20% H2O2 Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. 10011218-500ML
4-n-NP, >99% Dr. Ehrenstorfer GmbH
4-n-NP-d4 Pointe-Claire
6-benzylaminopurine WAKO 0.5 mg/L
75% ethanol Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. 1269101-500ML
7890A-5975 gas chromatography Agilent
ACQULTY ultra-performance liquid chromatography Waters
Amber glass vials Waters
Artificial climate incubator Ningbo DongNan Lab Equipment Co.,LTD RDN-1000A-4
Autoclaves STIK MJ-Series
C18 column ACQUITY UPLC BEH
Centrifuge Thermo Fisher
DB-5MS capillary column Agilent
Dichloromethane Sigma-Aldrich 40071190-4L
Freeze dryer SCIENTZ 
High-throughput tissue grinder SCIENTZ 
Methanol Sigma-Aldrich
MicrOTOF-QII mass spectrometer Bruker Daltonics
Milli-Q system Millipore MS1922801-4L
Murashige & Skoog medium HOPEBIO HB8469-7
N-hexane Sigma-Aldrich H109658-4L
Nitrogen blowing instrument  AOSHENG MD200-2
NP isomers, >99% Dr. Ehrenstorfer GmbH
Oasis HLB cartridges Waters 60 mg/3 mL
Research plus Eppendorf 100-1000 µL
Seeds of Little Finger carrot (Daucus carota var. sativus)  Shouguang Seed Industry Co., Ltd
Shaking Incubators Shanghai bluepard instruments Co.,ltd. THZ-98AB
Solid phase extractor AUTO SCIENCE
Ultrasound machine ZKI UC-6
UV-sterilized ultra-clean workbench AIRTECH

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Chakraborty, P., et al. Baseline investigation on plasticizers, bisphenol A, polycyclic aromatic hydrocarbons and heavy metals in the surface soil of the informal electronic waste recycling workshops and nearby open dumpsites in Indian metropolitan cities. Environmental Pollution. 248, 1036-1045 (2019).
  2. Abril, C., Santos, J. L., Martin, J., Aparicio, I., Alonso, E. Occurrence, fate and environmental risk of anionic surfactants, bisphenol A, perfluorinated compounds and personal care products in sludge stabilization treatments. Science of the Total Environment. 711, 135048 (2020).
  3. Xu, Y. W., et al. Determination and occurrence of bisphenol A and thirteen structural analogs in soil. Chemosphere. 277, 130232 (2021).
  4. Cai, Q. Y., et al. Occurrence of nonylphenol and nonylphenol monoethoxylate in soil and vegetables from vegetable farms in the Pearl River Delta, South China. Archives of Environmental Contamination and Toxicology. 63 (1), 22-28 (2012).
  5. Wang, S. Y., et al. et al Migration and health risks of nonylphenol and bisphenol a in soil-winter wheat systems with long-term reclaimed water irrigation. Ecotoxicology and Environmental Safety. 158, 28-36 (2018).
  6. Gunther, K., Racker, T., Bohme, R. An isomer-specific approach to endocrine-disrupting nonylphenol in infant food. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 65 (6), 1247-1254 (2017).
  7. Van Eerd, L. L., Hoagland, R. E., Zablotowicz, R. M., Hall, J. C. Pesticide metabolism in plants and microorganisms. Weed Science. 51 (4), 472-495 (2003).
  8. Hillebrands, L., Lamshoeft, M., Lagojda, A., Stork, A., Kayser, O. Evaluation of callus cultures to elucidate the metabolism of tebuconazole, flurtamone, fenhexamid, and metalaxyl-M in Brassica napus L., Glycine max (L.) Merr., Zea mays L., and Triticum aestivum L. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 68 (48), 14123-14134 (2020).
  9. Macherius, A., et al. Metabolization of the bacteriostatic agent triclosan in edible plants and its consequences for plant uptake assessment. Environmental Science & Technology. 46 (19), 10797-10804 (2012).
  10. Sun, J. Q., et al. Uptake and metabolism of nonylphenol in plants: Isomer selectivity involved with direct conjugation. Environmental Pollution. 270, 116064 (2021).
  11. Schymanski, E. L., et al. Identifying small molecules via high resolution mass spectrometry: communicating confidence. Environmental Science & Technology. 48 (4), 2097-2098 (2014).
  12. Moschet, C., Anumol, T., Lew, B. M., Bennett, D. H., Young, T. M. Household dust as a repository of chemical accumulation: new insights from a comprehensive high-resolution mass spectrometric study. Environmental Science & Technology. 52 (5), 2878-2887 (2018).
  13. Ren, Z., et al. Hydroxylated PBDEs and brominated phenolic compounds in particulate matters emitted during recycling of waste printed circuit boards in a typical e-waste workshop of South China. Environmental Pollution. 177, 71-77 (2013).
  14. de Wit, C. A. An overview of brominated flame retardants in the environment. Chemosphere. 46 (5), 583-624 (2002).
  15. Sun, J. Q., Chen, Q., Qian, Z. X., Zheng, Y., Yu, S. A., Zhang, A. P. Plant Uptake and Metabolism of e,4-Dibromophenol in Carrot: In Vitro Enzymatic Direct Conjugation. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 66 (17), 4328-4335 (2018).
  16. Chibwe, L., Titaley, I. A., Hoh, E., Simonich, S. L. M. Integrated framework for identifying toxic transformation products in complex environmental mixtures. Environmental Science & Technology Letters. 4 (2), 32-43 (2017).
  17. Hollender, J., Schymanski, E. L., Singer, H. P., Ferguson, P. L. Nontarget screening with high resolution mass spectrometry in the environment: ready to go. Environmental Science & Technology. 51 (20), 11505-11512 (2017).
  18. Nafisi, M., Fimognari, L., Sakuragi, Y. Interplays between the cell wall and phytohormones in interaction between plants and necrotrophic pathogens. Phytochemistry. 112, 63-71 (2015).
  19. Zhang, Q., et al. Multiple metabolic pathways of 2,4,6-tribromophenol in rice plants. Environmental Science & Technology. 53 (13), 7473-7482 (2019).
  20. Hou, X., et al. Glycosylation of tetrabromobisphenol A in pumpkin. Environmental Science & Technology. 53 (15), 8805-8812 (2019).

Tags

מדעי הסביבה גיליון 192
הבהרת חילוף החומרים של 2,4-דיברומופנול בצמחים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wu, J., Yang, X., Wang, Q., Zhou,… More

Wu, J., Yang, X., Wang, Q., Zhou, Q., Zhang, A., Sun, J. Elucidating the Metabolism of 2,4-Dibromophenol in Plants. J. Vis. Exp. (192), e65089, doi:10.3791/65089 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter