Summary
يقيم هذا البروتوكول النشاط الحركي لذبابة الفاكهة من خلال تتبع وتحليل حركة الذباب في ساحة مصنوعة يدويا باستخدام برنامج مفتوح المصدر فيجي ، متوافق مع المكونات الإضافية لتقسيم وحدات البكسل لكل إطار بناء على تسجيل فيديو عالي الدقة لحساب معلمات السرعة والمسافة وما إلى ذلك.
Abstract
ذبابة الفاكهة الميلانية هي كائن نموذجي مثالي لدراسة الأمراض المختلفة بسبب وفرة تقنيات التلاعب الجيني المتقدمة والسمات السلوكية المتنوعة. يعد تحديد النقص السلوكي في النماذج الحيوانية مقياسا حاسما لشدة المرض ، على سبيل المثال ، في الأمراض التنكسية العصبية حيث يعاني المرضى غالبا من ضعف في الوظيفة الحركية. ومع ذلك ، مع توفر أنظمة مختلفة لتتبع وتقييم العجز الحركي في نماذج الذباب ، مثل الأفراد المعالجين بالعقاقير أو المحورة وراثيا ، لا يزال هناك نقص في نظام اقتصادي وسهل الاستخدام للتقييم الدقيق من زوايا متعددة. تم تطوير طريقة تعتمد على واجهة برمجة تطبيق AnimalTracker (API) هنا ، وهي متوافقة مع برنامج معالجة الصور في فيجي ، لإجراء تقييم منهجي لأنشطة حركة كل من الأفراد البالغين واليرقات من الفيديو المسجل ، مما يسمح بتحليل سلوك التتبع الخاص بهم. لا تتطلب هذه الطريقة سوى كاميرا عالية الدقة وتكامل الأجهزة الطرفية للكمبيوتر لتسجيل السلوك وتحليله ، مما يجعلها نهجا فعالا وبأسعار معقولة لفحص نماذج الذباب ذات أوجه القصور السلوكية المعدلة وراثيا أو البيئية. يتم إعطاء أمثلة على الاختبارات السلوكية باستخدام الذباب المعالج دوائيا لإظهار كيف يمكن للتقنيات اكتشاف التغيرات السلوكية في كل من الذباب البالغ واليرقات بطريقة متكررة للغاية.
Introduction
يوفر ذبابة الفاكهة الميلانية كائنا نموذجيا ممتازا للتحقيق في الوظائف الخلوية والجزيئية في نماذج الأمراض العصبية التي تم إنشاؤها بواسطة التعديل الجيني1 ، والعلاج الدوائي2 ، والشيخوخة3. إن الحفظ العالي للمسارات البيولوجية والخصائص الفيزيائية والجينات المتجانسة المرتبطة بالأمراض بين البشر وذبابة الفاكهة يجعل ذبابة الفاكهة تقليدا مثاليا من المستوى الجزيئي إلى المستوى السلوكي4. في العديد من نماذج الأمراض ، يعد النقص السلوكي مؤشرا مهما ، حيث يوفر نموذجا مفيدا لمختلف اعتلالات الأعصاب البشرية 5,6. يستخدم ذبابة الفاكهة الآن لدراسة العديد من الأمراض البشرية ، والنمو العصبي ، والأمراض التنكسية العصبية مثل مرض باركنسون والتصلب الجانبي الضموري7،8. يعد اكتشاف القدرة الحركية لنماذج المرض أمرا بالغ الأهمية لفهم التقدم الممرض وقد يوفر ارتباطا ظاهريا بالآليات الجزيئية الكامنة وراء عملية المرض.
في الآونة الأخيرة ، تم تطوير أدوات برمجية متاحة تجاريا وبرامج فعالة من حيث التكلفة لاستراتيجيات الكشف عن ذبابة الفاكهة الحركية ، مثل الاختبار عالي الإنتاجية في الذباب المجمع9,10 وقياس الحركة في الوقت الفعلي11,12. أحد هذه الأساليب التقليدية هو الانجذاب الجغرافي السلبي التفاعلي السريع (RING) ، والذي يطلق عليه أيضا مقايسة التسلق ، والذي يتضمن قنوات متعددة تسمح باحتواء عدد كبير من الذباب من نفس الجنس والعمر ، مما يقلل من التباين أثناء جمع البيانات 9,13. طريقة أخرى للاختبار المسبق لتحليل السلوك الحركي هي جهاز مراقبة نشاط TriKinetics Drosophila (DAM) ، وهو جهاز يستخدم حزما متعددة للكشف عن حركة نشاط الذباب داخل أنبوب زجاجي رفيع14. يسجل الجهاز الموقع بشكل مستمر ، والذي يمثل الحركة الآلية عن طريق حساب تقاطعات الحزمة لدراسة النشاط وإيقاع الساعة البيولوجية للذباب على مدى فترة زمنية أطول15. على الرغم من أن هذه الطرق قد استخدمت على نطاق واسع في تحليل العيوب السلوكية في ذباب الفاكهة لتحديد التغيرات في الحركة السلوكية ، إلا أنها تتطلب دائما معدات اختبار خاصة أو عمليات تحليل معقدة ، وتقييد تطبيقها في بعض النماذج باستخدام جهاز محدود وبسيط. تقوم الاستراتيجيات الجماعية لتتبع الحيوانات لاختبار ذبابة الفاكهة البالغة ، مثل FlyGrAM11 واختبار جزيرة ذبابة الفاكهة 10 ، بتنفيذ التوظيف الاجتماعي والتتبع الفردي في منطقة محددة مسبقا. ومع ذلك ، قد يكون للتقييد الفردي الاجتماعي في المناطق المتحدية تأثير سلبي على الهويات في الصور ، بسبب تصادم الذباب أو تداخله. على الرغم من أن بعض الطرق القائمة على المواد مفتوحة المصدر ، مثل TRex16 و MARGO 12 و FlyPi17 ، لديها حالة طوارئ ، إلا أنها يمكن أن تتبع الذباب بسرعة مع الاستخدام المرن في الاختبارات السلوكية. ترتبط مناهج الاختبار هذه بتركيبات الأجهزة التجريبية المعقدة أو متطلبات البرامج الخاصة أو لغات الكمبيوتر الاحترافية. بالنسبة لليرقات، فإن قياس المسافة الإجمالية المقطوعة عبر عدد خطوط حدود الشبكة لكل وحدة زمنية18، أو العد التقريبي لانقباضات جدار الجسم للأفراد يدويا19، هي الطرق السائدة لتقييم قدرتها الحركية. بسبب نقص الدقة في المعدات أو الأجهزة وطرق التحليل ، قد تفلت بعض الحركة السلوكية لليرقات من الكشف ، مما يجعل من الصعب تقييم الحركة السلوكية بدقة ، وخاصة الحركة الدقيقة15.
تستخدم الطريقة المطورة الحالية واجهة برمجة تطبيقات AnimalTracker (API) ، المتوافقة مع برنامج معالجة الصور في فيجي (ImageJ) ، لإجراء تقييم منهجي للنشاط الحركي لكل من الذباب البالغ واليرقات من خلال تحليل سلوك التتبع من مقاطع الفيديو عالية الدقة (HD). فيجي هي توزيعة ImageJ برمجية مفتوحة المصدر يمكنها الجمع بين مكتبات البرامج القوية والعديد من لغات البرمجة النصية ، مما يؤدي إلى نماذج أولية سريعة لخوارزميات معالجة الصور ، مما يجعلها شائعة بين علماء الأحياء لقدراتها على تحليل الصور20. في النهج الحالي ، يتم استغلال تكامل فيجي في واجهة برمجة تطبيقات AnimalTracker لتطوير اختبار سلوكي فريد من نوعه لذبابة الفاكهة مع إدخال خوارزمية شخصية ، ويوفر خطوة مفيدة للتوثيق التفصيلي والبرامج التعليمية لدعم القدرات التحليلية القوية للسلوك الحركي (الشكل 1). للتحايل على تعقيد التحديدات الموضوعية في الصور الناتجة عن تصادم الذباب أو تداخله ، تقتصر كل ساحة على استضافة ذبابة واحدة فقط. عند تقييم دقة تتبع النهج ، تم تنفيذه لتتبع وقياس الحركات الحركية لذبابة الفاكهة التي تم إعطاؤها باستخدام عقار روتينون السام ، والذي يستخدم بشكل عام للنماذج الحيوانية لمرض باركنسون ، مما أدى في النهاية إلى اكتشاف ضعف الحركة في العلاج الدوائي21. هذه المنهجية، التي تستخدم برمجيات مفتوحة المصدر ومجانية، لا تتطلب أجهزة عالية التكلفة، ويمكنها تحليل الحركة السلوكية لذبابة الفاكهة بدقة وبشكل متكرر.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تم استخدام W1118 الذباب البالغ واليرقات الثالثة في هذه الدراسة.
1. التحضير التجريبي
ملاحظة: ساحة مفتوحة المجال لتتبع حركة ذبابة الفاكهة مصنوعة من هلام السيليكا عديم اللون والرائحة.
- امزج الكاشف A والكاشف B بنسبة 1:10 ، وفقا لتعليمات الشركة المصنعة لمجموعة السيليكا (انظر جدول المواد). تأكد من إضافة بيكربونات الصوديوم إلى الخليط عن طريق التقليب حتى يتغير اللون إلى اللون الأبيض. انقلي الخليط إلى طبق بتري نظيف وضعيه في فرن على حرارة 40 درجة مئوية لتجفيفه لمدة 48 ساعة.
- اضبط الكاميرا عالية الدقة (انظر جدول المواد) على حامل ثلاثي القوائم ، واضبطها بحيث تكون عدسة الكاميرا عمودية على سطح ساحة السيليكا. ضبط البعد البؤري وفتحات الكاميرا ، تأكد من تركيز الكاميرا على سطح السيليكا وأن الشاشة مضاءة بشكل كاف. يوضح الشكل 1 الإعداد التجريبي.
- انقل ذبابة إلى ساحة المجال المفتوح لتسجيل مقطع فيديو مستمر لا يقل عن 61 ثانية.
ملاحظة: بالنظر إلى الطبيعة البطيئة لليرقات ، يوصى بوقت تسجيل فيديو يزيد عن 10 دقائق.- افتح الفيديو باستخدام فيجي ، واسحب شريط التقدم إلى الإطار الأولي ، ووافق ضمنيا. اختر الجسم الكامل للذبابة باستخدام أداة "الاختيار اليدوي" (الشكل 2B ، C).
- انقر فوق الصورة > ضبط سطوع وتباين > لضبط توازن اللون الأبيض حتى تقترب القيمة الرمادية للمنطقة المحددة من الخلفية العريضة (الشكل 2D-F).
ملاحظة: يتيح تجانس الخلفية للإطار الأول للبرنامج تمييز الخلفية بدون أي كائنات وإنشاء تباين عند وجود ذبابة ، مما يسمح للبرنامج بتتبعها.
- قم بإجراء التجربة بأكملها في بيئة اختبار محددة عند 25 درجة مئوية ورطوبة نسبية 60٪ ، في منطقة هادئة وخالية من التعرض للضوء الساطع.
2. تسجيل الفيديو والمعالجة المسبقة
- بعد فترة قصيرة من التخدير باستخدام 95٪ ثاني أكسيد الكربون (CO2) ، انقل ذبابة إلى الساحة المفتوحة واضغط على زر التسجيل في تطبيق الكاميرا لبدء تسجيل الفيديو.
ملاحظة: لتقليل تأثير المخدر على الحركة ، اترك الذباب يتعافى لمدة 10 دقائق قبل بدء تسجيل الفيديو. يوصى أيضا بالتخدير البارد عن طريق التبريد.- بمجرد أن يتعافى الذباب من التخدير ، ضع طبق الساحة الذي يحتوي على الذبابة تحت الكاميرا وهز اللوحة بسرعة من جانب إلى آخر للتأكد من أن الذبابة تتحرك عند بدء التسجيل.
- عند الانتهاء من التسجيل ، اضغط على زر الإيقاف لإنهاء تسجيل الفيديو.
ملاحظة: تأكد من أن وقت تسجيل الفيديو يتجاوز قليلا وقت تتبع الوجهة بهامش صغير. بالإضافة إلى ذلك ، لتحسين الكفاءة التجريبية ، من الممكن تتبع ذباب متعدد تلقائيا. يعتمد هذا على دقة الكاميرا لتمكين اقتصاص فيديو عالي الجودة. - قم بتحويل مقاطع الفيديو المسجلة إلى تنسيق AVI باستخدام ترميز MJPEG ، بحيث يمكن فتحها وتحليلها باستخدام فيجي. وفي الوقت نفسه ، اضبط معدل الإطارات في الثانية (fps) للفيديو على 15 إطارا في الثانية للذباب البالغ و 12 إطارا في الثانية لليرقات.
3. تحليل الفيديو
- افتح الفيديو الذي تم تحويله باستخدام "استخدام المكدس الافتراضي" و "التحويل إلى التدرج الرمادي" ، وهما خياران في النافذة المنبثقة عند فتح الفيديو مع فيجي (الشكل 2 أ).
- اصنع إطارا أول فارغا ، كما ذكر أعلاه.
- احصل على نافذة معالجة باستخدام أداة "تعيين الصورة النشطة" الخاصة بالمكون الإضافي AnimalTracker وإنشاء منطقة تتبع تدور حول الساحة في نافذة الفيديو الأصلية باستخدام الأداة "البيضاوية" (الشكل 3 أ).
- اضبط المرشحات (الشكل 3 أ ، 3) ومعلمات المرشحات (الشكل 4 أ - ز) لأول إطار فارغ في نافذة المعالجة. ثم حدد الإطار التالي في نافذة الفيديو الأصلية ، واختر السطح المصفى لنافذة المعالجة (الشكل 5A-C).
ملاحظة: تعمل خطوة التصفية على تقليل تشويش الصورة و / أو إزالة الخلفية ، مما يجعل من الأسهل فصل المقدمة عن الخلفية في تقريب الإطارات. - بمجرد تحديد نافذة معالجة تمت تصفيتها ، أدر الذبابة المتعقبة بملف تعريف أحمر مغطى في نافذة المعالجة باستخدام أداة "تعيين العتبة" (الشكل 3A و 4 والشكل 5D-E والشكل 6A).
- استخدم "ضبط كاشف blob" للسماح للكمبيوتر بالتعرف على الذبابة بملف تعريف أحمر مغطى في نافذة المعالجة (الشكل 3A و 5 والشكل 6B).
- اضبط الإطار 901 كإطار أخير للذبابة البالغة ، محسوبا حسب مدة تسجيل الفيديو والإطارات في الثانية (الشكل 3 أ ، 6 ، الشكل 6 ج).
ملاحظة: تم تتبع التجربة التالية مع اليرقات لمدة 10 دقائق ، لذلك تم تعيين الإطار 7200 كإطار أخير. - استخدم أداة "إظهار النقط" لتقديم مستطيل تتبع في نافذة الفيديو الأصلية (الشكل 3A و 7 والشكل 6D و E). بعد ذلك ، ابدأ التتبع وقم بتصدير ملف التتبع بعد اكتمال المراقبة (الشكل 3 أ ، 8 ، 9 والشكل 7 أ ، ب).
4. تتبع تحليل الملف
- قم بتحميل ملفات المسار والمنطقة باستخدام المكون الإضافي لمحلل تتبع > تعقب الحيوانات (الشكل 8 أ).
- حدد الفهرس المطلوب باستخدام إعدادات المنطقة وقم بتغيير إعدادات المعلمات (الشكل 8). احسب وقت الفاصل الزمني للإطار باستخدام معدل الإطارات.
ملاحظة: في هذه الحالة ، يكون معدل الإطارات 15 إطارا في الثانية ، والفاصل الزمني للإطار 0.067 ثانية تقريبا ، وهو الإعداد الافتراضي (الشكل 8D). - إنتاج مخططات التحليل الكمي باستخدام برنامج جداول البيانات و GraphPad Prism بعد تحليلها في محلل التتبع (الشكل 9).
5. تحليل لكل إطار
- قم بإجراء تحليل السرعة لكل فاصل إطار. قم بتحليل ملف المسار بدون فيجي إذا كانت هناك حاجة إلى مزيد من البحث التفصيلي.
- افتح ملف المسار ، وانسخ جميع الإحداثيات إلى Microsoft Office Excel ، وقم بتقسيم الخلايا باستخدام مفتاح المسافة.
ملاحظة: على سبيل المثال ، بمجرد تقسيم الملف إلى عمودين "C" و "D" ، يتم حساب سرعة ذبابة الفاكهة لكل فاصل إطار بواسطة الصيغة SQRT ((C5-C4) ^ 2 + (D5-D4) ^ 2) ، والتي تظهر في العمود "E" (الشكل 10A). تشير البيانات الموجودة في العمود "E" إلى عدد وحدات البكسل التي نقلتها الذبابة بين إطارين ، مع عدم مراعاة الإطار الأول. حدد جميع النتائج المحسوبة وأدخل مخططا خطيا لإظهار سرعة حركة ذبابة بديهية لكل فاصل زمني للإطار ، مع ذروة على المخطط الخطي (الشكل 10 ب).
- افتح ملف المسار ، وانسخ جميع الإحداثيات إلى Microsoft Office Excel ، وقم بتقسيم الخلايا باستخدام مفتاح المسافة.
- احسب وقت الجمود لكل فاصل إطار. بعد تقسيم الملف إلى عمودين "C" و "D" ، احسب حالة الجمود لذبابة الفاكهة لكل فاصل زمني باستخدام الصيغة IF (SQRT ((C6-C5) ^ 2 + (D6-D5) ^ 2) <20 ، 0 ، 1) ، والتي تظهر في العمود "E". (الشكل 10 ج).
ملاحظة: على عكس تحليل السرعة ، تم تحديد نتائج الإطار الأول. واعتبرت الذباب الذي تحرك أقل من 20 بكسل غير متحرك وسجل على أنه "0" في العمود "E".- حدد جميع النتائج المحسوبة وأدخل مخططا عموديا لإظهار وقت الجمود بصريا بهامش المخطط العمودي بأكمله (الشكل 10 د).
- تأكد من أن زاوية الاتجاه تتغير.
ملاحظة: يمثل تحليل زاوية تغيير الاتجاه اختيار اتجاه الذباب. بمجرد تقسيم الملف إلى عمودين "C" و "D" ، يتم حساب زاوية تغيير الاتجاه بواسطة الصيغة ACOS (((SQRT ((C7-C6) ^ 2 + (D7-D6) ^ 2)) ^ 2 + (SQRT ((C6-C5) ^ 2 + (D6-D5) ^ 2)) ^ 2- (SQRT ((C7-C5) ^ 2 + (D7-D5) ^ 2)) ^ 2) / (2 * SQRT ((C6-C5) ^ 2 + (D6-D5) ^ 2)) * (SQRT ((C7-C6) ^ 2 + (D7-D6) ^ 2)))* 180 / PI () ، والذي يتم تقديمه في العمود "E" (الشكل 10E). تشير النتائج المحسوبة إلى الزاوية بين ثلاثة إحداثيات.- حدد جميع النتائج المحسوبة وأدخل مخططا مبعثرا لتوضيح زاوية تغير اتجاه حركة الذباب (الشكل 10F).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
في هذه الدراسة ، تم فحص العجز الحركي في الذباب البالغ واليرقات الثالثة المعالجة بالروتينون ومقارنتها في نشاطها الحركي بذبابة التحكم التي تتغذى على مذيب الدواء ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO). ثبت أن العلاج بالروتينون في ذبابة الفاكهة يسبب فقدان الخلايا العصبية الدوبامينية في الدماغ22 ويؤدي إلى عجز حركي كبير23. كما هو موضح في الشكل 11 والشكل 12 ، فإن الذباب البالغ واليرقات الثالثة المعالجة بالروتينون لديها عجز حركي كبير مقارنة بالذباب الشاهد الذي يتغذى على DMSO. يوضح الشكل 11 والشكل 12B-E التغيرات النسبية في المسافة والسرعة ووقت الجمود لمعلمات الحركة بين الذباب المعالج بالروتينون أو بدونه. يوضح الشكل 11 والشكل 12F-K تحليلا تمثيليا لمعلمات السرعة ووقت الجمود واختيار الاتجاه ، مع أو بدون علاج الروتينون في البالغين واليرقات. التحليل الكمي لمعلمات المسافة ووقت الجمود والسرعة باستخدام برنامج فيجي في الذباب البالغ (الشكل 11) واليرقات الداخلية الثالثة (الشكل 12) للمجموعات التي تتغذى على الأدوية يؤكد كذلك أن العلاج بالروتينون يمكن استخدامه للتحقيق في العجز الحركي في الأمراض البشرية ، بما في ذلك الحالات التنكسية العصبية ، وتكرار بعض الخصائص السلوكية التي لوحظت في البشر والثدييات.
الشكل 1: مخطط انسيابي يحدد إعداد المعدات والإجراءات التجريبية لتحليل تتبع حركة ذبابة الفاكهة . يتم تصوير ساحة التتبع الحركي بكاميرا عالية الدقة يتم دمجها في الكمبيوتر والتحكم فيه. يتكون إجراء تحليل حركة ذبابة الفاكهة من تسجيل الفيديو وتتبع الحركة وتحليل ملف التتبع ومعالجة البيانات والتحليل البارامتري. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: تجانس الخلفية للإطار الأول. (أ) حدد خيار "التحويل إلى التدرج الرمادي" أثناء فتح الفيديو المحول ، لتحويل الفيديو إلى تدرج الرمادي وتجنب تداخل اللون. (ب) حدد ذبابة الفاكهة باستخدام أداة "الاختيار اليدوي"، الموضحة في المربع الأحمر. (ج) أثناء اختيار التحليل، استخدم خط أصفر لتحديد الخطوط العريضة للذباب. إن إبقاء الخط الأصفر قريبا من ملامح الذبابة يقلل من احتمالية اختيار منطقة لا تشغلها الذبابة. شريط المقياس = 1 سم. (D) اضبط السطوع والتباين للإطار الأول حتى تتغير المساحة المربعة باللون الأصفر إلى نفس التدرج الرمادي مثل الخلفية. (E) أكمل ضبط السطوع والتباين للإطار الأول ، ولكن ليس لجميع الإطارات ، بالنقر فوق "لا" في نافذة "المكدس". (F) في النهاية ، يتم ضبط الإطار الأول لإنشاء خلفية موحدة لا تشوبها شائبة. شريط المقياس = 1 سم. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 3: نافذة التتبع وإعدادات منطقة التتبع. (أ) أكمل تحليل التتبع بالنقر فوق المكونات الإضافية للمتعقب بالترتيب المحدد في نافذة تتبع الحيوانات. (B) بعد ضبط الصورة النشطة في الشكل A,1، يتم تقديم نافذة معالجة تعرض الإطار الحالي فقط. يتم تمييز نافذة الفيديو الأساسية ونافذة المعالجة بوضوح ويتم استخدامها في مواقف مختلفة. لتغيير الإطار الحالي ، تأكد من تنفيذ التغيير في نافذة الفيديو الأساسية ؛ سيكون التغيير مرئيا في كلا النافذتين. شريط المقياس = 1 سم. (C) إنشاء منطقة تتبع تدور حول الساحة ، باستخدام الأداة "البيضاوية" للتعرف على الكمبيوتر. يجب أن يكون تحديد منطقة التتبع في ساحة محاطة بدائرة في نافذة فيديو مفتوحة، وليس في نافذة معالجة. (د) حدد منطقة تتبع بخطوط صفراء لتناسب الساحة إلى أقصى حد ، من أجل تقليل إزعاج الضوء الخارجي. شريط المقياس = 1 سم. (ه) لتعيين منطقة الاهتمام (ROI ) في منطقة التتبع ، انقر فوق الأزرار التي تتبع الترتيب المميز بالأرقام الموضحة في نافذة "مصمم المنطقة". في هذه الخطوة ، يجب إكمال العملية بأكملها بعد فتح نافذة الفيديو المختارة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: إعداد المرشح للإطار الأول. (أ) من خلال إكمال إعداد عائد الاستثمار لمنطقة التتبع ، يتغير الخط الأصفر الذي يحيط بالساحة إلى اللون الأخضر في كل من نافذة الفيديو المفتوحة ونافذة المعالجة. شريط المقياس = 1 سم. (B) إضافة الغرض من المرشحات يضبط خلفية سوداء لجعل الكائن المستهدف أكثر وضوحا للإطار الأول في نافذة المعالجة. يجب إجراء العملية بأكملها داخل نافذة معالجة ، بدلا من نافذة فيديو مفتوحة. (ج، د) تؤدي إضافة مرشحات "سحب الخلفية" و "التمويه الغاوسي" إلى نافذة "إعدادات التصفية" إلى جعل الإطار الأول في نافذة المعالجة أسود. يجب إكمال عملية إعداد المرشح بالكامل في الإطار الأول. (ه) يتم تعيين المعلمات خطوة بخطوة عن طريق النقر فوق الأزرار المميزة برقم ومستطيل أحمر في نافذة "غوازر الخلفية". يجب تشغيل خطوة "تعيين الصورة" بعد تحديد نافذة المعالجة. (F) شريط المقياس = 1 سم. سيتم عرض نافذة "الصورة المتوسطة" بعد النقر فوق الزر "إظهار الفلتر" في "E4" وإغلاق النافذة مباشرة دون أي عملية. (ز) يتم تعيين معلمة التمويه الغاوسي بقيمة سيغما الافتراضية 2.0. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: إعدادات العتبة للإطار الثاني. (A) بالنقر فوق شريط التقدم السفلي ، اجعل نافذة الفيديو تتقدم إلى الإطار الثاني. تتكرر الذبابة في منتصف الشاشة ويتم التعرف عليها بواسطة فيجي. شريط المقياس = 1 سم. (B,C) عرض نافذة المعالجة قبل وبعد التصفية. ( ب) إظهار نافذة المعالجة التي تمت تصفيتها عن طريق تحديد الوضع المميز بمستطيل أحمر. (C) مثال لنافذة معالجة ذات مستطيل أحمر بعد تحديد الوضع "المصفى". شريط المقياس = 1 سم. (د) اضبط العتبة عن طريق تحديد طريقة العتبة الافتراضية ، "عتبة التدرج الرمادي" ، الموضحة في نافذة "العتبات" ، بعد اختيار أداة "تعيين العتبة" في الشكل 3 أ ، 4. (ه) اضبط المعلمات عن طريق تحريك مربع شريط التقدم في المنتصف حتى يتم رؤية ذبابة التتبع وتغطيتها بملف التعريف الأحمر. لا يوصى بتغيير الإعدادات الافتراضية للمعلمات المربعة في المستطيل الأحمر أدناه. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6: كاشف النقطة ، وإعداد الإطار الأخير ، واختيار تتبع الحيوانات. (أ) عند الوصول إلى العتبة المذكورة في الشكل 5E ، تكشف نافذة المعالجة عن ملف تعريف أحمر كبير يتبع الذبابة في الإطار الثاني. اجعل المظهر الجانبي الأحمر الذي يغطي الذبابة مناسبا لتتبع الذبابة. شريط المقياس = 1 سم. (B) حدد الذبابة المغطاة بملف تعريف أحمر كهدف للتتبع عن طريق تحديد طريقة كاشف النقطة الافتراضية ، "كاشف النقطة الأساسي". (ج) اضبط الإطار 901 كإطار أخير باستخدام أداة "تعيين الإطار الأخير" في الشكل 3 أ ، 6. يتم حساب إجمالي رقم الإطار بالصيغة "رقم الإطار = fps * وقت التسجيل". (D) يطير التتبع بمستطيل أصفر محاصر بعد عرض النقط في نافذة الفيديو المفتوحة (قسم اللوحة اليسرى). في اللوحة اليسرى الموسعة ، يتم إرفاق ذباب الفاكهة باللون الأحمر (قسم اللوحة اليمنى). شريط المقياس = 1 سم. (E) ذبابة التتبع مع مستطيل أحمر محاصر بعد النقر لتحديد المستطيل الأحمر في "D" (قسم اللوحة العلوية). في توسيع اللوحة العلوية ، يتم إرفاق ذباب الفاكهة باللون الأحمر (قسم اللوحة السفلية). تأكد من اكتمال اختيار مستطيل أصفر حول ذبابة تتبع في نافذة الفيديو المفتوحة. أكمل التحديد في نافذة الفيديو المفتوحة ، وسيتم تحديد الذبابة بواسطة فيجي في جميع الإطارات. شريط المقياس = 1 سم. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 7: نتائج تتبع التتبع. يظهر تتبع التتبع بشكل منفصل في نافذة الفيديو المفتوحة ( A) ونافذة المعالجة (B). للحصول على ملف تعريف تتبع التتبع ، انقر فوق شريط التقدم في نافذة الفيديو الأصلية وحرك شريط التقدم للتحقق من استمرارية التتبع. يعرض تتبع التتبع مسافة الزحف للذباب بشكل حدسي. شريط المقياس = 1 سم. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 8: تتبع تحليل الملف باستخدام مكونات AnimalTracker الإضافية. (أ) يسهل محلل التتبع تحليلا مفصلا لملف التتبع ؛ يشار إلى كل خطوة مميزة بمستطيل أحمر برقم. (ب) اضبط معلمات "إعدادات المنطقة" في A ، 4. أربعة معلمات، هي الزمن، والمسافة، وزمن الجمود، ومتجه السرعة، موضحة في المستطيل الأحمر. يتم تحديد المعلمة بناء على النتيجة المرجوة. (ج-ز) قم بتعيين معلمات التكوين بشكل فردي في نافذة "تعيين المعلمات" في A ، 5. (ج) يتم توضيح أربعة معلمات قابلة للتعديل في نافذة "إعدادات معلمات التكوين" ، (D-G) التي تعرض نوافذ "إعدادات الوقت" و "إعداد وقت الجمود" و "إعدادات المسافة" و "إعداد متجه السرعة" ، على التوالي. لا يوصى بتعديل القيمة الافتراضية لإعدادات المعلمة. ومع ذلك ، بالنسبة إلى "الفاصل الزمني للإطار" ، يجب حساب المعلمة باستخدام الصيغة "الفاصل الزمني للإطار = 1 / fps" عند تغيير fps للفيديو. بالإضافة إلى ذلك ، من الممكن استخدام مقياس معروف للتأكد من المسافة والسرعة الفعليتين من خلال ربط وحدات البكسل المسجلة بتتبع الذبابة بقيمة ملموسة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 9: نتيجة تعرض تحليل ملف التتبع. (أ) إعداد الشكل 8 أ ، 6. يتوفر وضعان لعرض البيانات: "مجمعة حسب المناطق" و "مجمعة حسب المعلمات". (ب) تظهر نتائج تحليل ملف التتبع على أنها "مجمعة حسب المناطق" في "أ ، 6.1". (سي إف) تظهر نتائج تحليل ملف التتبع على أنها "مجمعة حسب المعلمات" في A ، 6.2 ، وتظهر "وقت الجمود" (C) ، و "متجه السرعة" (D) ، و "الوقت" (E) ، و "المسافة" (F) بشكل منفصل. يتم تحديد نتائج وقت ومسافة الجمود على أنها "s" و "بكسل". يجب تعريف وحدة متجه السرعة على أنها "بكسل / ثانية" ، والإخراج مع التعليق التوضيحي "الطول". يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 10: نتائج تحليل البيانات للسرعة لكل إطار في الثانية. (A وC وE) تحتوي بيانات التصدير على إحداثيات وحدات البكسل في الأقسام الأفقية (العمود "C") والعمودية (العمود "D") ، بالإضافة إلى حركة وحدات البكسل وعدم الحركة وزاوية تغيير الاتجاه بين الفواصل الزمنية ذات الإطارين (العمود "E" في A و C و E على التوالي) ، والتي يتم حسابها تلقائيا بواسطة الصيغة الموضحة في السياق. نظرا لأن النتائج المصدرة من فيجي هي مستندات نصية ، فمن المستحسن فتح الملف باستخدام Microsoft Office Excel وتقسيم البيانات إلى ثلاثة أعمدة عن طريق إضافة مسافات بينها. (ب و د و و) يعرض المخطط الخطي النتائج المحسوبة من مجموعة بيانات حركة البيكسلات (B). تمثل قيمة الذروة العالمية السرعة ، مما يدل على قدرات اكتشاف الحركة ؛ يعرض المخطط العمودي النتائج المحسوبة من مجموعة بيانات الجمود (D). تمثل درجة التناثر في المخطط العمودي الجمود ، الذي يظهر عيب القدرة الحركية للذباب. يعرض الرسم التخطيطي المبعثر النتائج المحسوبة من مجموعة البيانات الخاصة بزاوية تغيير الاتجاه (F). يمثل إثراء البقع الموضحة في مخطط التشتت الاتجاه الذي تختاره الذبابة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 11: تحليل مقارن للحركة بين الذباب المعالج بالروتينون أو بدونه. (أ) يتم عرض الرسوم البيانية التمثيلية لتتبع تتبع الذباب البالغ W1118 الذي تم تغذيته بأغذية قياسية تحتوي على 500 ميكرومتر روتينون ، أو DMSO للتحكم. تم جمع ذباب W1118 ثم وضعه في بيئة خاضعة للرقابة تتكون من طعام قياسي مع 500 ميكرومتر روتينون أو DMSO ، 25 درجة مئوية ، ورطوبة 60٪. تم استخدام ستة ذباب للتحليل من كل مجموعة بعد 48 ساعة. تكشف النتيجة أن مسافة حركة تتبع الذباب الذي يتغذى على الروتينون قد انخفضت بشكل كبير مقارنة بمسافة التحكم. أظهرت النتيجة قدرة حركية معيبة في الذباب الذي يتغذى على الروتينون. (ب - ه) يتم إجراء التحليل الكمي للمعالجة الروتينينية على متوسط المسافة المقطوعة ، ووقت الجمود ، والسرعة المتوسطة ، والسرعة القصوى باستخدام فيجي. أظهرت نتائج علاج الروتينون انخفاضا كبيرا في المسافة المقطوعة ومتوسط السرعة ، وزيادة كبيرة في وقت الجمود. (إف كيه) تحليل وحدات البكسل لكل إطار (F ، G) ، ووقت الجمود لكل إطار (H ، I) ، وتغيرات زاوية الاتجاه (J ، K) بين الذباب المعالج بالروتينون (G ، I ، K) أو DMSO (F ، H ، J). تظهر أمثلة الرسوم البيانية التي توضح تأثيرات الروتينون على سرعة الحركة عددا أقل من القمم التي تمثل سرعة الحركة لكل فترة إطار في الذباب الذي يتغذى على الروتينون (G) مقارنة بتلك الموجودة في التحكم (F) ، مما يشير إلى شدة عيب النشاط الحركي (F ، G). عمود الجمود الحدسي للبكسل المتحرك لكل إطار أقل ، مما يظهر حركة أقل بكثير في غضون 1 دقيقة للذباب الذي يتغذى على الروتينون (I) مقارنة بذباب التحكم (H). تكشف أمثلة الرسوم البيانية لتغيرات الزاوية المتحركة لاتجاه الحيوانات التي تتغذى على الروتينون (K) التحكم (J) عن تغيرات في الاتجاه الذي يختاره الذباب. البيانات هي متوسط SEM ± لستة ذباب ذكور تم رصدها لمدة 1 دقيقة. تشير العلامات النجمية إلى اختلافات كبيرة بين المجموعات (***p < 0.001 ؛ اختبار t غير المزاوج ، p = 0.05). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 12: تحليل مقارن للحركة بين اليرقات المعالجة بالروتينون أو بدونه. (أ) النتائج التمثيلية لمقارنة النشاط الحركي من خلال تتبع أثر يرقات W1118 الثالثة التي تغذت بالروتينون أو DMSO. باختصار ، تم جمع يرقات W1118 الثالثة وزراعتها في 10٪ سكروز ، أو 10٪ سكروز يحتوي على 500 ميكرومتر روتينون ، في بيئة 25 درجة مئوية مع رطوبة 60٪. تم استخدام ست يرقات لكل مجموعة للتحليل. مع الأخذ في الاعتبار الحركة البطيئة لليرقات ، تم تحديد وتحليل البيانات المسجلة على مدى 5 دقائق لتقييم آثار الروتينون على الحركة. (ب - ه) يتم تحليل متوسط المسافة ، ووقت الجمود ، والسرعة المتوسطة ، والسرعة القصوى للمجموعتين اللتين تم تحليلهما في فيجي كميا. أظهرت النتائج الكمية أن مسافة الحركة والسرعة المتوسطة والسرعة القصوى تنخفض بشكل ملحوظ في اليرقات التي تتغذى على الروتينون ، ويزيد وقت الجمود بشكل ملحوظ في اليرقات التي تتغذى على الروتينون. (إف كيه) على غرار الذباب البالغ ، أظهر تحليل وحدات البكسل لكل إطار ، ووقت الجمود ، وتغيرات زاوية الاتجاه بين الذباب المعالج بالروتينون (G ، I ، K) وبدون روتينون (F ، H ، J) أن اليرقات المعالجة بالروتينون لديها سرعة حركة أقل ، ووقت أكثر ثباتا ، وتناوبت اتجاهاتها. كشفت النتائج أن الحركة السلوكية لتتبع اليرقات التي تتغذى على الروتينون ضعيفة بشكل كبير مقارنة بالسيطرة. تظهر النتائج نشاطا حركيا معيبا للذباب الذي يتغذى على الروتينون. البيانات هي متوسط SEM ± ست يرقات عمرها 3 أيام تم رصدها لمدة 5 دقائق. تشير العلامات النجمية إلى وجود فرق كبير بين المجموعات (* p < 0.05 ؛ ** p < 0.01 ؛ ***p < 0.001 ؛ اختبار t غير المزاوج ، p = 0.05). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الجدول 1: مقارنة بين المنهجيات القائمة على تتبع الحيوانات للقياس الكمي للنشاط الحركي في ذبابة الفاكهة. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
لقد صممنا طريقة ، تستند إلى مادة AnimalTracker API مفتوحة المصدر المتوافقة مع برنامج معالجة الصور في فيجي ، والتي يمكن أن تمكن الباحثين من تقييم النشاط الحركي بشكل منهجي من خلال تتبع كل من الذباب اليرقي البالغ والفردي. AnimalTracke هي أداة مكتوبة بلغة Java يمكن دمجها بسهولة في قواعد البيانات الحالية أو الأدوات الأخرى لتسهيل تحليل سلوك تتبع الحيوانات المصمم للتطبيق24. عند تحليل كل إطار على حدة بواسطة صيغة حساب برمجية تحدد النشاط الحركي للبالغين واليرقات ، يمكن تحليل العديد من المعلمات ، بما في ذلك سرعة الحركة ، والمسافة المقطوعة ، وعدم الحركة ، وتغيرات زاوية الاتجاه بمرونة. يمكن رسم هذه المعلمات ، التي تمثل جوانب مختلفة من الحركة السلوكية ، لتوضيح التغيرات الحركية بمرور الوقت. بالإضافة إلى ذلك ، من خلال إنشاء واجهة مستخدم رسومية ، وتوفير وثائق مفصلة حول استخدامها ، وواجهة برمجة التطبيقات ، نهدف إلى جعل هذه الطريقة في متناول الباحثين الذين يفتقرون إلى الخبرة في البرمجة والمستخدمين ذوي الخبرة الذين ينشئون نماذج تجريبية مخصصة.
للتحقق من أن الطريقة يمكن أن تراقب السلوك بدقة ، تم إجراء اختبار حركي للذباب واليرقات البالغة المعالجة بالروتينون ، بالإضافة إلى مقارنة نشاطها الحركي بنشاط الذباب الضابط الذي يتغذى على مذيب الدواء. يستخدم برنامج فيجي ، مع مكوناته الإضافية ، لتحليل إحداثيات البكسل لكل إطار في تسجيل الفيديو للحركة ، مما يسمح بحساب السرعة والمسافة والمعلمات الأخرى للذباب التجريبي. لاحظنا انخفاضا كبيرا في المسافة المقطوعة بمرور الوقت في إدارة الروتينون (الشكل 11) ، وهو ما يتوافق مع النتائج المبلغ عنها23. وفي الوقت نفسه ، لوحظت سرعة الحركة الصاعدة والاتجاه غير الطبيعي المختار في المجموعات التي تتغذى على المخدرات ، للمساعدة في توضيح المزيد من التفاصيل حول النقص السلوكي في الذباب. نظرا للنجاح في الكشف عن النشاط الحركي للذباب البالغ ، سعينا بعد ذلك إلى تقييم حركة اليرقات (الشكل 12). بالمقارنة مع المجموعة الضابطة ، كانت نتائج تتبع اليرقات التي تغذت على الروتينون ضعيفة بشكل كبير ، بالتوازي مع نتائج الذباب البالغ الذي يتغذى على الأدوية. تشير التجارب التي أجريت على البالغين واليرقات التي تغذت على الروتينون إلى أن هذه الطريقة يمكن أن تسجل بدقة انخفاض الذباب الذي ينتج عجزا حركيا مقارنة بالضوابط. أظهر هذا التقرير بنجاح تطبيقات الطريقة الحالية في تحديد وتحليل القدرة الحركية والجوانب الأخرى للعيوب السلوكية لذباب الفاكهة في نماذج الاختبار أو الأبحاث الدوائية في الحيوانات.
للتأكد من أن تحليل الفيديو والتتبع يسفر عن نتائج ناجحة وقابلة للتكرار ، يوصى بالالتزام بالإرشادات التالية. أولا ، لاختيار معدل إطارات الفيديو ، نوصي بتحويل الفيديو المسجل إلى تنسيق 15 إطارا في الثانية (fps). هذا لا يمكن أن يحافظ فقط على تتبع الحركة الجيد ، ولكن أيضا تجنب بطء تحليل الكمبيوتر الناجم عن كميات هائلة من البيانات. من خلال تحسين معدل إطارات الفيديو ، يصبح تحليل مسار الحركة أكثر تفصيلا. ثانيا ، يمكن أيضا تعديل المعلمات في الصيغة لتناسب المخطط التجريبي المقابل عند تحليل الحركة الثابتة بين كل إطارين. من أجل مراقبة اليرقات الحركية ، من الضروري استخدام هلام السيليكا بدلا من الأجار ، لأن هلام السيليكا المتصلب ضيق ولا يمكن لليرقات الدخول إليه. علاوة على ذلك ، فإن هلام السيليكا شفاف ويمكن صبغه بإضافة مادة ملونة لإنتاج خلفية مثالية ، مما يسهل التأثيرات البصرية المرغوبة التي تعزز جودة الصورة.
يتم تطوير أنظمة تتبع الحيوانات لتوفير حلول شاملة لمجتمعات المسببات وعلم الأعصاب وعلم الوراثة السلوكية. يقدم الجدول 1 مقارنة بين ميزات برامج التتبع المتعددة المتوفرة حاليا 10،11،12،16،17،25،26. هذا النهج فعال للغاية من حيث التكلفة ، ومباشر التعلم ، ودقيق في قياس السلوك الحركي ، دون الحاجة إلى برامج ومعدات مكلفة. ليس هناك شك في أن هذه الطريقة يمكن أن تمتد بسهولة إلى نماذج حيوانية أخرى تشبه ذبابة الفاكهة ، وحتى إلى الحيوانات الأكبر مثل الجرذان والفئران. يمكن توسيع بنية واجهة برمجة تطبيقات AnimalTracker بسهولة من خلال تطبيقات ImageJ المستقلة أو المكونات الإضافية ، مما يوفر مجموعة واسعة من مجموعات الأدوات المفيدة لأبحاث وتحليل السلوك المخصص24. ومع ذلك ، فإن هذه الدراسة لها قيود معينة. نظرا لأنه يتم وضع ذبابة واحدة في ساحة مفتوحة المجال لتسجيل الصور ويتم تتبع الفيديو بشكل فردي ، فإن هذه الطريقة غير فعالة وتستغرق وقتا طويلا. لقد حاولنا توسيع القدرة على تسجيل ساحات متعددة في وقت واحد ، مما يسمح بما يصل إلى ستة تسجيلات فردية. من الممكن نظريا تسجيل عدد أكبر من ذبابة الفاكهة في وقت واحد. هذا يعتمد على حجم الساحة وتكوين الكاميرا. بدلا من ذلك ، إذا رغب المستخدمون في التوسع في تسجيل ذبابة الفاكهة المجمعة ، فمن المستحسن النظر في العدد المحدود من السجلات الفردية وتكوين جودة كافية لتحديد الاصطدامات والتداخلات بين الذباب. لم يتم النظر في التحسينات في كفاءة الاختبار عن طريق التعلم الآلي في الدراسة ، حيث لم يتم اكتشاف نهج متوافق وبأسعار معقولة يمكن دمجه مع النظام الحالي لتمييز الهويات بصريا وتتبع النماذج بدقة.
باختصار ، الطريقة الموضحة هنا تطور وتتحقق من صحة نهج فعال ومباشر يعتمد على برنامج مجاني مفتوح المصدر ، مصمم لتقليل استهلاك الوقت وتحسين التقنيات التجريبية للإشارة الكمية وتحليل حركة ذبابة الفاكهة في مراحل اليرقات والبالغين. من خلال التحليل المنهجي ، يمكن أن تساعدنا هذه الطريقة في فهم كيفية تغير سرعة الحيوان بمرور الوقت أثناء الحركة ، وكذلك خصائص اختيار الاتجاه. وبالتالي ، فإن دمج البرامج مفتوحة المصدر في الأجهزة الرقمية شائعة الاستخدام يوفر طريقة موثوقة لاختبار النشاط الحركي في نماذج الذباب المختلفة. قد يكون هذا مفيدا لتقييم المخرجات الحركية الفسيولوجية والمرضية في اختبار نماذج الأمراض التنكسية العصبية المشتقة من العلاج الدوائي والتعديل الوراثي في ذبابة الفاكهة وكذلك الحيوانات الأخرى.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ويعلن صاحبا البلاغ أنه ليس لهما مصالح مالية متنافسة.
Acknowledgments
تم دعم هذا العمل من خلال صندوق إطلاق خاص من جامعة سوشو والمؤسسة الوطنية للعلوم في الصين (NSFC) (82171414). نشكر أعضاء مختبر البروفيسور تشون فنغ ليو على مناقشاتهم وتعليقاتهم.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Animal tracker | Hungarian Brain Research Program | version: 1.7 | pfficial website: http://animaltracker.elte.hu/main/downloads |
| Camera software | Microsoft | version: 2021.105.10.0 | built-in windows 10 system |
| Computer | DELL | Vostro-14-5480 | a comupter running win 10 system is available |
| Drosophila carbon dioxide anesthesia workstation | Wu han Yihong technology | #YHDFPCO2-018 | official website: http://www.yhkjwh.com/ |
| Fiji software | Fiji team | version: 1.53v | official website: https://fiji.sc/ |
| Format factory software | Pcfreetime | version: X64 5.4.5 | official website: http://www.pcfreetime.com/formatfactory/CN/index.html |
| Graph pad prism | GraphPad Software | version: 8.0.2 | official website: https://www.graphpad-prism.cn |
| Hight definition camera | TTQ | Jingwang2 (HD1080P F1.6 6-60mm) | official website: http://www.ttq100.com/product_show.php?id=35 |
| Office software | Microsoft | version: office 2019 | official website: https://www.microsoftstore.com.cn/software/office |
| Petri dish | Bkman | 110301003 | size: 60 mm |
| Silica gel | DOW | SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit | Mix well according to the instructions |
| Sodium bicarbonate | Macklin | #144-55-8 | Mix well with silica gel |
References
- Ham, S. J., et al. Loss of UCHL1 rescues the defects related to Parkinson's disease by suppressing glycolysis. Science Advances. 7 (28), (2021).
- Algarve, T. D., Assmann, C. E., Aigaki, T., da Cruz, I. B. M. Parental and preimaginal exposure to methylmercury disrupts locomotor activity and circadian rhythm of adult Drosophila melanogaster. Drug and Chemical Toxicology. 43 (3), 255-265 (2020).
- Jones, M. A., Grotewiel, M. Drosophila as a model for age-related impairment in locomotor and other behaviors. Experimental Gerontology. 46 (5), 320-325 (2011).
- Yamaguchi, M., Yoshida, H. Drosophila as a model organism. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1076, 1-10 (2018).
- Rothenfluh, A., Heberlein, U. Drugs, files, and videotape: the effects of ethanol and cocaine on Drosophila locomotion. Current Opinion in Neurobiology. 12 (6), 639-645 (2002).
- Tsuda, L., Lim, Y. M. Alzheimer's disease model system using Drosophila. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1076, 25-40 (2018).
- Dung, V. M., Thao, D. T. P.
- Liguori, F., Amadio, S., Volonte, C. Fly for ALS: Drosophila modeling on the route to amyotrophic lateral sclerosis modifiers. Cellular and Molecular Life Sciences. 78 (17-18), 6143-6160 (2021).
- Cao, W., et al. An automated rapid iterative negative geotaxis assay for analyzing adult climbing behavior in a Drosophila model of neurodegeneration. Journal of Visualized Experiments. (127), 56507 (2017).
- Eidhof, I., et al. High-throughput analysis of locomotor behavior in the Drosophila island assay. Journal of Visualized Experiments. (129), 55892 (2017).
- Scaplen, K. M., et al. Automated real-time quantification of group locomotor activity in Drosophila melanogaster. Scientific Reports. 9 (1), 4427 (2019).
- Werkhoven, Z., Rohrsen, C., Qin, C., Brembs, B., de Bivort, B. MARGO (Massively Automated Real-time GUI for Object-tracking), a platform for high-throughput ethology. PLoS One. 14 (11), e0224243 (2019).
- Gargano, J. W., Martin, I., Bhandari, P., Grotewiel, M. S. Rapid iterative negative geotaxis (RING): a new method for assessing age-related locomotor decline in Drosophila. Experimental Gerontology. 40 (5), 386-395 (2005).
- Cichewicz, K., Hirsh, J. ShinyR-DAM: a program analyzing Drosophila activity, sleep and circadian rhythms. Communications Biology. 1, 25 (2018).
- McParland, A. L., Follansbee, T. L., Ganter, G. K. Measurement of larval activity in the Drosophila activity monitor. Journal of Visualized Experiments. 98, e52684 (2015).
- Walter, T., Couzin, I. D. TRex, a fast multi-animal tracking system with markerless identification, and 2D estimation of posture and visual fields. eLife. 10, (2021).
- Maia Chagas, A., Prieto-Godino, L. L., Arrenberg, A. B., Baden, T. The €100 lab: A 3D-printable open-source platform for fluorescence microscopy, optogenetics, and accurate temperature control during behaviour of zebrafish, Drosophila, and Caenorhabditis elegans. PLoS Biology. 15 (7), e2002702 (2017).
- Nichols, C. D., Becnel, J., Pandey, U. B. Methods to assay Drosophila behavior. Journal of Visualized Experiments. (61), (2012).
- Xiao, G. Methods to assay the behavior of Drosophila melanogaster for toxicity study. Methods in Molecular Biology. 2326, 47-54 (2021).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Johnson, M. E., Bobrovskaya, L. An update on the rotenone models of Parkinson's disease: their ability to reproduce the features of clinical disease and model gene-environment interactions. Neurotoxicology. 46, 101-116 (2015).
- Coulom, H., Birman, S. Chronic exposure to rotenone models sporadic Parkinson's disease in Drosophila melanogaster. The Journal of Neuroscience. 24 (48), 10993-10998 (2004).
- Kumar, P. P., Bawani, S. S., Anandhi, D. U., Prashanth, K. V. H. Rotenone mediated developmental toxicity in Drosophila melanogaster. Environmental Toxicology and Pharmacology. 93, 103892 (2022).
- Gulyas, M., Bencsik, N., Pusztai, S., Liliom, H., Schlett, K. AnimalTracker: an ImageJ-based tracking API to create a customized behaviour analyser program. Neuroinformatics. 14 (4), 479-481 (2016).
- Qu, S. EasyFlyTracker: a simple video tracking Python package for analyzing adult Drosophila locomotor and sleep activity to facilitate revealing the effect of psychiatric drugs. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 15, 809665 (2022).
- Yarwais, Z. H., Najmalddin, H. O., Omar, Z. J., Mohammed, S. A. Automated data collection of Drosophila movement behaviour assays using computer vision in Python. International Journal of Innovative Approaches in Science Research. 4 (1), 15-22 (2020).
