Summary
Das vorliegende Protokoll bewertet die Bewegungsaktivität von Drosophila , indem es die Bewegung von Fliegen in einer handgefertigten Arena unter Verwendung der Open-Source-Software Fidschi verfolgt und analysiert, die mit Plugins kompatibel ist, um Pixel jedes Frames basierend auf hochauflösenden Videoaufzeichnungen zu segmentieren, um Parameter wie Geschwindigkeit, Entfernung usw. zu berechnen.
Abstract
Drosophila melanogaster ist aufgrund seiner Fülle an fortschrittlichen genetischen Manipulationstechniken und vielfältigen Verhaltensmerkmalen ein idealer Modellorganismus für die Erforschung verschiedener Krankheiten. Die Identifizierung von Verhaltensstörungen in Tiermodellen ist ein entscheidendes Maß für den Schweregrad der Erkrankung, zum Beispiel bei neurodegenerativen Erkrankungen, bei denen Patienten häufig Beeinträchtigungen der Motorik erfahren. Mit der Verfügbarkeit verschiedener Systeme zur Verfolgung und Bewertung motorischer Defizite in Fliegenmodellen, wie z. B. medikamentös behandelten oder transgenen Individuen, fehlt jedoch noch ein wirtschaftliches und benutzerfreundliches System zur präzisen Auswertung aus mehreren Blickwinkeln. Hier wird eine Methode entwickelt, die auf dem Application-Programming Interface (API) AnimalTracker basiert und mit dem Fidschi-Bildverarbeitungsprogramm kompatibel ist, um die Bewegungsaktivitäten sowohl adulter als auch larvaler Individuen aus aufgezeichneten Videos systematisch auszuwerten und so deren Tracking-Verhalten zu analysieren. Diese Methode erfordert nur eine hochauflösende Kamera und eine Hardwareintegration für Computerperipheriegeräte, um das Verhalten aufzuzeichnen und zu analysieren, was sie zu einem erschwinglichen und effektiven Ansatz für das Screening von Fliegenmodellen mit transgenen oder umweltbedingten Verhaltensmängeln macht. Beispiele für Verhaltenstests mit pharmakologisch behandelten Fliegen werden gegeben, um zu zeigen, wie die Techniken Verhaltensänderungen sowohl bei erwachsenen Fliegen als auch bei Larven auf hochgradig wiederholbare Weise erkennen können.
Introduction
Drosophila melanogaster ist ein hervorragender Modellorganismus für die Untersuchung zellulärer und molekularer Funktionen in neuronalen Krankheitsmodellen, die durch Genmodifikation1, medikamentöse Behandlung2 und Seneszenz3 entstanden sind. Die hohe Erhaltung biologischer Signalwege, physikalischer Eigenschaften und krankheitsassoziierter Homologgene zwischen Mensch und Drosophila macht die Fruchtfliege zu einem idealen Nachahmer von der molekularen bis zur Verhaltensebene4. In vielen Krankheitsmodellen ist die Verhaltensschwäche ein wichtiger Index, der ein hilfreiches Modell für verschiedene menschliche Neuropathien darstellt 5,6. Drosophila wird heute verwendet, um mehrere menschliche Krankheiten, die neurologische Entwicklung und neurodegenerative Erkrankungen wie Parkinson und amyotrophe Lateralsklerose zu untersuchen 7,8. Die Detektion der motorischen Fähigkeiten der Krankheitsmodelle ist entscheidend für das Verständnis des pathogenen Verlaufs und könnte eine phänotypische Korrelation zu den molekularen Mechanismen liefern, die dem Krankheitsprozess zugrunde liegen.
In jüngster Zeit wurden kommerziell erhältliche Software-Tools und kostengünstige Programme für Strategien zur Detektion des Bewegungsapparates von Drosophila entwickelt, wie z. B. Hochdurchsatztests in gruppierten Fliegen9,10 und Messungen der Fortbewegung in Echtzeit11,12. Ein solcher konventioneller Ansatz ist die schnelle interaktive negative Geotaxis (RING), auch Kletterassay genannt, der mehrere Kanäle umfasst, die es ermöglichen, eine große Fliegenpopulation mit gleichem Geschlecht und Alter einzudämmen, wodurch die Variation reduziert wird, während die Daten gesammelt werden 9,13. Ein weiteres Vortestverfahren zur Analyse des Bewegungsverhaltens ist der TriKinetics Drosophila Activity Monitor (DAM), eine Vorrichtung, die mehrere Strahlen verwendet, um die Bewegung der Fliegenaktivität innerhalb eines dünnen Glasröhrchens14 zu erfassen. Die Vorrichtung zeichnet kontinuierlich die Position auf, die eine automatisierte Fortbewegung darstellt, indem die Strahlkreuzungen berechnet werden, um die Aktivität und den circadianen Rhythmus von Fliegen über einen längeren Zeitraum zu untersuchen15. Obwohl diese Methoden bei der Analyse von Verhaltensfehlern bei Fruchtfliegen weit verbreitet sind, um Veränderungen in der Verhaltensfortbewegung zu bestimmen, erfordern sie immer spezielle Testgeräte oder komplexe Analyseprozesse und schränken ihre Anwendung in einigen Modellen mit einem begrenzten, einfachen Gerät ein. Gruppenbasierte Strategien zur Tierverfolgung zum Testen der adulten Drosophila, wie z. B. FlyGrAM11 und der Drosophila Island Assay10, implementieren soziale Rekrutierung und individuelles Tracking in einem vordefinierten Bereich. Nichtsdestotrotz können sich soziale individuelle Einschränkungen in benachteiligten Gebieten negativ auf die Identifizierung in den Bildern auswirken, verursacht durch die Kollision oder Überlappung von Fliegen. Auch wenn einige materialbasierte Open-Source-Methoden wie TRex16, MARGO 12 und FlyPi17 einen Notfall haben, können sie die Fliegen mit flexiblem Einsatz in Verhaltenstests schnell verfolgen. Diese Testansätze sind mit aufwendigen Versuchsapparaturen, speziellen Softwareanforderungen oder professionellen Computersprachen verbunden. Bei Larven sind die Messung der Gesamtstrecke, die über die Anzahl der Gitterbegrenzungslinien pro Zeiteinheit18 zurückgelegt wird, oder die grobe Zählung der Körperwandkontraktionen für Individuen19 die vorherrschenden Methoden zur Beurteilung ihrer Bewegungsfähigkeit. Aufgrund der mangelnden Präzision von Geräten oder Vorrichtungen und Analysemethoden kann es vorkommen, dass einige Verhaltensbewegungen von Larven nicht entdeckt werden, was es schwierig macht, Verhaltensbewegungen, insbesondere feine Bewegungen, genau zu beurteilen15.
Die hier entwickelte Methode nutzt die AnimalTracker-Programmierschnittstelle (API), die mit dem Fidschi-Bildverarbeitungsprogramm (ImageJ) kompatibel ist, um die Bewegungsaktivität sowohl von adulten als auch von Larvenfliegen systematisch zu bewerten, indem ihr Tracking-Verhalten aus hochauflösenden (HD) Videos analysiert wird. Fiji ist eine Open-Source-Software-ImageJ-Distribution, die robuste Softwarebibliotheken mit zahlreichen Skriptsprachen kombinieren kann, was zu einem schnellen Prototyping von Bildverarbeitungsalgorithmen führt, was sie bei Biologen wegen ihrer Bildanalysefunktionen beliebt macht20. Im aktuellen Ansatz wird die Integration von Fidschi in die AnimalTracker-API genutzt, um einen einzigartigen Drosophila-Verhaltensassay mit personalisierter Algorithmus-Einfügung zu entwickeln, und bietet einen nützlichen Schritt für detaillierte Dokumentationen und Tutorials, um robuste analytische Fähigkeiten des Bewegungsverhaltens zu unterstützen (Abbildung 1). Um die Komplikation der objektiven Identifizierung in den Bildern zu umgehen, die durch die Kollision oder Überlappung von Fliegen verursacht wird, ist jede Arena darauf beschränkt, nur eine Fliege zu beherbergen. Nach der Bewertung der Tracking-Präzision des Ansatzes wurde er implementiert, um die Bewegungsbewegungen von Drosophila zu verfolgen und zu quantifizieren, die mit dem toxischen Medikament Rotenon verabreicht wurden, das im Allgemeinen für Tiermodelle der Parkinson-Krankheit verwendet wird, und schließlich eine Beeinträchtigung der Fortbewegung in der medikamentösen Behandlung entdeckte21. Diese Methodik, die Open-Source- und freie Software verwendet, erfordert keine kostspieligen Instrumente und kann die Verhaltensbewegung von Drosophila präzise und reproduzierbar analysieren.
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Protocol
Für die vorliegende Studie wurden W1118 adulte Fliegen und Larven im dritten Stadium verwendet.
1. Versuchsvorbereitung
HINWEIS: Eine Freilandarena für die Fortbewegungsverfolgung von Drosophila besteht aus einem farb- und geruchlosen Kieselgel.
- Mischen Sie Reagenz A und Reagenz B im Verhältnis 1:10 gemäß den Anweisungen des Herstellers für das Kieselsäure-Kit (siehe Materialtabelle). Stellen Sie sicher, dass der Mischung Natriumbicarbonat durch Rühren zugesetzt wird, bis die Farbe weiß wird. Die Mischung in eine saubere Petrischale geben und bei 40 °C zum Trocknen für 48 Stunden in den Ofen stellen.
- Stellen Sie die HD-Kamera (siehe Materialtabelle) auf ein Stativ und stellen Sie sie so ein, dass das Kameraobjektiv senkrecht zur Oberfläche der Siliziumdioxidarena steht. Stellen Sie durch Einstellen der Brennweite und der Blendenöffnungen der Kamera sicher, dass die Kamera auf die Oberfläche des Siliziumdioxids fokussiert ist und das Display ausreichend beleuchtet ist. Der Versuchsaufbau ist in Abbildung 1 dargestellt.
- Bringen Sie eine Fliege in die Freilandarena, um ein kontinuierliches Video von mindestens 61 s aufzunehmen.
HINWEIS: In Anbetracht der Trägheit der Larven wird eine Videoaufnahmezeit von mehr als 10 Minuten empfohlen.- Öffnen Sie das Video mit Fidschi, ziehen Sie den Fortschrittsbalken auf das erste Bild und stimmen Sie stillschweigend zu. Wählen Sie den gesamten Körper der Fliege mit dem Werkzeug "Freihandauswahl" aus (Abbildung 2B, C).
- Klicken Sie auf das Bild > passen Sie > Helligkeit und Kontrast an, um den Weißabgleich anzupassen, bis sich der Grauwert des ausgewählten Bereichs dem breiten Hintergrund nähert (Abbildung 2D-F).
HINWEIS: Die Hintergrundhomogenisierung des ersten Frames ermöglicht es der Software, den Hintergrund ohne Objekte zu unterscheiden und einen Kontrast zu erzeugen, wenn eine Fliege vorhanden ist, sodass die Software sie verfolgen kann.
- Führen Sie das gesamte Experiment in einer Testumgebung mit 25 °C und 60 % relativer Luftfeuchtigkeit in einem ruhigen Bereich durch, der keinem hellen Licht ausgesetzt ist.
2. Videoaufzeichnung und -vorverarbeitung
- Nach einer kurzen Narkosezeit mit 95 % Kohlendioxid (CO2) bringen Sie eine Fliege in die offene Arena und drücken Sie die Aufnahmetaste an der Kameraanwendung, um die Videoaufnahme zu starten.
Anmerkungen: Um die Wirkung des Anästhetikums auf die Fortbewegung zu minimieren, lassen Sie die Fliegen 10 Minuten lang sich erholen, bevor Sie mit der Videoaufzeichnung beginnen. Eine kühle Betäubung durch Kühlung wird ebenfalls empfohlen.- Sobald sich die Fliegen von der Narkose erholt haben, stellen Sie die Arenaschale mit der Fliege unter die Kamera und schütteln Sie die Platte schnell von einer Seite zur anderen, um sicherzustellen, dass die Fliege in Bewegung ist, wenn die Aufnahme beginnt.
- Drücken Sie nach Abschluss der Aufnahme die Stopp-Taste , um die Videoaufnahme zu beenden.
HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Videoaufzeichnungszeit die Zielverfolgungszeit geringfügig überschreitet. Um die experimentelle Effizienz zu verbessern, ist es außerdem möglich, mehrere Fliegen spontan zu verfolgen. Dies hängt von der Auflösung der Kamera ab, um einen qualitativ hochwertigen Videoausschnitt zu ermöglichen. - Konvertieren Sie die aufgenommenen Videos in das AVI-Format mit MJPEG-Kodierung, damit sie mit Fidschi geöffnet und analysiert werden können. Stellen Sie in der Zwischenzeit die Bildrate pro Sekunde (fps) des Videos auf 15 fps für erwachsene Fliegen und 12 fps für Larven ein.
3. Videoanalyse
- Öffnen Sie das Video, das transformiert wurde, mit "Virtuellen Stapel verwenden" und "In Graustufen konvertieren", zwei Optionen im Popup-Fenster, wenn Sie das Video mit Fidschi öffnen (Abbildung 2A).
- Erstellen Sie einen leeren ersten Frame, wie oben erwähnt.
- Erhalten Sie ein Verarbeitungsfenster, indem Sie das Werkzeug "Aktives Bild setzen" des AnimalTracker-Plugins verwenden, und erstellen Sie mit dem Werkzeug "Oval" einen Tracking-Bereich, der die Arena im ursprünglichen Videofenster umkreist (Abbildung 3A).
- Stellen Sie die Filter (Abbildung 3A,3) und die Parameter der beiden Filter (Abbildung 4A-G) für das erste leere Bild im Verarbeitungsfenster ein. Wählen Sie dann das nächste Bild im ursprünglichen Videofenster aus und wählen Sie die gefilterte Oberfläche des Verarbeitungsfensters aus (Abbildung 5A-C).
HINWEIS: Der Filterschritt dient dazu, das Bildrauschen zu verringern und/oder den Hintergrund zu entfernen, wodurch es einfacher wird, den Vordergrund beim Binarisieren der Frames vom Hintergrund zu trennen. - Sobald ein gefiltertes Verarbeitungsfenster ausgewählt ist, drehen Sie die verfolgte Fliege mit einem roten Profil, das im Verarbeitungsfenster verdeckt ist, indem Sie das Werkzeug "Schwellenwert festlegen" verwenden (Abbildung 3A, 4, Abbildung 5D-E und Abbildung 6A).
- Verwenden Sie den "set blob-detector", damit der Computer die Fliege mit einem roten Profil erkennen kann, das im Verarbeitungsfenster abgedeckt ist (Abbildung 3A, 5 und Abbildung 6B).
- Legen Sie Frame 901 als letztes Frame für die erwachsene Fliege fest, berechnet anhand der Aufnahmedauer und der fps des Videos (Abbildung 3A,6, Abbildung 6C).
HINWEIS: Das folgende Experiment mit Larven wurde 10 Minuten lang verfolgt, daher ist Frame 7200 als letzter Frame festgelegt. - Verwenden Sie das Werkzeug "Blobs anzeigen", um ein Tracking-Rechteck im ursprünglichen Videofenster darzustellen (Abbildung 3A,7 und Abbildung 6D,E). Starten Sie dann das Tracking und exportieren Sie die Tracking-Datei, nachdem die Überwachung abgeschlossen ist (Abbildung 3A,8,9 und Abbildung 7A,B).
4. Tracking-Dateianalyse
- Laden Sie die Track- und Zonendateien mit dem Animal Tracker > Tracking Analyzer-Plug-in (Abbildung 8A).
- Wählen Sie den gewünschten Index mithilfe der Zoneneinstellungen aus und ändern Sie die Parametereinstellungen (Abbildung 8). Berechnen Sie die Zeit des Frame-Intervalls anhand der Framerate.
HINWEIS: In diesem Zustand beträgt die Bildrate 15 fps und das Bildintervall beträgt ca. 0,067 s, was der Standardeinstellung entspricht (Abbildung 8D). - Erstellen Sie die quantitativen Analysediagramme mit der Tabellenkalkulationssoftware und GraphPad Prism, nachdem sie im Tracking Analyzer analysiert wurden (Abbildung 9).
5. Analyse pro Frame
- Führen Sie eine Geschwindigkeitsanalyse pro Frame-Intervall durch. Analysieren Sie die Track-Datei ohne Fidschi, wenn eine detailliertere Recherche erforderlich ist.
- Öffnen Sie die Track-Datei, kopieren Sie alle Koordinaten in Microsoft Office Excel, und teilen Sie die Zellen mit der Leertaste.
HINWEIS: Wenn die Datei beispielsweise in die Spalten "C" und "D" unterteilt wurde, wird die Geschwindigkeit von Drosophila pro Frame-Intervall mit der Formel SQRT((C5-C4)^ 2+(D5-D4)^2) berechnet, die in der Spalte "E" angezeigt wird (Abbildung 10A). Die Daten in Spalte "E" geben die Anzahl der Pixel an, die die Fliege zwischen zwei Frames bewegt hat, wobei der erste Frame nicht berücksichtigt wird. Wählen Sie alle berechneten Ergebnisse aus und fügen Sie ein Liniendiagramm ein, um eine intuitive Flugbewegungsgeschwindigkeit pro Frame-Intervall mit einem Peak auf dem Liniendiagramm anzuzeigen (Abbildung 10B).
- Öffnen Sie die Track-Datei, kopieren Sie alle Koordinaten in Microsoft Office Excel, und teilen Sie die Zellen mit der Leertaste.
- Berechnen Sie die Immobilitätszeit pro Frame-Intervall. Nachdem die Datei in die Spalten "C" und "D" aufgeteilt wurde, berechnen Sie den Immobilitätsstatus von Drosophila pro Frame-Intervall mit der Formel IF(SQRT((C6-C5)^ 2+(D6-D5)^2) <20, 0, 1), die in der Spalte "E" angezeigt wird. (Abbildung 10C).
HINWEIS: Im Gegensatz zur Geschwindigkeitsanalyse wurden die Ergebnisse des ersten Frames definiert. Fliegen, die sich weniger als 20 Pixel bewegten, galten als unbeweglich und wurden als "0" in Spalte "E" aufgezeichnet.- Wählen Sie alle berechneten Ergebnisse aus, und fügen Sie ein Säulendiagramm ein, um die Immobilitätszeit am Rand des gesamten Säulendiagramms visuell darzustellen (Abbildung 10D).
- Stellen Sie sicher, dass sich der Richtungswinkel ändert.
HINWEIS: Die Analyse des Richtungswinkels stellt die Richtungswahl der Fliegen dar. Nachdem die Datei in die Spalten "C" und "D" aufgeteilt wurde, wird der Winkel der Richtungsänderung mit der Formel ACOS(((SQRT((C7-C6)^2+(D7-D6)^2))^2+(SQRT((C6-C5)^2+(D6-D5)^2))^2-(SQRT((C7-C5)^2+(D7-D5)^2))^2)/(2*SQRT((C6-C5)^2+(D6-D5)^2))*(SQRT((C7-C6)^ 2+(D7-D6)^2)))*180/PI(), die in der Spalte "E" dargestellt ist (Abbildung 10E). Die berechneten Ergebnisse geben den Winkel zwischen drei Koordinaten an.- Wählen Sie alle berechneten Ergebnisse aus und fügen Sie ein Streudiagramm ein, um den Winkel der Richtungsänderung der Fliegenbewegung zu veranschaulichen (Abbildung 10F).
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Representative Results
In der vorliegenden Arbeit wurden lokomotorische Defizite bei adulten Fliegen und Larven im dritten Stadium, die mit Rotenon behandelt wurden, untersucht und in ihrer motorischen Aktivität mit der einer Kontrollfliege verglichen, die mit dem Wirkstofflösungsmittel Dimethylsulfoxid (DMSO) gefüttert wurde. Es hat sich gezeigt, dass die Behandlung mit Rotenon bei Drosophila zu einem Verlust von dopaminergen Neuronen im Gehirn führt22 und zu signifikanten lokomotorischen Defizitenführt 23. Wie in Abbildung 11 und Abbildung 12 gezeigt, weisen adulte Fliegen und Larven im dritten Stadium, die mit Rotenon behandelt wurden, signifikante lokomotorische Defizite im Vergleich zu Kontrollfliegen auf, die mit DMSO gefüttert wurden. Abbildung 11 und Abbildung 12B-E veranschaulichen die relativen Änderungen der Entfernung, der Geschwindigkeit und der Immobilitätszeit für Bewegungsparameter zwischen Fliegen, die mit oder ohne Rotenon behandelt wurden. Abbildung 11 und Abbildung 12F-K zeigen eine repräsentative Analyse der Parameter Geschwindigkeit, Immobilitätszeit und Richtungswahl, mit oder ohne Rotenonbehandlung bei adulten Tieren und Larven. Die quantitative Analyse der Parameter Entfernung, Immobilitätszeit und Geschwindigkeit unter Verwendung der Fidschi-Software bei erwachsenen Fliegen (Abbildung 11) und Larven im dritten Stadium (Abbildung 12) der medikamentenfütternden Gruppen bestätigt weiter, dass die Behandlung mit Rotenon verwendet werden kann, um lokomotorische Defizite bei menschlichen Krankheiten, einschließlich neurodegenerativer Erkrankungen, zu untersuchen und einige der Verhaltensmerkmale zu replizieren, die bei Menschen und Säugetieren beobachtet wurden.
Abbildung 1: Flussdiagramm, das den Aufbau der Ausrüstung und das experimentelle Verfahren für die Bewegungsverfolgungsanalyse von Drosophila skizziert. Die Bewegungs-Tracking-Arena wird mit einer HD-Overhead-Kamera abgebildet, die in einen Computer integriert ist und von diesem gesteuert wird. Das Verfahren zur Analyse der Fortbewegung von Drosophila besteht aus Videoaufzeichnung, Bewegungsverfolgung, Tracking-Dateianalyse, Datenverarbeitung und parametrischer Analyse. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Hintergrundhomogenisierung des ersten Frames. (A) Aktivieren Sie beim Öffnen des transformierten Videos die Option "In Graustufen konvertieren", um das Video in Graustufen umzuwandeln und Farbstörungen zu vermeiden. (B) Umreißen Sie Drosophila mit dem Werkzeug "Freihandauswahl", das im roten Kasten gezeigt wird. (C) Als Analyseauswahl wurde eine gelbe Linie verwendet, um die Umrisse der Fliegen abzugrenzen. Wenn Sie die gelbe Linie nahe an den Konturen der Fliege halten, verringert sich die Wahrscheinlichkeit, dass ein Bereich ausgewählt wird, der nicht von der Fliege besetzt ist. Maßstabsleiste = 1 cm. (D) Passen Sie die Helligkeit und den Kontrast für das erste Bild an, bis der gelb umrandete Bereich die gleichen Graustufen wie der Hintergrund annimmt. (E) Schließen Sie die Helligkeits- und Kontrastanpassung für das erste Bild, aber nicht für alle Bilder ab, indem Sie im Fenster "Stapel" auf "Nein" klicken. (F) Letztendlich wird der erste Rahmen angepasst, um einen einheitlichen und makellosen Hintergrund zu schaffen. Maßstabsleiste = 1 cm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Einstellungen für das Tracking-Fenster und die Tracking-Zone. (A) Schließen Sie die Tracking-Analyse ab, indem Sie auf die Tracker-Plugins in der Reihenfolge klicken, die im Fenster Tierverfolgung markiert ist. (B) Nach dem Einstellen des aktiven Bildes in Abbildung A,1 wird ein Verarbeitungsfenster angezeigt, in dem nur das aktuelle Bild angezeigt wird. Das primäre Videofenster und das Verarbeitungsfenster sind klar voneinander getrennt und werden in unterschiedlichen Situationen verwendet. Um das aktuelle Bild zu ändern, stellen Sie sicher, dass die Änderung im primären Videofenster ausgeführt wird. Die Änderung wird in beiden Fenstern sichtbar sein. Maßstabsleiste = 1 cm. (C) Erstellen Sie einen Tracking-Bereich, der die Arena umkreist, indem Sie das "ovale" Werkzeug zur Computererkennung verwenden. Die Auswahl der Tracking-Zone muss sich in einer eingekreisten Arena in einem geöffneten Videofenster und nicht in einem Verarbeitungsfenster befinden. (D) Umreißen Sie einen Tracking-Bereich mit den gelben Linien, der so weit wie möglich zur Arena passt, um die Störung durch externes Licht zu minimieren. Maßstabsleiste = 1 cm. ( E ) Um den Bereich of Interest (ROI) im Tracking-Bereich einzustellen, klicken Sie auf die Schaltflächen nach der Reihenfolge, die mit den im Fenster "Zone Designer" angezeigten Zahlen gekennzeichnet ist. In diesem Schritt muss der gesamte Vorgang abgeschlossen sein, nachdem das ausgewählte Videofenster geöffnet wurde. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4: Filtereinstellung für den ersten Frame. (A) Wenn Sie die Einstellung des ROI für den Tracking-Bereich abgeschlossen haben, ändert sich die gelbe Linie, die die Arena umgibt, sowohl im geöffneten Videofenster als auch im Verarbeitungsfenster grün. Maßstabsleiste = 1 cm. (B) Wenn Sie den Zweck von Filtern hinzufügen, wird ein schwarzer Hintergrund festgelegt, um das Zielobjekt für das erste Bild im Verarbeitungsfenster deutlicher zu machen. Der gesamte Vorgang sollte in einem Verarbeitungsfenster und nicht in einem geöffneten Videofenster ausgeführt werden. (C,D) Wenn Sie die Filter "Hintergrundsubtrahierung" und "Gaußsche Unschärfe" zum Fenster "Filtereinstellungen" hinzufügen, wird das erste Bild im Bearbeitungsfenster schwarz. Der gesamte Filtereinstellungsprozess muss im ersten Frame abgeschlossen sein. (E) Die Parameter werden Schritt für Schritt eingestellt, indem Sie auf die mit einer Zahl und einem roten Rechteck gekennzeichneten Schaltflächen im Fenster "Hintergrundsubtrahierer" klicken. Der Schritt "Bild setzen" muss nach Auswahl des Bearbeitungsfensters ausgeführt werden. (F) Maßstabsleiste = 1 cm. Das Fenster "Medianbild" wird angezeigt, nachdem Sie in "E4" auf die Schaltfläche "Filter anzeigen" geklickt und das Fenster direkt ohne Bedienung geschlossen haben. (G) Der Parameter der Gaußschen Unschärfe wird mit einem Standard-Sigma-Wert von 2,0 eingestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 5: Schwellenwerteinstellungen des zweiten Frames. (A) Klicken Sie auf den unteren Fortschrittsbalken, um das Videofenster zum zweiten Bild zu bewegen. Die Fliege taucht in der Mitte des Bildschirms wieder auf und wird von Fidschi identifiziert. Maßstabsleiste = 1 cm. (B,C) Zeigt das Verarbeitungsfenster vor und nach dem Filtern an. (B) Zeigen Sie das gefilterte Verarbeitungsfenster an, indem Sie den Modus auswählen, der mit einem roten Rechteck markiert ist. (C) Ein Beispiel für ein Verarbeitungsfenster mit einem roten Rechteck, nachdem der Modus "gefiltert" ausgewählt wurde. Maßstabsleiste = 1 cm. (D) Stellen Sie den Schwellenwert ein, indem Sie die Standard-Schwellenwertmethode "Graustufen-Schwellenwert" auswählen, die im Fenster "Schwellenwerte" angezeigt wird, nachdem Sie das Werkzeug "Schwellenwert festlegen" in Abbildung 3A,4 ausgewählt haben. (E) Passen Sie die Parameter an, indem Sie das Fortschrittsbalkenfeld in der Mitte verschieben, bis die Tracking-Fliege zu sehen und vom roten Profil bedeckt ist. Es wird nicht empfohlen, die Standardeinstellungen für die Parameter zu ändern, die im roten Rechteck unten eingerahmt sind. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 6: Blob-Detektor, Einstellung des letzten Frames und Auswahl der Tierverfolgung. (A) Bei Erreichen des in Abbildung 5E angegebenen Schwellenwerts zeigt das Verarbeitungsfenster ein beträchtliches rotes Profil, das auf die Fliege im zweiten Bild folgt. Passen Sie das rote Profil, das die Fliege bedeckt, an, um die Fliege zu verfolgen. Maßstabsleiste = 1 cm. (B) Definieren Sie die rote, profilbedeckte Fliege als Ziel für die Verfolgung, indem Sie die Standard-Blob-Detektor-Methode "Basis-Blob-Detektor" auswählen. (C) Legen Sie Frame 901 als letzten Frame fest, indem Sie das Werkzeug "Letzten Frame setzen" in Abbildung 3A,6 verwenden. Die Gesamtzahl der Bilder wird nach der Formel "Bildnummer = fps * Aufnahmezeit" berechnet. (D) Das Tracking fliegt mit einem gelben Rechteck, das nach den angezeigten Blobs im geöffneten Videofenster (linker Bereich) eingerahmt ist. In der vergrößerten linken Tafel sind Fruchtfliegen in Rot angebracht (rechter Tafelausschnitt). Maßstabsleiste = 1 cm. (E) Die Tracking-Fliege mit einem roten Rechteck eingerahmt, nachdem Sie auf das rote Rechteck in "D" (oberer Panel-Bereich) geklickt haben. In der oberen Plattenvergrößerung sind Fruchtfliegen in Rot angebracht (unterer Plattenausschnitt). Stellen Sie sicher, dass die Auswahl eines gelben Rechtecks um eine Tracking-Fliege im geöffneten Videofenster abgeschlossen ist. Schließen Sie die Auswahl im geöffneten Videofenster ab, und die Fliege wird in allen Frames von Fidschi identifiziert. Maßstabsleiste = 1 cm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 7: Ergebnisse der Verfolgungsverfolgung. Der Tracking-Trace wird im geöffneten Videofenster ( A ) und im Verarbeitungsfenster (B) separat angezeigt. Um das Tracking-Trace-Profil abzurufen, klicken Sie auf den Fortschrittsbalken im ursprünglichen Videofenster und verschieben Sie den Fortschrittsbalken, um die Kontinuität des Traces zu überprüfen. Die Tracking-Spur stellt die Kriechstrecke der Fliegen intuitiv dar. Maßstabsleiste = 1 cm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 8: Tracking-Dateianalyse mit den AnimalTracker-Plugins. (A) Der Tracking-Analysator ermöglicht eine detaillierte Analyse der Tracking-Datei; Jeder Schritt, der mit einem roten Rechteck markiert ist, wird durch eine Zahl gekennzeichnet. (B) Stellen Sie die Parameter "Zoneneinstellungen" in A,4 ein. Vier Parameter, Zeit, Entfernung, Immobilitätszeit und Geschwindigkeitsvektor, werden im roten Rechteck angezeigt. Der Parameter wird basierend auf dem gewünschten Ergebnis ausgewählt. (C-G) Stellen Sie die Konfigurationsparameter einzeln im Fenster "Parameter einstellen" von A,5 ein. (C) Vier einstellbare Parameter sind im Fenster "Konfigurationsparametereinstellungen" dargestellt, (D-G) mit den Fenstern "Zeiteinstellungen", "Immobilitätszeiteinstellung", "Entfernungseinstellungen" und "Geschwindigkeitsvektoreinstellung". Es wird nicht empfohlen, den Standardwert für die Parametereinstellungen zu ändern. Für das "Frame-Intervall" sollte der Parameter jedoch mit der Formel "Frame-Intervall = 1/fps" berechnet werden, wenn die fps des Videos geändert werden. Darüber hinaus ist es möglich, eine bekannte Skala zu verwenden, um die tatsächliche Entfernung und Geschwindigkeit zu ermitteln, indem die mit der Verfolgung einer Fliege aufgezeichneten Pixel zu einem greifbaren Wert korreliert werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 9: Ergebnisanzeige der Tracking-Datei-Analyse. (A) Die Einstellung in Abbildung 8A,6. Es stehen zwei Modi zur Anzeige der Daten zur Verfügung: "gruppiert nach Zonen" und "gruppiert nach Parametern". (B) Die Ergebnisse der Tracking-Dateianalyse werden in "A,6.1" als "gruppiert nach Zonen" angezeigt. (C-F) Die Ergebnisse der Tracking-Dateianalyse werden in A,6.2 als "gruppiert nach Parametern" angezeigt, wobei "Immobilitätszeit" (C), "Geschwindigkeitsvektor" (D), "Zeit" (E) und "Entfernung" (F) separat angezeigt werden. Die Ergebnisse der Immobilitätszeit und -distanz werden als "s" und "Pixel" quantifiziert. Die Einheit des Geschwindigkeitsvektors sollte als "Pixel/s" definiert und mit der Annotation "Länge" ausgegeben werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 10: Ergebnisse der Datenanalyse für die Geschwindigkeit pro Sekunde. (A, C und E) Die Exportdaten enthalten Koordinaten von Pixeln in horizontalen (Spalte "C") und vertikalen (Spalte "D") Partitionen sowie die Bewegung von Pixeln, die Immobilität und den Winkel der Richtungsänderung zwischen Zwei-Frame-Intervallen (Spalte "E" in A, C bzw. E), die automatisch durch die Formel berechnet wird, die im Kontext beschrieben wird. Da es sich bei den aus Fidschi exportierten Ergebnissen um Textdokumente handelt, empfiehlt es sich, die Datei mit Microsoft Office Excel zu öffnen und die Daten durch Hinzufügen von Leerzeichen in drei Spalten aufzuteilen. (B, D und F) Ein Liniendiagramm zeigt die berechneten Ergebnisse aus dem Datensatz der Pixelbewegung (B) an. Der globale Spitzenwert stellt die Geschwindigkeit dar, die auf die Bewegungserkennungsfunktionen hinweist. Das Säulendiagramm zeigt die berechneten Ergebnisse aus dem Datensatz der Immobilität (D) an. Der Grad der Sparsity im Säulendiagramm stellt die Immobilität dar, die den motorischen Leistungsdefekt von Fliegen aufweist; Ein Streudiagramm zeigt die berechneten Ergebnisse aus dem Datensatz des Richtungsänderungswinkels (F) an. Die im Streudiagramm dargestellte Anreicherung der Spritzer stellt die von der Fliege gewählte Richtung dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 11: Eine vergleichende Analyse der Bewegung zwischen Fliegen, die mit oder ohne Rotenon behandelt wurden. (A) Repräsentative Diagramme der Spur von W1118 adulten Fliegen, die mit Standardfutter gefüttert wurden, das 500 μM Rotenon oder DMSO zur Kontrolle enthielt, sind dargestellt. W1118 Fliegen wurden gesammelt und dann in eine kontrollierte Umgebung gebracht, die aus Standardfutter mit 500 μM Rotenon oder DMSO, 25 °C und 60 % Luftfeuchtigkeit bestand. Aus jeder Gruppe wurden nach 48 h sechs Fliegen zur Analyse herangezogen. Das Ergebnis zeigt, dass die Bewegungsdistanz von Fährtenfliegen, die mit Rotenon gefüttert wurden, im Vergleich zu der der Kontrolle signifikant verringert ist. Das Ergebnis zeigte eine defekte Motorik bei Fliegen, die mit Rotenon gefüttert wurden. (B-E) Die quantitative Analyse der Rotenonbehandlung anhand der durchschnittlich zurückgelegten Strecke, der Immobilitätszeit, der mittleren Geschwindigkeit und der maximalen Geschwindigkeit wird anhand von Fidschi durchgeführt. Die Ergebnisse der Rotenon-Behandlung zeigten eine signifikante Abnahme der zurückgelegten Strecke und der mittleren Geschwindigkeit sowie eine signifikante Zunahme der Immobilitätszeit. (F-K) Analyse der Pixel pro Frame (F,G), der Immobilitätszeit pro Frame (H,I) und des Winkels der Richtungsänderungen (J,K) zwischen Fliegen, die mit Rotenon (G,I,K) oder DMSO (F,H,J) behandelt wurden. Beispieldiagramme, die die Auswirkungen von Rotenon auf die Bewegungsgeschwindigkeit veranschaulichen, zeigen weniger Spitzen, die die Bewegungsgeschwindigkeit pro Bildintervall bei Fliegen darstellen, die mit Rotenon (G) gefüttert wurden, im Vergleich zu denen in der Kontrolle (F), was auf den Schweregrad des Bewegungsdefekts (F,G) hinweist. Die intuitionistische Immobilitätsspalte der bewegten Pixel pro Frame ist geringer und zeigt signifikant weniger Bewegung innerhalb von 1 Minute für rotenongefütterte Fliegen (I) im Vergleich zu den Kontrollfliegen (H). Beispielgraphen des Bewegungswinkels von Richtungsänderungen bei Rotenon-gefütterten (K) und Kontrolltieren (J) zeigen Veränderungen in der von den Fliegen gewählten Richtung. Bei den Daten handelt es sich um den Mittelwert ± SEM von sechs männlichen Fliegen, die 1 Minute lang überwacht wurden. Sternchen deuten auf signifikante Unterschiede zwischen den Gruppen hin (***p < 0,001; ungepaarter t-Test, p = 0,05). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 12: Eine vergleichende Analyse der Bewegung zwischen Larven, die mit oder ohne Rotenon behandelt wurden. (A) Repräsentative Ergebnisse des Vergleichs der Bewegungsaktivität durch Verfolgung der Spur von W1118-Larven im dritten Stadium, die mit Rotenon oder DMSO gefüttert wurden. Kurz gesagt, W1118 Larven im dritten Stadium wurden in 10% Saccharose oder 10% Saccharose mit 500 μM Rotenon in einer Umgebung bei 25 °C und 60% Luftfeuchtigkeit gesammelt und kultiviert. Für die Analyse wurden sechs Larven pro Gruppe verwendet. Unter Berücksichtigung der langsamen Bewegung der Larven wurde die Datenaufzeichnung über einen Zeitraum von 5 min quantifiziert und analysiert, um die Auswirkungen von Rotenon auf die Fortbewegung zu bewerten. (B-E) Die durchschnittliche Entfernung, die Immobilitätszeit, die mittlere Geschwindigkeit und die maximale Geschwindigkeit der beiden in Fidschi analysierten Gruppen werden quantitativ analysiert. Die quantitativen Ergebnisse zeigen, dass die Bewegungsdistanz, die mittlere Geschwindigkeit und die maximale Geschwindigkeit bei Larven, die mit Rotenon gefüttert wurden, signifikant abnehmen und die Immobilitätszeit bei Larven, die mit Rotenon gefüttert wurden, signifikant zunimmt. (F-K) Ähnlich wie bei adulten Fliegen zeigte die Analyse der Pixel pro Frame, der Immobilitätszeit und des Winkels der Richtungsänderungen zwischen Fliegen, die mit Rotenon (G,I,K) und ohne Rotenon (F,H,J) behandelt wurden, dass die mit Rotenon behandelten Larven eine geringere Bewegungsgeschwindigkeit und eine längere Immobilitätszeit aufwiesen und ihre Richtungen wechselten. Die Ergebnisse zeigen, dass die Verhaltensbewegung von Trackinglarven, die mit Rotenon gefüttert wurden, im Vergleich zur Kontrolle signifikant beeinträchtigt ist. Die Ergebnisse zeigen eine gestörte Bewegungsaktivität von Fliegen, die mit Rotenon gefüttert wurden. Bei den Daten handelt es sich um den Mittelwert ± SEM von sechs 3 Tage alten Larven, die 5 Minuten lang überwacht wurden. Sternchen zeigen einen signifikanten Unterschied zwischen den Gruppen an (*p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001; ungepaarter t-Test, p = 0,05). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Tabelle 1: Vergleich von Animals-Tracking-basierten Methoden zur Quantifizierung der lokomotorischen Aktivität in Drosophila. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.
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Discussion
Wir haben eine Methode entwickelt, die auf dem Open-Source-Material AnimalTracker API basiert, das mit dem Fidschi-Bildverarbeitungsprogramm kompatibel ist und es Forschern ermöglicht, die Bewegungsaktivität systematisch zu bewerten, indem sie sowohl erwachsene als auch einzelne Larvenfliegen verfolgen. AnimalTracke ist ein in Java geschriebenes Tool, das sich leicht in bestehende Datenbanken oder andere Tools integrieren lässt, um die Analyse des von der Anwendung entworfenen Tierverfolgungsverhaltenszu erleichtern 24. Nach einer Frame-by-Frame-Analyse durch eine Software-Berechnungsformel, die die Bewegungsaktivität der erwachsenen Tiere und Larven quantifiziert, können verschiedene Parameter wie Bewegungsgeschwindigkeit, zurückgelegte Strecke, Immobilität und Richtungsänderungen flexibel analysiert werden. Diese Parameter, die verschiedene Aspekte der Verhaltensfortbewegung repräsentieren, können grafisch dargestellt werden, um die Veränderungen des Bewegungsapparates im Laufe der Zeit zu veranschaulichen. Darüber hinaus wollen wir durch die Erstellung einer grafischen Benutzeroberfläche, eine detaillierte Dokumentation ihrer Verwendung und eine Anwendungsprogrammierschnittstelle diese Methode für Forscher zugänglich machen, denen es an Programmiererfahrung mangelt, und für erfahrene Benutzer, die benutzerdefinierte experimentelle Paradigmen erstellen.
Um zu überprüfen, ob die Methode das Verhalten genau überwachen kann, wurden Bewegungstests von erwachsenen Fliegen und Larven, die mit Rotenon behandelt wurden, sowie ein Vergleich ihrer motorischen Aktivität mit der von Kontrollfliegen, die mit dem Lösungsmittel des Medikaments gefüttert wurden, durchgeführt. Die Fidschi-Software mit ihren Plugins wird verwendet, um die Pixelkoordinaten jedes Bildes in der Videoaufzeichnung der Bewegung zu analysieren und so die Geschwindigkeit, Entfernung und andere Parameter der experimentellen Fliegen zu berechnen. Wir beobachteten eine signifikante Abnahme der zurückgelegten Distanz im Laufe der Zeit bei der Verabreichung von Rotenon (Abbildung 11), was mit den berichteten Ergebnissenübereinstimmt 23. In der Zwischenzeit wurden die aufsteigende Bewegungsgeschwindigkeit und die abnormale Richtung in Gruppen beobachtet, die mit Medikamenten gefüttert wurden, um mehr Details über die Verhaltensschwäche bei Fliegen zu veranschaulichen. Angesichts des Erfolgs bei der Erkennung der Bewegungsaktivität erwachsener Fliegen versuchten wir dann, die Mobilität der Larven zu bewerten (Abbildung 12). Im Vergleich zur Kontrolle waren die Ergebnisse der mit Rotenon gefütterten Tracking-Larven signifikant beeinträchtigt, parallel zu denen der adulten Fliegen, die mit Medikamenten gefüttert wurden. Experimente mit den Erwachsenen und Larven, die mit Rotenon gefüttert wurden, deuten darauf hin, dass mit dieser Methode die Reduktion von Fliegen, die Defizite am Bewegungsapparat produzierten, im Vergleich zu Kontrollen genau erfasst werden kann. Dieser Bericht hat erfolgreich die Anwendung der aktuellen Methode zur Quantifizierung und Analyse der Bewegungsfähigkeit und anderer Facetten von Verhaltensfehlern von Fruchtfliegen in Testmodellen oder in der pharmakologischen Forschung an Tieren demonstriert.
Um sicherzustellen, dass die Video- und Tracking-Analyse erfolgreiche und reproduzierbare Ergebnisse liefert, empfiehlt es sich, die folgenden Richtlinien einzuhalten. Für die Wahl der Videobildrate empfehlen wir zunächst, das aufgenommene Video in ein Format von 15 Bildern pro Sekunde (fps) zu konvertieren. Dies kann nicht nur eine gute Bewegungsverfolgung aufrechterhalten, sondern auch die Langsamkeit der Computeranalyse vermeiden, die durch große Datenmengen verursacht wird. Durch die Verbesserung der Videobildrate wird die Bewegungstrajektorienanalyse detaillierter. Zweitens können die Parameter in der Formel auch an das entsprechende experimentelle Schema angepasst werden, wenn die statische Bewegung zwischen jeweils zwei Frames analysiert wird. Für die Überwachung des Bewegungsapparates der Larven ist es wichtig, Kieselgel anstelle von Agar zu verwenden, da das verfestigte Kieselgel dicht sitzt und die Larven nicht hineingelangen können. Darüber hinaus ist Kieselgel transparent und kann durch Zugabe von Farbsubstanz gefärbt werden, um einen optimalen Hintergrund zu erzeugen, was die gewünschten optischen Effekte ermöglicht, die die Bildqualität verbessern.
Tierverfolgungssysteme werden weiterentwickelt, um umfassende Lösungen für die Ätiologie, die Neurowissenschaften und die Verhaltensgenetik bereitzustellen. Tabelle 1 zeigt einen Vergleich der Funktionen mehrerer derzeit verfügbarer Tracking-Programme 10,11,12,16,17,25,26. Dieser Ansatz ist äußerst kostengünstig, einfach zu erlernen und präzise bei der Messung des Bewegungsverhaltens, ohne dass kostspielige Software und Geräte erforderlich sind. Es besteht kein Zweifel, dass diese Methode bequem auf andere Drosophila-ähnliche Tiermodelle und sogar auf größere Tiere wie Ratten und Mäuse ausgeweitet werden kann. Die Struktur der AnimalTracker-API kann mit Leichtigkeit durch unabhängige ImageJ-Anwendungen oder Plugins erweitert werden und bietet eine breite Palette nützlicher Toolkits für die benutzerdefinierte Verhaltensforschung und -analyse24. Dennoch hat diese Studie gewisse Einschränkungen. Da eine einzelne Fliege für die Bildaufnahme in einer Freilandarena platziert wird und die Videoverfolgung individuell durchgeführt wird, ist diese Methode ineffizient und zeitaufwändig. Wir haben versucht, die Kapazität für die gleichzeitige Aufnahme mehrerer Arenen zu erweitern, so dass bis zu sechs Einzelaufnahmen möglich sind. Theoretisch ist es möglich, eine größere Anzahl von Drosophila gleichzeitig zu erfassen; Dies hängt von der Größe der Arena und der Konfiguration der Kamera ab. Wenn Benutzer auf die Erfassung von gruppierten Drosophila ausdehnen möchten, wird alternativ empfohlen, die begrenzte Anzahl von Einzelaufzeichnungen und eine Konfiguration von ausreichender Qualität zu berücksichtigen, um Kollisionen und Überlappungen zwischen den Fliegen zu identifizieren. Verbesserungen der Testeffizienz durch maschinelles Lernen wurden in der Studie nicht berücksichtigt, da kein erschwinglicher und kompatibler Ansatz gefunden wurde, der in das aktuelle System integriert werden kann, um Identitäten visuell zu unterscheiden und Modelle genau zu verfolgen.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die hier beschriebene Methode einen effizienten und unkomplizierten Ansatz entwickelt und validiert, der auf freier Open-Source-Software basiert, um den Zeitaufwand zu reduzieren und experimentelle Techniken zur quantitativen Anzeige und Analyse der Fortbewegung von Drosophila im Larven- und Erwachsenenstadium zu verfeinern. Durch systematische Analyse kann uns diese Methode helfen zu verstehen, wie sich die Geschwindigkeit des Tieres im Laufe der Zeit während der Bewegung ändert, sowie die Merkmale der Richtungswahl. Daher bietet die Integration von Open-Source-Software in häufig verwendete digitale Geräte eine zuverlässige Möglichkeit, die Bewegungsaktivität in verschiedenen Fliegenmodellen zu testen. Dies könnte nützlich sein, um physiologische und pathologische lokomotorische Outputs bei der Erprobung neurodegenerativer Krankheitsmodelle zu testen, die aus pharmakologischer Behandlung und transgener Modifikation in Drosophila und anderen Tieren abgeleitet wurden.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde durch einen speziellen Startfonds der Soochow-Universität und der National Science Foundation of China (NSFC) (82171414) unterstützt. Wir danken den Labormitgliedern von Prof. Chunfeng Liu für ihre Diskussionen und Kommentare.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Animal tracker | Hungarian Brain Research Program | version: 1.7 | pfficial website: http://animaltracker.elte.hu/main/downloads |
| Camera software | Microsoft | version: 2021.105.10.0 | built-in windows 10 system |
| Computer | DELL | Vostro-14-5480 | a comupter running win 10 system is available |
| Drosophila carbon dioxide anesthesia workstation | Wu han Yihong technology | #YHDFPCO2-018 | official website: http://www.yhkjwh.com/ |
| Fiji software | Fiji team | version: 1.53v | official website: https://fiji.sc/ |
| Format factory software | Pcfreetime | version: X64 5.4.5 | official website: http://www.pcfreetime.com/formatfactory/CN/index.html |
| Graph pad prism | GraphPad Software | version: 8.0.2 | official website: https://www.graphpad-prism.cn |
| Hight definition camera | TTQ | Jingwang2 (HD1080P F1.6 6-60mm) | official website: http://www.ttq100.com/product_show.php?id=35 |
| Office software | Microsoft | version: office 2019 | official website: https://www.microsoftstore.com.cn/software/office |
| Petri dish | Bkman | 110301003 | size: 60 mm |
| Silica gel | DOW | SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit | Mix well according to the instructions |
| Sodium bicarbonate | Macklin | #144-55-8 | Mix well with silica gel |
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