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Medicine

Optimierung der Epimedii Folium Hammelöl-Verarbeitungstechnologie und Prüfung ihrer Wirkung auf die Embryonalentwicklung von Zebrafischen

Published: March 17, 2023 doi: 10.3791/65096
Automatic Translation
1, 1,2, 1, 1, 1, 1, 1,2
1Chongqing Academy of Chinese Materia Medica, 2Bioengineering College of Chongqing University

Summary

In diesem Protokoll wurde die Hammelöl-Verarbeitungstechnologie von Epimedii folium (EF) durch die Anwendung einer Box-Behnken-experimentellen Design-Response-Oberflächenmethodik optimiert und der Einfluss von rohem und optimiertem wasserextrahiertem EF auf die Embryonalentwicklung von Zebrafischen vorläufig untersucht.

Abstract

Als Traditionelle Chinesische Medizin (TCM) hat Epimedii folium (EF) eine Geschichte in Medizin und Lebensmitteln, die > 2.000 Jahre alt ist. Klinisch wird EF, das mit Hammelöl verarbeitet wird, häufig als Arzneimittel verwendet. In den letzten Jahren haben die Berichte über Sicherheitsrisiken und unerwünschte Reaktionen von Produkten, die EF als Rohstoff verwenden, allmählich zugenommen. Durch die Verarbeitung kann die Sicherheit der TCM effektiv verbessert werden. Nach der TCM-Theorie kann die Verarbeitung von Hammelöl die Toxizität von EF verringern und seine tonisierende Wirkung auf die Nieren verstärken. Es fehlt jedoch an einer systematischen Erforschung und Bewertung der EF-Hammelöl-Verarbeitungstechnologie. In dieser Studie haben wir die experimentelle Design-Response-Oberflächenmethodik von Box-Behnken verwendet, um die Schlüsselparameter der Verarbeitungstechnologie zu optimieren, indem wir den Inhalt mehrerer Komponenten bewertet haben. Die Ergebnisse zeigten, dass die optimale Hammelöl-Verarbeitungstechnologie von EF wie folgt war: Erhitzen des Hammelöls auf 120 °C ± 10 °C, Zugabe des rohen EF, sanftes Braten auf 189 °C ± 10 °C, bis es gleichmäßig glänzt, und dann herausnehmen und abkühlen lassen. Pro 100 kg EF sollten 15 kg Hammelöl verwendet werden. Die Toxizitäten und Teratogenitäten eines wässrigen Extrakts aus Roh- und Hammelöl, das mit EF verarbeitet wurde, wurden in einem Entwicklungsmodell eines Zebrafischembryos verglichen. Die Ergebnisse zeigten, dass die rohe Kräutergruppe mit größerer Wahrscheinlichkeit Zebrafischdeformationen verursachte und ihre halbmaximale tödliche EF-Konzentration niedriger war. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die optimierte Hammelöl-Verarbeitungstechnologie stabil und zuverlässig war und eine gute Wiederholgenauigkeit aufweist. Bei einer bestimmten Dosis war der wässrige Extrakt von EF toxisch für die Entwicklung von Zebrafischembryonen, und die Toxizität war für das Roharzneimittel stärker als für das verarbeitete Arzneimittel. Die Ergebnisse zeigten, dass die Hammelölverarbeitung die Toxizität von rohem EF reduzierte. Diese Erkenntnisse können genutzt werden, um die Qualität, Einheitlichkeit und klinische Sicherheit von mit Hammelöl verarbeitetem EF zu verbessern.

Introduction

Epimedii folium (EF) sind die getrockneten Blätter von Epimedium brevicornu Maxim., Epimedium sagittatum (Sieb. et Zucc.) Maxim., Epimedium pubescens Maxim., oder Epimedium koreanum Nakai. EF kann zur Behandlung von Osteoporose, Wechseljahrssyndrom, Knoten in der Brust, Bluthochdruck, koronarer Herzkrankheit und anderen Krankheiten eingesetzt werden1. Als Traditionelle Chinesische Medizin (TCM) blickt EF auf eine mehr als 2.000-jährige Geschichte in Medizin und Ernährung zurück. Aufgrund seines niedrigen Preises und seiner bemerkenswerten Wirkung auf die Nieren wird es häufig in Medikamenten und gesunden Lebensmitteln verwendet. EF wird durch Braten mit Hammelöl verarbeitet, ein Prozess, der erstmals in der Lei Gong-Verarbeitungstheorie beschrieben wurde, die von Lei Xiao in der Liu-Song-Periode2 geschrieben wurde. Die Wirksamkeit von rohem EF und gebratenem EF ist sehr unterschiedlich. Rohes EF vertreibt hauptsächlich Rheuma, während das gebratene EF die Nieren erwärmt, um Yang3 zu stärken. Gegenwärtig wird EF häufig als Rohstoff in Arzneimitteln und gesunden Lebensmitteln verwendet. Es gibt 399 gelistete chinesische Patentarzneimittel, neun importierte Naturkost und 455 inländische Naturkost mit EF als Rohstoff4. Dieses medizinische Material hat große Anwendungsaussichten. In den letzten Jahren gab es jedoch vermehrt Berichte über unerwünschte Reaktionen und Leberschäden beim Menschen, die durch gesunde Lebensmittel und chinesische Patentmedikamente verursacht wurden, die EF als Rohstoff verwenden, und verwandte Toxizitätsstudien 5,6,7 haben berichtet, dass EF als Rohstoff potenzielle Sicherheitsrisiken birgt.

Chinesische medizinische Verarbeitung bezieht sich auf pharmazeutische Techniken, die die Toxizität effektiv reduzieren oder beseitigen und die Sicherheit von TCMs verbessern können. Die traditionelle Verarbeitungsmethode von EF ist das Braten mit Hammelöl, das die Toxizität von EF verringert und seine Wirkung verstärkt, die Nieren zu erwärmen und Yang8 zu fördern. Diese Verarbeitungsmethode ist im chinesischen Arzneibuch und in verschiedenen Verarbeitungsspezifikationenenthalten 1. Das Verfahren von EF ist nur wie folgt spezifiziert: Pro 100 kg EF werden 20 kg Fruchtöl (raffiniert) zugegeben, und es wird mild gebrannt, bis es gleichmäßig und glänzendist 1. In den oben genannten Standards gibt es keine strengen Parameter für die EF-Verarbeitungsmethode, sodass die lokalen Verarbeitungsspezifikationen nicht vereinheitlicht wurden, um Konsistenz zu gewährleisten. Daher wäre es sinnvoll, eine systematische Untersuchung des EF-Prozesses durchzuführen. In dieser Arbeit wurde die experimentelle Box-Behnken-Design-Response-Oberflächenmethode verwendet, um die Verarbeitungstechnologie von EF zu optimieren.

Das Box-Behnken-Versuchsdesign ist eine Methode, die typischerweise zur Optimierung der Faktoren in einem Prozess verwendet wird. Die Extraktionsparameter können optimiert werden, indem die funktionale Beziehung zwischen mehreren Regressionsgleichungsanpassungsfaktoren und Effektwerten hergestellt wird. In jüngster Zeit wurde diese Methode häufig verwendet, um die TCM-Extraktion 5,6,7 und die Verarbeitung von 9,10,11 zu untersuchen. Verschiedene Studien haben über TCM-Zubereitungsmethoden berichtet, die die Salzverarbeitung, die Weinverarbeitung und das Braten nach einem Box-Behnken-Design umfassen, wie z. B. für salzverarbeitete Psoraleae fructus 12, weinverarbeitete Cnidii fructus13 und gerösteten Cinnamomi ramulus14. Diese Methode zeichnet sich durch eine reduzierte Testzeit und eine hohe Testgenauigkeit aus und eignet sich für Multi-Faktor- und Multi-Level-Tests. Das Verfahren ist einfacher als das orthogonale Bemessungsprüfverfahren und umfassender als das einheitliche Bemessungsverfahren15. Die erhaltenen Beziehungen können den vorhergesagten Wert eines beliebigen Testpunktes innerhalb des Testbereichs bestimmen, was ein großer Vorteil ist. Mit einem Zebrafischmodell kann getestet werden, ob EF nach der Verarbeitung weniger toxisch ist.

In TCM-Toxizitätsstudien hat das Zebrafischmodell die doppelten Vorteile des hohen Durchsatzes von Zellexperimenten und der Ähnlichkeit mit Nagetierexperimenten16. Dieses Modell zeichnet sich durch seine geringe Größe, hohe Laichrate, kurzen Fortpflanzungszyklus und einfache Zucht aus. Das Modell kann in groß angelegten synchronen Experimenten in Zellkulturplatten verwendet werden, und die Dosierung des experimentellen Arzneimittels ist gering, der experimentelle Zyklus ist kurz, die Kosten sind niedrig und der gesamte experimentelle Prozess ist einfach zu beobachten und zu bedienen17. Zebrafischembryonen sind durchsichtig und entwickeln sich schnell. Daher können die Toxizität und die teratogene Wirkung von Arzneimitteln auf viszerales Gewebe in verschiedenen Entwicklungsstadien direkt unter dem Mikroskop beobachtet werden18. Die Genhomologie zwischen Zebrafisch und Mensch liegt bei bis zu 85 %18. Der Signaltransduktionsweg des Zebrafisches ähnelt dem des Menschen18. Die biologische Struktur und die physiologische Funktion von Zebrafischen sind denen von Säugetieren sehr ähnlich18. Daher kann ein Zebrafischmodell für Drogentests Versuchstiere liefern, die zuverlässig und vollständig auf den Menschen anwendbar sind19.

In dieser Studie haben wir die Box-Behnken-Design-Response-Oberflächenmethodik verwendet, um die Menge und Temperatur von Hammelöl und die in der EF-Verarbeitungstechnologie verwendete Frittiertemperatur zu optimieren, wobei die Gehalte an Icariin, Epimedin A, Epimedin B, Epimedin C und Baohuosid I als Bewertungsindizes dienten. Das Zebrafischmodell wurde verwendet, um die Wirkung eines EF-Wasserextrakts auf die Embryonalentwicklung von Zebrafischen vor und nach der Verarbeitung vorläufig zu untersuchen und den Abschwächungseffekt der Verarbeitung auf EF zu bewerten.

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Protocol

Alle tierbezogenen Versuche wurden mit Genehmigung der Versuchsethikkommission des Chongqing Instituts für TCM durchgeführt (Prüftierethik-Zertifikatsnummer: ZJS2022-03).

1. Bestimmung der bioaktiven Bestandteile

HINWEIS: Bei der in dieser Forschung verwendeten Spezies handelte es sich um Epimedium sagittatum, und die Proben wurden im Landkreis Fengdu, Chongqing, gesammelt. Die Probe wurde als trockener oberirdischer Teil von E. sagittatum (Sieb. et Zucc.) Grundsatz. von Forschern des Instituts für Biologische Medizin, Chongqing Institut für Traditionelle Chinesische Medizin.

  1. Bereiten Sie die Kontrollproduktlösung vor, indem Sie die entsprechende Menge jeder Referenzsubstanz, nämlich Icariin, Epimedin A (EA), Epimedin B (EB), Epimedin C (EC) und Baohuosid I (BI), unter Verwendung einer elektronischen Analysenwaage genau wiegen und in Methanol lösen. Bereiten Sie damit eine gemischte Referenzlösung her, die 381,61 μg/ml Icariin, 124,14 μg/ml EA, 110,24 μg/ml EB, 1091,75 μg/ml EC und 184,98 μg/ml BI enthält.
  2. Bereiten Sie die Testproduktlösung vor, indem Sie EF durch ein Sieb Nr. 3 zerkleinern. Geben Sie ca. 0,2 g (unter Verwendung einer elektronischen Analysenwaage) zerkleinertes EF in einen Erlenmeyerkolben mit Stopfen, fügen Sie 20 ml verdünntes Ethanol hinzu und beschallen Sie dann 1 h lang mit einer Leistung von 400 W und einer Frequenz von 50 kHz. Gut schütteln und durch einen 0,22 μm Membranfilter passieren, um die Testlösung zu erhalten.
  3. Führen Sie die Chromatographie wie folgt durch. Verwenden Sie die Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) mit einer C18-Säule mit Abmessungen von 4,6 mm x 250 mm und einem Innendurchmesser von 5 μm. Verwenden Sie Acetonitril als mobile Phase A und Reinstwasser als mobile Phase B. Verwenden Sie die folgenden Gradientenelutionsparameter: 0-30 min, 24% A bis 26% A; 30-31 min, 26% A bis 45% A; 31-45 min, 45 % A bis 47 % A. Verwenden Sie eine Detektionswellenlänge von 220 nm (für den verwendeten Detektor siehe Materialtabelle). Halten Sie die Säulentemperatur bei 30 °C und die Stromgeschwindigkeit bei 1,0 ml/min und verwenden Sie eine Probengröße von 10 μl.
  4. Um den linearen Zusammenhang zu untersuchen, verwenden Sie die gemischte Referenzlösung wie in Schritt 1.1, die 2-mal, 4-mal, 8-mal, 16-mal und 32-mal verdünnt wurde, für Icariin, EA, EB, EC bzw. BI. Verwenden Sie Acetonitril als mobile Phase A und Reinstwasser als mobile Phase B.
  5. Verwenden Sie die folgenden Gradientenelutionsparameter: 0-30 min, 24 % A bis 26 % A; 30-31 min, 26% A bis 45% A; 31-45 min, 45 % A bis 47 % A. Verwenden Sie eine Detektionswellenlänge von 220 nm (für den verwendeten Detektor siehe Materialtabelle). Halten Sie die Säulentemperatur bei 30 °C und die Stromgeschwindigkeit bei 1,0 ml/min und verwenden Sie eine Probengröße von 10 μl. Notieren Sie schließlich die Spitzenbereiche. Zeichnen Sie die lineare Regression mit der Referenzkonzentration (x-Achse, μg/ml) als Abszisse und der Peakfläche (y-Achse) als Ordinate mit professioneller Software auf (siehe Materialtabelle).
  6. Führen Sie den Präzisionstest durch, indem Sie die gemischte Kontrolllösung sechs Mal hintereinander mittels HPLC unter Verwendung der in Schritt 1.3 gezeigten chromatographischen Bedingungen messen. Zeichnen Sie die Detektionszeit und die Peakbereiche jeder chemischen Zusammensetzung auf und berechnen Sie die relativen Standardabweichungen (RSD) der Peakbereiche, um die Präzision (Reproduzierbarkeit) mit der folgenden Formel zu bewerten:
    RSD% = Standardabweichung (SD)/arithmetisches Mittel der berechneten Ergebnisse (X) x 100 %
  7. Um die Reproduzierbarkeitsprüfung durchzuführen, wiegen Sie das EF-Pulver genau und bereiten Sie sechs Teile der Testproduktlösung parallel gemäß der Methode in Schritt 1.2 vor. Die hergestellten Lösungen werden unter den in Schritt 1.3 dargestellten chromatographischen Bedingungen einer HPLC unterzogen. Zeichnen Sie die Retentionszeiten und Peakflächen jeder chemischen Zusammensetzung auf und berechnen Sie die Mengen jeder Verbindung anhand einer Standardkurve (Peakflächen im Vergleich zu Konzentrationen). Berechnen Sie den RSD-Prozentsatz wie oben.
  8. Um den Stabilitätstest durchzuführen, lagern Sie die Testlösungen bei Raumtemperatur und messen Sie ihren Inhalt mit der in Schritt 1.3 beschriebenen HPLC-Methode um 0 h, 2 h, 4 h, 8 h, 12 h und 24 h nach der Vorbereitung, um die Stabilität zu beurteilen. Zeichnen Sie die Retentionszeiten und Peakbereiche jeder chemischen Zusammensetzung auf und berechnen Sie den RSD-Prozentsatz der Peakflächen wie oben.
  9. Zur Durchführung des Probenrückgewinnungstests werden 0,2 g EF-Pulver für sechs Wiederholungen in einen Erlenmeyerkolben mit Stopfen gewogen. Fügen Sie eine geeignete Menge der Referenzlösung hinzu (die der Probe zugesetzte Menge der Referenzsubstanz entspricht 100 % des bekannten Gehalts der Probe) und bereiten Sie die Prüflösung nach dem in Schritt 1.2 beschriebenen Verfahren vor.
  10. Injizieren Sie die Proben in den Chromatographen und analysieren Sie sie gemäß den chromatographischen Bedingungen in Schritt 1.3. Zeichnen Sie die Spitzenbereiche auf und berechnen Sie die durchschnittlichen Erholungs- und RSD%-Werte wie folgt:
    Ausbeuterate mit Spitzen = (Probeninhalt mit Spitzen − Probeninhalt)/Probenmenge x 100 %

2. Optimierung der EF-Hammelöl-Aufbereitungstechnologie unter Verwendung der Box-Behnken-Design-Response-Oberflächenmethodik

  1. Wählen Sie die wichtigsten Parameter in der EF-Verarbeitung, wie z. B. die Menge an Hammelöl (A; 15%-35%), die Hammelöltemperatur (B; 50-120 °C) und die Frittiertemperatur (C; 80-300 °C), als Einflussfaktoren aus. Verwenden Sie die umfassenden Bewertungen von Icariin-, EA-, EB-, EC- und BI-Inhalten als Bewertungsindizes. Der prozentuale Anteil an Hammelöl ist hier der Massenprozentsatz.
  2. Verwenden Sie die Software zur Analyse der Antwortfläche (siehe Materialtabelle), um die Box-Behnken-Experimente zur Antwortfläche zu entwerfen, die quadratische Antwortfläche zu untersuchen und ein Polynommodell zweiter Ordnung zu konstruieren. Wählen Sie den neuen Box-Behnken-Versuchsplan aus, und legen Sie die Option Numerische Faktoren auf 3 fest. Legen Sie die Faktoren A, B und C fest. Klicken Sie auf Weiter. Legen Sie die Option "Antworten" auf 1 fest (was der umfassenden Punktzahl entspricht). Klicken Sie auf Weiter , um das Design abzuschließen. Insgesamt waren 17 Experimente geplant (siehe Tabelle 1).
    HINWEIS: Informationen zu den unabhängigen und abhängigen Variablen sowie zu ihren niedrigen, mittleren und hohen Stufen finden Sie in Tabelle 2.
  3. Verarbeiten Sie die EF gemäß den spezifischen Parametern in Tabelle 1. Wiegen Sie beispielsweise für die Bestellnummer 1 raffiniertes Hammelöl mit 15 % V/V und erhitzen Sie es dann auf 50 °C, um es zu schmelzen. Das rohe EF zum geschmolzenen Hammelfleisch geben, bei schwachem Feuer (190 °C) unter Rühren braten, bis es gleichmäßig glänzt, dann herausnehmen und abkühlen lassen. Durchführung von 17 experimentellen Operationen. Insgesamt wurden in dieser Arbeit 17 Gruppen von EF-verarbeiteten Produkten erhalten.
    HINWEIS: Hammelöl ist bei Raumtemperatur (25 °C) fest und schmilzt beim Erhitzen zu Flüssigkeit. Als Hilfsstoff kann Hammelöl in flüssigem Zustand verwendet werden.
  4. Bereiten Sie die Testlösungen der verarbeiteten Produkte nach der in Schritt 1.2 beschriebenen Methode vor. Anschließend werden sie mit HPLC gemäß den in Schritt 1.3 beschriebenen chromatographischen Bedingungen analysiert. Zeichnen Sie die Verweilzeiten und Peakbereiche jeder chemischen Zusammensetzung auf und berechnen Sie den Gehalt an Icariin, EA, EB, EC und BI in jeder Testlösung anhand einer externen Standardkurve. Verwenden Sie die folgende Formel zur Berechnung der Gesamtpunktzahl, um die Gesamtpunktzahl der 17 Versuchsgruppen zu berechnen:
    Gesamtpunktzahl = Z/Z max × 0,5 + BI/BImax × 0,5
    wobei Z die Summe der Icariin-, EA-, EB- und EC-Gehalte ist; Zmax ist der Maximalwert der Summe der Icariin-, EA-, EB- und EC-Gehalte in den 17 Versuchsgruppen; BI ist der BI-Inhalt; und BImax ist der Maximalwert des BI-Inhalts in den 17 Versuchsgruppen.
  5. Importieren Sie die umfassenden Auswertungsergebnisse für die 17 Versuchsgruppen in die Datenanalysesoftware (siehe Materialtabelle), um die experimentellen Daten zu analysieren. Wählen Sie unter den Auswertungselementen die Option "Quadratische Prozessreihenfolge" und die Option "Polynommodelltyp" aus.

3. Prüfung der Wirkung der Verarbeitung auf die Embryonalentwicklung von Zebrafischen

  1. Probenvorbereitung
    1. Zerkleinern Sie das Rohöl und die verarbeitete EF durch ein Sieb Nr. 3 (siehe Materialtabelle). Zu 100 g jeder EF-Probe werden 1.000 ml Reinstwasser hinzugefügt. Weichen Sie das EF 0,5 h lang ein, kochen Sie das Wasser zweimal für jeweils 30 Minuten und filtern Sie es dann mit Filterpapier.
    2. Kombinieren Sie die Filtrate und konzentrieren Sie die Probe durch Erhitzen. Fügen Sie Reinstwasser zu einem Endvolumen von 100 ml hinzu, um die verarbeiteten EF (PEF, 1 g/ml) und die rohen EF (CEF, 1 g/ml) Stammlösungen zu erhalten. Messen Sie die Menge des Roharzneimittels in jeder Stammlösung.
    3. Aliquote von 1 ml, 1,5 ml, 2,5 ml, 5 ml und 7,5 ml Stammlösungen in 10-ml-Messkolben geben und dann Reinstwasser in das Volumen geben, um die Testlösungen mit Konzentrationen von 100 mg/ml, 150 mg/ml, 200 mg/ml, 250 mg/ml, 500 mg/ml und 750 mg/ml für die Zebrafisch-Embryotoxizitätsstudie herzustellen.
      ANMERKUNG: Die Konzentrationen der Testlösungen wurden unter Bezugnahme auf die einschlägige Literatur 20,21 und durch Durchführung von Vorversuchen hergestellt, um den in der normalen Toxikologie verwendeten10-fachen Konzentrationsgradienten zu erhalten. CEF war eine unverarbeitete Probe, und PEF war eine Probe, die mit der besten in Abschnitt 2 beschriebenen Verarbeitungstechnologie hergestellt wurde.
  2. Zebrafischhaltung und Embryonenbehandlung21
    1. Wildtyp-Zebrafische (siehe Materialtabelle) 2 Tage lang bei kontrollierter Temperatur anpassen, in einem Durchflussaquarium bei pH 7,0-7,4 halten und zweimal täglich füttern.
      HINWEIS: Die Hemmung der Melaninbildung bei Zebrafischen wurde durch die Zugabe von 1-Phenyl-2-thioharnstoff in einer Konzentration von 0,003 % (Masse/Volumen) zum Nährmedium erreicht, wodurch ihr Körper für die morphologische Beobachtung transparent blieb.
    2. Wählen Sie abends erwachsene fruchtbare Wildtyp-Zebrafische aus und trennen Sie sie mit Hilfe von Leitblechen in Paarungskästen. Entfernen Sie die Leitbleche am nächsten Morgen und lassen Sie die Fische 30 Minuten lang laichen. Sammeln Sie die befruchteten Eier alle 15 Minuten mit einer Pipette. Insgesamt wurden 520 gesunde Wildtyp-Embryonen gesammelt. Bewahren Sie die Zebrafischembryonen 24 h lang in einem Inkubator bei 28,5 °C auf.
    3. Ordnen Sie die gesunden Embryonen 24 Stunden nach der Befruchtung (hpf) nach dem Zufallsprinzip 13 Gruppen zu und weichen Sie zusammen mit einer Kontrollgruppe separat 10 ml jeder der folgenden Lösungen in einer Kulturschale ein: PEF: 100 μg/ml, 150 μg/ml, 200 μg/ml, 250 μg/ml, 500 μg/ml, 750 μg/ml; CEF: 100 μg/ml, 150 μg/ml, 200 μg/ml, 250 μg/ml, 500 μg/ml, 750 μg/ml . Behandeln Sie die leere Kontrollgruppe mit dem Medium als Lösung. Jede Gruppe enthielt 40 Embryonen in dieser Studie.
      HINWEIS: Die mittlere Zusammensetzung beträgt 0,15 M NaCl, 5 mM KCl, 0,25 mM Na2HPO4,0,45 mMKH2PO4, 1,3 mM CaCl2,1,0 mM MgSO4 und 4 mM NaHCO3.
    4. Züchten Sie den Zebrafisch in einem Inkubator mit konstanter Temperatur für bis zu 120 hpf. Zählen Sie täglich die Anzahl der toten Larven, beobachten Sie die Hauptorganmorphologie der Larven in jeder Versuchsgruppe unter einem Stereomikroskop (Maßstabsbalken = 500 μm, siehe Materialtabelle) und berechnen Sie die Halbtodkonzentration (LC50) von Zebrafischen bei 72 hpf mit Hilfe einer Datenanalysesoftware (siehe Materialtabelle).

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Representative Results

Methodische Untersuchungsergebnisse
Es wurde ein linearer Zusammenhang zwischen der Konzentration von Icariin, EA, EB, EC, BI und chromatographischen Peakbereichen beobachtet (siehe Tabelle 3). Die RSD%-Werte (n = 6) der chromatographischen Peakbereiche von Icariin, EA, EB, EC und BI betrugen 0,28 %, 1,22 %, 0,65 %, 1,67 % bzw. 1,06 %, was darauf hindeutet, dass die Präzision der HPLC-Messungen gut war. Die RSD%-Werte (n = 6) der Gehalte an Icariin, EA, EB, EC und BI betrugen 1,59 %, 1,46 %, 1,86 %, 2,29 % bzw. 0,98 %, was auf eine gute Wiederholbarkeit der Methode hinweist. Die RSD%-Werte (n = 6) der Peakbereiche von Icariin, EA, EB, EC und BI in den Proben betrugen 1,49 %, 1,96 %, 1,42 %, 0,96 % bzw. 0,81 %, was darauf hindeutet, dass die Probenlösung innerhalb von 24 Stunden stabil war. Die durchschnittlichen Rückgewinnungsraten von Icariin, EA, EB, EC und BI betrugen 99,98 %, 100,14 %, 100,09 %, 100,75 % bzw. 100,94 %, und die RSD-%-Werte betrugen 0,56 %, 0,78 %, 0,84 %, 1,10 % bzw. 1,47 % (siehe Tabelle 4). Diese Ergebnisse zeigen, dass die Genauigkeit der Methode den Anforderungen entsprach.

Die oben genannten experimentellen Ergebnisse zeigten, dass die analytische Methode Ergebnisse lieferte, die eine ausgezeichnete Präzision, Reproduzierbarkeit und Genauigkeit aufwiesen und für die Qualitätsanalyse der EF-verarbeiteten Produkte akzeptabel waren.

Optimierung der Hammelöl-Aufbereitungstechnologie von EF unter Anwendung der Box-Behnken-Design-Response-Oberflächenmethodik
Wir führten eine quadratische polynomiale Regressionsanpassung der obigen Daten durch, um das folgende Modell zu erhalten: Y = 0,86 − 0,11 x A + 0,025 x B − 0,078 x C − 0,023 x A x B − 0,037 x A x C + 0,037 x B x C − 0,045 x A 2 + 2,5 x 10-3 x B 2 − 0,14 x C2. Die Varianzanalyse ergab einen Wert von P < 0,01, was darauf hinweist, dass das Modell signifikant war. Der P-Wert der fehlenden Anpassung betrug P > 0,05, was darauf hindeutet, dass die fehlende Anpassung nicht signifikant war. DerR2-Wert betrug 0,9300, was darauf hinweist, dass die Anpassung des Modells gut und der Fehler gering war. Mit diesem Modell war es möglich, die Wirkung des Gehalts an chemischer Zusammensetzung des mit Hammelöl gebratenen EF zu analysieren und vorherzusagen. Darüber hinaus wirkten sich A2 undD2 auf den Gehalt der verarbeiteten Produkte aus, und der Unterschied war statistisch signifikant (P < 0,01). Die Effekte von A und C des Ein-Grad-Semesters undC2 des Semesters zweiter Ordnung auf die Gesamtpunktzahl waren signifikant. Der Ein-Grad-Term B, der zweite Ordnungsterm A 2, B2 und alle Interaktionsitems hatten keinen signifikanten Einfluss auf den Gesamtwert. Die Analyse der P-Werte zeigte, dass von den experimentellen Parametern die Hammelölmenge (A) den größten Einfluss auf den Gesamtscore hatte, gefolgt von der Frittiertemperatur (C) und der Hammelöltemperatur (B). Die oben genannten Ergebnisse sind in Tabelle 5 dargestellt.

Die Software wurde verwendet, um die Hammelölmenge, die Hammelöltemperatur und die Frittiertemperatur auf die Mediane einzustellen und den umfassenden Score als Index zu verwenden, um ein einfaktorielles Einflussdiagramm eines Faktors zu zeichnen (Abbildung 1). Durch die Erhöhung der Frittiertemperatur wurde zunächst der Gesamtwert erhöht und dann verringert (Abbildung 1). Die Temperatur des Hammelöls hatte einen vernachlässigbaren Einfluss auf die Gesamtbewertung. Die Hammelölmenge war der wichtigste signifikante Faktor, der die Veränderung der Gesamtbewertung beeinflusste, und mit zunehmender Menge tendierte der Gehalt nach unten.

Um die Ergebnisse besser zu verstehen, werden die vorhergesagten Modelle in Abbildung 2 als 3D-Oberflächendiagramme dargestellt. In Bezug auf die Steigung der Wirkungsfläche gilt: Je größer die Signifikanz des Wechselwirkungseffekts zwischen den Faktoren, desto sanfter die Steigung und desto geringer ist der Effekt. Eine Ellipse in Form einer Höhenlinie deutet auf eine starke Wechselwirkung zwischen Faktoren hin, während ein Kreis das Gegenteil anzeigt. Die Wirkungsfläche der Hammelölmenge und der Frittiertemperatur war im Vergleich zu den anderen getesteten Faktoren steiler, und die Höhenlinien waren tendenziell elliptischer (siehe Abbildung 2C,D), was darauf hindeutet, dass die Wechselwirkung zwischen diesen beiden Faktoren signifikanter war; Im Gegensatz dazu waren die Wechselwirkungen zwischen anderen Faktoren nicht signifikant (siehe Abbildung 2A,B,E,F).

Die optimale Hammelölverarbeitungstechnologie von EF wurde wie folgt ausgewählt: eine Hammelölmenge von 15%; eine Hammelöltemperatur von 120 °C; und einer Frittiertemperatur von 189 °C. Da die Temperatur im realen Betrieb nicht sehr genau geregelt werden kann, wird der Temperaturwert als variable ±10 °C angegeben. Daher waren die endgültigen Parameter wie folgt: eine Hammelölmenge von 15%; eine Hammelöltemperatur von 120 °C ± 10 °C; und einer Frittiertemperatur von 189 °C ± 10 °C. Das optimale Verfahren war wie folgt: Das Hammelöl auf 120 °C ± 10 °C erhitzen, das rohe EF hinzufügen, bei leichtem Feuer (189 °C ± 10 °C) gleichmäßig glänzend braten, herausnehmen und abkühlen. Pro 100 kg EF sollten 15 kg Hammelöl (raffiniertes Öl) verwendet werden. Unter diesen Bedingungen wurden drei parallele Experimente durchgeführt, und die erzielten Werte betrugen 0,96, 0,97 und 0,94 (RSD% = 1,60 %), was auf stabile und praktikable Bedingungen hinweist. Die typischen HPLC-Chromatogramme der rohen, verarbeiteten und gemischten Referenzsubstanzen von EF sind in Abbildung 3 dargestellt.

Test des Einflusses der Verarbeitung auf die Embryonalentwicklung von Zebrafischen
Der Zebrafisch schlüpfte bei 72 hpf zu Jungtieren. Die Entwicklung jedes Organs war im Grunde abgeschlossen. Die Fischkörper blieben durchsichtig und ließen sich leicht auf die Seite auf dem Objektträger legen. Die Formen der Organe waren unter dem Mikroskop leicht zu beobachten und zu identifizieren. In der Blanko-Kontrollgruppe traten während des Verabreichungszeitraums keine Todesfälle oder Organtoxizität auf. Verglichen mit der Kontrollgruppe wurden bei einer Wirkstoffkonzentration von 100 μg/ml keine offensichtlichen Auffälligkeiten in der rohen EF-Gruppe (S) und der verarbeiteten Gruppe (P) bei 72 hpf gefunden. Bei 96 hpf und später traten die Unvollständigkeit der Schwimmblase und der Verlust der Schwimmblase bei den Jungfischen in der Rohgruppe häufiger auf, während sie bei den Jungfischen in der verarbeiteten Gruppe seltener waren. Bei einer Wirkstoffkonzentration von 150 μg/ml wurden bei den Jungfischen in der Rohgruppe bei 72 hpf offensichtliche Wirbelsäulendeformitäten, Körperverkrümmungsdeformitäten, Perikardödeme und Leberdeformationen beobachtet, aber diese Veränderungen waren bei den Jungfischen in der verarbeiteten Gruppe selten, und der Grad der Teratogenität war schwächer als der der Rohgruppe. Bei einer Wirkstoffkonzentration von 200 μg/ml starben alle Jungfische in der Rohgruppe, und bei den Jungfischen in der verarbeiteten Gruppe zeigte sich eine deutliche Teratogenität. Bei einer Wirkstoffkonzentration von 250 μg/ml überlebte eine kleine Anzahl von Zebrafischen in der verarbeiteten Gruppe. Die mikroskopischen Untersuchungsergebnisse des Zebrafisches sind in Abbildung 4 dargestellt.

Die Sterblichkeitsraten der Zebrafische in den rohen und verarbeiteten Epimedium-Kräutergruppen hingen von der Konzentration und dem Zeitpunkt der Verabreichung ab. Die Beziehung zwischen Zeit, Dosis und Mortalität ist in Abbildung 5 dargestellt. Die Ergebnisse der Zebrafischmortalität zeigten, dass 24 h nach der Verabreichung (48 hpf) bei einer Wirkstoffkonzentration von 200 μg/ml alle Zebrafische in der Roharzneimittelgruppe starben, während die Mortalität in der verarbeiteten Gruppe nur 6,67% betrug. 48 h nach Verabreichung von EF (72 hpf) betrug die Konzentration, die den Tod aller Zebrafische in der Rohdrogengruppe verursachte, 200 μg/ml, und die Konzentration, die den Tod aller Zebrafische in der verarbeiteten Gruppe verursachte, betrug 500 μg/ml. Die mediane Letalkonzentration der beiden Experimentalgruppen bei 72 hpf wurde berechnet. Die Ergebnisse zeigten, dass der LC50 (siehe Abbildung 6) 151,3 μg/ml in der Rohgruppe (S) und 219,8 μg/ml in der verarbeiteten Gruppe (P) betrug.

Figure 1
Abbildung 1: Univariate Analyse. Die Abbildung zeigt das Ein-Faktor-Einflussdiagramm. A ist das einfaktorielle Ergebnis der Menge an Hammelöl (Talg); B ist das einfaktorielle Ergebnis der Temperatur des Hammelöls; und C ist das einfaktorielle Ergebnis der Frittiertemperatur. Mit steigender Frittiertemperatur steigt der Gesamtscore zunächst an und sinkt dann. Die Hammelöltemperatur hat wenig Einfluss auf die Punktzahl. Die Menge an Hammelöl war der wichtigste signifikante Faktor, der die Veränderung der Gesamtbewertung beeinflusste, und der Gehalt zeigte einen Abwärtstrend mit zunehmender Menge an Hammelöl. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 2
Abbildung 2: Wirkungsfläche und Konturdiagramm des Einflusses verschiedener Faktoreninteraktionen auf den Gesamtscore. (A) Diese Abbildung zeigt ein 3D-Diagramm der Wirkungsfläche der Wechselwirkung zwischen der Hammelölmenge und der Temperatur. (B) Diese Abbildung zeigt ein Konturdiagramm der Wechselwirkung zwischen Hammelölmenge und Temperatur. (C) Diese Abbildung zeigt ein 3D-Diagramm der Wirkungsfläche der Wechselwirkung zwischen der Hammelölmenge und der Verarbeitungstemperatur. (D) Diese Abbildung zeigt ein Konturdiagramm der Wechselwirkung zwischen Hammelöldosierung und Verarbeitungstemperatur. (E) Diese Abbildung zeigt ein 3D-Diagramm der Wirkungsfläche der Wechselwirkung zwischen Hammelölmenge und Verarbeitungstemperatur. (F) Diese Abbildung zeigt ein Konturdiagramm der Wechselwirkung zwischen Hammelölmenge und Verarbeitungstemperatur. Das Ergebnis zeigt, dass die Antwortfläche der Hammelölmenge und der Frittiertemperatur steiler war als die anderen getesteten Parameter und die Höhenlinien tendenziell elliptisch waren (siehe C,D), was darauf hindeutet, dass die Wechselwirkung zwischen diesen beiden Faktoren signifikant war, während die Wechselwirkungen zwischen anderen Faktoren nicht signifikant waren (siehe A,B,E, F). Der in der Abbildung verwendete Begriff Talgöl bezieht sich auf Hammelöl. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 3
Abbildung 3: HPLC-Chromatogramme der rohen, verarbeiteten und gemischten Referenzsubstanzen von EF. (A) Diese Abbildung zeigt das HPLC-Chromatogramm der gemischten Referenzsubstanz. (B) Diese Abbildung zeigt das HPLC-Chromatogramm von rohem Epimedii folium. (C) Diese Abbildung zeigt das HPLC-Chromatogramm der mit Epimedii folium verarbeiteten Produkte. Diese drei Bilder zeigen, dass der BI-Inhalt in unformatiertem EF gering ist, während er nach der Verarbeitung zunimmt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 4
Abbildung 4: Schliffbilder von Zebrafischen. Diese Abbildung zeigt Schliffbilder des Zebrafisches. (A) Diese Abbildung zeigt die Ergebnisse für die Beobachtung des Zebrafisches unter dem Mikroskop in der Blindgruppe. (B) Diese Abbildung zeigt die Ergebnisse für die Beobachtung des Zebrafisches unter dem Mikroskop in der Rohgruppe. (C) Diese Abbildung zeigt die Ergebnisse für die Beobachtung des Zebrafisches unter dem Mikroskop in der bearbeiteten Gruppe. In der Blanko-Kontrollgruppe traten während des Verabreichungszeitraums keine Todesfälle oder Organtoxizität auf. Bei einer EF-Wirkstoffkonzentration von 150 μg/ml wurden bei den Jungfischen in der Rohgruppe bei 72 hpf offensichtliche Wirbelsäulendeformitäten, Körperverkrümmungen, Perikardödeme und Leberdeformationen beobachtet, während diese Veränderungen bei Jungfischen in der verarbeiteten Gruppe selten waren und der Grad der Teratogenität schwächer war als in der Rohgruppe. Bei einer Wirkstoffkonzentration von 200 μg/ml starben alle Jungfische in der Rohgruppe, und in der verarbeiteten Gruppe zeigte sich eine deutliche Teratogenität. Bei einer Wirkstoffkonzentration von 250 μg/ml überlebte in der verarbeiteten Gruppe nur eine geringe Anzahl von Zebrafischen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 5
Abbildung 5: Die Beziehung zwischen Dosierungszeit, Dosis und Mortalität. Diese Abbildung zeigt die Dosierungszeit-Dosis-Mortalitäts-Beziehung. (A) Diese Abbildung zeigt die Dosierungszeit-Dosis-Mortalitäts-Beziehung der Rohölgruppe. (B) Diese Abbildung zeigt die Dosierungszeit-Dosis-Mortalitäts-Beziehung der verarbeiteten Gruppe. n = 40. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 6
Abbildung 6: LC50 Diagramm von rohem und verarbeitetem EF. Das LC50-Diagramm der rohen und verarbeiteten EF ist dargestellt. Die mittleren letalen Konzentrationen der beiden Versuchsgruppen bei 72 hpf wurden berechnet. Der LC50 betrug 151,3 μg/ml in der Rohgruppe (S) und 219,8 μg/ml in der Verarbeitungsgruppe (P). n = 40. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Tabelle 1: Versuchsaufbau und Ergebnisse der Box-Behnken-Antwortflächenmethode der 17 Versuchsgruppen. Tabelle 1 zeigt die 17 Versuchsgruppen, die mit der Box-Behnken-Design-Response-Oberflächenmethode entworfen wurden, und ihre umfassenden Score-Ergebnisse. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Tabelle 2: Variablen, die im Box-Behnken-Design verwendet werden. Die unabhängigen und abhängigen Variablen sind hier zusammen mit ihren niedrigen, mittleren und hohen Werten aufgeführt. Das Box-Behnken-Design ermöglichte die Identifizierung der einflussreichsten Faktoren bei der EF-Verarbeitung, wobei die Hammelölmenge (A) (15%-35%), die Hammelöltemperatur (B) (50 °C-120 °C) und die Frittiertemperatur (C) (80 °C-300 °C) die Einflussfaktoren waren. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Tabelle 3: Regressionsgleichungen und lineare Bereiche der chemischen Bestandteile von EF. Die Ergebnisse der Regressionsgleichung und des linearen Bereichs der chemischen Zusammensetzung von EF zeigen, dass es eine gute Linearität zwischen den einzelnen Konzentrationen von Icariin, EA, EB, EC und BI und ihren chromatographischen Peakbereichen gab. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Tabelle 4: Testraten für die Probenrückgewinnung. Die durchschnittlichen Rückgewinnungsraten von Icariin, EA, EB, EC und BI betrugen 99,98 %, 100,14 %, 100,09 %, 100,75 % bzw. 100,94 %, und die RSD%-Werte betrugen 0,56 %, 0,78 %, 0,84 %, 1,10 % bzw. 1,47 %. Die Ergebnisse zeigen, dass die Genauigkeit der Methode geeignet war. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Tabelle 5: Regressionskoeffizienten des vorhergesagten quadratischen Modells. Der P-Wert des Modells betrug P < 0,01, was darauf hinweist, dass das Modell signifikant war. Der P-Wert der fehlenden Anpassung betrug P > 0,05, was darauf hindeutet, dass die fehlende Anpassung nicht signifikant war. Der R2-Wert betrug 0,9300, was darauf hindeutet, dass die Anpassung des Modells gut und der Fehler gering war, sodass das Modell für die Analyse und Vorhersage der Wirkung des Gehalts an chemischer Zusammensetzung des mit Hammelöl gebratenen EF geeignet war. Darüber hinaus hatten A2 undD2 signifikante Auswirkungen auf den Gehalt an verarbeiteten Erzeugnissen (P < 0,01). Die Einflüsse von A und C des Ein-Grad-Terms undC2 des Termses zweiter Ordnung auf die Gesamtpunktzahl waren signifikant. Der Ein-Grad-Term B, der zweite Ordnungsterm A 2, B2 und alle Interaktionsitems hatten keine signifikanten Auswirkungen auf den Gesamtwert. Die Analyse des P-Wertes zeigte, dass von den experimentellen Parametern die Menge an Hammelöl (A) den größten Einfluss auf den Gesamtscore hatte, gefolgt von der Brattemperatur (C) und der Temperatur des Hammelöls (B). Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

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Discussion

Unabhängige Variablen und die Bestimmung ihrer Niveaus
Die EF-Verarbeitungstechnologie wird nur in der Ausgabe 2020 des chinesischen Arzneibuchs und in den lokalen Verarbeitungsspezifikationen für chinesische Arzneimittel beschrieben, die von 26 Provinzen, Gemeinden und autonomen Regionen im ganzen Land veröffentlicht wurden1. Die Beschreibung umfasst die folgenden Schritte: Hammelöl nehmen und zum Schmelzen erhitzen, EF-Schnitzel hinzufügen, mit langsamem Feuer unter Rühren braten, bis es gleichmäßig und glänzend ist, herausnehmen und abkühlen lassen. Zusätzlich werden pro 100 kg Epimedium 20 kg (abgekürzt 20 %) Hammelöl (raffiniert) verwendet. Die Parameter des Verarbeitungsprozesses von EF sind jedoch nicht spezifiziert. Unter den unabhängigen Variablen in diesem Experiment konnten drei Schlüsselfaktoren im Produktionsprozess quantifiziert werden: die Hammelöldosierung, die Hammelöltemperatur und die Frittiertemperatur. Der Wertebereich sollte entsprechend der obigen Beschreibung eingestellt werden. Aus den Ergebnissen des Vorversuchs geht hervor, dass die EF-Blätter bei einer Menge an Hammelöl von 15 % gleichmäßig mit Hammelöl überzogen werden können. Wenn die Dosierung 35% übersteigt, ist zu viel Hammelöl vorhanden. Schließlich sollte der Bereich der Hammelölmenge 15%-35% betragen. Bei einer Temperatur von 50 °C schmilzt Hammelöl. Wenn die Temperatur >120 °C erreicht, beginnt das Hammelöl zu rauchen und die Temperatur ist zu hoch. Daher sollte der Temperaturbereich des Hammelöls zwischen 50 °C und 120 °C liegen. Die Ausgabe 2020 des chinesischen Arzneibuchs schreibt vor, dass EF mit einem langsamen Feuer gebraten werden sollte. Das langsame Feuer sollte 200 °C nicht überschreiten und die Frittiertemperatur sollte zwischen 80 °C und 300 °C liegen.

Umfassendes Scoring
Während der Verarbeitung von Epimedium werden die glykosidischen Bindungen aufgebrochen und die glykosidischen Komponenten in niedrigere glykosidische Komponenten umgewandelt. Die Bestimmung des Gehalts an EF-verarbeiteten Produkten in der Ausgabe 2020 des chinesischen Arzneibuchs basiert auf der Bestimmung des Gesamtgehalts an Icariin, EA, EB und EC in den ursprünglichen medizinischen Materialien, und eine Monoglykosidkomponente, BI, wird separat als Indikator aufgeführt. In diesem Experiment betrug die Gesamtgewichtung von Icariin, EA, EB und EC in der verarbeiteten EF 50 %, die Gewichtung der BI 50 %, und die umfassende Punktzahl wurde auf der Grundlage dieser Werte festgelegt.

Die Response-Surface-Methodik (RSM) ist ein statistisches Verfahren zur Identifizierung optimaler Prozessparameter und zur Lösung multivariater Probleme. Bei dieser Technik wird ein vernünftiges Versuchsdesign verwendet, um bestimmte Daten durch Experimente zu erhalten, und eine multivariate quadratische Regressionsgleichung wird verwendet, um eine funktionale Beziehung zwischen den Faktoren und den Antwortvariablenabzuleiten 22. Einheitliches Design und orthogonale Designprozessoptimierung werden häufig verwendet, aber ihre Testgenauigkeit ist nicht hoch und das mathematische Modell ist nicht sehr vorhersehbar. Das mathematische Modell, das RSM zugrunde liegt, ist in hohem Maße vorhersagbar. RSM erfordert weniger Experimente und kürzere Zyklen, was nicht nur die Probleme beseitigen kann, die mit der traditionellen mathematischen Statistik verbunden sind, sondern auch die Beziehungen zwischen Faktoren und Antwortvariablen klären kann23. RSM konzeptualisiert die Reaktion des Systems als Funktion eines oder mehrerer Faktoren und verwendet grafische Techniken, um diese funktionale Beziehung darzustellen, um dem Benutzer zu helfen, die optimalen Bedingungen im Versuchsdesign durch intuitive visuelle Beobachtung auszuwählen. Diese Vorteile haben dazu geführt, dass dieses Verfahren in der chemischen Industrie24, in der Biotechnik, in der Lebensmittelindustrie25, in der pharmazeutischen Industrie und in TCM-Präparaten weit verbreitet ist.

Obwohl RSM die funktionelle Beziehung zwischen Antwortvariablen (zu untersuchende Indizes) und Faktoren (unabhängige Variablen) identifizieren kann, sind nicht alle Experimente für die Optimierung der Antwortfläche geeignet, da nicht immer eine starke funktionelle Beziehung zwischen der Antwortvariablen und den Faktoren besteht. RSM erhält häufig stetige Funktionsbeziehungen, die erfordern, dass alle Faktoren stetige Variablen sind. Dennoch sind nicht alle zu untersuchenden Faktoren kontinuierliche Variablen oder haben signifikante Auswirkungen auf die Antwortwerte zu Beginn des Versuchsdesigns. Um die Anzahl der Experimente zu reduzieren und die Genauigkeit der Modellierung der Antwortfläche zu verbessern, ist ein Screening erforderlich, um die signifikanten Faktoren auszuwählen und ihre Stufen durch faktorielles Design, einheitliches Design oder orthogonales Design zu bestimmen, bevor die Methodik für das Design der Antwortfläche durchgeführt wird. Der größte Vorteil der Methode der Antwortfläche besteht darin, dass nach korrekter Erstellung des Modells der Wert der Antwortvariablen unter jeder Kombination von Bedingungen vorhergesagt werden kann und die funktionale Beziehung durch die 3D-Antwortfläche intuitiver und visueller gesehen werden kann. Diese Visualisierung ist für Forscher eine große Hilfe, um die optimalen Verarbeitungsbedingungen zu finden26.

In dieser Studie wurde das Box-Behnken-Designprinzip von RSM verwendet, um 17 kombinierte Experimente mit dem umfassenden chemischen Gehalt von EF als Antwortwert zu entwerfen. Die besten Ergebnisse zur Prozessoptimierung wurden schließlich durch Regressionsanalyse erzielt. Die Verarbeitungstechnik wurde wie folgt optimiert: Das Hammelöl auf 120 °C ± 10 °C erhitzen, das rohe EF zugeben, mit einem sanften Feuer (189 °C ± 10 °C) gleichmäßig glänzend braten, anschließend herausnehmen und abkühlen. Pro 100 kg EF sollten 15 kg Hammelöl (raffiniertes Öl) verwendet werden. Unsere Ergebnisse zeigten, dass der EF-Prozess stabil, zuverlässig und wiederholbar war. Zusätzlich wurden die Wechselwirkungen zwischen den Faktoren analysiert, und die Wechselwirkung zwischen der Hammelölmenge und der Frittiertemperatur, nicht aber die Wechselwirkungen zwischen anderen Faktoren, war signifikant. In dieser Studie konnte gezeigt werden, dass das Design der Antwortfläche als Methode zur Analyse der Wechselwirkungen zwischen Faktoren und der Beziehungen zwischen Faktoren und deren Reaktionsflächenwerten die Optimierung der Verarbeitungsbedingungen in kurzer Zeit mit einer minimalen Anzahl von Experimenten ermöglicht. Die ausgewählten Faktoren in dieser Studie waren die Schlüsselfaktoren, die im Ein-Faktor-Screening-Experiment identifiziert wurden, und ihre Konzentrationen wurden in einem vorläufigen Experiment bestimmt. Die Testproben entsprachen den Merkmalen der Methode der Antwortfläche, so dass die Studie in der Lage war, die Methode der Antwortfläche zu verwenden, um ein Vorhersagemodell zu erstellen. Die experimentellen Ergebnisse können als Referenz für die Verbesserung der Qualität und Gleichmäßigkeit der verarbeiteten EF dienen.

Zebrafischembryonen werden als Modellorganismen im Bereich der Entwicklungsgenetik verwendet, da sie transparent sind, sich in vitro entwickeln und leicht zu beobachten sind27. Zu den häufig verwendeten Toxizitätsindikatoren für Zebrafische in Studien zur Entwicklungstoxizität gehören unter anderem die Embryonalmortalität, die embryonale Fehlbildungsrate, das Dottersacködem, die Pigmentbildung, die Eikondensation, die Schwanzstreckung, die Kopfmorphologie und die Körpersegmentbildung28. Verglichen mit Techniken zur Bewertung der Toxizität von Säugetieren liegt die Spezifität von Zebrafischembryonen für den Nachweis der Toxizität von Verbindungen bei 70 % bis 80 %, und die Sensitivität liegt bei über 80 %18. Ton et al.29 fanden heraus, dass die Genauigkeit der Bewertung der Entwicklungstoxizität von nicht-teratogenen Verbindungen mit Zebrafischembryonen bei 75 % lag. Teratogene Verbindungen wurden hier mit 100%iger Genauigkeit bewertet. Obwohl die TCM die Eigenschaften komplexer Komponenten und unklarer Zielorgane der Toxizität aufweist, können Zebrafischembryonen dennoch als Versuchstiermodell für die genaue und schnelle Bewertung der Entwicklungstoxizität verwendet werden. Er et al.30 fanden heraus, dass Emodin die Überlebens- und Schlupfraten von Zebrafischembryonen beeinflusste und eine Rumpfbiegung und ein Dottersacködem verursachte. Chen et al.31 fanden heraus, dass Muscone ein Perikardödem des Zebrafischembryos, eine Wirbelsäulenverkrümmung und ein Dottersacködem verursachte. Er et al.32 fanden heraus, dass Arnebiae Radix in allen Entwicklungsstadien tödliche Wirkungen auf Zebrafische hatte, und 1,0 mg/L Arnebiae Radix hemmte die Embryonalentwicklung, was zu einer reduzierten Anzahl von Somiten, Schwanzmissbildungen, Körperbiegung und reduziertem Melanin in Zebrafischembryonen führte.

Um die Auswirkungen von rohem und verarbeitetem EF auf die Embryonalentwicklung von Zebrafischen zu untersuchen, wurde in dieser Studie ein Experiment zur Entwicklungstoxizität von Zebrafischembryonen durchgeführt. Die Daten zeigten, dass die LC50-Werte 151,3 μg/ml für die Rohgruppe (S) und 219,8 μg/ml für die verarbeitete Gruppe (P) betrugen. Die Beobachtung der Zebrafischkörper in jeder Versuchsgruppe durch ein Mikroskop zeigte einen offensichtlichen Grad an Zebrafisch-Teratogenität in der Rohgruppe. Die meisten Fische zeigten unterschiedliche Grade der Teratogenität, einschließlich Wirbelsäulendeformität, Körperverkrümmungsdeformität, Perikardödem, Unvollständigkeit der Schwimmblase oder Leberdeformation, und diese Beobachtungen waren in der verarbeiteten Gruppe selten. Diese Experimente zeigten, dass die Toxizität von EF nach der Verarbeitung signifikant reduziert war, was darauf hindeutet, dass die Verarbeitung die Toxizität von Arzneimitteln beim Menschen verringern könnte. Die experimentellen Ergebnisse liefern eine Referenz für die Verbesserung der klinischen Medikationssicherheit von Hammelöl-verarbeiteten EF.

Die traditionelle chinesische Medizin legt nahe, dass die Funktion der Niere eng mit dem Wachstum, der Entwicklung und der Fortpflanzung des menschlichen Körpers zusammenhängt33. In den alten Büchern der traditionellen chinesischen Medizin wird festgehalten, dass die Niere das Knochenmark des Körpers ist. Die Niere speichert Essenz, und das Knochenmark befindet sich in der Knochenhöhle, um den Knochen zu ernähren. Bei einem Mangel an Nierenessenz wird das Knochenmark reduziert34. Die traditionelle chinesische Medizin zur Tonisierung des Nieren-Yang kann Lendenwirbelschwäche, Osteoporose, Impotenz, vorzeitige Ejakulation und kalte Unfruchtbarkeit der Gebärmutter behandeln35. EF ist eines der repräsentativen Arzneimittel zur Tonisierung des Nieren-Yang. Moderne pharmakologische Studien haben gezeigt, dass EF offensichtliche Auswirkungen auf das Skelettsystem, das Immunsystem, das Fortpflanzungssystem, das Herz-Kreislauf-System und das Nervensystem hat und antitumorale Wirkungen hat36. In Bezug auf die Aktivität auf das Skelettsystem kann Icariin37 den Serumspiegel von E2 bei ovariektomierten Ratten verbessern und die Expression von ERβ mRNA im Knochengewebe von ovariektomierten Ratten hochregulieren. Die Synthese von ERβ wird erhöht, wodurch die biologische Wirkung von ER verbessert, die Knochenresorptionsaktivität von Osteoklasten geschwächt und die Knochenbildung von Osteoblasten gefördert wird. Die Veränderungen im Knochenabbau sind größer als der negative Saldo des Knochenstoffwechsels. Epimedin A kann die Knochenmikrostruktur und die Knochenumsatzmarker im Serum in Osteoporose-Modellmäusen verbessern, indem es die Osteoklastenbildung, -differenzierung und -resorption hemmt und eine Rolle beim Knochenschutz spielt38. Epimedin C hat eine offensichtliche Anti-Osteoporose-Aktivität, hauptsächlich in Bezug auf die Erhöhung der Knochenmasse und die Verbesserung der trabekulären Mikrostruktur, um letztendlich die Knochenfestigkeit zu erhöhen39. Andere Studien haben gezeigt, dass Epimedin B40 und Baohuosid I41 eine Anti-Osteoporose-Wirkung haben.

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Disclosures

Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.

Acknowledgments

Diese Arbeit wird unterstützt durch das Basic Scientific Research Business Project der Chongqing Academy of Traditional Chinese Medicine (Projektnummer: jbky20200013), das Performance Incentive Guidance Project der Chongqing Scientific Research Institutions (Projektnummer: cstc2021jxjl 130025) und das Chongqing Municipal Health Commission Key Discipline Construction Project of Chinese Materia Medica Processing.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetonitrile Fisher 197164
Baohuoside Equation 1 (BEquation 1 )  Chengdu Manst Biotechnology Co., Ltd. MUST-20042402
Chromatographic column Waters Corporation Symmetry C18
Design Expert software Stat- Ease Inc., Minneapolis, MN Trial Version8.0.6.1
Detector Waters Corporation 2998
Disintegrator Hefei Rongshida Small Household Appliance Co., Ltd. S-FS553
Electronic analytical balance Mettler-Toledo International Inc. MS205DU
Epimedin A (EA) Chengdu Manst Biotechnology Co., Ltd. MUST-21112118
Epimedin B (EB) Chengdu Manst Biotechnology Co., Ltd. MUST-20080403
Epimedin C (EC) Chengdu Manst Biotechnology Co., Ltd. MUST-20080310
Ethanol Chongqing Chuandong Chemical ( Group ) Co., Ltd. 20180801
Graphpad software GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA 6.02
High Performance Liquid Chromatography (HPLC) Waters Corporation 2695
Icariin Chengdu Glip Biotechnology Co., Ltd. 21091401
Methanol Chongqing Chuandong Chemical (Group) Co., Ltd. 20171101
Microporous membrane Tianjin Jinteng Experimental Equipment Co., Ltd. 0.22μm
Mutton oil Kuoshan Zhiniu Fresh Food Store 20211106
Office Excel office software Microsoft Office Excel 2021
Pharmacopoeia sieve Shaoxing Shangyu Huafeng Hardware Instrument Co., Ltd. R40/3
Pure water machine Chongqing Andersen Environmental Protection Equipment Co., Ltd. AT Sro 10A
Qualitative filter paper Shanghai Leigu Instrument Co., Ltd. 18cm
Stereomicroscope Carl Zeiss, Oberkochen, Germany Stemi 2000
Ultrasonic cleaner Branson Ultrasonics (Shanghai) Co.,Ltd. BUG25-12
Zebrafish China Zebrafish Resource Center (CZRC) The AB strain

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Optimierung der Epimedii Folium Hammelöl-Verarbeitungstechnologie und Prüfung ihrer Wirkung auf die Embryonalentwicklung von Zebrafischen
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