Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Стандартизация цитометрического анализа на основе антител к яичному желтку

Published: May 19, 2023 doi: 10.3791/65123
Automatic Translation
1,2,3, 2,3,4, 1, 2, 2, 2,5, 2,3,5, 1,2,3,5
1Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia da Universidade Federal do Amazonas - UFAM, 2Instituto Leônidas e Maria Deane (ILMD), Fundação Oswaldo Cruz (FIOCRUZ), 3Programa de Pós-Graduação em Biologia da Interação Patógeno-Hospedeiro do Instituto Leônidas e Maria Deane (ILMD), Fundação Oswaldo Cruz (FIOCRUZ), 4Programa de Pós-graduação em Ciências Aplicadas à Hematologia – Universidade Estadual do Amazonas/Fundação Hospitalar de Hematologia e Hemoterapia do Amazonas, 5Programa de Pós-Graduação em Imunologia Básica e Aplicada, Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal do Amazonas (UFAM)

Summary

В данном протоколе описана методика подготовки латексных шариков для анализов с использованием антител IgY для выявления антигена.

Abstract

Иммунологические анализы являются важными тестами для обнаружения многочисленных молекулярных мишеней. Среди методов, доступных в настоящее время, цитометрический анализ шариков приобрел известность в последние десятилетия. Каждая микросфера, считываемая оборудованием, представляет собой событие анализа способности к взаимодействию между испытуемыми молекулами. Тысячи этих событий считываются в одном анализе, что обеспечивает высокую точность и воспроизводимость анализа. Эта методология также может быть использована для валидации новых входных данных, таких как антитела IgY, для диагностики заболеваний. Эти антитела получают путем иммунизации цыплят интересующим антигеном и последующего извлечения иммуноглобулина из желтка яиц животных; Таким образом, это безболезненный и высокопродуктивный метод получения антител. В дополнение к методологии высокоточной валидации способности к распознаванию антител в этом анализе, в данной работе также представлен метод извлечения этих антител, определения наилучших условий сопряжения антител и латексных шариков, а также определения чувствительности теста.

Introduction

Среди методов иммунологического анализа, направленных на диагностику заболеваний, цитометрический анализ шариков стал высокочувствительным и надежным подходом, поскольку он позволяет анализировать тысячи частиц в одном анализе1. Этот метод, помимо высокой производительности и возможности использования меньших объемов образцов, также обладает большой гибкостью, поскольку позволяет обнаруживать несколько молекул, таких как цитокины, молекулы адгезии, изотипы антител и белки 2,3.

Для разработки этих анализов используются различные частицы, в том числе латексные шарики, которые являются эффективным и недорогим сырьем. Они могут представлять модификации на своей поверхности, такие как наличие функциональных групп или белков, которые допускают ковалентное или нековалентное соединение определенных молекул 3,4,5.

Эти иммунологические анализы используют такие компоненты, как антигены и антитела, для обнаружения маркеров заболеваний и обычно требуют антител от млекопитающих, таких как мыши, кролики и козы. Это создает проблемы, связанные с этическими вопросами, поскольку иммунизация млекопитающих, как правило, требует большого количества животных для получения хорошего урожая, а также частого выполнения процедур, которые приводят к страданиям животных 6,7. Альтернативой этому является использование антител IgY, выделенных из яичных желтков иммунизированных цыплят, поскольку в желтках могут быть обнаружены высокие концентрации специфических антител против инокулированных антигенов; Производство курицы эквивалентно производству 4,3 кроликов в течение года 6,7.

Таким образом, целью данного протокола является предоставление метода оценки антител IgY, полученных из желтков куриных яиц, с помощью проточной цитометрии с латексными шариками. Для этого мы предлагаем метод стандартизации цитометрического шарикового иммуноферментного анализа в формате сэндвича с использованием латексных шариков. В качестве модели использовали антитела IgY, направленные на антиген Plasmodium falciparum , богатый гистидином белка II (IgY-PfHRP2). Мы описываем метод экстракции антител, обсуждаем критические этапы определения их связывающей концентрации с латексными шариками и представляем оценку предела обнаружения антигена. Высокая точность проточной цитометрии в сочетании с низкой стоимостью латексных шариков делают этот метод применимым для анализа иммуноферментных инструментов, таких как антитела и антигены. Этот метод может быть использован для обнаружения разноплановых целей.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ПРИМЕЧАНИЕ: См. Таблицу материалов для получения подробной информации, относящейся ко всем материалам, реагентам и инструментам, используемым в этом протоколе.

1. Извлечение IgY из яичных желтков

  1. Гигиена яиц
    1. Погрузите яйца (только что снесенные или через 4 дня после снесения, из линии Gallus gallus Dekalb White) в 0,2% разбавленный раствор гипохлорита натрия, быстро промойте под проточной водой и аккуратно протрите для последующего или немедленного использования.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если не использовать сразу, хранить при температуре 4 °C до 15 дней.
  2. Отделение желтков
    1. Яйцо аккуратно разбить, а желток отделить от белка с помощью желткового сепаратора.
    2. Излишки белизны удалите с помощью фильтровальной бумаги. Проткните желток и соберите его внутреннюю часть в коническую пробирку объемом 50 мл. Перед употреблением желток храните при температуре −20 °C не менее 24 часов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В ходе этих экспериментов (данные не показаны) было замечено, что использование желтков, которые не были предварительно заморожены, препятствовало выделению иммуноглобулинов из липидной части желтков.
  3. Подкисление желтков
    1. Разморозьте хранящийся желток и разведите его в соотношении 1:10 в 1 мМ PBS. Доведите рН раствора до 5 с 1 N HCl и инкубируйте раствор при 4 °C в течение 6-24 ч.
    2. Центрифугируют раствор при 3 000 × г в течение 40 мин, извлекают надосадочную жидкость и фильтруют ее с помощью целлюлозного фильтра 0,7 мм.
  4. Осаждение липидов каприловой кислотой
    1. Отрегулируйте рН надосадочной жидкости до 5 и добавьте каприловую кислоту (≥98% начальной концентрации) до конечной концентрации 8,7% при постоянном помешивании в течение 30 мин при 4 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Объем надосадочной жидкости может варьироваться в зависимости от липидной массы, осажденной на стадии 1.3.2. Так, например, к 35 мл надосадочной жидкости, полученной после фильтрации, следует добавить 3,107 мл каприловой кислоты.
    2. Центрифугируют образцы в течение 15 мин при 18 600 × г и отделяют надосадочную жидкость от осажденного материала.
    3. Отрегулируйте рН раствора до 7,4 с использованием 1 М NaOH, количественно определите антитела с помощью анализа Брэдфорда8 и храните антитела при −20 °C до момента использования.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Антитела были получены в концентрации 1 мкг/мкл, которая была проверена с помощью 12% геля SDS-PAGE.

2. Кривая насыщения антител IgY к латексным шарикам

  1. Связывание шариков с антителами IgY
    1. Добавьте 21 мкл 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимида (EDC, начальная концентрация 367 мМ) и 21 мкл N-гидроксисукцинимида (NHS, начальная концентрация 50 мМ) к 21 мкл латексных шариков (4% по массе) и доведите до конечного объема 2,1 мл с отфильтрованным 10 мМ PBS.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Диапазон рН раствора ПБС должен быть между 7,2 и 7,4, так как в данной работе наблюдалось отрицательное изменение сцепления и других этапов при использовании раствора вне этого диапазона.
    2. Инкубируют при температуре 22 °C при быстром встряхивании в течение 3 ч.
    3. Добавляют 4 мкг, 2 мкг, 1 мкг, 0,5 мкг, 0,25 мкг, 0,125 мкг и 0 мкг ранее экстрагированного антитела захвата IgY-PfHRP2 (см. этап 1.4.3) в различные микропробирки, содержащие 100 мкл раствора, описанного на стадии 2.1.1 (конечная концентрация гранул 0,04%), и инкубируют в тех же условиях, что описаны на этапе 2.1.2, в течение 16 ч.
    4. Центрифугируют образцы при 857 × г при 15 °C в течение 5 мин, выбрасывают надосадочную жидкость и дважды промывают латексные шарики 500 мкл отфильтрованного 10 мМ PBS (0,008% конечная концентрация гранул) с использованием циклов центрифугирования и ресуспендии.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не превышайте 857 × г, так как в этой работе было замечено, что при превышении этой скорости шарики подвергаются деформациям, которые отрицательно влияют на результат теста.
  2. Блокировка бусин
    1. Повторно суспендируйте образцы в 1 мл блокирующего буфера (концентрация конечных гранул 0,004%) (отфильтрованный 10 мМ PBS + бычий сывороточный альбумин, BSA, 5%) и инкубируйте в тех же условиях, как описано на этапе 2.1.2, в течение 2 ч.
    2. После блокировки промыть, как описано в шаге 2.1.4, и повторно выполнить в буфере PBS 10 мМ.
  3. Инкубация вторичными антителами против курицы, помеченными Alexa Fluor 488
    1. Добавьте 100 мкл флуоресцентных антикуриных антител (2 мг/мл), разбавленных до 1:2 000 в 10 мМ PBS + 0,5% БСА в каждую микропробирку, как описано в шаге 2.1.3.
    2. Инкубируйте образцы, как описано в шаге 2.1.2, на этот раз в темноте, в течение 30 минут.
    3. Промойте шарики, как показано на шаге 2.1.4, и повторно суспендируйте 250 мкл (0,016% конечная концентрация гранулы), отфильтрованного 10 мМ PBS. Выполните считывание показаний проточного цитометра, как описано в разделе 5.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Исходя из полученных данных о проценте флуоресценции, обратите внимание на начальную точку формирования плато (1 мкг, как в этом исследовании). Мы рекомендуем использовать вторую точку плато (2 мкг, как показано здесь) для следующих шагов (рис. 1).

Figure 1
Рисунок 1: График анализа методом проточной цитометрии для определения точки насыщения связывания антител IgY-Pf HRP2 с латексными шариками. Ось X представляет концентрацию антител, а ось Y — процент полученной флуоресценции. Критерий Краскела-Уоллиса, стр < 0,0033. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

3. Анализ проточной цитометрии на основе латексных шариков для обнаружения антигена

  1. После определения точки насыщения антител IgY к латексным шарикам повторите процесс активации гранул в соответствии с шагом 2.1.1.
    1. Соедините шарики при наблюдаемой концентрации насыщения (как описано в шаге 2.1.3) и инкубируйте в соответствии с шагом 2.1.2.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В анализах, выполненных с использованием антител IgY-PfHRP2, условие насыщения составляло 2 мкг на каждый 1 мкл латексных шариков.
  2. Заблокируйте и промойте бусины в соответствии с шагом 2.2.
  3. Инкубация с антигеном
    1. Для определения предела детектирования распределите эквивалент 100 мкл закупки блокированного шарика в пробирки, содержащие различное количество рекомбинантного белка Pf HRP2 (1 мкг/мл) (r PfHRP2, 10 мкг, 1 мкг, 0,1 мкг, 0,01 мкг, 0,001 мкг, 0,0001 мкг и 0 мкг), разведенных в 10 мМ PBS + 0,5% BSA в тройном размере.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот рекомбинантный белок был разработан в работе Sousa et al.9.
    2. Инкубируют растворы гранул с белком rPfHRP2, как описано в шаге 2.1.2, в течение 1 ч.
    3. Выполните промывку, как описано в шаге 2.1.4, и выбросьте надосадочную жидкость после центрифугирования.
  4. Инкубация с первичным антителом
    1. Добавьте 2 мкг мышиного антитела IgG против белка rPfHRP2, разведенного в 10 мМ PBS + 0,5% BSA, до конечного объема 100 мкл в каждом образце. Инкубируйте образцы, как описано в шаге 2.1.2, и выбросьте надосадочную жидкость после последнего центрифугирования.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это антитело было разработано в работе Sousa et al.9.
  5. Инкубация со вторичным антителом
    1. Добавьте 100 мкл флуоресцентных антимышиных антител (2 мг/мл), разбавленных до 1:2 000 в 10 мМ PBS + 0,5% BSA к каждому образцу. Инкубируют, как описано на этапе 2.1.2, и ресуспендируют в 250 мкл (0,016% конечная концентрация гранул) отфильтрованного 10 мМ PBS. Выполните чтение в соответствии с разделом 5.

4. Показания проточного цитометра образцов

  1. Настройка цитометрии: Выравнивание оптических параметров цитометра, соединенного с компьютером
    1. Включите компьютер и проточный цитометр и подождите несколько минут, пока оборудование подключится к компьютеру.
    2. Нажмите на программное обеспечение для цитометрии, установленное на компьютере, и войдите в него. В рабочей области программного обеспечения выберите Цитометр | Стартап | Режим очистки | Жидкости SIT.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Пузырьки воздуха и препятствия должны быть удалены в процессе запуска цитометра перед взятием образца.
  2. Контроль качества
    1. Используйте реагент для контроля качества для проверки напряжений трубок фотоумножителя и оценки чувствительности цитометра.
    2. Поместите реагент для настройки цитометра и шарики для отслеживания в закрытую полистирольную трубку размером 12 мм x 75 мм.
    3. Аккуратно перемешайте трубку вихревым способом.
  3. Приготовление суспензионных валиков
    1. Для определения исходного уровня добавьте 0,5 мл разбавителя (10 мМ отфильтрованного PBS, pH 7) и три капли гранул в пробирку из полистирола размером 12 мм x 75 мм. Осторожно встряхните трубку перед использованием.
    2. В рабочей области программного обеспечения цитометра выберите Цитометр | CST и подождите, пока цитометр отключится от интерфейса программного обеспечения цитометра и подключится к интерфейсу CS&T. Обратите внимание на следующее сообщение в строке состояния программного обеспечения цитометра в нижней части экрана: Отключен цитометр.
    3. Используйте закрытую полистирольную трубку размером 12 мм x 75 мм, содержащую реагент для контроля качества, и присоедините ее к зонду проточного цитометра.
  4. Проверка конфигурации цитометра
    1. В окне " Сводка системы" убедитесь, что конфигурация цитометра подходит для эксперимента.
  5. Настройка для проверки производительности
    1. Выберите идентификатор установочных бусин, соответствующий лоту исследовательских бусин CS&T.
  6. Проверка производительности
    1. Прикрепите пробирку к зонду проточного цитометра и нажмите на окно Setup Control . Выберите «Проверить производительность» и нажмите «Выполнить».
    2. После завершения проверки производительности дождитесь открытия диалогового окна. Выполните одно из следующих действий.
      1. Чтобы просмотреть отчет о производительности цитометра, нажмите «Просмотреть отчет».
      2. Чтобы завершить проверку производительности и вернуться к представлению настройки рабочей области, нажмите кнопку Finish.
      3. Просмотрите окончательный результат анализа морфометрической и флуоресцентной чувствительности, который отображается в сводке системы | Результат работы цитометра со статусом PASSED.
      4. Извлеките пробирку из цитометра. Проверьте результаты работы цитометра, отображаемые в окне «Сводка системы ».

5. Анализ образца с помощью проточной цитометрии

  1. Войдите в программное обеспечение цитометра.
    1. В рабочей области программного обеспечения цитометра выберите Цитометр | Режим очистки | Жидкости SIT.
    2. Подстройтесь под рабочее пространство программного обеспечения.
    3. Определите стратегию стробирования на основе морфометрических и флуоресцентных характеристик отрицательных управляющих частиц (шариков без флуоресценции).
    4. Чтобы определить морфометрию клеток, выберите Dot Plot Plot Graphic для анализа параметров FSC-A с помощью SSC-A (дополнительный рисунок 1A).
    5. Определите одиночные ячейки с помощью SSC с помощью точечного графика для анализа SSC-H по оси y и SSC-W по оси x (дополнительный рисунок 1B) и определите отдельные ячейки по FSC с помощью точечного графика для анализа FSC-H по оси y и FSC-W по оси x (дополнительный рисунок 1C).
    6. Для флуоресцентного анализа выберите FL1 Dot Plot Plots с помощью FCS-A. Используйте пробирку из полистирола размером 12 мм x 75 мм, содержащую немаркированные образцы и образцы, предварительно помеченные одноцветным Alexa Fluor 488 (дополнительный рисунок 1D, E).
  2. Получение образца методом проточной цитометрии.
    1. Используйте полистирольную трубку размером 12 мм x 75 мм с пробкой, содержащую ранее промаркированные образцы. Тщательно перемешайте содержимое пробирки, прикрепите пробирку к зонду проточного цитометра и щелкните левой кнопкой мыши на Acquire.
    2. Чтобы установить мощность лазеров, нажмите «Параметры» и в опциях ниже установите напряжение FSC на 182 В и напряжение SSC на 236 В. Чтобы установить пороговое значение, нажмите на Цитометр | Threshold, а в параметрах ниже отрегулируйте FSC на 500 В.
    3. Установите вентиль анализа для определения характеристик частиц по размеру и сложности, а также для выполнения анализа отдельных ячеек.
    4. Чтобы удалить автофлуоресценцию, проанализируйте образец без красителей, содержащий только латексные шарики , и отрегулируйте напряжение детектора: в приведенных ниже вариантах отрегулируйте напряжение FL1 (FITC) до 332 В.
    5. Задайте вентиль флуоресцентного анализа в четырехугольном формате от отрицательной точки, показанной на точечном графике.
    6. После настройки морфометрического и флуоресцентного анализов настройте устройство на 50 000 событий: в разделе « Регистрация» нажмите « Запись».

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

На рисунке 2 представлено графическое представление процесса экстракции антител IgY путем подкисления с последующим разделением с помощью каприловой кислоты (рисунок 2).

Figure 2
Рисунок 2: Схематическое изображение этапа экстракции антител IgY и разделения с помощью каприловой кислоты . (А) Отделение желтка, извлечение в конической пробирке и замораживание. (Б) Разведение желтка, доведение рН до 5. (C) Центрифугирование раствора и фильтрация надосадочной жидкости. (D) Добавление каприловой кислоты и центрифугирование раствора. (E) Супернатантные антитела, выделенные на предыдущем этапе. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

В этой работе антитела до (дорожка 1, рис. 3) и после разделения каприловой кислоты (дорожка 2, рис. 3) показали сходные электрофоретические профили с характерными полосами 65 кДа и 27 кДа, которые относятся к легким и тяжелым цепям IgY соответственно . В дополнение к ним были видны и другие полосы, вероятно, из-за предшественника С-концевого фрагмента белка яичного желтка вителлогенина II10.

Figure 3
Рисунок 3: SDS-PAGE (12% гель), демонстрирующий электрофоретический профиль антитела IgY-Pf HRP2 до и после разделения с использованием каприловой кислоты. Lane M: белковый молекулярный маркер; дорожка 1: антитела IgY-PfHRP2 перед разделением каприловой кислоты; дорожка 2: антитела IgY после разделения каприловой кислоты. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

На рисунке 4 представлено схематическое изображение предлагаемого теста, включая начальный этап связывания антител IgY с латексными шариками и другие этапы обнаружения антигена и считывания показаний в проточном цитометре.

Figure 4
Рисунок 4: Схематическое изображение цитометрического шарикового анализа, предложенного в настоящем исследовании. (A) Инкубация антител IgY PfHRP2 с латексными шариками. (B) Антитела IgY PfHRP2 в сочетании с латексными шариками. (C) Латексные шарики, связанные с анти-Pf HRP2 IgY, связанными с белком r Pf HRP2, первичным антителом IgG мыши против PfHRP2 и флуоресцентным вторичным антителом против мышей. (С1) Точечный график из образцов латексных шариков, проанализированных методом проточной цитометрии. Розовая линия-граница представляет собой шлюз анализа. (С2) Одноклеточный анализ. (C3)Флуоресцентный анализ отдельных клеток. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Оценка концентрации антител в бусинах является важным этапом для разработки иммуноферментного анализа с использованием латексных шариков. На рисунке 1 показана кривая процентной флуоресценции различных концентраций антител, связанных с каждым микролитром использованных коммерческих латексных шариков. Увеличение процентных значений наблюдалось с увеличением концентрации, и процентные значения достигали плато при концентрации антител 2 мкг; Затем эта концентрация считалась наилучшей для проведения иммунологического анализа с целевым антигеном. Этот анализ показал незначительные стандартные отклонения между репликатами (Дополнительная таблица S1).

Предел обнаружения определяли путем оценки процента флуоресценции реакционной способности латексных шариков (содержащих антитело к Pf HRP2 в насыщающей концентрации) против различных концентраций белка r PfHRP2(рис. 5). После разработки с помощью сэндвич-иммуноанализа удалось наблюдать увеличение флуоресценции от количества 0,01 мкг белка rPfHRP2, а процентная флуоресценция достигала плато при количестве 0,1 мкг. При сравнении количеств 0 мкг и 0,01 мкг достоверной разницы во флуоресценции между ними не выявлено. Однако при сравнении количества 0,01 мкг с 0,1 мкг, 1 мкг и 10 мкг наблюдалась достоверная разница во флуоресценции: р < 0,0048 (критерий Краскела-Уоллиса) (рис. 5). Этот тест также показал минимальные стандартные отклонения среди репликатов (Дополнительная таблица S2).

Figure 5
Рисунок 5: График анализа методом проточной цитометрии для определения предела обнаружения белка rPfHRP2 в предлагаемом сэндвич-анализе. Ось x представляет концентрацию белка rPfHRP2, а ось Y представляет полученную процентную флуоресценцию. Критерий Краскела-Уоллиса, стр. < 0,0048. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Дополнительный рисунок S1: Флуоресцентный анализ гранул на основе антител к яичному желтку методом проточной цитометрии. (A) Морфометрический анализ размера по сложности (FSC/SSC), (B) анализ отдельных клеток по сложности, (C) анализ отдельных клеток по размеру, (D,E) анализ процентной флуоресценции Alexa Fluor 488 в сферах на основе антител к яичному желтку в различных концентрациях. Сокращения: FSC = прямое рассеяние; SSC = боковой разброс. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительная таблица S1: Средние процентные значения и стандартные отклонения по тесту кривой насыщения связи антител IgY-PfHRP2 с латексными шариками. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительная таблица S2: Средние процентные значения и стандартные отклонения предела обнаружения белка rPfHRP2. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Метод осаждения антител IgY путем снижения рН с последующим разделением липидов с помощью каприловой кислоты эффективен для выделения общих антител без потери функциональности. Предложенный здесь метод проще и дешевле, чем тот, о котором сообщили Redwan et al.11, в которых также использовалось осаждение путем подкисления и каприловой кислоты, но с более сложным и трудоемким протоколом. Этот метод также имеет преимущества по сравнению с широко используемыми методами выделения IgY из яичных желтков, например, с использованием осаждения ПЭГ 12,13, сульфата натрия 14,15 и хлороформа 16, среди прочих, поскольку они включают токсичные реагенты или реагенты, которые трудно удалить из образца. В данной работе электрофоретические профили образцов антител, выделенных до и после разделения липидов с использованием каприловой кислоты, были сходны и представляли один и тот же профиль. Однако после разделения с использованием каприловой кислоты антитела были сконцентрированы на стадии, которая была эффективна в удалении липидов без какого-либо негативного влияния на удаление загрязняющих белков из образцов.

Стандартизация метода связывания антител IgY с латексными шариками имеет важное значение для максимизации аналитической способности проточной цитометрии в каждом анализе. В тестах, проведенных в нашей лаборатории, было замечено, что молекулы разных размеров имеют разную концентрацию насыщения в зависимости от количества используемых шариков (данные не показаны). По этой причине, для каждого анализа, который необходимо выполнить, в идеале должна быть проверена концентрация насыщения шариков, как показано в настоящем исследовании. В анализе, описанном здесь, условие связи насыщения составляло 2 мкг антител IgY на каждый микролитр шариков, поскольку это представляло процент флуоресценции, близкий к 100%, и такой же процент сохранялся при удвоении концентрации антител.

В предлагаемом цитометрическом анализе гранул используются коммерческие латексные шарики, что подразумевает использование циклов центрифугирования и ресуспендирования для этапов промывки и инкубации компонентов анализа. Промывки являются решающим этапом для успеха теста, и, следовательно, важно не использовать большую силу центрифугирования, чем предложено здесь, поскольку более высокая скорость приводит к изменению морфологии шариков, что ухудшает показания в проточном цитометре. Однако, если центрифугирование менее мощное, чем предложенное здесь, существует больший риск потери гранул во время процесса, так как они могут быть легко ресуспендированы от стенок микропробирок или дна пластин. По этой причине процесс удаления надосадочной жидкости необходимо проводить аккуратно, чтобы избежать этих проблем.

При применении данной методики к разработке иммунологических анализов для других мишеней могут быть внесены коррективы в отношении буферов, температуры и инкубационного времени с учетом специфических характеристик антител и антигенов, которые будут использоваться в новом тесте. Анализ кривой насыщения антигеном в настоящем исследовании позволил определить предел обнаружения теста. Как показано на рисунке, используя конформацию сэндвич-формата, мы определили предел обнаружения 0,01 мкг, и это значение аналогично самому низкому пределу обнаружения, полученному обычным ИФА. Однако этот тест имеет гораздо более высокий уровень надежности, чем классические методики ИФА, благодаря высокой точности анализов, выполняемых в проточной цитометрии, о чем свидетельствует предел обнаружения, полученный из нескольких предыдущих исследований, таких как Simonova et al.17 (5 пг/мл). Sharma et al.19 показали чувствительность в 4-80 раз выше, чем обычный ИФА, а Merbah et al.19 получили тест, который был на 91% более чувствительным, чем обычный ИФА. Также можно отметить, что эти анализы КБА обладают высокой воспроизводимостью, поскольку тройной анализ показал очень низкие стандартные отклонения в этой работе.

Основными ограничениями описанного здесь метода являются необходимость использования проточного цитометра и тот факт, что этот метод состоит из нескольких этапов и занимает некоторое время. Описанные этапы представляют собой важную стандартизацию, которая необходима для обеспечения надежности диагностических тестов с использованием латексных шариков, которые оцениваются с помощью проточной цитометрии. Поэтому предлагаемая здесь методология является альтернативой классическим моделям сэндвич-тестов. Этот метод может применяться к различным типам анализов и может быть пригоден для соединения нескольких молекул с поверхностью шариков, а также для обнаружения различных аналитов.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы заявляют об отсутствии потенциального конфликта интересов в отношении исследования, авторства и публикации данной статьи.

Acknowledgments

Мы хотели бы поблагодарить FIOCRUZ ("Programa de excelência em pesquisa básica e aplicada em saúde dos laboratórios do Instituto Leônidas e Maria Deane - ILMD/Fiocruz Amazônia-PROEP-LABS/ILMD FIOCRUZ AMAZÔNIA"), Программу последипломного образования в области биотехнологии (PPGBIOTEC at the Universidade Federal do Amazonas - UFAM), Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível (CAPES) и Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Amazonas (FAPEAM) за предоставление стипендий. Рисунки 2 и 4 были созданы с помощью biorender.com.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anti-Chicken IgY (H+L), highly cross-adsorbed, CF 488A antibody produced in donkey Sigma-Aldrich SAB4600031
Anti-mouse IgG (H+L), F(ab′)2 Sigma-Aldrich SAB4600388
BD FACSCanto II BD Biosciences BF-FACSC2
BD FACSDiva CS&T research beads (CS&T research beads) BD Biosciences 655050
BD FACSDiva software 7.0 BD Biosciences 655677
Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate Bio-Rad #5000006
Bovine serum albumin Sigma-Aldrich A4503
Caprilic acid Sigma-Aldrich O3907
Centrifuge 5702 R Eppendorf Z606936
Chloride 37% acid molecular grade NEON 02618 NEON
CML latex, 4% w/v Invitrogen C37253
Megafuge 8R Thermo Scientific TS-HM8R
N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide Hydrochloride Powder (EDC) Sigma-Aldrich E7750-1G
N-Hydroxysuccinimide (NHS) Sigma-Aldrich 130672-25G
Phosphate buffered saline Sigma-Aldrich 1003335620
Sodium hydroxide Acs Cientifica P.10.0594.024.00.27
Sodium hypochlorite Acs Cientifica R09211000
Thermo Mixer Heat/Cool KASVI K80-120R

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Salzer, U., Sack, U., Fuchs, I. Flow cytometry in the diagnosis and follow up of human primary immunodeficiencies. Electronic Journal of the International Federation of Clinical Chemistry and Laboratory. 30 (4), 407 (2019).
  2. de Figueiredo, A. M., Glória, J. C., Chaves, Y. O., Neves, W. L. L., Mariúba, L. A. M. Diagnostic applications of microsphere-based flow cytometry: A review. Experimental Biology and Medicine. 247 (20), 1852-1861 (2022).
  3. Morgan, E., et al. Cytometric bead array: A multiplexed assay platform with applications in various areas of biology. Clinical Immunology. 110 (3), 252-266 (2004).
  4. Graham, H., Chandler, D. J., Dunbar, S. A. The genesis and evolution of bead-based multiplexing. Methods. 158, 2-11 (2019).
  5. Kellar, K. Multiplexed microsphere-based flow cytometric assays. Experimental Hematology. 30 (11), 1227-1237 (2002).
  6. Schade, R., et al. Chicken egg yolk antibodies (IgY-technology): A review of progress in production and use in research and human and veterinary medicine. ATLA Alternatives to Laboratory Animals. 33 (2), 129-154 (2005).
  7. Xu, Y., et al. Application of chicken egg yolk immunoglobulins in the control of terrestrial and aquatic animal diseases: A review. Biotechnology Advances. 29 (6), 860-868 (2011).
  8. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72 (1-2), 248-254 (1976).
  9. Sousa, L. P., et al. A novel polyclonal antibody-based sandwich ELISA for detection of Plasmodium vivax developed from two lactate dehydrogenase protein segments. BMC Infectious Diseases. 14 (1), 49 (2014).
  10. Klimentzou, P., et al. Development and immunochemical evaluation of antibodies Y for the poorly immunogenic polypeptide prothymosin alpha. Peptides. 27 (1), 183-193 (2006).
  11. Redwan, E. M., Aljadawi, A. A., Uversky, V. N. Simple and efficient protocol for immunoglobulin Y purification from chicken egg yolk. Poultry Science. 100 (3), 100956 (2021).
  12. Lee, H. Y., Abeyrathne, E. D. N. S., Choi, I., Suh, J. W., Ahn, D. U. K. Sequential separation of immunoglobulin Y and phosvitin from chicken egg yolk without using organic solvents. Poultry Science. 93 (10), 2668-2677 (2014).
  13. Pauly, D., Chacana, P., Calzado, E., Brembs, B., Schade, R. IgY Technology: Extraction of chicken antibodies from egg yolk by polyethylene glycol (PEG) precipitation. Journal of Visualized Experiments. (51), e3084 (2011).
  14. Chang, H. M., Lu, T. C., Chen, C. C., Tu, Y. Y., Hwang, J. Y. Isolation of immunoglobulin from egg yolk by anionic polysaccharides. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 48 (4), 995-999 (2000).
  15. Ko, K. Y., Ahn, D. U. Preparation of immunoglobulin Y from egg yolk using ammonium sulfate precipitation and ion exchange chromatography. Poultry Science. 86 (2), 400-407 (2007).
  16. Polson, A. Isolation of IgY from the yolks of eggs by a chloroform polyethylene glycol procedure. Immunological Communications. 19 (3), 253-258 (1990).
  17. Simonova, M. A., et al. xMAP-based analysis of three most prevalent staphylococcal toxins in Staphylococcus aureus cultures. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 406 (25), 6447-6452 (2014).
  18. Sharma, P., et al. A multiplex assay for detection of staphylococcal and streptococcal exotoxins. PLoS One. 10 (8), e0135986 (2015).
  19. Merbah, M., et al. Standardization of a cytometric p24-capture bead-assay for the detection of main HIV-subtypes. Journal of Virological Methods. 230, 45-52 (2016).

Tags

Биохимия Выпуск 195 Проточная цитометрия антитела IgY латексные шарики диагностика иммунологические анализы
Стандартизация цитометрического анализа на основе антител к яичному желтку
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Corrêa Glória, J.,… More

Corrêa Glória, J., Oliveira Chaves, Y., Marques de Figueiredo, A., Coutinho de Souza, C., Duarte da Silva, E. R., Lopes Batista, J. C., Nogueira, P. A., Morais Mariúba, L. A. Standardization of a Cytometric Bead Assay Based on Egg-Yolk Antibodies. J. Vis. Exp. (195), e65123, doi:10.3791/65123 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter