Summary
Her demonstrerer vi brugen af cellebaseret elektrisk impedans (CEI) som en meget nem og ligetil metode til at studere Zika-virusinfektion og replikation i humane celler i realtid. Desuden er CEI-analysen nyttig til evaluering af antivirale forbindelser.
Abstract
Cellebaseret elektrisk impedans (CEI) teknologi måler ændringer i impedans forårsaget af et voksende eller manipuleret klæbende cellemonolag på kulturpladebrønde indlejret med elektroder. Teknologien kan bruges til at overvåge konsekvenserne af Zika-virus (ZIKV) infektion og vedhængende cellereplikation i realtid, da denne virus er meget cytopatogen. Det er et ligetil assay, der ikke kræver brug af etiketter eller invasive metoder og har fordelen ved at levere realtidsdata. Kinetikken af ZIKV-infektion er stærkt afhængig af den anvendte cellelinje, virusstamme og mangfoldighed af infektion (MOI), som ikke let kan studeres med konventionelle endepunktsassays. Desuden kan CEI-analysen også anvendes til evaluering og karakterisering af antivirale forbindelser, som også kan have dynamiske hæmmende egenskaber i løbet af infektionen. Denne metodeartikel giver en detaljeret forklaring af den praktiske udførelse af CEI-analysen og dens potentielle anvendelser i ZIKV-forskning og antiviral forskning generelt.
Introduction
Zikavirus (ZIKV) udbrud er forbundet med alvorlige sygdomskomplikationer, såsom mikrocefali og Guillain-Barre syndrom 1,2,3. Selvom fremtidige epidemier er plausible på grund af forskellige risikofaktorer såsom spredning af mygvektorfordeling og stigende urbanisering, har ingen vaccine eller antiviralt lægemiddel til dato gjort det til markedet endnu 3,4. Derfor bør traditionelle ZIKV-forskningsmetoder suppleres med nye værktøjer til at studere denne virus og dens potentielle antivirale forbindelser. Antiviral forskning er ofte baseret på fænotypiske assays, hvor endepunktet er tilstedeværelsen af en specifik parameter, såsom forekomsten af en virusinduceret cytopatisk effekt (CPE) eller produktion af et bestemt virusinduceret protein ved hjælp af et reportergen 5,6,7. Disse metoder har imidlertid slutpunktsaflæsninger, er arbejdskrævende og kan kræve kompleks analyse. Derfor tilbyder impedansbaserede metoder et attraktivt alternativ.
Cellebaseret elektrisk impedans (CEI) defineres som modstanden mod strømstrøm fra en elektrode til en anden, forårsaget af et klæbende cellelag podet på elektrodeholdige brønde. Den etablerede CEI-teknologi, der anvendes i denne metode, er Electric Cell-substrat Impedance Sensing (ECIS), oprindeligt udviklet af Giaever og Keese 8,9. Dette bruges i et bredt felt af biologiske forskningsområder, såsom kræftmetastaser, toksikologi og sårheling10,11,12. Dets princip er afhængig af et elektrisk felt, der genereres ved en kontinuerlig fejning af vekselstrømsspændinger (AC) over et frekvensområde13. Cellerne udsættes for disse ikke-invasive elektriske felter, og med forudbestemte intervaller måles impedansændringerne forårsaget af cellevækst eller ændringer i celleadhærens eller morfologi14. Desuden fører ændret cellelevedygtighed også til impedansændringer, hvilket gør teknologien til et nyttigt værktøj til overvågning af infektion med cytopatogene vira15,16,17. Da morfologiske ændringer af cellelaget vil blive detekteret i nanoskalaområdet, tilbyder teknologien et meget følsomt detektionsværktøj. CEI-analysen beskrevet i denne artikel er en nem, ikke-invasiv, realtids, etiketfri metode til at måle impedansændringerne i cellelaget over tid.
Selvom CEI ikke er blevet brugt til at evaluere forløbet af ZIKV-infektion eller dets potentielle antivirale midler, er dets anvendelse som et diagnostisk værktøj blevet undersøgt før18. I en nylig undersøgelse blev brugen af CEI-analysen til bestemmelse af den antivirale aktivitet af flere ZIKV-hæmmere i A549-celler valideret for første gang19. Denne metodeartikel beskriver dette CEI-assay mere detaljeret og udvider det til forskellige klæbende cellelinjer samt en række ZIKV-stammer ved forskellige infektionsmultipliciteter (MOI). Herved demonstreres den alsidige anvendelse af denne metode i flavivirus antiviral forskning. Metoden har den afgørende fordel ved celleovervågning i realtid, som gør det muligt at detektere vigtige infektionstider og den dynamiske hæmmende aktivitet af potentielle antivirale forbindelser. Samlet set udgør CEI-teknologien et kraftfuldt og værdifuldt værktøj til at supplere det nuværende udvalg af antivirale metoder.
Protocol
Alle beskrevne trin udføres under sterile forhold i et laminært flowskab i et laboratorium for biosikkerhedsniveau 2. Alle brugte vira blev opnået og anvendt som godkendt i henhold til reglerne fra et belgisk institutionelt undersøgelsesudvalg (departement Leefmilieu, Natuur en Energie, protokol SBB 219 2011/0011) og biosikkerhedsudvalget ved KU Leuven.
1. Vedligeholdelse af cellekultur
BEMÆRK: Denne protokol udføres med et udvalg af cellelinjer, men kan naturligvis tilpasses enhver vedhæftende cellelinje, der kun kræver optimering af cellesåtæthed.
- A549 human lungeadenokarcinomcellelinje, U87 human malignt glioblastomcellelinje og HEL 299 humane embryonale lungefibroblastceller i T75-dyrkningskolber ved 37 °C og 5% CO2 i en befugtet inkubator.
- Subkultur cellerne ved 80% -95% sammenløb. Alle reagenser skal være ved stuetemperatur (RT), før cellerne dyrkes.
- Fjern det konditionerede dyrkningsmedium fra cellerne. Brug 5 ml Dulbeccos fosfatbufferede saltvand (DPBS) til at vaske cellemonolaget en gang.
- Fordel 1 ml 0,25% trypsin-ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA) jævnt over cellemonolaget. Derefter inkuberes i op til 3 minutter ved 37 °C, indtil cellerne begynder at løsne sig.
- Tilsæt 9 ml frisk komplet vækstmedium (se materialetabel for detaljer). Pipet forsigtigt op og ned for at resuspendere cellerne.
- Det ønskede volumen cellesuspension overføres til en ny T75-dyrkningskolbe, og der tilsættes et passende volumen frisk vækstmedium for at opnå et samlet volumen på 15 ml.
BEMÆRK: De in vitro-cellelinjer , der anvendes i denne protokol, subkultureres i 1: 4 til 1: 10 fortyndinger, afhængigt af den specifikke cellelinje, for at muliggøre ideelle vækstbetingelser. Subkulturer udføres hver 3-4 dage, så det ønskede cellesuspensionsvolumen kan også variere afhængigt af antallet af inkubationsdage.
2. Forberedelse af CEI-plade
- Tag en 96-brønds plade med interdigiterede elektroder (se materialetabel) og fyld alle brønde med 100 μL vækstkulturmedium.
- Fyld mellemrummet mellem brøndene med DPBS.
BEMÆRK: Dette gøres for at reducere kanteffekten på grund af fordampning, der observeres ved dyrkning af celler i plader med 96 brønde. - Pladen inkuberes i 4 timer ved 37 °C i en inkubator med 5 % CO2.
3. Såning af celler
- Cellerne fjernes fra dyrkningskolben som beskrevet i punkt 1, og de opslæmmes igen i frisk vækstmedium i et 50 ml glas.
- Tæl antallet af levedygtige celler ved hjælp af den valgte metode.
BEMÆRK: I tilfælde af A549-celler når levedygtigheden generelt ~ 100%. For at bestemme cellenummeret bruger vi et automatiseret celleanalysesystem baseret på acridinorange/propidiubiodidfarvning (se materialetabel). Andre celletællingsmetoder fungerer lige så godt. - Resuspender cellerne i frisk vækstmedium for at opnå den ønskede celletæthed. I denne undersøgelse er den optimale A549-celletæthed 0,15 × 106 (levedygtige) celler / ml.
- Tag 96-brøndpladen med interdigiterede elektroder ud af inkubatoren og fjern mediet med en multikanalpipet.
- Der dispenseres 100 μL af cellesuspensionen (svarende til 15 × 103 celler i dette tilfælde) pr. hul i 96-brøndpladen.
- Lad cellerne ekvilibrere i 15 minutter ved stuetemperatur, før de placeres i CEI-enheden.
4. Opsætning og kørsel af CEI-assayet
- Anbring inkubatoren, der huser CEI-enhedens pladeholder, ved 37 °C og 5% CO2.
- Placer 96-brøndpladen i enheden.
- Åbn enhedens software, og konfigurer et nyt eksperiment ved at klikke på Indstil i ruden Indsaml data. Vent på, at den bærbare computer opretter forbindelse til ECIS-enheden, og konfigurer pladen ved at kontrollere brøndenes impedanser. Kontroller, om alle brønde er korrekt konfigureret, som angivet med en grøn farve. Hvis ikke, gentages trin 4.2, indtil alle hullerne er grønne.
- Vælg matrixtypen i ruden Brøndkonfiguration i henhold til det anvendte kulturelement.
- Vælg tilstanden Flere frekvenser/klokkeslæt.
BEMÆRK: I denne tilstand måler enheden impedansændringer ved et frekvensområde. - Start målingen ved at klikke på Start.
BEMÆRK: Impedans i realtid kan overvåges på softwarens grænseflade. Vælg den ønskede frekvens, der skal vises. I dette eksempel vælges 16 kHz.
5. Sammensat forberedelse og inkubation
BEMÆRK: Som et eksempel på en antiviral forbindelse anvendes labyrinthopeptin A1 (se materialetabel). Da denne protokol kan generaliseres til alle forbindelser med potentiel antiviral aktivitet, henviser vi til den som 'forbindelsen'.
- Lad komplet cellekulturmedium uden tilsætning af føtalt bovint serum (FBS) (kaldet 'assaybuffer') ekvilibrere ved RT.
- Hold forbindelserne på is.
- Der fremstilles en 10x koncentreret fortynding af hver forbindelse i analysemedium i 5 ml polypropylenrør.
- Serielt fortyndes forbindelserne i analysemedium i 5 ml polypropylenrør for at opnå de ønskede 10x koncentrationer.
- Sæt CEI-enheden på pause ved at klikke på Sæt på pause i ruden Opsætning af dataindsamling. Vent på, at det aktuelle tidspunkt er afsluttet, og tag 96-brøndpladen ud.
- Kontroller vedhæftning og monolagsdannelse af cellerne under et lysmikroskop.
- Fjern 20 μL fra hvert hul med en flerkanals pipet.
- Der tilsættes 20 μL sammensat opløsning eller køretøj i de ønskede huller. Forbered et layout med de specifikke betingelser for korrekt pipettering.
- Pladen inkuberes i 15 minutter ved 37 °C med 5% CO2.
BEMÆRK: En normal celleinkubator bruges til dette inkubationstrin i stedet for en CEI-enhed. Cellekontrolbrønde (CC) er køretøjsbehandlede brønde.
6. Virusforberedelse og infektion
- Optø et hætteglas med viruslager. I dette eksempel anvendes ZIKV MR766 og ZIKV PRVABC59.
- Der fremstilles virusfortyndinger ved den ønskede MOI eller fortyndinger i analysemedium i et 15 ml polypropylenrør.
BEMÆRK: I dette repræsentative eksempel bruges MOI 0,5, 0,1, 0,05, 0,01, 0,005, 0,001, 0,005 og 0,00005. - Der tilsættes 100 μL virusfortynding i de tildelte huller på 96-brøndpladen. Der tilsættes analysesubstrat til CC-hullerne.
- Dekontaminer de anvendte virusbeholdere.
- Sæt pladen tilbage i CEI-enheden, og fortsæt målingerne i 6 på hinanden følgende dage ved at klikke på Genoptag eksperiment.
BEMÆRK: Viruskontrolbrønde (VC) er køretøjsbehandlede inficerede celler, mens der i CC-brønde tilsættes analysemedium i stedet for virusfortynding. Hvis forbindelsernes cytotoksicitet vurderes, tilsættes 100 μL analysebuffer i stedet for virusfortynding.
7. Analyse af data
- Afslut eksperimentet ved at klikke på Udfør , og tilføj valgfrie oversigtskommentarer, f.eks. oplysninger om de specifikke eksperimentbetingelser i det viste vindue. Klik på OK , når dataindsamlingen er fuldført.
- Vælg den ønskede frekvens i ruden Graf , hvor den største impedansforskel mellem CC og VC måles ved eksperimentets afslutning.
- For at bestemme den bedste frekvens skal du køre et piloteksperiment med uinficerede og inficerede celler og vælge den frekvens, der - på det tidspunkt, hvor impedansen af de inficerede celler er faldet til sit baselineniveau - fører til den største observerede impedansforskel mellem de uinficerede og inficerede celler. I tilfælde af A549-celler inficeret med ZIKV er dette 16 kHz.
- Hvis du vil eksportere alle data i regnearksformat, skal du sørge for, at alle felter er markeret i ruden Brøndkonfiguration og klikke på Filer | Eksportér data | Grafdata.
- Normaliser dataene ved at trække den gennemsnitlige VC-impedansværdi målt ved eksperimentets afslutning fra alle datapunkterne og dividere denne med den gennemsnitlige CC-impedansværdi for det sidste tidspunkt målt før infektion.
- Plot de normaliserede data i funktionen af tid til at opnå CEI-profilgrafer.
- Beregn det normaliserede areal under kurven (AUCn) for hver tilstand for at bestemme parametre såsom 50% hæmmende koncentrationer (IC50).
- Beregn andre nyttige parametre, såsom CIT50, for eksempel at sammenligne infektiviteten af forskellige virusstammer.
Representative Results
I denne artikel beskrives brugen af CEI-analysen i ZIKV-forskning detaljeret. Arbejdsprocessen for dette assay er illustreret i figur 1. Vi demonstrerer bekvemmeligheden ved realtidsovervågning af ZIKV-infektion i en ønsket celletype samt evaluering af infektionshæmning med en antiviral forbindelse. Som et antiviralt eksempel bruger vi det velbeskrevne peptid labyrinthopeptin A1 (Laby A1); Vi henviser til dette som 'forbindelsen', da dens specifikke egenskaber ligger uden for rammerne af denne metodeartikel og diskuteres andetsteds20,21. Bemærk, at metodens reproducerbarhed ikke diskuteres i resultatafsnittet, da vi ønsker at fokusere på de enkelte impedansprofiler opnået ved hjælp af metoden. Dette er dog blevet beskrevet tidligere19.
I det første sæt eksperimenter demonstrerer vi vigtigheden af celletæthedsoptimering ved udførelse af CEI-infektionsassays (figur 2). Når for mange celler er podet, vil cellemonolaget være fuldt vokset og ikke være i stand til yderligere at sprede sig over CEI-elektroderne. Dette fører til en mindre forskel mellem CC og VC og dermed en lavere opløsning, hvilket reducerer detektionsvinduet for antiviral aktivitet. Dette er godt eksemplificeret i figur 2E. For visse større celletyper, såsom U87-celler, kan såceller for tæt endda føre til fuldstændig frigørelse af cellemonolaget, når pladen manipuleres, som vist her (figur 2F). Dette observeres også mikroskopisk.
Figur 2 viser også, at analysen er meget nyttig til udførelse af cellefølsomhedsundersøgelser. Det fremgår klart af figur 2A,B, at infektionskinetikken er meget afhængig af celletypen. Figur 2C viser, at U87-celler kun er modtagelige for ZIKV-infektion ved høje MOI'er.
I det andet sæt eksperimenter fremhæves den alsidige anvendelse af CEI-infektionsanalysen ved anvendelse af forskellige ZIKV-stammer ved forskellige MOI'er og i nærvær af en velbeskrevet antiviral forbindelse (figur 3). Disse eksperimenter udføres med A549-celler, en model, der almindeligvis anvendes i flavivirusforskning22,23. Denne cellelinje er også blevet anvendt i andre undersøgelser, der har vist dens egnethed i CEI-assays24. For det første sammenlignes infektionskinetik af en repræsentativ ZIKV-stamme af den afrikanske afstamning MR766 med dem fra den asiatiske afstamning PRVABC59. Figur 3A viser, at begge stammer har sammenlignelige CEI-mønstre, hvor PRVABC59 har lidt langsommere CPE-inducerende egenskaber. Dette afspejles også af CIT50-værdierne (figur 3B). Denne interessante parameter blev først introduceret af Fang et al.16 og tager højde for kinetikken af CEI-målinger. Det defineres som den tid, der er nødvendig for at reducere impedans med 50% sammenlignet med cellekontrollen.
Derefter blev cellerne inficeret med tre forskellige MOI'er af enten ZIKV MR766 eller PRVABC59 i nærvær eller fravær af forskellige sammensatte koncentrationer, og impedansprofilerne blev overvåget. Som det fremgår af figur 3C-H, hæmmer eller forsinker visse sammensatte koncentrationer impedansfaldet forårsaget af ZIKV-infektion. Dette afspejles også, når AUC-værdierne beregnes. CEI-analyseresultaterne viser også visuelt, at den antivirale aktivitet afhænger af MOI og tidspunktet for styrkeevaluering. AUC-n-beregninger kan bruges til at bestemme IC50-værdier, som vist i figur 3I. Endelig viser figur 3H, at CIT50-værdier også kan bruges til at bestemme og sammenligne sammensatte styrker. Inaktive forbindelser eller sammensatte koncentrationer er karakteriseret ved CEI-profiler, AUC og CIT50-værdier, der kan sammenlignes med VC.
Figur 1: Skematisk oversigt over analysens arbejdsgang. Tidslinjen og de forskellige håndterings- og inkubationstrin i CEI-analysen er afbildet her. Forkortelser: CEI = cellebaseret elektrisk impedans; ZIKV = Zika-virus; D = dage. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Normaliserede CEI-profiler af ZIKV-inficerede celler ved forskellige tætheder. (A,D) A549, (B,E) HEL 299 eller (C,F) U87-celler blev podet ved (A-C) 15.000-20.000 ("optimale") eller (D-F) 75.000 ("suboptimale") celler pr. brønd i en 96-brønds CEI-plade. Efter 24 timers impedansovervågning blev cellerne inficeret med ti gange MOI-fortyndinger af ZIKV MR766. Impedans blev yderligere overvåget i 5 på hinanden følgende dage. CEI-profiler (gennemsnit ± interval af to tekniske replikater) for et repræsentativt eksperiment vises. Forkortelser: CEI = cellebaseret elektrisk impedans; MOI = mangfoldighed af infektion; ZIKV = Zika-virus; Norm = normaliseret. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Normaliserede CEI-profiler af A549-celler efter infektion med to ZIKV-stammer og hæmning af en antiviral forbindelse. (A) Adhærente A549-celler blev inficeret med forskellige MOI'er af enten ZIKV MR766 eller ZIKV PRVABC59, og impedans blev overvåget kontinuerligt. Gennemsnit ± SD for tre tekniske replikater af et repræsentativt eksperiment vises. (B) CIT50-værdier blev beregnet på grundlag af CEI-profilen for A og sammenlignet. Gennemsnit ± SD for tre udførte tekniske replikater vises. (C-H) Adhærente A549-celler blev behandlet med forskellige sammensatte koncentrationer og efterfølgende inficeret med en specifik MOI af enten ZIKV MR766 (C-E) eller ZIKV PRVABC59 (F-H). Impedans blev løbende overvåget. Gennemsnit ± interval af to tekniske replikater af et repræsentativt eksperiment vises. (I) For at sammenligne forbindelseshæmning med forskellige ZIKV-stammer og fortyndinger blev AUC n beregnet, og hæmmende procenter blev bestemt ved at trække alle betingelser fra CC AUC n og dividere med VC AUCn. (J) CIT50-værdierne for eksperimentet vist i C-H blev beregnet for at sammenligne de forskellige ZIKV-stammer og MOI. Der vises et gennemsnitligt ± interval af to tekniske replikater. Forkortelser: CEI = cellebaseret elektrisk impedans; MOI = mangfoldighed af infektion; ZIKV = Zika-virus; Norm = normaliseret; CIT 50 = tidspunkt, hvor impedansen faldt med50% i forhold til ubehandlet kontrol; AUC = areal under kurven CC = cellekontrol; VC = viruskontrol. Klik her for at se en større version af denne figur.
Discussion
Denne artikel beskriver brugen af CEI-analysen i ZIKV antiviral forskning. Assayet har fordelen ved realtidsovervågning og kan derfor bruges til at evaluere kinetikken af ZIKV-infektion og antiviral hæmning med selektive forbindelser. De data, der opnås med denne metode, muliggør en objektiv og visuel observation af den virusinducerede CPE og styrken af en potentiel antiviral forbindelse.
Da CEI er en meget følsom metode, skal der udvises stor omhu, når du udfører dette cellulære assay. Det er afgørende, at der udføres præcis pipettering for at undgå pipetteringsvariation så meget som muligt. Desuden skal andre faktorer, der kan påvirke eksperimentelle resultater, såsom cellenummer og brugt viral bestand, holdes konstante mellem eksperimentgentagelser. Dette er faktorer, der i høj grad påvirker kinetikken af cellevækst og infektion og derfor kan føre til variation i beregnede CIT50-værdier og/eller andre parametre.
Ved udførelse af CEI-analysen i nærvær af (potentielle) antivirale forbindelser er det vigtigt at afgøre, om de påvirker impedansen af cellerne i fravær af en virus. Teknikken er så følsom, at impedansændringer kan måles langt under forbindelsens cytotoksiske koncentrationer19.
Selvom kun ZIKV-data er vist i denne artikel, kan analysen let anvendes på andre cytopatogene (flavi)vira med kun minimal optimeringsindsats, såsom optimal bestemmelse af CEI-overvågningsfrekvens. Tilpasninger af CEI-analysen er blevet anvendt med forskellige humane og animalske vira, såsom chikungunya, influenza A og human og hesteherpesvirus25,26,27,28. Her anvendes den også som en simpel metode til kvantificering af virale titere eller til identifikation af antivirale forbindelser. Disse undersøgelser brugte celleanalyse i realtid, en alternativ CEI-metode.
Anvendelsen af CEI-teknologien er begrænset til klæbende celletyper, da analysens princip er afhængig af vedhængende cellers egenskaber for at sprede sig over de elektrodeindlejrede brønde. Brøndoverfladebelægninger såsom fibronectin kan bruges til at forbedre cellevedhæftning29. Metoden har nogle andre ulemper, den første relateret til dens omkostninger. Bortset fra investeringen i CEI-overvågningsenheden og tilhørende hard- og software er forbrugsstofferne også noget dyre. Da protokollen kræver overvågning af virusinfektion i flere dage, kan en 96-brøndplade om ugen evalueres. Sammen med de høje omkostninger begrænser dette brugen til indstillinger med lav til medium kapacitet.
På grund af disse gennemstrømningsproblemer er teknologien uegnet til antivirale screeningsindstillinger. Det er imidlertid meget tiltalende i indledende eksperimentelle faser, for eksempel ved evaluering af cellefølsomhed til undersøgelse af ZIKV-infektion i en bestemt sygdomsrelateret indstilling. Teknologien er også nyttig med transfekterede eller knockout-cellelinjer for let at observere ændringer i infektionskinetik, for eksempel i nærvær eller fravær af visse indgangsreceptorer. Dette er interessant, når man undersøger involvering af cellulære faktorer i ZIKV-infektion. I senere prækliniske faser, når en bestemt spidskandidat er blevet valgt, kan CEI-analysen anvendes til yderligere dybdegående karakterisering af en udvalgt forbindelse. CEI-biosensorer kan også ændres ved at immobilisere visse biogenkendelseselementer, såsom virusspecifikke antistoffer, til påvisning af vira18. Alt i alt fremhæver dette den alsidige brug af CEI i en virologiindstilling.
Disclosures
Forfatterne bekræfter, at der ikke er nogen interessekonflikt.
Acknowledgments
Forfatterne takker Clément Heymann og Gorrit Lootsma for korrekturlæsning af manuskriptet. Undersøgelsen blev støttet af interne bevillinger fra Laboratoriet for Virologi og Kemoterapi (Rega Institute, KU Leuven).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| A549 cells | American Type Culture Collection (ATCC) | CCL-185 | These cells are cultured in MEM Rega-3 supplemented with 10% FBS, 2 mM L-glutamine, 0.075% sodium bicarbonate. |
| Acridine Orange/Propidium Iodide Stain | Logos Biosystems | F23001 | Live/dead stain |
| Cellstar polypropylene tubes, 15 mL | Greiner bio-one | 1,88,271 | |
| Cellstar polypropylene tubes, 50 mL | Greiner bio-one | 2,27,261 | |
| Dulbecco's Modified Essential Medium (DMEM) | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 41965-039 | Cell culture medium for U87 and HEL 299 cells |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 14190-094 | |
| ECIS cultureware 96W20idf | Applied BioPhysics | 96W20idf PET | Assay plate for CEI device |
| Electric cell-substrate impedance sensing (ECIS) Z array station | Applied BioPhysics | CEI device, including 96 well station, external control module and laptop with control, acquisition and display software. The necessary software is installed before shipment. NOTE: this device is currently out of production and has been replaced by the more advanced ECIS Z-Theta device | |
| Falcon polystyrene tubes, 5 mL | Corning | 352054 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Cytiva | SV30160.03 | Cell culture medium additive for all used cells |
| HEL 299 cells | ATCC | CCL-137 | These cells are cultured in DMEM supplemented with 10% FBS and 0.01 M HEPES. |
| HEPES buffer, 1 M | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 15630-056 | Cell culture medium additive for U87 cells |
| Labyrinthopeptin A1 | Kind gift from Prof. Dr. Roderich Süssmuth, Technische Universität Berlin, Germany | Antiviral compound used as an example in this protocol. It is dissolved in DMSO. | |
| L-Glutamine, 200 mM | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 25030-024 | Cell culture medium additive for A549 cells |
| Luna cell counting slides | Logos Biosystems | L12001 | |
| Luna-FL dual fluoresence cell counter | Logos Biosystems | L20001 | Cell viability counter |
| Minimum Essential Medium Rega-3 (MEM Rega-3) | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 19993013 | Cell culture medium for A549 cells |
| Sodium Bicarbonate, 7.5% | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 25080-060 | Cell culture medium additive for A549 cells |
| Tissue culture flask T75 | TPP | Y9076 | |
| Trypsin-EDTA, 0.25% | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 25200-056 | Dissociation reagent |
| U87 cells | ATCC | HTB-14 | These cells are cultured in DMEM supplemented with 10% FBS and 0.01 M HEPES. |
| Virkon Rely+On tablets | Lanxess | 115-0020 | Disinfectant sollution |
| Zika virus (ZIKV) MR766 | ATCC | VR-84 | ZIKV prototype strain, isolated from sentinel Rhesus monkey in Uganda in 1968 |
| ZIKV PRVABC59 | ATCC | VR-1843 | ZIKV strain isolated from patient in Puerto Rico in 2015 |
References
- Cao-Lormeau, V. M., et al. Guillain-Barré Syndrome outbreak associated with Zika virus infection in French Polynesia: a case-control study. Lancet. 387 (10027), 1531-1539 (2016).
- Mlakar, J., et al. Zika virus associated with microcephaly. The New England. Journal of Medicine. 374 (10), 951-958 (2016).
- Pierson, T. C., Diamond, M. S. The emergence of Zika virus and its new clinical syndromes. Nature. 560 (7720), 573-581 (2018).
- Pergolizzi, J., et al. The Zika virus: Lurking behind the COVID-19 pandemic. Journal of Clinical Pharmacy and Therapeutics. 46 (2), 267-276 (2021).
- Bernatchez, J. A., et al. Development and validation of a phenotypic high-content imaging assay for assessing the antiviral activity of small-molecule inhibitors targeting Zika virus. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 62 (10), e00725 (2018).
- Zou, J., Shi, P. Y. Strategies for Zika drug discovery. Current Opinion in Virology. 35, 19-26 (2019).
- Mottin, M., et al. Discovery of new Zika protease and polymerase inhibitors through the open science collaboration Project OpenZika. Journal of Chemical Information and Modeling. 62 (24), 6825-6843 (2022).
- Giaever, I., Keese, C. R. Monitoring fibroblast behavior in tissue culture with an applied electric field. Proceedings of the National Academy of Sciences. 81 (12), 3761-3764 (1984).
- Giaever, I., Keese, C. R. A morphological biosensor for mammalian cells. Nature. 366 (6455), 591-592 (1993).
- Rahim, S., Üren, A. A real-time electrical impedance based technique to measure invasion of endothelial cell monolayer by cancer cells. Journal of Visualized Experiments. (50), e2792 (2011).
- Szulcek, R., Bogaard, H. J., van Nieuw Amerongen, G. P. Electric cell-substrate impedance sensing for the quantification of endothelial proliferation, barrier function, and motility. Journal of Visualized Experiments. (85), e51300 (2014).
- Li, X., et al. Hsp70 suppresses mitochondrial reactive oxygen species and preserves pulmonary microvascular barrier integrity following exposure to bacterial toxins. Frontiers in Immunology. 9, 1309 (2018).
- Wegener, J., Keese, C. R., Giaever, I. Electric cell-substrate impedance sensing (ECIS) as a noninvasive means to monitor the kinetics of cell spreading to artificial surfaces. Experimental Cell Research. 259 (1), 158-166 (2000).
- Xu, Y., et al. A review of impedance measurements of whole cells. Biosensors and Bioelectronics. 77, 824-836 (2016).
- Pennington, M. R., Van de Walle, G. R. Electric cell-substrate impedance sensing to monitor viral growth and study cellular responses to infection with alphaherpesviruses in real time. mSphere. 2 (2), e00039 (2017).
- Fang, Y., Ye, P., Wang, X., Xu, X., Reisen, W. Real-time monitoring of flavivirus induced cytopathogenesis using cell electric impedance technology. Journal of Virological Methods. 173 (2), 251-258 (2011).
- McCoy, M. H., Wang, E. Use of electric cell-substrate impedance sensing as a tool for quantifying cytopathic effect in influenza a virus infected MDCK cells in real-time. Journal of Virological Methods. 130 (1-2), 157-161 (2005).
- Stukovnik, Z., Bren, U. Recent developments in electrochemical-impedimetric biosensors for virus detection. International Journal of Molecular Sciences. 23 (24), 15922 (2022).
- Oeyen, M., Meyen, E., Doijen, J., Schols, D. In-depth characterization of Zika virus inhibitors using cell-based electrical impedance. Microbiology Spectrum. 10 (4), e0049122 (2022).
- Prochnow, H., et al. Labyrinthopeptins exert broad-spectrum antiviral activity through lipid-binding-mediated virolysis. Journal of Virology. 94 (2), e01471 (2020).
- Oeyen, M., et al. Labyrinthopeptin A1 inhibits dengue and Zika virus infection by interfering with the viral phospholipid membrane. Virology. 562, 74-86 (2021).
- Vicenti, I., et al. Comparative analysis of different cell systems for Zika virus (ZIKV) propagation and evaluation of anti-ZIKV compounds in vitro. Virus Research. 244, 64-70 (2018).
- Gobillot, T. A., Humes, D., Sharma, A., Kikawa, C., Overbaugh, J. The robust restriction of Zika virus by type-I interferon in A549 cells varies by viral lineage and is not determined by IFITM3. Viruses. 12 (5), 503 (2020).
- Verma, N. K., Moore, E., Blau, W., Volkov, Y., Babu, P. R. Cytotoxicity evaluation of nanoclays in human epithelial cell line A549 using high content screening and real-time impedance analysis. Journal of Nanoparticle Research. 14, 1137 (2012).
- Thieulent, C. J., et al. Screening and evaluation of antiviral compounds against Equid alpha-herpesviruses using an impedance-based cellular assay. Virology. 526, 105-116 (2019).
- Labadie, T., Grassin, Q., Batéjat, C., Manuguerra, J. -C., Leclercq, I. Monitoring influenza virus survival outside the host using real-time cell analysis. Journal of Visualized Experiments. (168), e61133 (2021).
- Piret, J., Goyette, N., Boivin, G. Novel method based on real-time cell analysis for drug susceptibility testing of herpes simplex virus and human cytomegalovirus. Journal of Clinical Microbiology. 54 (8), 2120-2127 (2016).
- Zandi, K. A real-time cell analyzing assay for identification of novel antiviral compounds against chikungunya virus. Methods in Molecular Biology. 1426, 255-262 (2016).
- Ebrahim, A. S., et al. Functional optimization of electric cell-substrate impedance sensing (ECIS) using human corneal epithelial cells. Scientific Reports. 12 (1), 14126 (2022).
